המחברים מודים מרין מנואל ואוליביה גולדמן-Szwajkajzer על עזרתם לוקח את התצלומים. המחברים מודים גם ארג&#39;ון Masukar וטוביאס בוק להגהה את כתב היד. תומך פיננסי נמסרו על ידי Nationale Agence לשפוך la משוכלל ונדיר (HYPER-MND, ANR-2010-BLAN-1429-1401), ה- NIH-NINDS (R01NS077863), קרן תיירי לטראן (פרויקט OHEX), האגודה הצרפתית מיופתיה ( מספר מענק 16026) ומחיר היעד ALS הם הודו בהכרת תודה. פליקס לירוי היה הנמען של &quot;דוקטור Contrat&quot; ​​מן אקול נורמל סופרייר, Cachan.

הניסויים בוצעו בהתאם להוראות האירופי (86/609 / CEE ו- 2010-63-UE) וחקיקה צרפתית, ואושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת פריז דקארט. 1. חוט שדרה כנה Slice <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות הבאים יומי או יום אחד מראש. אם כל זמן הלילה, בועה עם 95% O 2, 5% CO 2 ולשמור בקירור בקבוקי סגור היטב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן נמוך Na + מלאכותי הנוזל השדרתי (ACSF): 3 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ לאא 2 4 PO, 230 סוכרוז מ&quot;מ, 26 מ&quot;מ NaHCO 3, 0.8 מ&quot;מ 2 CaCl, 8 מ&quot;מ MgCl 2, 25 גלוקוז מ&quot;מ, חומצה אסקורבית 0.4 מ&quot;מ, 1 מ&quot;מ Na-kynurenate, 2 מ&quot;מ Na-פירובט. בועה עם 95% O 2 ו -5% CO 2 (pH 7.4). מאז Na-kynurenate הוא לעתים קרובות קשה לפזר, לוודא כדי לרכוש את הכבל מפורט בטבלת החומרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן solu-גלוקונאט Ktion: 130 מ&quot;מ K-גלוקונאט, 15 מ&quot;מ KCl, 0.05 מ&quot;מ EGTA, 20 HEPES מ&quot;מ, 25 מ&quot;מ גלוקוז, 1 מ&quot;מ Na-kynurenate, 2 מ&quot;מ Na-פירובט, מותאם pH 7.4 עם KOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ACSF: 130 mM NaCl, KCl 2.5 מ&quot;מ, 2 מ&quot;מ 2 CaCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 1 מ&quot;מ לאא 2 4 PO, 26 מ&quot;מ NaHCO 3, 25 גלוקוז מ&quot;מ, 0.4 חומצה אסקורבית מ&quot;מ, 2 מ&quot;מ Na-פירובט. בועה עם 95% O 2 ו -5% CO 2 (pH 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת לנתיחה, לפזר אגר 2% ב 80 מ&quot;ל של תמיסת-גלוקונאט K, להתחמם על 60 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זלוף intracardiac <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לבצע הכנה זו על עכברים נשיים וגבריים, שגילן נע בין P2 ל P11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם זריקה intraperitoneal של 0.1 מ&quot;ל של 25 מ&quot;מ נתרן pentobarbital (50 מ&quot;ג / ק&quot;ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במחטים או קלטת, לשתק את העכבר על גבה על צלחת פטרי גדולה מלאת סיליקון. השתמש microscop לנתחדואר לשארית לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזקת קצה עצם החזה, הרם את החזה וחתך את הסרעפת באמצעות מספריים בסדר. לאחר מכן פתח את החזה משני הצדדים על ידי חיתוך דרך הצלעות כדי לחשוף את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את אטריום ימין לפני ניקוב החדר השמאלי עם מחט 27G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse עם ACSF Na + נמוך קר כקרח. לאחר 30 שניות, נמוך Na + ACSF יש לראות זורם החוצה של אטריום. כמויות נמוכות של נתרן למנוע את התאים מפני spiking ולהפחית מוות הסלולר במהלך לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך ללחוץ על למחט בלב תחת מיקרוסקופ לנתח עד שהכבד הופך צהוב כאשר הדם מנוקז. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתיחת חוט שדרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף את החיה ולשים אותו על הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר במהירות את העור של הגב (איור 1A1). בשני חתכים דרך הכתפיים יורדים כלוב החזה (איור 1A2). ואז לחתוך את חבל הטבור כפי low ככל האפשר בחלק הזנב כדי לבודד את עמוד השדרה עם תחילת הצלעות מהחלק התחתון של החיה. הפוך את החיה שוב להסיר את הקרביים עדיין מחוברים הצלעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את עמוד השדרה למשנהו, צלחת פטרי מלאות סיליקון קטן ולהשתמש 4 סיכות חרקים להחזיק עד הגבי זה בצד (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברציפות perfuse חיה עם ACSF-מבעבע carbogen (בסביבות 4 מעלות צלזיוס) תוך ביצוע laminectomy של הצד הגבה, וחשיפת חוט השדרה של הסוף המקורי (איור 1 ב). לשם כך, הכנס את הקצה מספרי בסדר בין העצם ואת חוט השדרה וחתכת את עצם טיפות טיפות המסוף המקורי, והקפד להתרחק בחומר הלבן. מתחלף בכל צד תוך שימוש בפינצטה כדי להרחיק את הלהקה של העצם כבר לחתוך (איור 1B1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספרי האביב זמינים הקטנים פינצטה, להרים את הדורה וחותךמשני הצדדים בעת החזקת חלק רופף של דורה כדי למנוע נזק לחוט השדרה עם מספריים. חותכים לאורך ציר rostro- הזנב. הערה: הדורה היא קרום רציף שקוף למחצה; בגיל זה מאטר פיא היא שברירית מדי יתפורר במהלך הניתוח וחותך (איור 1B2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדורה היא שימוש שהוסר כוס בוטה או קצה פלסטיק לדחוף את הכבל בעדינות בצד השמאל של החריץ שנוצר על ידי עמוד השדרה חצי לחתוך, לחתוך את שורשי גחון ועל גב בצד ימין, החלה מהצד המקורי קליעה, ממקום שבו הם מזינים את הכבל (כמה מ&quot;מ לפחות, איור 1B2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הפעולה בצד שמאל, תמיד הולך מ מקורי כדי הזנב. אם שמאלי, להתחיל מהאגף השמאלי ולאחר מכן לעבור לצד ימין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיבוץ אגר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליק את החוט מתוך עמוד השדרה. בעזרת מערוך חרקים קטן להצמידאת הכבל עם פני השטח הגבה עד ולהסיר כל פיסת הממברנה בעדינות עדיין קשור אליו (איור 1C1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לנקות, לקצץ את שני הקצוות (איור 1C2). הכנס סיכה חרקים bended בחלק הקדמי של חוט כדי לתפעל את כבל ושים לב האוריינטציה שלו (החץ באיור 1C2). ואז להעביר את חוט השדרה פתרון קר כקרח K-גלוקונאט. הערה: פתרון זה מחק את הרכב התאי של CSF וימנע תאים מהמוות של הלם אוסמוטי פעם motoneurons יקוצץ 26. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חוט השדרה הוא בתוך פתרון תוך התאי, לקחת הכוס עם אגר מתוך האמבטיה היבשה לקרר אותו על תערובת של קרח ומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחוש תוך מדידת הטמפרטורה. כאשר הטמפרטורה מגיעה 38 ° C לטבול את חוט השדרה, מחזיק אותו על ידי סיכת החרק ולמקם אותו מקורי צד למטה. ודא חוט השדרה הוא כמו straight ככל האפשר, הרחק מהקירות, חלק הזנב מעט כלפי מעלה (איור 1D1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את הכוס בתערובת של קרח ומים לאפשר אגר לגבש מהר ככל האפשר. ודא שהוא נשאר במקום שהכבל הוא וישר ככל האפשר (איור 1D1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פִּלוּחַ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התמצקות, חותך את הגוש אגר המכיל את חוט השדרה בצורה כזאת, כי הבסיס של הבלוק הוא בזווית 35 מעלות עם החלק המותני של החוט (חץ באיור 1D2). המשטח הגבה צריכה להיות פונה משם מהבסיס (האיור 1D2). הערה: זהו צעד קריטי בהליך עבור שמירה על הרצף של ברכות motoneuron לשורשי הגחון שממנו הם יוצאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדביק את הבלוק לתוך התא של vibratome באמצעות דבק cyanoacrylate. לטבול אותו פתרון K-גלוקונאט ולהוסיף פתרון-גלוקונאט K קפוא דשדשנו לשמורבאמבטיה מקוררת (מתחת ל -2 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך 350 - 400 מיקרומטר פרוסות עבות של האזור המותני (לזיהוי על ידי העקמומיות שלה בקוטר גדול יותר). ב הכיוון הנכון שלה (ראה 1.4.1.), השתמש להב לחתוך מן הגב אל פני השטח הגחון ולעשות פרוסות ברציפות יותר מקורי. בדרך כלל, ישנם 4-5 פרוסות מתאימות עם שורשי גחון הארכת 2 מ&quot;מ או יותר. השתמש בפרמטרים הבאים: 10 ° זווית, 70 הרץ תדירות הרטט 10 מ&quot;מ / דקה מהירות של חיתוך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דְגִירָה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפרוסות ACSF ב 34 ° C. לאחר כ 30 דקות, לצנן את הפרוסות עד RT ולהתחיל את