אנו מודים לורה Bampton, אלכס דוידסון, ריצ&#39;רד פרטון, אריטה Acharya לסיוע במהלך תקופת ההכנה של כתב היד הזה; מריאנה וולפנר לדיונים על הפעלת ביצה; מאט Wayland לתמיכת הדמיה; ונאן הו עבור תמיכה כללית במעבדה. עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת קיימברידג &#39;, ISSF כדי TTW [מספר מענק 097,814].

הערה: ביצוע כל הצעדים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. 1. הכנה לנתיחה הערה: השלבים המתוארים כאן הם בהתאם E. Gavis, אוניברסיטת פרינסטון &amp; וייל et. al. 18. בצע את השלבים הבאים יומיים לפני הדמיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח בקבוקון זבוב המכיל כ 10 מיליליטר של מזון מוצק להוסיף כמות קטנה של שמרים יבשים לאחד בפינה, פחות מ 1 גרם מספיק. הערה: לקבלת מידע אודות בקבוקונים לטוס או מזון לראות &quot;תסיסנית תחזוקה &#39;19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1 - 3 טיפות של מים כדי ללחלח את השמרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הבקבוקון הצידה בזווית של 45 מעלות ולאפשר 3 - 5 דקות על השמרים כדי לקחת את המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד שמרים סופג את המים, בחר בקבוק זבובים להביע GCaMP5 MYR UASt- 20 מונע על ידי אמבט-VP16GAL4 (המכונה GCaMP5) שצצו לאחרונה (א myristoyטופס lated של GCaMP5 נבחר לספק אות גבוהה יחס רעש דרך קושר את Geci הקרום בתוך הביצה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש את הזבובים בבקבוק עם גז CO 2. הקפד לשמור את הבקבוק הפוך כדי לא לאבד זבובים במזון הרטוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצת הזבובים מורדמים על כרית CO 2 ולמיין 10 - 15 נקבות ו 5 זכרים באמצעות מכחול תחת מיקרוסקופ לנתח. הערה: זהו תקן לכלול זכרים לספק נקבות בריאות לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר את הבקבוקון משלב 1.3 מוכן, מוסיף את הזבובים שנבחרו כדי הבקבוקון. תשמור על עצמך כדי לשמור על אופקי הבקבוקון עד הזבובים להיות פעילים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצנצנת על 25 מעלות צלזיוס למשך כ 36 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את הזבובים הנותרים מפנקס CO 2 על הבקבוק או שנזרק. </li></ol> 2. השחלות תסיסנית ביתור הערה: השלבים המתוארים כאן הם בהתאם וייל et. אל. <sעד&gt; 18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 36 שעות, לטשטש הזבובים מבקבוקון yeasted עם 2 CO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזבובים בתוך הבקבוקון מורדמים להטות אותם על כרית 2 CO להיות מסודר עם מברשת צבע תחת מיקרוסקופ לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר נקבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד שתי השחלות מן הנקבה. עבור פרוטוקול מפורט מלא לראות וייל et. al. 18. לסיכום: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום טיפה קטנה של שמן halocarbon מחומצן (סדרה 95) על מס &#39;1.5, 22 x 40 מ&quot;מ coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחוז הנשי עם מלקחיים על הקדמי של הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזקת הנקבה תחת מיקרוסקופ לנתח, להשתמש בקבוצה השנייה של מלקחיים כדי להסיר את האחוריים של הנקבה בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב את הרקמה האחורית מן המלקחיים השניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוחט על חלל הבטן עם המלקחיים השניים מן הקדמי אל האחורי של הבטן. שתי ההשחלות האטומות צריכות לדבוק המלקחיים כשבחוץ של FEMAle. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גע השחלות לתוך השמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל רקמה מן המלקחיים על ידי מנגב את המלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים אלה (2.4.1 - 2.4.7) כדי להשיג שלוש coverslips, כל שחלות המכילות בין זבוב אחד. </li></ol></li></ol> 3. בידוד פרט ביציות בשלות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח סטנדרטי עם ההגדלה מוגדרת 4X, על coverslip הראשון משלב 2.4, להפריד בין שתי שחלות ידי קריעת oviduct. