מחברים במיוחד רוצה להודות ד&quot;ר פאולו פרחי, במחלקה כירורגית, רפואיים לפתולוגיה מולקולרית Critical Care Medicine, אוניברסיטת פיזה, למתן דגימות מח עצם ובקיאותו-אבות osteo אדם

הערה: לאחר הסכמה בכתב, דגימות HBM התקבלו במהלך ניתוח אורתופדי עבור החלפת מפרק הירך. מיד לאחר osteotomy בצוואר הירך ולפני הירך קודחות מזרק 20 מ&quot;ל המכיל 500 UI של הפרין, שימש לשאוב בע&quot;מ טריים. הפרוטוקול הוא ייחשב נרחב החלים על כל מקור בע&quot;מ. 1. בידוד של תאים mononuclear מח האדם עצם (HBM-MNCs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 5 - 10 מ&quot;ל של BM טרי 50 מ&quot;ל, החלת פתרון בופר פוספט של Dulbecco (D-PBS) ומערבבים על ידי היפוך. לא פחות להפיץ 25 מ&quot;ל בשני צינורות חרוטי חדש 50 מ&quot;ל, להוסיף 25 מ&quot;ל של D-PBS על צינור אחד ומערבבים על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הצינורות לעמוד במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר, להפרדת שברי עצם ושומן מפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות שומן צף עם ההשעיה תא פיפטה ולסנן פסטר סטרילית דרך 70 מיקרומטר מסננים מבלי להפריע גלולה שבר העצם. </li> &lt;li&gt; הגדר ארבעה צינורות 50 מ&quot;ל עם 15 מ&quot;ל של מדיום עבור צנטריפוגה שיפוע צפיפות רציפה (1.077 גרם / מ&quot;ל). ודא כי המדיום הזה הוא בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות שכבה 20 - 25 מ&quot;ל של בדילול BM על גבי בינוני שיפוע צפיפות. בצע פעולה זו בזהירות, לתת זרזיף השעית תא על קירות הצינור כדי למנוע שכבות ערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע צנטריפוגה שיפוע צפיפות ב 400 XG במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם הבלם נכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את הטבעת לבנבן של תאים הממוקמים בין שני השלבים בעזרת פיפטה פסטר סטרילי ולהעביר אותו צינור 50 מ&quot;ל טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם מדיום תרבות טרי: גלוקוז נמוך, אדום ללא פנול (1,000 מ&quot;ג / ליטר) הבינוני הנשר השונה של Dulbecco (DMEM), 10% (v / v) ואקווה א.ב. בסרום סוג האדם (PhABS), 2 מ&quot;מ L- גלוטמין ו אנטיביוטיקה (DMEM / 10% PhABS). צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant מחדש להשעות גלולה ב 5 - 10 מ&quot;ל של DMEM טריים / 10% PhABS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך ספירת תאים.לקבוע את מספר תאי הדם הלבנים ע&quot;י 1: 1 דילול trypan. זה החל על hemocytometer, ולבחון תחת מיקרוסקופ לעומת שלב. אל תכלול אריתרוציטים קטן ומעוגל מושלם ותאים מתים כחולים מוכתם מן ספירת התאים. הערה: מומלץ מאוד כדי אצוות מסך PhABS לביצועים שלהם בהחלמה MPC. PhABS ממקורות ארה&quot;ב נתן תוצאות הטובות ביותר בעוד רוב סר ממוצא שונה הביא תרבויות MPC עם אחוזים גבוהים של תאי MSC הדמויים. </li></ol> בידוד 2. של MPCs מ-MNCs HBM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר צלוחיות T-75 הידרופובי עם 15 מ&quot;ל של PhABS טרי DMEM / 10% ולתת לאזן pH וטמפרטורה ידי הדגירה טרום ב 37 ° C ב 5% CO 2 למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 זרע - 6 x 10 7 HBM-MNCs לכל בקבוק לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 למשך 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולזרוק תאים בינוניים שאינם חסיד צלוחיות. הוסף 15 מ&quot;ל של PhABS DMEM / 10% טרי לדגור על 37 מעלות צלזיוסב 5% CO 2. לשמור על תרבויות למשך 6 - 8 ימים, שינוי בינוני כל 48 שעות. אופציונאלי: כדי להגדיל את תשואת MPC, לא חסידי תאי 2.3 יכולים להיות מחדש מצופים בבקבוק התרבות חדש ומתוחזק כמתואר עבור התרבויות העיקריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולזרוק בינוני צלוחיות, לשטוף עם DMEM טריים להוסיף 2 מ&quot;ל של פרוטאז חינם בעלי חיים ניתוק פתרון. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 - 15 דקות (למנוע דגירה ממושכת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של PhABS טרי DMEM / 10%, לשאוב את ההשעיה תא צנטריפוגות ב 400 XG במשך 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולזרוק supernatant מחדש להשעות גלולה ב 1 - 2 מ&quot;ל של DMEM טריים / 10 PhABS%. המשך ספירת תאים כמתוארים בשלב 1.10. הערה: אל תשתמש טריפסין / EDTA כמו ניתוק מגיב. MPCs הוא טריפסין עמיד. הקרנה מורפולוגי של התרבויות, לפני קטיף תא, מומלצת מאוד כדי להעריך הנוכחות של תאי MSC הדמוי דמוי כישור. בסכום תיקים רב של תאי MSC הדמויים הם דetected, להגדיל את הטוהר של מוצר התא על ידי הסרת התאים המזוהמים באופן סלקטיבי. לשם כך, עיכול טריפסין יכול להתבצע לפני קצירת MPC, על ידי הוספת 2 מ&quot;ל של טריפסין / EDTA 0.05% למשך 2 דקות. תרבויות שטפו פעמיים עם 5 מ&quot;ל של DMEM / 10% PhABS, ולאחר מכן להמשיך פרוטאז טיפול כנ&quot;ל. </li></ol> אפיון Cell 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cytometry זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדר דגימות כפולות של 10 תאים 5 טריים מנותקים בתמיסת כביסה: D-PBS בתוספת 0.5% (v / v) אלבומין בסרום שור (BSA) ו- 0.02% (w / v) יזיד הנתרן. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות. זהירות: אזיד הנתרן הוא רעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות כדורים ב 200 μl של פתרון כביסה ולהוסיף אנטי CD90, אנטי CD45, אנטי CD73 נוגדנים נגד CD31 מצומדות עם צבעי ניאון ( &quot;TEST&quot;); במקביל להגדיר בקרת isotype ( &quot;CTRL&quot;). הערה: סכומים של מכתים נוגדנים צריכים להיקבע על ידי טיטרציה או אקורדינג להוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת דגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות. Re להשעות תאי 500 μl של פתרון כביסה ולרכוש לפחות 5 x 10 4 אירועים על תזרים ססגוני cytometer 7 9 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את התוצאות על ידי חלקות-נקודה ולהשתמש &quot;CTRL&quot; אירועים שנרשמו להגדיר רביעים. הערה: על מנת להגדיר את התרבות כתרבות MPC אחוז CD73 נג CD90 נג CD45 + CD31 + תאים צריך להיות מעל 95%. עבור יישומים ספציפיים מסוימים, כלומר, ניתוח ביטוי גנים, חתוכי ההתאוששות צריך להיות מוגברים עד 97 - 98%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי Nestin וניתוח ארגון F- אקטין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט MPCs טרי הפרד, שקופיות קאמרית תרבות (20,000 / 2 ס&quot;מ). אפשר תאים לדבוק ידי דגירת לילה בשעה 37 ° C ב 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים בתמיסה וסיבי כביסהx ב 4% (w / v) פסקה פורמלדהיד בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. כדי להסיר מקבע ולהוסיף פתרון כביסה, דגירה במשך 2 דקות ויוצקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור כביסה פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Permeabilize ברה-PBS בתוספת 0.05% (v / v) טריטון X-100 במשך 15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצוות ידי משפר אות בחינם חלבון (30 דקות &#39;ב RT) או פתרון חסימה סטנדרטי (D-PBS בתוספת 3% (w / v) BSA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר משפר אות / חסימת פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 7 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​(w / v) של נוגדן ראשוני nestin אנטי אנושי דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה בתא humidified. במקביל, השתמש נוגדנים לשלוט isotypic להעריך אותות קרינה ספציפיים לא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות על ידי הוספת D-PBS, להשאיר למשך 2 דקות ויוצקים. חזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​(w / v) של נוגדנים משני מצומדות צבע פלואורסצנטי דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מחליק כנ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף Phalloidin ניאון (5 UI / ml), לעזוב ב RT במשך 30 מ &#39;ב בחושך לשטוף 3 פעמים ב D-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הקירות קאמריים הר שקופיות במדיום הרכבה מימית בתוספת antifade מגיב 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) לגילוי גרעינים. המשך הדמיה 7 9 10. </li></ol></li></ol> 4. בידול Mesengenic של MPCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 2 x 10 4/2 ס&quot;מ MPCs מבודדים טרי צלוחיות תרבות T75 TC שטופלו ולתת תאים לדבוק לילה DMEM / 10% PhABS על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף DMEM / 10% PhABS עם המדיום סרום מופחת רגיל, כ -200 μl / 2 ס&quot;מ, המיועד (בינוני MSC-RS) הרחבת התא סטרומה mesenchymal. לגדל תאים כדי מפגש (P1-MSCs), בדרך כלל 7 עד 10 ימים מיום האינדוקציה. רענן בינוני כל 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולזרוק בינוני צלוחיות, לשטוף עם המדיום MSC-RS טריים להוסיף 2 מ&quot;ל של פרוטאז חינם בעלי חיים ניתוק פתרון. לדגור על 3776; צלזיוס למשך 5 - 15 דקות (למנוע דגירה ממושכת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של מדיום MSC-RS טריים, לשאוב את ההשעיה תא צנטריפוגות ב 400 XG במשך 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant מחדש להשעות גלולה ב 1 - 2 מ&quot;ל של מדיום MSC-RS טריים. המשך ספירת תאים כמתואר בשלב 1.10 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך-תת תרבות להם על ידי זריעת 3 - 5 x 10 תאים 3/2 ס&quot;מ. לגדל תאים כדי מפגש (P2-MSCs). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים על ידי עיכול פרוטאז כמתואר משלב 4.3 לשלב 4.5 והמשך אפיון כמפורט בסעיף 3. הערה: אחוז של CD73 + CD90 + CD45 נג תאי CD31 נג נמוך מ -95% היה מצביע רק בידול חלקי ודורש מעבר תרבות נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> P2-MSCs פלייט ב 2 x 10 4 / cm 2 בשישה גם צלחות TC שטופלו ולגדול מפגש במדיום MSC-RS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מארק שתי בארות כמו &quot;אין הבדל&quot; ולרענן בינוני MSC-RS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מארק שני גםים כמו &quot;osteo&quot; ולהחליף בינוני עם 200 μl / 2 ס&quot;מ של מדיום osteogenic סטנדרטי, שתוכננה במיוחד עבור בידול MSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מארק שתי בארות כמו &quot;Adipo&quot; ולהחליף בינוני עם 200 μl / 2 ס&quot;מ של מדיום adipogenic סטנדרטי, שתוכננה במיוחד עבור בידול MSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על תרבויות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 על ידי שינוי התקשורת כולה כל 48 שעות. הערה: מומלץ מאוד להשתמש תקן זמינה מסחרי מדיה הבחנה עבור שחזור מבחן. אחרי 2/3 שבועות בתנאי הבחנה, משקעי סידן להופיע בתרבויות מושרות osteogenic, תוך הצטברות טיפות שומנים תאיות ניכרת בתא מושרה adipogenic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולזרוק תקשורת ותרבות ולאחר מכן לשטוף עם D-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן התרבויות על ידי הוספת 1 מ&quot;ל של 4% (w / v) פסקה פורמלדהיד במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר מקבע להוסיף D-PBS, דגירה במשך 2 דקות ויוצקים. חזור כביסהפעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם אחד &quot;אין הבדל&quot; יחד עם שני &quot;osteo&quot; מסומן בארות בתמיסת ניאון ספציפית hydroxyapatite ואחד &quot;אין הבדל&quot; יחד עם שני &quot;Adipo&quot; מסומן בארות 200 פתרון אדום ננומטר הנילוס. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר 11,12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מכתים פתרונות ולשטוף D-PBS פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר D-PBS, להוסיף D-PBS בתוספת 50% (v / v) גליצרין והמשך הדמיה 7 9 10. </li></ol> 5. MPC אליפטית Assay הנבטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייצר spheroids 3D, שכב 20 טיפות μl של השעיה MPC מבודדים טרי (1.5 x 10 4 תאים / ירידה) על המשטח הפנימי של מכסה צלחת פטרי. הערה: ככל טיפות טיפול עלולות להוביל לקרע שלהם, זה מאוד לא מומלץ להניח להם עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להשתמש במכסה כדי לסכם בצלחת פטרי המכילות D-PBS כדי למנוע תלוי טיפות אידוי. לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2לילה כדי לאפשר לתאים המצרפי spheroids 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדר ג&#39;ל סמיך של מטריקס בעכברים (ECM) חלבונים על ידי הוספת 300 aliquots μl של חלבוני ECM סטנדרטיים צלחת תרבות מראש בקירור 24 גם, ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להתהפך מכסת צלחת פטרי בעדינות להרים את spheroids בעזרת פיפטה פסטר סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נח spheroids על ג&#39;ל חלבון ECM, להוסיף 700 aliquots μl של מדיום גידול תא האנדותל VEGF-עשיר רגיל ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות ו 7 ימים של תרבות, לצלם את תרבויות 3D בהספק הגדלת 4X. להעריך מבצבצות spheroids החלת תוכנת ניתוח תמונה על ידי מדידת המרחק הרדיאלי בין תא הפולש האחרון והקצה אליפטית. צעדים חזרו יחד לפחות 20 בכיוונים שונים. המרחק הממוצע הוא ייחשב כחיובי כאשר 50 מיקרומטר או מעל. </li></ol>

<ol>
	<li>Stoltz, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+and+Regenerative+Medicine:+Myth+or+Reality+of+the+21th+Century.">Stem Cells and Regenerative Medicine: Myth or Reality of the 21th Century.</a> Stem Cells Int. 2015, 734731 (2015).</li><li>Pacini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+and+stochastic+approaches+in+the+clinical+application+of+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs).">Deterministic and stochastic approaches in the clinical application of mesenchymal stromal cells (MSCs).</a> Front Cell Dev Biol. 2, 50 (2014).</li><li>Galvez, P., Clares, B., Hmadcha, A., Ruiz, A., Soria, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+cell-based+medicinal+product:+regulatory+structures+in+the+European+Union.">Development of a cell-based medicinal product: regulatory structures in the European Union.