ההקלטות. </li></ol></li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig1.jpg" /> באיור 1. Dissection A1:. הסרת העור של הגב לחשוף בעמודה הגבה A2:חיתוך של הכתפיים והצלעות לשחרר את הגב טור B1:. עמוד השדרה הצמיד על צלחת פטרי מלאות סיליקון (צד הגב למעלה, בצד הזנב השמאלי) B2:. אותו דבר עם חוט השדרה חשוף גזור C1:. חוט השדרה מבודד . (מקורי בצד שמאל) C2: חוט שדרה מוכן להיות מוטבעים (עד צד הגחוני, בצד מקורה שמאל). שים לב סיכת החרק הקטנה בצד המקורי D1:.. חוט שדרה בכוס אגרה (דאו צד מקורי, בצד גחון מול התחתון) D2: בלוק אגר Cut עם חוט השדרה המוטבע. הערת זווית 35 ° צורות חוט השדרה עם הבסיס של הבלוק ואת ההרחבה המותני (חץ). ברי סולם 1 סנטימטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54525/54525fig1large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 2. הצבת Slice לתוך הקאמרי הערה: Veשורשי ntral הם באורך משתנה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן קופסא טפטפות שונים בקטרי טיפ הנעים בין 40 ל 170 מיקרומטר מראש. כדי להכין טפטפות יניקה, להכין טפטפות רבים עם להתחדד ארוך. בעזרת סכין יהלום, לעשות חתך שהוצבו בנקודות שונות. אז תחת מיקרוסקופ לנתח, לשבור אותו על ידי להכות את הקצה עם פינצטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את תא המיקרוסקופ הקלטה ולמקם אותו תחת מיקרוסקופ לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פרוסה המכילה שורש גחון של אורך מספיק (2 מ&quot;מ או יותר) כדי להיות מותקנות על האלקטרודה גירוי יניקה. בחר את הכיוון הנכון של הפרוסה עם שורשי הגחון כלפי מעלה (איור 2 א) ובעדינות לחתוך את אגר סביב שורשי הגחון ולהשאיר את השאר של אגר ברחבי הפרוסה (התרשים 2B). הערה: מאחר אגר הוא נחוש יותר הפרוס, זה יאפשר את החוטים של העוגן של הפרוסה לנוח על אגר ולא על הפרוסה ובכך אnchor לא לגרום נזק לרקמות. ודא החוטים של העוגן של הפרוסה הם מעל ברכת motoneuron (באדום באיור 2C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר קאמרית בחזרה אל המיקרוסקופ ברציפות perfuse לתא הקלטה עם ACSF בשיעור של 1 - 2 מ&quot;ל / דקה, ב RT. בעזרת פיפטה זכוכית מלאה ACSF ומחובר מזרק, למצוץ אחד שורש הגחון (חץ באיור 2C). על מנת להשיג גירוי טוב של שורש הגחון, קצה פיפטה צריך להיות הדוק סביב שורש הגחון. מוט אחד צריך להיות ב האלקטרודה מגרה והשני באמבטיה (או מחובר הפניה אלקטרודה-clamping תיקון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג הקלטת תיקון- clamp של תא מהסוג הרצוי ולהקליט את השפעת גירוי שורש הגחון כמתואר previsouly 10. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנה, השתמש מגבר לרכישת נתונים. מסנן כל תא הקלטות ב 3 קילוהרץ. לספרה ב 10 קילוהרץ. לפצות התנגדות גשר curreמצב NT-מהדק. </li></ol></li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig2.jpg" /> איור 2. גחון רוט כן ת: פרוסת חוט השדרה המותני מוטבע אגר עם השורש הגחוני פונה כלפי מעלה ב:. פרוסת חוט השדרה המותני עם השורשים הגחון משוחרר מן אגר C:. פרוסת חוט השדרה המותני עם אלקטרודה מגרה הניח בחוזקה סביב השורשים הגחון (חץ) . שים לב למיקום של תאי רנשו להביע קרינה אדומה chrna2-Cre עכבר 28 חצה עם כתב העכבר R26 טום 17. ברי סולם 1 מ&quot;מ. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54525/54525fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<ol>
	<li>Brooks, C. M., Downman, C. B., Eccles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=After-potentials+and+excitability+of+spinal+motoneurones+following+antidromic+activation.">After-potentials and excitability of spinal motoneurones following antidromic activation.</a> J Neurophysiol. 13 (1), 9-38 (1950).</li><li>Bories, C., Amendola, J., Lamotte d'Incamps, B., Durand, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+electrophysiological+abnormalities+in+lumbar+motoneurons+in+a+transgenic+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Early electrophysiological abnormalities in lumbar motoneurons in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Eur J Neurosci. 25 (2), 451-459 (2007).</li><li>Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+currents+in+visually+identified+motoneurones+of+neonatal+rat+spinal+cord.">Membrane currents in visually identified motoneurones of neonatal rat spinal cord.</a> J Physiol. 423, 27-46 (1990).</li><li>Hori, N., Tan, Y., Strominger, N. L., Carpenter, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+activity+of+rat+spinal+cord+motoneurons+in+slices.">Intracellular activity of rat spinal cord motoneurons in slices.</a> J Neurosci Methods. 112 (2), 185-191 (2001).</li><li>Arai, Y., Mentis, G. Z., Wu, J. Y., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventrolateral+origin+of+each+cycle+of+rhythmic+activity+generated+by+the+spinal+cord+of+the+chick+embryo.">Ventrolateral origin of each cycle of rhythmic activity generated by the spinal cord of the chick embryo.</a> PLoS One. 2 (5), e417 (2007).</li><li>Cullheim, S., Lipsenthal, L., Burke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+monosynaptic+contacts+between+type-identified+alpha-motoneurons+in+the+cat.">Direct monosynaptic contacts between type-identified alpha-motoneurons in the cat.</a> Brain Res. 308 (1), 196-199 (1984).</li><li>Cullheim, S., Kellerth, J. O., Conradi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+direct+synaptic+interconnections+between+cat+spinal+alpha-motoneurons+via+the+recurrent+axon+collaterals:+a+morphological+study+using+intracellular+injection+of+horseradish+peroxidase.">Evidence for direct synaptic interconnections between cat spinal alpha-motoneurons via the recurrent axon collaterals: a morphological study using intracellular injection of horseradish peroxidase.</a> Brain Res. 132 (1), 1-10 (1977).</li><li>Gogan, P., Gueritaud, J. P., Horcholle-Bossavit, G., Tyc-Dumont, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+excitatory+interactions+between+spinal+motoneurones+of+the+cat.">Direct excitatory interactions between spinal motoneurones of the cat.</a> J Physiol. 272 (3), 755-767 (1977).</li><li>Ichinose, T., Miyata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+excitation+of+motoneurons+in+the+isolated+spinal+cord+of+newborn+rats+detected+by+whole-cell+recording.">Recurrent excitation of motoneurons in the isolated spinal cord of newborn rats detected by whole-cell recording.</a> Neurosci Res. 31 (3), 179-187 (1998).</li><li>Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+excitatory+postsynaptic+ionotropic+receptors+coactivated+at+the+motoneuron-Renshaw+cell+synapse.">Four excitatory postsynaptic ionotropic receptors coactivated at the motoneuron-Renshaw cell synapse.</a> J Neurosci. 28 (52), 14121-14131 (2008).</li><li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+effects+of+centripetal+impulses+in+axons+of+spinal+ventral+roots.">Central effects of centripetal impulses in axons of spinal ventral roots.</a> J Neurophysiol. 9, 191-204 (1946).</li><li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+nerve+impulses+in+the+gray+matter+as+a+mechanism+in+central+inhibition.">Interaction of nerve impulses in the gray matter as a mechanism in central inhibition.</a> Fed Proc. 5 (1 Pt 2), 86 (1946).</li><li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+interaction+of+nerve+impulses+in+the+gray+matter+and+on+the+nature+of+central+inhibition).">Observations on interaction of nerve impulses in the gray matter and on the nature of central inhibition).</a> Am J Physiol. 146, 443-448 (1946).