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג זוג מלקחיים סגורים למרכז בשחלה אחת, נזהר שלא לנקב כל תאי ביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כנס חללי לנתח סטנדרטי למרכז השחלה ליד המלקחיים הסגורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לגרור החללית לנתח דרך השחלה לכיוון בקוטב האחורי, שבו הביציות הבשלות (שלב 14 תאי ביצה) ממוקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1 - 3.4 2 - 5 פעמים בהתאם לגודל של השחלה ומספר הביצים. הערה: תוספת של CO 2 </sub&gt; בדרך כלל גורם בתצהיר של ביצה אחת אשר תופיע גדול עם נספחים הגבו עלה מאשר ביצים טרום שהופקד. ביצה זה אמור להיות מושלך הדמיה שכן הוא כבר הופעל בתוך גוף הנקבה. הערה: ביציות בשלות צפויות להפריד בקלות מן הרקמה החיבורית שחלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אין ביציות בשלות גלויות מחוץ השחלה, להמשיך מתגרה בעדינות עם החללית לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הביציות הבשלות גלויות על coverslip מחוץ השחלה, לתמרן 3 - 5 בשורה במרכז coverslip. הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הפעל את החללית בעדינות לאורך הצד של הביצים. הערה: הימנע משיכת הנספחים הגבי כמו זה יכול לגרום נזק ביצה. הערה: בהתאם הגדרת הדמיה בעתיד, ליישר את הביצים כ 200 מיקרומטר בנפרד בניצב coverslip לאזור הדמיה מקסימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מיושר, להסיר את שאר רקמת השחלה על ידי גרירתו מן הביצים מיושר באמצעות forceps. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר עודף שמן בטופחו עם הפינה של רפואי לנגב. היזהר שלא לגעת ביציות בשלות עם רפואי לנגב ביציות בשלות כמו כי הם פנו יאבדו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר crosshair על coverslip בטוש לפשט איתור המדגם תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את coverslip במקום בטוח ולהשאיר את תאי ביצה המוכנים על coverslip לנוח 5 - 10 דקות. זה מאפשר את הביצה להתיישב שמן. דוגמאות ניתן להשתמש עד 1 שעות שלאחר הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1 - 3.11 עבור שאר coverslips עם שחלות עליהם. </li></ol> 4. הכנות לקראת הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביא חיץ הפעלה מוכן 15 לטמפרטורת חדר. הערה: חיץ ההפעלה היא חיץ hypotonic: 3.3 מ&quot;מ לאא 2 4 PO, 16.6 מ&quot;מ KH 2 4 PO, 10 mM NaCl, 50 מ&quot;מ KCl, 5% פוליאתילן גליקול 8000, 2 מ&quot;מ CaCl 2, הביא 6.4 pH עם 1: יחס 5 של NaOH: KOH.לפרטים נוספים, ראה Mahowald, 1983 15. Aliquots של חיץ הפעלה יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך חודשים על 4 מעלות צלזיוס עד 2 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להעביר coverslips מוכן, חיץ הפעלה טפטפות זכוכית למתקן הדמיה. הערה: שדה רחב, confocal, דיסק מסתובב או מיקרוסקופ גיליון האור יכול לשמש. אנו ממליצים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. תוצאות הנציג שלנו התקבלו באמצעות מיקרוסקופ confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אובייקטיבי מתאים הדמיה ביצית בשלה כולו צריך להיבחר (כאן: 20X 0.7 NA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר coverslip המוכן הראשון על במת מיקרוסקופ. יש להיזהר שלא לשבור את coverslips על הבמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איכותי לבחור שדה הראייה עם תא ביצית בשלה עבור הפעלה. האם לא תאי ביצה נקבה תמונה או בעלי blebbing בקרום. הערה: צעדים 4.6 - 4.7, פקודות תוכנה תשתנינה בהתאם מיקרוסקופ ויצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פסק הדמית גדרמטרים עבור עירור GFP רגיל (488 ננומטר) ופליטה (500 - 580 ננומטר). גם הקים נוף שדה בהיר כדי לחזות להתמצא הביצה הבוגרת ושמן עקור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את