</a> Br Med Bull. 105, 85-105 (2013).</li><li>Herberts, C. A., Kwa, M. S., Hermsen, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+in+the+development+of+stem+cell+therapy.">Risk factors in the development of stem cell therapy.</a> J Transl Med. 9, 29 (2011).</li><li>Petrini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+purification+of+mesodermal+progenitor+cells+from+human+adult+bone+marrow.">Identification and purification of mesodermal progenitor cells from human adult bone marrow.</a> Stem Cells Dev. 18 (6), 857-866 (2009).</li><li>Trombi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+culture+of+mesodermal+progenitor+cells.">Selective culture of mesodermal progenitor cells.</a> Stem Cells Dev. 18 (8), 1227-1234 (2009).</li><li>Pacini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+expression+of+pluripotency-associated+genes+in+mesodermal+progenitor+cells+(MPCs).">Constitutive expression of pluripotency-associated genes in mesodermal progenitor cells (MPCs).</a> PLoS One. 5 (3), 9861 (2010).</li><li>Pacini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+integrin+expression+is+associated+with+podosome-like+structures+on+mesodermal+progenitor+cells.">Specific integrin expression is associated with podosome-like structures on mesodermal progenitor cells.</a> Stem Cells Dev. 22 (12), 1830-1838 (2013).</li><li>Fazzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesodermal+progenitor+cells+(MPCs)+differentiate+into+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs)+by+activation+of+Wnt5/calmodulin+signalling+pathway.">Mesodermal progenitor cells (MPCs) differentiate into mesenchymal stromal cells (MSCs) by activation of Wnt5/calmodulin signalling pathway.</a> PLoS One. 6 (9), 25600 (2011).</li><li>Tormin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD146+expression+on+primary+nonhematopoietic+bone+marrow+stem+cells+is+correlated+with+in+situ+localization.">CD146 expression on primary nonhematopoietic bone marrow stem cells is correlated with in situ localization.</a> Blood. 117 (19), 5067-5077 (2011).</li><li>Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+red:+a+selective+fluorescent+stain+for+intracellular+lipid+droplets.">Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets.</a> J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).</li><li>Wang, Y. H., Liu, Y., Maye, P., Rowe, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+mineralized+nodule+formation+in+living+osteoblastic+cultures+using+fluorescent+dyes.">Examination of mineralized nodule formation in living osteoblastic cultures using fluorescent dyes.</a> Biotechnol Prog. 22 (6), 1697-1701 (2006).</li><li>Horwitz, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarification+of+the+nomenclature+for+MSC:+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 7 (5), 393-395 (2005).</li><li>Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+mesenchymal+stem+cells.">Clinical applications of mesenchymal stem cells.</a> J Hematol Oncol. 5, 19 (2012).</li><li>Si, Y. L., Zhao, Y. L., Hao, H. J., Fu, X. B., Han, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSCs:+Biological+characteristics,+clinical+applications+and+their+outstanding+concerns.">MSCs: Biological characteristics, clinical applications and their outstanding concerns.</a> Ageing Res Rev. 10 (1), 93-103 (2011).</li><li>Le Blanc, K., Tammik, C., Rosendahl, K., Zetterberg, E., Ringden, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+expression+and+immunologic+properties+of+differentiated+and+undifferentiated+mesenchymal+stem+cells.">HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells.</a> Exp Hematol. 31 (10), 890-896 (2003).</li><li>Phinney, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+heterogeneity+of+mesenchymal+stem+cell+populations:+clues+to+their+therapeutic+efficacy.">Biochemical heterogeneity of mesenchymal stem cell populations: clues to their therapeutic efficacy.</a> Cell Cycle. 6 (23), 2884-2889 (2007).