</li><li>Pambo-Pambo, A., Durand, J., Gueritaud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+excitability+changes+in+lumbar+motoneurons+of+transgenic+SOD1G85R+and+SOD1G(93A-Low)+mice.">Early excitability changes in lumbar motoneurons of transgenic SOD1G85R and SOD1G(93A-Low) mice.</a> J Neurophysiol. 102 (6), 3627-3642 (2009).</li><li>Quinlan, K. A., Schuster, J. E., Fu, R., Siddique, T., Heckman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+postnatal+maturation+of+electrical+properties+in+spinal+motoneurons+in+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Altered postnatal maturation of electrical properties in spinal motoneurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Physiol. 589 (Pt 9), 2245-2260 (2011).</li><li>Martin, E., Cazenave, W., Cattaert, D., Branchereau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+alteration+of+motoneuronal+morphology+induces+hyperexcitability+in+the+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Embryonic alteration of motoneuronal morphology induces hyperexcitability in the mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neurobiol Dis. 54, 116-126 (2013).</li><li>Hadzipasic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+degeneration+of+a+physiological+subtype+of+spinal+motor+neuron+in+mice+with+SOD1-linked+ALS.">Selective degeneration of a physiological subtype of spinal motor neuron in mice with SOD1-linked ALS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16883-16888 (2014).</li><li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110 (3), 385-397 (2002).</li><li>Tallini, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+transgenic+mice+express+enhanced+green+fluorescent+protein+in+central+and+peripheral+cholinergic+neurons.">BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons.</a> Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).</li><li>Manuel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics,+high-frequency+oscillations,+and+subprimary+firing+range+in+adult+mouse+spinal+motoneurons.">Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons.</a> J Neurosci. 29 (36), 11246-11256 (2009).</li><li>Obeidat, A. Z., Nardelli, P., Powers, R. K., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+motoneuron+firing+by+recurrent+inhibition+in+the+adult+rat+in+vivo.">Modulation of motoneuron firing by recurrent inhibition in the adult rat in vivo.</a> J Neurophysiol. 112 (9), 2302-2315 (2014).</li><li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+intrinsic+hyperexcitability+does+not+contribute+to+motoneuron+degeneration+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+currents+dynamically+set+the+recruitment+and+firing+properties+of+F-type+motoneurons+in+neonatal+mice.">Potassium currents dynamically set the recruitment and firing properties of F-type motoneurons in neonatal mice.</a> J Neurophysiol. 114 (3), 1963-1973 (2015).</li><li>Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+composition+and+kinetics+of+the+Renshaw+cell+heteromeric+nicotinic+receptors.">Subunit composition and kinetics of the Renshaw cell heteromeric nicotinic receptors.</a> Biochem Pharmacol. 86 (8), 1114-1121 (2013).</li><li>Lamotte d'Incamps, B., Krejci, E., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+shaping+the+slow+nicotinic+synaptic+current+at+the+motoneuron-renshaw+cell+synapse.">Mechanisms shaping the slow nicotinic synaptic current at the motoneuron-renshaw cell synapse.</a> J Neurosci. 32 (24), 8413-8423 (2012).</li><li>Dugue, G. P., Dumoulin, A., Triller, A., Dieudonne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-dependent+use+of+co-released+inhibitory+transmitters+at+central+synapses.">Target-dependent use of co-released inhibitory transmitters at central synapses.</a> J Neurosci. 25 (28), 6490-6498 (2005).</li><li>Mentis, G. Z., Siembab, V. C., Zerda, R., O'Donovan, M. J., Alvarez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+afferent+synapses+on+developing+and+adult+Renshaw+cells.">Primary afferent synapses on developing and adult Renshaw cells.</a> J Neurosci. 26 (51), 13297-13310 (2006).</li><li>Perry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firing+properties+of+Renshaw+cells+defined+by+Chrna2+are+modulated+by+hyperpolarizing+and+small+conductance+ion+currents+Ih+and+ISK.">Firing properties of Renshaw cells defined by Chrna2 are modulated by hyperpolarizing and small conductance ion currents Ih and ISK.</a> Eur J Neurosci. 41 (7), 889-900 (2015).</li><li>Thurbon, D., Luscher, H. R., Hofstetter, T., Redman, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+electrical+properties+of+ventral+horn+neurons+in+rat+spinal+cord+slices.">Passive electrical properties of ventral horn neurons in rat spinal cord slices.</a> J Neurophysiol. 79 (5), 2485-2502 (1998).</li><li>Zengel, J. E., Reid, S. A., Sypert, G. W., Munson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+electrical+properties+and+prediction+of+motor-unit+type+of+medial+gastrocnemius+motoneurons+in+the+cat.">Membrane electrical properties and prediction of motor-unit type of medial gastrocnemius motoneurons in the cat.</a> J Neurophysiol. 53 (5), 1323-1344 (1985).</li><li>Cooper, S., Sherington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gower's+tract+and+spinal+border+cells.">Gower's tract and spinal border cells.</a> Brain. 63, 123-124 (1940).</li><li>Morin, F., Schwartz, H. G., O'Leary, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+study+of+the+spinothalamic+and+related+tracts.">Experimental study of the spinothalamic and related tracts.</a> Acta Psychiatr Neurol Scand. 26 (3-4), 371-396 (1951).</li><li>Sengul, G., Fu, Y., Yu, Y., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+projections+to+the+cerebellum+in+the+mouse.">Spinal cord projections to the cerebellum in the mouse.</a> Brain Struct Funct. 220 (5), 2997-3009 (2015).</li><li>Russier, M., Carlier, E., Ankri, N., Fronzaroli, L., Debanne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A-,+T-,+and+H-type+currents+shape+intrinsic+firing+of+developing+rat+abducens+motoneurons.">A-, T-, and H-type currents shape intrinsic firing of developing rat abducens motoneurons.</a> J Physiol. 549 (Pt 1), 21-36 (2003).</li><li>Dourado, M., Sargent, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+nicotinic+receptors+underlying+Renshaw+cell+excitation+by+alpha-motor+neurons+in+neonatal+rat+spinal+cord).">Properties of nicotinic receptors underlying Renshaw cell excitation by alpha-motor neurons in neonatal rat spinal cord).</a> J Neurophysiol. 87 (6), 3117-3125 (2002).</li><li>Mitra, P., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+spinal+cord+slice+preparation+for+recording+from+lumbar+motoneurons+of+the+adult+mouse.">An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse.</a> J Neurophysiol. 107 (2), 728-741 (2012).</li><li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx.">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> J Neurosci. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li><li>Olney, J. W., Price, M. T., Samson, L., Labruyere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+specific+ions+in+glutamate+neurotoxicity.">The role of specific ions in glutamate neurotoxicity.</a> Neurosci Lett. 65 (1), 65-71 (1986).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