Z-המטוס הנמוך ביותר שבו ביציות בשלות גלויות ולהגדיר Z-מחסנית מלאה להילקח עבור 40 מיקרומטר בכ 2 מיקרומטר לכל צעד. הגדר את הפרמטרים כך שאין עיכוב בין רכישת מחסנית Z. הגדר את סדרת הזמן לתפוס כ -30 דקות. </li></ol> 5. הפעלת ביצת גופיים הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל לכידת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכו 1 - מלא 2 Z- ערימות להירכש. זו מציגה את הביצית בשלה לפני ההפעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למשוך כ 300 μl של חיץ ההפעלה לתוך פיפטה מזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיצוב קצה פיפטה זכוכית המכיל חיץ ההפעלה בזווית של 45 מעלות מעל coverslip, לאט להזיז את פיפטה לתוך נתיב קרן עד שהוא ממש מעל להיות הדמיה ביצית בשלה. פיפטה הזכוכית צריכה2 ס&quot;מ מעל שמן - 1 להיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1 - 2 טיפות של חיץ ההפעלה בתוך פחות מ -5 שניות מן פיפטה מזכוכית. זה אמור לתפוס את השמן. להימנע מהוספת חיץ הפעלה עודפת או נגיעת הביצה עם פיפטה הזכוכית כפי שהוא יכול לגרום לעקירה של הביצית בשלה. יש להיזהר שלא לגעת coverslip עם פיפטה כמו זה יכול לגרום לשינוי בועות מטוס או אוויר מוקדי להיווצר שמן טבילה בין המטרה לבין coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך הוספת חיץ הפעלה במהלך רכישת תמונה, בדוק את הערוץ בהיר שדה כדי להבטיח שהשמן הוחלף על ידי חיץ ההפעלה. הערה: זה יהיה ראשון להופיע כצל בשל פיפטה שבירה נתיב הקרן אלא גם יגרום להופעת טיפות שמן זעירות. כמה טיפות שמן יכול להישאר הקשורים ביצית בשלה שישפיע תוצאות הניסוי ואיכות תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם השמן לא שנעקר מהתוספת הראשונית של חוזרי חיץ הפעלת צעדי 5.4 - 5.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השמן הוא עקור בהצלחה, לאפשר הסדרת הזמן לרוץ עד לסיום. הערה: בשל נפיחות של ביציות בכל הפעלה, כמה תאי ביצה יעברו בדרמתיות מעל מישור המוקד או שדה הראייה על תוספת של חיץ הפעלה. במצב זה, להפסיק את הרכישה ואת הר coverslip הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר רצף התמונה השלים רכישה, לשמור את הנתונים. </li></ol> 6. לאחר רכישת עיבוד תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את מערך הנתונים באמצעות פיג&#39;י (http://fiji.sc/Downloads#Fiji), או תוכנת עיבוד תמונה שווה ערך, ובחר את הקבצים הרלוונטיים לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבנות השלכה של הנתונים רכשו לבחור: תמונה&gt; סטאקס&gt; Z-פרויקט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פרוסה-Z התחלת א-פרוסת Z תחנה, בדרך כלל הקטע השלם. בחר סוג הקרנה, בדרך כלל מוגדר &#39;מקס עוצמה &quot;. בדוק תיבת הסימון &#39;בכל הזמנים Frames&#39; כדי להחיל את ההגדרות שנבחרו לסדרה כולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אםיותר מערוץ ניאון אחד כבר צילמו, השתמש בכלי ערוצים לאפשר תנועה בין צבעים, לבצע מרוכבים, או להפוך את גווני האפור בתמונה. כלי תמונה&gt; צבעים בוחרים&gt; ערוצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתאים את בהירות התמונה ו בניגוד תמונה בחר&gt; התאם&gt; בהירות / ניגודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייצא תמונה אחת, להעביר מחוון זמנים למסגרת רלוונטית בחר File&gt; Save As&gt; Jpeg, או כל פורמט מועדף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מיקום וכותרת עבור הקובץ המיוצא, ולאחר מכן שמור. הערת קצב הפריימים מתוכנת ההדמיה יידרש לתת חותמת זמן על התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייצא את סדרת הזמן כסרט לבחור: File&gt; Save As&gt; AVI, ולאחר מכן בוחר קצב פריימים (~ 7 פריימים לשניים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מיקום וכותרת עבור הקובץ המיוצא, ולאחר מכן שמור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור את הקובץ המותאם בפורמט פיג&#39;י, בחר File&gt; Save. </li></ol>