</li><li>Phinney, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+mesenchymal+stem+cells:+implications+for+cell+therapy.">Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: implications for cell therapy.</a> J Cell Biochem. 113 (9), 2806-2812 (2012).</li><li>Tolar, J., Le Blanc, K., Keating, A., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+hitting+the+right+spot+with+mesenchymal+stromal+cells.">Concise review: hitting the right spot with mesenchymal stromal cells.</a> Stem Cells. 28 (8), 1446-1455 (2010).</li><li>Corselli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tunica+adventitia+of+human+arteries+and+veins+as+a+source+of+mesenchymal+stem+cells.">The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Dev. 21 (8), 1299-1308 (2012).</li><li>Bieback, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+alternatives+to+fetal+bovine+serum+for+the+expansion+of+mesenchymal+stromal+cells+from+bone+marrow.">Human alternatives to fetal bovine serum for the expansion of mesenchymal stromal cells from bone marrow.</a> Stem Cells. 27 (9), 2331-2341 (2009).</li><li>Watson, L., Elliman, S. J., Coleman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+isolation+to+implantation:+a+concise+review+of+mesenchymal+stem+cell+therapy+in+bone+fracture+repair.">From isolation to implantation: a concise review of mesenchymal stem cell therapy in bone fracture repair.</a> Stem Cell Res Ther. 5 (2), 51 (2014).</li><li>Pacini, S., Petrini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+MSCs+angiogenic+cells?+New+insights+on+human+nestin-positive+bone+marrow-derived+multipotent+cells.">Are MSCs angiogenic cells? New insights on human nestin-positive bone marrow-derived multipotent cells.</a> Front Cell Dev Biol. 2, 20 (2014).</li></ol>

The authors have no competing financial interests or other conflicts of interest.

In the last decades, MSCs have been extensively researched and pre-clinically evaluated for possible application in the treatment of various bone/articular, immunological, neurological, cardiovascular, gastrointestinal and hematological disorders14,15. The easy and inexpensive isolation of multipotent MSCs, from many different tissues, together with their lack of significant immunogenicity16, contribute to make these cells one of the most interesting cell population to be applied in cell based therapies. Nonetheless, the very low frequency in the tissue of origin represents a great limitation to the MSCs application in clinics, forcing the expansion of these cells, in vitro, before the infusion or transplantation. 
Expanded MSC cultures have revealed high grades of heterogeneity and variability17-19 making it difficult to reach a consensus about MSC production and characterization protocols. Moreover, recent investigations suggested the presence of multiple in vivo MSC ancestors in a wide range of tissues, which contribute to culture heterogeneity10,20. In fact, it has been proposed that particular culture conditions possibly select or simply promote specific sub-populations of MSCs progenitors present, in various percentages, in "crude" and unprocessed samples like bone marrow (hBM-MNCs) or adipose tissues (stromal vascular fraction)2. Thus, the variability in MSC-initiating cell populations together with the great number of different enrichment/isolation and culture protocols applied, represent a great obstacle to the definition of feasible MSC-based therapies.
A crucial factor affecting heterogeneity of MSC cultures is serum supplementation21. In our hands replacement of FBS with PhABS in primary cultures from hBM-MNCs, combined with high density seeding on hydrophobic plastics, led to the isolation of a novel highly adherent cell population with distinct biological features named MPCs5,6. We observed that the addition of small percentages of PhABS to FBS primary cultures also allowed MPC isolation, suggesting the presence of MPC inducing agents in the human serum6. At the moment, the MPC isolation/characterization protocol is a unique method available to obtain almost pure MPCs. The protocol has been carefully adjusted and it is highly reproducible for quality screening of MPC preparations before further applications.