חיתוך אלכסוני של חוט השדרה הוא חשוב שכן הוא מאפשר גירוי חד-צדדי של ברכות motoneuron ותאי Renshaw בכל מגזר בחוליות יחיד באופן אמין, מקיף וספציפי. יתר על כן, היא מאפשרת זיהוי מהיר, אלגנטי ולא מעורפל של motoneurons מוקלט. לאחר מכן, אנו נדגיש את היתרונות של טכניקה זו לעומת שיטות כנות פרוסה אחרות, ולאחר מכן אנו נדגיש את החסרונות הנפוצים ביותר כדי להימנע בעת ביצוע הליך זה. רוב המחקרים באמצעות פרוסות רוחביות לבסס הזדהותם על תכונות חשמליות מהותיות 3,14,15,29. עם זאת, אלה להשתנות במידה רבה בין בריכות motoneuron וכן בין תת motoneuron בתוך הבריכה נתון (אלפא, בטא וגמא-motoneurons 30). לכן, מחקרים באמצעות פרמטרים גודל צפויים לכלול-motoneurons גמא קטן. מצד שני, קופר שרינגטון דescribed בשנת 1940 קבוצה של תאי עצב גדולים בתביעה האפורה לרוחב ventro של חוט השדרה המותני של קופים וחתולים אשר חצה עולה אקסונים 31,32. בנוסף להיותו קרוב somas motoneuron, הם ציינו שהם הופיעו נבדל היסטולוגית מ motoneurons. מאמר שפורסם לאחרונה אישרו את קיומה של תאים כאלה העכבר 33. בשל גודלו הגדול של תאים אלה ומיקומן שיוכלו נכלל בטעות במחקרים לשעבר. קריטריון זיהוי שלנו אינו כולל תאי גבול שדרה משוערים, מאז האקסון שלהם אינו צופה בשורש הגחון, ובמקביל לאפשר זיהוי אמין של כל motoneurons ללא קשר לגודל שלהם. יתר על כן, ניתוח המאפיינים החשמליים המהותיים, (למשל, התנגדות קלט), הוא יותר זמן רב יותר מאשר ההתבוננות הפשוטה של פוטנציאל פעולת antidromic. בנוסף לשימוש תכונות חשמליות מהותיות, כמה studies באמצעות פרוסות רוחבי, לאשר הזדהותם ידי ביצוע ניתוח פוסט הוק של סמן מולקולארי motoneurons (כגון איילט -1 / 2 16) או על ידי ביטוי חזותי את המורפולוגיה באמצעות biocytin labelings 14,17. הזדהויות כאלה הן אך מייגעות אינם מספקים זיהוי ישיר. הם כן מועלים לעתים נדירות באופן שיטתי. מספר מחקרים ניסו לעשות שימוש קווי עכבר להביע בסמן פלורסנטי גנטית בקידוד motoneuron (קו עכבר Hb9-GFP 18, צ&#39;אט-EGFP עכברים טרנסגניים המבטאים eGFP בתאים כולינרגית כולל motoneurons 19, או G85R SOD1-YFP עכברים טרנסגניים, אשר בתוקף להביע את החלבון היתוך YFP ב motoneurons 17). עם זאת, משום ביטוי הסמן הגנטי בדרך כלל מותנה בזמן ומאחר הפרוסות נלקחים בדרך כלל מעוברת או קטינים, הביטוי של הסמן לא יכול להיות נאות בגיל שנתי הTudy מתבצע. מחקרים אחרים השתמשו הזרקת סוכן מדרדרת לדמיין ברכת motoneuron 34. אנחנו גם בצענו זריקות בטאו רעלן הכולרה לתוך soleus או האד (התבוננות אישית). טכניקות תיוג כזה הן בעלי ערך רב לתייג ברכת motoneuron מסוימת אך דורשות ניתוח מייגע כמה ימים לפני הניסוי. יתר על כן, בגיל הצעיר שבו הניסויים הפרוסים נעשים, מקשה משמעותית למקד את השרירים במיוחד. לבסוף, קיים חשש ממשי perturbing motoneuron ידי הזרקת סוכן אקסוגניים. בתנאים אופטימליים הצלחנו להשיג פוטנציאל פעולה antidromic כמעט כל motoneurons המוקלט. זווית 35 ° בשימוש הוא קריטית להשגת שורשי גחון של אורך מספיק. לסיכום, בהכנת הפרוסה האלכסונית מציעה דרך מהירה ואמינה לזהות כל motoneuron, אשר עדיף על טכניקות זיהוי אחרות. כאמור במבוא, רק שני מחקרים דיווחו גירוי מוצלח של שורשי הגחון פרוסים רוחבי. המחקר הראשון רשם נוירונים צוואר רחם בחולדה והחיש את החומר הלבן שבו בדל שורש הגחון עולה 4. הם בהצלחה מושרה פוטנציאל פעולת antidromic ב 85% של הנוירונים המוקלטים. אנו מאמינים שיעור ההצלחה הגבוה שלהם הסתמך על העובדה כי ברמת צוואר הרחם, האקסונים somas של motoneurons נמצאים על אותו המישור. זהו לא המקרה פרוס זנב יותר. אפילו ברמת צוואר הרחם, הפרוסות הרוחביות שלהם רק שמר ספחים של שורשי הגחון, אשר הם פחות אמינים כדי לעורר. המחקר השני מגורה במגזר dorso-המותני עובר אפרוח 5. עם זאת, הם השתמשו הקלטת צבע רגישה מתח, אשר חסרה את הרזולוציה המרחבית כדי לציין את ההצלחה של גרימת פוטנציאל פעולת antidromic ברמת התא הבודדה. preparat הפרוסה שלנויון גם מציע דרך מעולה כדי לעורר תאי Renshaw כאמורים אחרון בעיתון 28. שימוש פרוסות האלכסוניות, הם הצליחו להקליט תגובות monosynaptic תאי רנשו ב -46% מהמקרים, שהיה שיפור גדול משיעור ההצלחה 10% נתקלו באמצעות פרוסות רוחביות 35. למרות שאנחנו לא יכולים למצוא השוואה דומה עבור הגירוי של ברכות motoneuron, תצפית זו בתא Renshaw מובילה אותנו להאמין כי motoneurons גם לשמור יותר קישוריות. חיתוך אלכסוני של חוט השדרה הוא טכניקה מאוד תובענית שדורשת להתאמן הרבה לפני קבלת הכנה מהימנה שממנה אפשר להקליט. שימוש מאוד פינצטה בסדר וחד מיקרו מספריים חיוני. השעה בילתה לנתח יכולה להיות ארוכה למדי (עד שעת 1) כל עוד ההליך כולו מתנהל במדיום לנתיחה מקורר-מבעבע carbogen. בעוד כמה מחברים לא הכירו שום תועלת של perfusio intracardiacn בהכנת פרוסות 36, החלטנו לשמור על שלב זה של ההליך. קשה למדוד את התועלת אובייקטיבית של זלוף intracardiac על איכות ההקלטות, במיוחד כי זה משתנה עם גיל. הגורם הקריטי ביותר הוא גיל העכבר. הקלטנו בהצלחה מעכברים בין P2 ו P11 באמצעות פרוטוקול לעיל. מעבר לגיל זה, את המיאלין חוט השדרה הופך צפוף מדי והתא הגדול (את motoneurons) למות לפני החיתוך, ככל הנראה בשל מחסור בחמצן. לאחר בחלון זה, מצאנו אותו יותר ויותר קשה להשיג פרוסות בריאות. לאחרונה, טכניקות חדשות דווחו להשיג פרוסות בריאות בחי מבוגרים 17,36. הם השתמשו תוספים מיותרים עד בינוני לנתח והקלטה שלהם כגון מקורות משלימים של אנרגיה (אתיל-פירובט), + Na נמוך Cl - ריכוזי למנוע oncosis של תאים 37,38 ו פוליאתילן גליקול להגביל את EFFects של transections הקרום הנרחב המתרחשים במהלך חיתוך. בעזרת שיפורים אלה, הם הצליחו להקליט עד 6 חיות בן חודש. בעתיד זה יהיה מעניין לנסות הכנות פרוסות אלכסוניות בבעלי חיים בוגרים כדי לשלב את היתרונות של שתי השיטות. שילוב שני פרוטוקולים צריך להוכיח קל יחסית ויספק כלי אמין כדי לאשר את זהות motoneuron וללמוד האוכלוסייה הממוקדת בביטחונות האקסון של motoneurons בעכברים בוגרים. בנוסף, אפשר לנסות להשיג פרוסות אלכסוניות בתוך העכבר עובר. ראוי לציון, ההכנה שלנו גם שומרת על השורשים מגבים, אשר יכול להיות מגורה ללמוד את monosynaptic ההפעלה לי עצבוב אל motoneurons, כמו גם ההפעלה של אוכלוסיות נוירונים בחוט הגבה שדרה. לסיכום, גירויי שורש גחון מציעים כולים אמינים כדי לאשר את זהות motoneuron וללמוד האוכלוסייה הממוקדת בביטחונות האקסון motoneuron. &lt;/ P&gt;