<ol>
	<li>Stricker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+biology+of+calcium+signaling+during+fertilization+and+egg+activation+in+animals.">Comparative biology of calcium signaling during fertilization and egg activation in animals.</a> Dev Biol. 211 (2), 157-176 (1999).</li><li>Horner, V. L., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitioning+from+egg+to+embryo:+triggers+and+mechanisms+of+egg+activation.">Transitioning from egg to embryo: triggers and mechanisms of egg activation.</a> Dev Dyn. 237 (3), 527-544 (2008).</li><li>Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+free+calcium+wave+traverses+the+activating+egg+of+the+medaka,+Oryzias+latipes.">A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes.</a> J Chem Biol. 76 (2), 448-466 (1978).</li><li>Fujiwara, T., Nakada, K., Shirakawa, H., Miyazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+inositol+trisphosphate-induced+calcium+release+mechanism+during+maturation+of+hamster+oocytes.">Development of inositol trisphosphate-induced calcium release mechanism during maturation of hamster oocytes.</a> Dev Biol. 156 (1), 69-79 (1993).</li><li>Hafner, M., Petzelt, C., Nobiling, R., Pawley, J. B., Kramp, D., Schatten, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wave+of+free+calcium+at+fertilization+in+the+sea+urchin+egg+visualized+with+fura-2.">Wave of free calcium at fertilization in the sea urchin egg visualized with fura-2.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 9 (3), 271-277 (1988).</li><li>Fontanilla, R. A., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+sperm-induced+calcium+wave+in+Xenopus+eggs+using+confocal+microscopy.">Characterization of the sperm-induced calcium wave in Xenopus eggs using confocal microscopy.</a> Biophys J. 75 (4), 2079-2087 (1998).</li><li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology.">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J Physiol. 578, 55-67 (2007).</li><li>Douglass, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> New Techniques in Systems Neuroscience. , (2015).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Wang, J., Wong, A., Flores, J., Vosshall, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain.">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li><li>Kaneuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+waves+occur+as+Drosophila+oocytes+activate.">Calcium waves occur as Drosophila oocytes activate.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 791-796 (2015).</li><li>York-Andersen, A. H., Parton, R. M., Bi, C. J., Bromley, C. L., Davis, I., Weil, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+and+rapid+calcium+wave+at+egg+activation+in+Drosophila.">A single and rapid calcium wave at egg activation in Drosophila.</a> Biol Open. 4 (4), 553-560 (2015).</li><li>Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+activation+of+Drosophila+eggs.">In vitro activation of Drosophila eggs.</a> Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).</li><li>Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+meiotic+divisions+in+Drosophila+oocytes.">Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes.</a> Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).</li><li>Horner, V. L., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+by+osmotic+and+hydrostatic+pressure+activates+Drosophila+oocytes+in+vitro+in+a+calcium-dependent+manner.">Mechanical stimulation by osmotic and hydrostatic pressure activates Drosophila oocytes in vitro in a calcium-dependent manner.</a> Dev Biol. 316 (1), 100-109 (2008).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> J Vis Exp. (60), (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essentials+of+Biology+1:+yeast,+Drosophila+and+C.+elegans.+Drosophila+Maintenance.">Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance.</a> JoVE Science Education Database. , (2016).</li><li>Melom, J. E., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+a+NCKX+Eliminates+Glial+Microdomain+Calcium+Oscillations+and+Enhances+Seizure+Susceptibility.">Mutation of a NCKX Eliminates Glial Microdomain Calcium Oscillations and Enhances Seizure Susceptibility.</a> J Neurosci. 33 (3), 1169-1178 (2013).</li><li>Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+flows+powered+by+asymmetrical+contraction+transport+PAR+proteins+to+establish+and+maintain+anterior-posterior+polarity+in+the+early+C.+elegans+embryo.">Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo.</a> Dev Cell. 7 (3), 413-424 (2004).</li><li>Maruyama, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGG-3+regulates+cell-surface+and+cortex+rearrangements+during+egg+activation+in+Caenorhabditis+elegans.">EGG-3 regulates cell-surface and cortex rearrangements during egg activation in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 17 (18), 1555-1560 (2007).</li><li>Wong, G. K., Woods, M. A., Szymczak, R. K., Gavlik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+normal+actin+cytoskeletal+reorganization+affects+cell+cycle+time+in+fertilized+sea+urchin+eggs.">Disruption of normal actin cytoskeletal reorganization affects cell cycle time in fertilized sea urchin eggs.</a> Mol Biol Cell. 15, 23 (2004).</li><li>Horner, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+calcipressin+sarah+is+required+for+several+aspects+of+egg+activation.">The Drosophila calcipressin sarah is required for several aspects of egg activation.</a> Curr Biol. 16 (14), 1441-1446 (2006).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

The first critical step in this protocol is isolating the mature eggs without damage. This can be achieved by gentile maneuvering of the eggs with the dissecting probe. Practice will enable this manipulation to be executed without damage to the eggs. A second crucial step is avoiding the loss of the sample when activation buffer is applied to the mature egg in oil. Application of the activation buffer should be done slowly and without contact with the coverslip. This step can be challenging if the microscope set-up does not allow for an easy access to the sample. Moving axillary parts of the microscope, such as a temperature incubator, is advisable. 
Modifications to this protocol can be made in order to visualize other fluorescently tagged factors, instead of Ca2+ at egg activation. More generally, different stages of Drosophila development or the results of adding a different buffer could be analyzed using this protocol. 
Troubleshooting may be required if the settings on the microscope are not optimal for visualizing the signal from the sample. This can be achieved by increasing or decreasing the laser power, altering capture range and adjusting the Z-stack parameters. Another issue might be eggs consistently moving out of the field of view upon the addition of activation buffer. If this happens regularly, allow the mature eggs to settle on the coverslips for a longer period of time, 15 to 20 minutes. Beware that using a higher viscosity oil will alter the displacement of the oil by activation buffer. 
This technique presented here is limited by the working distance of the objective, dehydration of the mature eggs and the ability to dissect the mature eggs without damage. However, when compared to in vivo imaging methods where the mature oocyte passes through the adult female and is deposited 13, our method enables more spatial resolution, the option to physically manipulate the mature egg before activation and the ability to test the role of egg activation without fertilization. 
There are many potential future applications of this technique, including testing reporter constructs for cellular components at egg activation and visualizing the Ca2+ wave in mutant backgrounds 14,24. Together with experimental and genetic tools, the ex vivo egg activation assay presented here enables the study of the trigger, propagation and downstream effects of the universally conserved Ca2+ wave.