מבחינה היסטורית, הקלטות motoneuron באמצעות אלקטרודה חדה נערכו in vivo על בעלי חיים גדולים כגון חתולים או חולדות 1 או על חוט השדרה כולו מבודד בעכברים 2. הופעה של טכניקת הקלטת תיקון- clamp במהלך 1980, קרא גישה ישירה אל motoneuron somas איטום צריך להיות מושגת תחת הנחיה חזותית. לפיכך, הכנת פרוסת חוט השדרה הושגה בקלות מאז תחילת שנות 1990 3. עם זאת, להכנת פרוסה מוקדם לעתים קרובות לא מאפשרת הגירוי של שורשי הגחון. למיטב ידיעתנו, רק שני מחקרים דיווחו גירוי מוצלח של שורשי הגחון פרוסים רוחבי, ואף אחד הושג מעכברי 4,5. במאמר זה אנו מציגים טכניקה כדי להשיג פרוסות חוט השדרה קיימא של עכברים בילוד (P2 - P11) שבו הבריכה motoneuron שומרת אקסונים היוצאים שורש הגחון שלה. לפרוקגירוי שורש RAL מפעיל פוטנציאל פעולת antidromic בחזרה somas על ברכת motoneuron יציאה מאותו שורש הגחון. זה גם מלהיב את המטרות בטחונות motoneuron, motoneurons האחר 6-10 ותאי Renshaw 11-13. מאז רק motoneurons לשלוח האקסונים שלהם למטה השורשים הגחון, אנו משתמשים הקלטה של פוטנציאל פעולה antidromic כדרך פשוטה סופי physiologicaly לזהות motoneurons 10. בנוסף לשימוש פוטנציאלי הלא כלול או מטעה קריטריונים אלקטרו וצורני כדי לוודא את זהותו motoneuron, מחקרים שנעשו לאחרונה על motoneurons חוט השדרה הסתמך גם על 16 מייגע זמן רב פוסט הוק stainings. זיהוי כאלה בדרך כלל מבוצע רק על מדגם של התאים המוקלטים. באסטרטגיות זיהוי אחרים מסתמכים על קווי עכבר שבה motoneurons להביע הקרינה אנדוגני <sup&gt; 17-19. עם זאת, באמצעות סמנים מקודדים גנטי עלול להיות קשה בגיל צעיר כאשר ביטוי סמן עדיין משתנה או אם המחקר כבר דורש באמצעות קו עכבר מהונדס. לחלופין, הקלטות פוטנציאל פעולת antidromic יכולות להתבצע באופן שגרתי על כל העכברים מתחיל הקלטת תא. מבצעי ניסוי עובדים על הכנות חוט שדרה שלמות של החתול, חולדה ועכבר, משתמשים באופן מהימן טכניקות זיהוי כאלה מאז 1950 1,2,20,21. בתנאים אופטימליים, הצלחנו לעורר פוטנציאל פעולה antidromic מן כמעט כל motoneurons מוקלט. יתר על כן, גירוי שורש גחון יכול לשמש כדי להלהיב motoneurons האחר מהימן 22,23 או המטרות שלהם. 10,24,25 התאים Renshaw. אנו מציגים כאן יישומים של גירוי שורש הגחון בצורת הקלטות פוטנציאל פעולת antidromic מ motoneuron somas, וכן עירור של תאי רנשו.

<table >
	<tbody>
		<tr >
			<td >Na-kynurenate</td>
			<td >ABCAM</td>
			<td >ab120256</td>
			<td >dissolves better then other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >KCl</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaH2PO4</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sucrose&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaHCO3&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CaCl2&#160;</td>
			<td >G Biosciences</td>
			<td >R040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MgCl2&#160;</td>
			<td >Quality Biological</td>
			<td >351-033-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >glucose&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ascorbic acid&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Na-pyruvate&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P2250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >K-gluconate&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P1847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EGTA&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaCl</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX-314</td>
			<td >Alomone</td>
			<td>Q150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mg-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td >A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CsOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td >232041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Na-GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td >51120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >gluconic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td >G1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cesium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td >232041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td >P5958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vannas Spring Scissors - 2.5mm&#160;</td>
			<td >FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stimulator</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td colspan="2">Isolated Pulse Stimulator Model 2100</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vibratome</td>
			<td >Campden</td>
			<td >Vibrating Microtome 7000 - Model 7000smz-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation

קלטות אלקטרו מתוך פרוסות חוט שדרה הוכיחו להיות טכניקת ערך לחקור מגוון רחב של שאלות, מן הסלולר מאפייני רשת. אנחנו מראים איך להכין פרוסות קיימא אלכסוניות של חוט השדרה של עכברים צעירים (P2 - P11). בהכנה זו, motoneurons לשמור האקסונים שלהם יוצאים מן שורשי הגחון של חוט השדרה. גירוי של אקסונים אלה מעורר גב הפצת פוטנציאל פעולה פולש somas motoneuron ומרגשים בטוחות motoneuron בתוך חוט השדרה. הקלטה של ​​פוטנציאל פעולה antidromic היא דרך מיידית, מוחלטת ואלגנטית לאפיין זהות motoneuron, אשר עולה שיטות זיהוי אחרות. יתר על כן, מגרה בטוחה motoneuron היא דרך פשוטה ואמינה כדי להלהיב את המטרות בטחונות של motoneurons בתוך חוט השדרה, כגון motoneurons אחר או Renshaw תאים. בפרוטוקול זה, אנו מציגים הקלטות antidromic מן motoneuron somas וכן עירור התא Renshaw, הנובע גירוי שורש הגחון.