שינוי Ca 2 + ריכוז התאי על הפעלת ביצה (ביצית) הוא מרכיב משומר של כל היצורים שנחקרו 1,2. אירוע זה יוזם מגוון רחב של התהליכים התלויים 2+ Ca, כולל חידוש של מחזור התא ותרגום של mRNAs מאוחסן. בשל דרישה זו עבור Ca 2 +, לדמיין את השינויים החולפים בריכוזים תאיים Ca 2 + כבר עניין מפתח. מבחינה היסטורית, אורגניזמים מודל נבחרו מחקרים על הפעלת ביצה בהתבסס על גודל וזמינות של ביציהן. גישות להדמיה שונות כבר נוצלו לעקוב ולכמת שינויים התאי Ca 2 + ריכוזים במערכות אלה, ובכלל זה: aequorin photoprotein בדגי medaka 3; Ca צבעי ניאון 2 + רגישים כגון פורעה-2 ב קיפוד ים ו אוגר 4,5; וסידן ירוק-1-dextran ב Xenopus 6. הדור ושיפור אינדיקטורים סידן מקודדים הגנטי (GECIs) שינה את היכולת לדמיין Ca 2+ דינמיקת in vivo 7. הבונה הגנטית אלה באים לידי ביטוי ברקמות ספציפיות ולהגביל את צורך הכנות רקמות פולשנית 8. GCaMPs הוא חלבון פלואורסצנטי ירוקה (GFP) בכיתה מבוססת של GECIs שהיה מאוד יעיל, בשל הזיקה הגבוהה Ca 2+ שלהם, יחס אות לרעש ואת היכולת להיות מותאם אישית 9-11. בנוכחות של Ca 2 +, במתחם GCaMP עובר סדרה של שינויים מרחביים, החל עקידת Ca 2+ כדי calmodulin, שתוצאתה היא עוצמת פלורסנט מוגברת של רכיב ה- GFP 9. GCaMPs נעשה שימוש נרחב במחקר על נוירונים תסיסנית לדמיין שינויי סידן התאי 12. Applicati האחרונהעל הטכנולוגיה GCaMP לדמיין Ca 2 + ביצים תסיסנית בוגרת גילה גל יחיד Ca 2 + חולף על הפעלת ביצה 13,14. גל Ca 2+ ניתן דמיין בהגדלה נמוכה בזמן ביוץ in vivo 13 או בהגדלה גבוהה יותר באמצעות assay הפעלת vivo לשעבר 13,14. ב assay vivo לשעבר, ביציות בוגרות בודדות מבודדות מן השחלות והופעלו באמצעות פתרון hypotonic, המכונה חיץ הפעלה, אשר הוכח לשחזר את אירועי in vivo הפעלת 15-17. Assay vivo לשעבר זו מאפשר ויזואליזציה ברזולוציה גבוהה הקלה של גל Ca 2+ תחת תנאי ניסויים שונים כולל שיבוש תרופתי, מניפולציות פיסיות מוטציות גנטיות. מאמר זה מדגים הכנת ביצים תסיסנית בוגרת vivo לשעבר הפעלה הדואר עוקבת מיקרוסקופיה רגילה לחזות גל Ca 2+ באמצעות GCaMP. גישה זו יכולה לשמש כדי לבחון את החניכה ובקר על גל Ca 2 + ו לחקור תוצאות במורד זרם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="999">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dry active yeast</td>
			<td style="width:373px;">Fleischman&#8217;s</td>
			<td style="width:243px;">#2192</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>Various will work</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lamp</td>
			<td>Mircotec Fibre optic</td>
			<td>MF0-90</td>
			<td>Various will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Medical wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Corporation</td>
			<td>KLEW3020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Marker pen</td>
			<td>Stabilo</td>
			<td>841/46</td>
			<td>OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CO2 pad</td>
			<td>&#160;Genesee Scientific</td>
			<td>59-114 (789060 Dutscher)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slip No. 1.5, 22 x 50mm</td>
			<td>International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm</td>
			<td>Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;">Halocarbon oil, series 95</td>
			<td rowspan="2">Halocarbon Products Corp.</td>
			<td>Distributor in Europe:</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Solvadis (GMBH)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oil 10 S</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td align="right">24627.188</td>
			<td>Can be used instead of Halocarbon oil, series 95</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Probe</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10140-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass pipette</td>
			<td>Fisherbrand,</td>
			<td>FB50251</td>
			<td>Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150mm length&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vial</td>
			<td style="width:373px;">Regina Industries</td>
			<td style="width:243px;">P1014</td>
			<td>GPPS&#160; 80mm x 25mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging calcium in drosophila at egg activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

כאן אנו מדגימים כיצד להכין ביצים תסיסנית בוגרת הפעלת vivo לשעבר. ביצים להביע הדמיה לאפשר Geci של Ca 2 + הדינמיקה בבית ההפעלה ביצה ותחילת ההתפתחות העוברית (איור 1). יצוין כי בהתאם GCaMP בשימוש, במיוחד בנוכחות קבוצת myristoyl, תוצאות עשויות להיות הבדלים איכותיים קלים 13 14. יש לנו גם הפגין תפקיד עבור אקטין תפקודי במהלך הפעלת ביצה על ידי התוספת של מעכב פילמור יקטין, cytochalasin D, למאגר ההפעלה (איור 2) 14. דרישת שלד התא ב הפעלת ביצה נשמרת. ב C. elegans, לאחר הפריה, רכיבי cytoskeletal הם מחדש להכין את העובר-תא אחד לחלוקת הסימטרית הראשונה 21,22. בשנת קיפוד ים, שיבוש cytoskeletal-ארגון מחדש לאחר ההפעלה הוכח להשפיע על מחזור התא על ידי מניעת טבעת התכווצות היווצרות 23. תפקידיו של תקטין בתיווך גל Ca 2+ ותפקוד ההמשך שלה ב הפעלת ביצת תסיסנית נשארו הובהרו באופן מלא. ב תסיסנית, שיתוף להדמיה של שלד התא Ca 2 + גל אקטין יכולה להיות מושגת באמצעות assay ההפעלה vivo לשעבר זה. סדרת זמן של ערוצים מרובים ניתן לרכוש ודינמיקה של Ca התאי 2+ ניתן להתאים עם שינויים בארגון יקטין הביצית (איור 3). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig1.jpg" /> איור 1:. גל אחד Ca 2 + ב תסיסנית ביצה הפעלת סדרת זמן של vivo לשעבר בוגרת ביצה תסיסנית להביע UASt- myrGCaMP5 הבאים אddition של חיץ ההפעלה (AH). העלייה Ca ציטופלסמית 2+ מקורו בקוטב האחורי (ב &#39;) מתפשטת (BF) עם מהירות ממוצעת של כ -1.5 מיקרומטר / sec. ייזום של גל בדרך כלל הוא ציין בתוך 3 דקות של תוספת של חיץ ההפעלה. בעקבות ההפעלה, רמות סידן תאיים של ביצית בשלה חוזר טרום הפעלת רמות (G, H). ראה השלים סרט 1 (דקות בסה&quot;כ זמן 33). ברי סולם = 50 מיקרומטר. מקס הקרנה = 40 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig2.jpg" /> איור 2: תוספת של Cytochalasin D כדי הפעלת מאגר מדאיג Ca2 + גל רביה. סדרת זמן של vivo לשעבר בוגרת ביצה תסיסנית להביע UASt- myrGCaMP5 הבאים תוספת של חיץ ההפעלה המכיל 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל cytochalasin D הריכוז הסופי (AH). בעוד גל Ca 2+ הוא יזם בקוטב האחורי (א), זה נפגע ואינו להגיע הקדמי של הביצה (F) (ראשי החץ לבנים מציינים חלק הקדמי של הגל). אין עוד שינויי Ca 2 + נצפו למעלה מ -30 דקות). ראה השלים סרט 2 (דקות בסה&quot;כ זמן 30). ברי סולם = 50 מיקרומטר. מקס הקרנה = 40 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig3.jpg" /> איור 3: Co-להדמיה של אקטין Ca 2 + ב Eהפעלת gg תסיסנית. סדרת זמן של vivo לשעבר בוגרת ביצה תסיסנית להביע UASt- myrGCaMP5 (ציאן) ו UASp -f-Tractin.tdTomato (מגנטה) התוספת הבאה של חיץ ההפעלה (AH). גל Ca 2+ יוזם מהקוטב האחורי ומשחזר כמו באיור 1. תקטין נראה שינוי לאורך זמן, ראשי חץ לבנים (A נגד H). העדר זיהוי אותות Ca 2 + במרכז ביצית בשלה הוא עקב תנועה של המדגם במהלך לכידת תמונה. ברי סולם = 50 מיקרומטר. מקס הקרנה = 40 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation at JoVE.com