אישור של זהות Motoneuron שימוש פוטנציאל פעולה Antidromic מיקוד נייד Motoneurons נמצאים צופר הגחון (גלוי באדום באיור 2C). התחל מהצרור של אקסונים להרכיב שורש הגחון וללכת עד הצרור מפזר באופן מלא ואחד מתחיל לראות את תא גדול (ציר soma הארוך, מעל 20 מיקרומטר). להשיג הקלטה כל תא של תא עגול ובריא באמצעות אלקטרודה ההתנגדות הראשונית של 3 עד 4 MΩ. הפתרון הפנימי שימוש הכיל: 140 מ&quot;מ K-גלוקונאט, 6 KCl מ&quot;מ, 10 מ&quot;מ HEPES, 1 מ&quot;מ EGTA, 0.1 מ&quot;מ CaCl 2, 4 מ&quot;מ Mg-ATP, 0.3 מ&quot;מ Na 2 GTP. התאם את ה- pH ל -7.3 עם KOH, ואת osmolarity ל 285 - 295 mOsm על ידי הוספת מים מזוקקים. <stronאישור g&gt; של זהות motoneuron לאחר הקלטת כל תא מושגת, להחיל גירוי biphasic יחיד של השורש הגחון (1 - 50 V, 0.1 - 0.3 msec) כדי לעורר פוטנציאל פעולה antidromic בתאים רשמה של חוט הגחון דמויות 3A1 ו 3A2 תכנית פעולה antidromic. פוטנציאלים ב-מהדק מתח או מהדק נוכחי, בהתאמה. כאשר מגדילים את עוצמת הגירוי בין 1 ל -5 V (איור 3A1) ו מ -10 ל -15 V (איור 3A2) פוטנציאל הפעולה antidromic מופיע בצורה כל-או-כלום עם חביון של 0.9 msec ו -1.1 msec, בהתאמה. בהתחשב בכך motoneurons רק לשלוח האקסונים שלהם דרך השורשים הגחון, פוטנציאל הפעולה antidromic הוא הוכחת זהות התא. במיעוט motoneurons (כ -10%), גירוי שורש הגחון נכשללעורר פוטנציאל פעולה antidromic אלא שהושרו פוטנציאל פעולה orthodromic. דמויות 3B1 ו 3B2 להראות פוטנציאל פעולה orthodromic מתח מהדק או מהדק הנוכחית, בהתאמה. כאשר מגדילים את סטימולציה 20 כדי 30 V (איור 3B1) ומ 25 כדי 40 V (איור 3B2), פוטנציאל פעולה מופיע, בעקבות פוסט סינפטי נוכחי מעורר קודם (EPSC) או מעוררי פוסט סינפטי פוטנציאל (EPSP). השהיות של פוטנציאל הפעולה ארוכות (5.1 msec ו -5.3 msec, בהתאמה). בשני תאים אלה, מגרה את שורש הגחון עורר עירור feed-קדימה (motoneurons לשלוח בטחונות האקסון לעצמם motoneurons אחרים) כי היה חזק מספיק כדי לעורר פוטנציאל פעולה orthodromic. בתאים כאלה, הכישלון לעורר פוטנציאל פעולת antidromic (מאופיינת האופנה שלה כל-או-כלום חביון קצר מ -5 msec) אינו מאפשר לנו להגיע למסקנה כי תאים אלה ar<html> motoneurons דואר. ראוי לציין, כי עוצמת הגירוי הדרוש כדי לעורר עירור feed-קדימה הוא גבוה יותר מאשר זה הדרוש כדי לעורר פוטנציאל פעולה antidromic. כל הגירויים המוצגים כאן הם 0.1 msec אבל לפעמים, גירוי ארוך יותר (עד 0.3 msec) עשוי להידרש כדי לעורר פוטנציאל פעולה antidromic. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig3.jpg" /> תגובות איור 3. Motoneuron כדי הגחון רוט גירוי A1: 1 V (זכר אדום) ו -5 V הגירויים (זכר שחור) A2:.. 10 V (זכר אדום) ו -15 V (זכר שחור) גירויים B1: 20 V (זכר אדום) ו -30 V (זכר שחור) גירויים . B2: 25 V (זכר אדום) ו -40 V (זכר שחור) גירויים. נקודות שחורות מצביעות עיתוי גירוי. ראשי חץ זוגי להדגיש את ההבדל latencies בין קוצים יָשָׁר ו antidromic.מ &#39;/ קבצים / ftp_upload / 54,525 / 54525fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. גירוי תא Renshaw מיקוד נייד תאי רנשו נמצאים צופר גחון 27,28. דמיינו את חבילות האקסון עם התערבות ההפרש לעומת זאת הדמיה (DIC) באמצעות 20X לבין מטרות 63X. התחל מהצרור של אקסונים להרכיב שורש הגחון וללכת עד אקסונים מתחילים להתפזר אך עדיין ניתן להבחין (איור 4 א, חיצים). כוון את התאים של גודל בינוני (כ 10 - 15 מיקרומטר קוטר, איור 4 א, ראשי חץ). להשיג הקלטה כל תא של תא עגול ובריא למראה באמצעות אלקטרודה ההתנגדות הראשונית של 5 עד 7 MΩ. בהתאם הניסוי, השתמשנו eiיס Cs + מבוסס או K + מבוססת פתרונות פנימיים 10. הפתרון המבוסס Cs מנע זרמי אשלגן גדולים אשר נראו סביב -45 mV. בניסויים מסוימים, אנחנו גם הוספנו 5 מ&quot;מ QX-314 לחסום את תעלות הנתרן האחראיות spiking בתא המוקלט. קל CS + מבוססי פתרון מכיל: 125 מ&quot;מ Cs-גלוקונאט, 5 מ&quot;מ QX-314 Cl, 10 HEPES מ&quot;מ, 10 מ&quot;מ EGTA, 1 מ&quot;מ CaCl 2, 4 מ&quot;מ Mg-ATP, ו -0.4 מ&quot;מ Na-GTP, עם pH מותאם 7.3 עם CsOH. K + מבוססי הפתרון צריך לשמש לאבחון, הוא voltage- ועדכן מהדק, תגובות תא Renshaw לגירוי שורש גחון בתנאים המתקרבות ככל האפשר אלה הפיסיולוגיים. פתרון זה מכיל: 125 מ&quot;מ K-גלוקונאט, 10 HEPES מ&quot;מ, 1 מ&quot;מ EGTA, 0.1 מ&quot;מ 2 CaCl, 4 מ&quot;מ Mg-ATP, 0.4 מ&quot;מ Na-GTP, עם pH מותאם 7.3 עם KOH. עוצמת הגירוי נעה בין 10 ל -100 V והמשך שלה נעה בין 50 ל 300 μsec. Bipo<html> פולסים Lar שימשו בכל המקרים. תגובת תאי Renshaw לגירוי שורש גחון גירוי של שורש הגחון מעורר את corelease של גלוטמט ואצטילכולין מן בטוחות motoneuron על גבי תאי רנשו 10. Feed-קדימה עיכוב בתיווך גאבא גליצין גם מגויס 10. איור 4B מציג תגובות הגירוי היחיד של שורש הגחון. התא נרשם מצב מתח- clamp עם פתרון מבוסס צזיום, ומתוחזק במתח של -45 mV. QX-314 בפתרון התאי מנע התא מפני ירי GABA ותגובות גליצין נחסמו על ידי gabazine מיקרומטר 3 ו -1 מיקרומטר סטריכנין, בהתאמה. הזרם הסינפטי פנימה באיור 4B הוא סכום של glutamatergic וזרמים ניקוטינית. <html> NT &quot;FO: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig4.jpg" /> גירוי תא איור 4. Renshaw משורש הגחון ת: תמונות של ברכת תא Renshaw רכשו באמצעות קבל אלכסוני באותה הפרוסה נלקחה ב שתי בהגדלה שונה (20X ו 40X מטרות). הערה האקסונים motoneuron מיזוג לתוך שורש הגחון (חץ). תאים המשוערים Renshaw מסומנים עם ראשי חץ. ברי סולם: 100 מיקרומטר A1, 50 מיקרומטר A2 B:. קלטות מהדק מתח של תא Renshaw בעקבות גירוי של (נקודה השחורה) שורש הגחון. העקב האדום הוא הממוצע של האפורים. מתח חזק נקבע ל -45 mV. QX-314 בפתרון תוך התאי מנע התא מפני ירי GABA ותגובות גליצין נחסמו על ידי gabazine מיקרומטר 3 ו -1 מיקרומטר סטריכנין, בהתאמה. נקודה שחורה מציינת עיתוי גירוי.com / קבצים / ftp_upload / 54,525 / 54525fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation at JoVE.com

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

אנחנו מראים איך להכין פרוסות אלכסוניות של חוט השדרה בעכברים צעירים. הכנה זו מאפשרת גירוי של שורשי הגחון.

הכנת פרוסות קורד אלכסון שדרה עבור גחון רוט גירוי

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

the-preparation-oblique-spinal-cord-slices-for-ventral-root

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.4K Views.  Centre de Neurophysique, Physiologie et Pathologie, Université Paris Descartes.  אנחנו מראים איך להכין פרוסות אלכסוניות של חוט השדרה בעכברים צעירים. הכנה זו מאפשרת גירוי של שורשי הגחון. 