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

מאמר זה מתאר פרוטוקול לשעבר vivo להתאמה המאפשר הדמיה Ca 2+ במהלך ההפעלה ביצה תסיסנית.

סידן הדמיה ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; ב ביצת הפעלה

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

imaging-calcium-in-drosophila-at-egg-activation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

7.8K Views.  University of Cambridge.  מאמר זה מתאר פרוטוקול לשעבר vivo להתאמה המאפשר הדמיה Ca 2+ במהלך ההפעלה ביצה תסיסנית. 

Video: Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-הדמיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי עין

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

הדמיה זקופה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; לשכות ביצה

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, and allow for the study of the cellular and molecular basis of normal and abnormal cardiac morphogenesis. Recent emerging technologies of retrospective single clonal analyses make the study of cardiac morphogenesis at single cell resolution feasible. However, tissue opacity and light scattering of the heart as imaging depth is increased hinder whole-heart imaging at single cell resolution. To overcome these obstacles, a whole-embryo clearing system that can render the heart highly transparent for both illumination and detection must be developed. Fortunately, in the last several years, many methodologies for whole-organism clearing systems such as CLARITY, Scale, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB and PACT have been reported. This lab is interested in the cellular and molecular mechanisms of cardiac morphogenesis. Recently, we established single cell lineage tracing via the ROSA26-CreERT2; ROSA26-Confetti system to sparsely label cells during cardiac development. We adapted several whole embryo-clearing methodologies including Scale and CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis) to clear the embryo in combination with whole mount staining to image single clones inside the heart. The heart was successfully imaged at single cell resolution. We found that Scale can clear the embryonic heart, but cannot effectively clear the postnatal heart, while CUBIC can clear the postnatal heart, but damages the embryonic heart by dissolving the tissue. The methods described here will permit the study of gene function at a single clone resolution during cardiac morphogenesis, which, in turn, can reveal the cellular and molecular basis of congenital heart defects.

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

הדמיה הותרה עוברית ולבבות אחרי לידה ברזולוצית תא בודד

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

שיטות לבדיקת בלוטת לימפה hemocytes ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; דיסק העין

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

אין ויוו הדמיה של גיד השריר מורפוגנזה ב דרוזופילה הגלמים

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

ניתוח של Actomyosin בסולמות הסלולר והרקמה המקומית באמצעות הזמן- סרטים פקיעה של מתורבת ביצת ביצה צ'יימברס

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

הדמיה חיה וניתוח של התכווצויות שרירים בתוך העובר דרוזופילה

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

מפשיר Culturing, Cryopreserving שורות תאים דרוזופילה

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

סידן פלואורסצנטי הדמיה ובעקבות היברידיזציה באתרו לאפיון עצבי בלתי מבשר בקספוס זריזה

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...