Video: The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

חוט השדרה Electrophysiology II: ייצור תאי אלקטרודה יניקה

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

הר הכנה שלמים של המבוגר תסיסנית עצבי חוט הגחון עבור הזרקת סיבים ענק דיי

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Preparation of Parasagittal Slices for the Investigation of Dorsal-ventral Organization of the Rodent Medial Entorhinal Cortex

Computation in the brain relies on neurons responding appropriately to their synaptic inputs. Neurons differ in their complement and distribution of membrane ion channels that determine how they respond to synaptic inputs. However, the relationship between these cellular properties and neuronal function in behaving animals is not well understood. One approach to this problem is to investigate topographically organized neural circuits in which the position of individual neurons maps onto information they encode or computations they carry out1. Experiments using this approach suggest principles for tuning of synaptic responses underlying information encoding in sensory and cognitive circuits2,3.
The topographical organization of spatial representations along the dorsal-ventral axis of the medial entorhinal cortex (MEC) provides an opportunity to establish relationships between cellular mechanisms and computations important for spatial cognition. Neurons in layer II of the rodent MEC encode location using grid-like firing fields4-6. For neurons found at dorsal positions in the MEC the distance between the individual firing fields that form a grid is on the order of 30 cm, whereas for neurons at progressively more ventral positions this distance increases to greater than 1 m. Several studies have revealed cellular properties of neurons in layer II of the MEC that, like the spacing between grid firing fields, also differ according to their dorsal-ventral position, suggesting that these cellular properties are important for spatial computation2,7-10.
Here we describe procedures for preparation and electrophysiological recording from brain slices that maintain the dorsal-ventral extent of the MEC enabling investigation of the topographical organization of biophysical and anatomical properties of MEC neurons. The dorsal-ventral position of identified neurons relative to anatomical landmarks is difficult to establish accurately with protocols that use horizontal slices of MEC7,8,11,12, as it is difficult to establish reference points for the exact dorsal-ventral location of the slice. The procedures we describe enable accurate and consistent measurement of location of recorded cells along the dorsal-ventral axis of the MEC as well as visualization of molecular gradients2,10. The procedures have been developed for use with adult mice (&gt; 28 days) and have been successfully employed with mice up to 1.5 years old. With adjustments they could be used with younger mice or other rodent species. A standardized system of preparation and measurement will aid systematic investigation of the cellular and microcircuit properties of this area.

We describe procedures for preparation and electrophysiological recording from brain slices that maintain the dorsal-ventral axis of the medial entorhinal cortex (MEC). Because neural encoding of location follows a dorsal-ventral organization within the MEC, these procedures facilitate investigation of cellular mechanisms important for navigation and memory.

הכנת פרוסות Parasagittal לחקירת ארגון הגבי-הגחוני של הקורטקס המדיאלי מכרסמים entorhinal

Computation in the brain relies on neurons responding appropriately to their synaptic inputs. Neurons differ in their complement and distribution of ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

חיתוך רוחב חוט השדרה בדג הזברה הזחל

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

נוהל השתלה קאמרי בעמוד השדרה לאורך<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של כבל עכבר השדרה

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information regarding glial activities at the cellular and molecular levels has been obtained through in vitro cell culture systems. The in vitro systems utilized, mainly include primary glia derived from neonatal brain cortical tissue and immortalized cell lines. However, these systems may not reflect the characteristics of spinal cord glial cells in vivo. In order to further investigate the roles of spinal cord glial cells in the development of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain using a culture system that better reflects the in vivo condition, our laboratory has developed a method to establish primary spinal cord mixed glial cultures from adult mice. Briefly, spinal cords are collected from adult mice and processed through papain digestion followed by myelin removal with a density-gradient medium. Single cell suspensions are cultured in complete Dulbecco&#39;s modified Eagle media (cDMEM) supplemented with 2-mercaptoethanol (2-ME) at 35.9 oC. These culture conditions were optimized specifically for the growth of mixed glial cells. Under these conditions, cells are ready to be used for experimentation between 12 - 14 d&#160;(cells are usually in log phase during this time) after the establishment of the culture (D 0) and can be kept in culture conditions up to D 21. This culture system can be used to investigate the responses of spinal cord glial cells upon stimulation with various substances and agents. Besides neuropathic pain, this system can be used to study glial responses in other diseases that involve pathological changes of spinal cord glial cells.

The development of neuropathic pain involves pathological changes of spinal cord glial cells. A reliable glial culture system derived from adult spinal cord tissue and designed for studying these cells in vitro is lacking. Therefore, we show here how&#160;to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue.

הכנת תרבויות גליה מעורבת ראשיים מרקמות קורד למבוגרים עכבר השדרה

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may result in damage to the spinal cord caused by the dissection process. Here, we show how the spinal cord can be extruded using hydraulic pressure. Handling time is significantly reduced to only a few minutes, likely decreasing protein damage. The low risk of damage to the spinal cord tissue improves subsequent immunohistochemical analysis. By performing hydraulic spinal cord extrusion instead of traditional laminectomy, the rodents can further be used for DRG isolation, thereby lowering the number of animals and allowing analysis across tissues from the same rodent. We demonstrate a consistent method to identify and isolate the DRGs according to their localization relative to the costae. It is, however, important to adjust this method to the particular animal used, as the number of spinal cord segments, both thoracic and lumbar, may vary according to animal type and strain. In addition, we illustrate further processing examples of the isolated tissues.

Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage.

שחול הידראולי של קורד ובידוד השדרה של גרעיני שורש הגבה במכרסמים

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

זברה<em&gt; באתרו</em&gt; הכנת בחוט השדרה עבור הקלטות אלקטרו מתוך השדרה חושית הנוירונים המוטוריים

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms underlying sensory transmission, nociceptive regulation, and chronic pain or itch development. Implementations of electrophysiological recordings together with morphological studies based on the utility of acute spinal cord slices have further improved our understanding of neuronal properties and the composition of local circuitry in SG. Here, we present a detailed and practical guide for the preparation of spinal cord slices and show representative whole-cell recording and morphological results. This protocol permits ideal neuronal preservation and can mimic in vivo conditions to a certain extent. In summary, the ability to obtain an in vitro preparation of spinal cord slices enables stable current- and voltage-clamp recordings and could thus facilitate detailed investigations into the intrinsic membrane properties, local circuitry and neuronal structure using diverse experimental approaches.

Here, we describe the essential steps for whole-cell patch-clamp recordings made from substantia gelatinosa (SG) neurons in the in vitro spinal cord slice. This method allows the intrinsic membrane properties, synaptic transmission and morphological characterization of SG neurons to be studied.

הכנה של חוט השדרה חריפה פרוסות תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטה בנוירונים הסובסטנציה Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...