MPCs could be used as a source for MSC production, thus limiting the variability introduced by use of unfractionated starting material. The precise definition of the multiple steps characterizing MPC mesengenic differentiation reported9 would allow synchronized mesenchymal cell expansion. Nonetheless, this latest condition could be realized exclusively applying highly purified MPC population, as a consequence the characterization of the cell products obtained by the protocol described here, results of crucial importance. This isolating method has been reported allowing MPC recovery with purity generally around 95%. However, donor/patient variability together with the variability related to the different batches of human pooled serum applied, could lead to a significant percentage of MSC-like cells co-isolated together with MPCs, under selective conditions. 
It is not clear if these "contaminating" MSC-like cells could arise from the other different in vivo progenitors described in bone marrow22 or from uncontrolled and spontaneous MPC differentiation. In any case, a consistent percentage of MSC-like cells in the MPC products nullify the possibility to applying these cells as homogeneous starting material for the MSC expansion. Thus, here it has been suggested a simple and inexpensive method, based on the MPC resistance to trypsin digestion, increasing the purity of the MPC products. Similar or even better results in purifying MPC cultures could be achieved by fluorescent or magnetic cell sorting performing CD73 and/or CD90 depletion, but significantly prolonging the process time and increasing the costs.
Moreover, MPCs showed expression of pluripotency-associated markers and Nestin, all rapidly lost during mesengenic differentiation7. Sprouting assay revealed MPC ability to invade murine ECM protein gel. Taken together these results indicate that MPCs have to be considered a more immature progenitor, retaining angiogenic potential. Nonetheless, the initial enthusiasm about mesodermal differentiation potential of MPCs is actually waning. In fact, after more than 7 years of studies on MPCs, mesengenic and angiogenic potential have been extensively described5-9, but differentiation toward any other cells of mesodermal origin is still lacking. Thus, here we propose a new, and more rigorous, definition of these cells as "Mesangiogenic Progenitor Cells", maintaining the acronym MPCs.
We also believe that most controversies about MSC angiogenic potential could be related to the heterogeneous composition of expanded cultures consisting of sub-populations of MPCs and MSCs in variable percentages23.
Finally, MPCs could also play a crucial role for the implementation of CBMPs applicable for tissue reconstruction, as these cells could also support the neo-vascularization. In fact, future studies on regeneration should take in consideration that the newly formed tissue growth should be supported by concomitant neo-angiogenesis. The co-existence of mesengenic and angiogenic potential in MPCs could significantly improve the regeneration potential of new therapeutic approaches that involve these interesting cells.

תאים סטרומה mesenchymal (MSCs) הם בעלי ערך קליני רלוונטי עבור קיבולת בידול רב השושלת שלהם ואת יכולתם לתמוך hemopoiesis, להפריש גורמי גדילה / ציטוקינים כמו גם לשחק תפקיד immunoregulation 1. בהגדרה של ייצור ויישום תא טיפולים מבוססים MSC כבר מושא המחקר קליני הנרחב טרום קליני 2, תוך שימת דגש מיוחד ברגולציה בינלאומית ספציפית את הבטיחות והיעילות של תא מבוסס מוצר רפואי (CBMP) טיפולים 3. MSCs אדם מתורבתים בהרחבה בתקשורת המכיל תוספי ריאגנטים מן החי, כגון בסרום שור העובר (FBS) טריפסין שור. לכן, לצד סיכונים זיהומיות הקשורות מניפולצית תא, חולים גם להתמודד עם חשיפת פריון וכן סיכונים אימונולוגיים צמודים חלבונים, פפטידים או ביומולקולות אחרות מן החי שיכולים נמשך לאחר תא קציר transplantation 4. כדי לעקוף את הבעיה, אנחנו מתורבתי מח עצמות אדם (HBM) MSCs -derived במדיום חיה ללא, החלפת FBS עם סרום סוג AB אדם אסף (PhABS). בתנאים אלה, לצד MSCs גדל זיהינו אוכלוסיית תא רומן. תאים אלה היו מורפולוגית phenotypically שונה MSCs והראו פרופיל ביטוי גנים ייחודי וכן נכסי הידבקות מאפיין גידול /. הם שמרו הוא mesengenic ו angiogenic פוטנציאל ולכן נקראו תאי mesodermal ובתאים (MPCs) 5. בהמשך לכך, הצלחנו להגדיר תנאי תרבות סלקטיבית לשחזור כדי ליצור MPCs על ציון גבוה של טוהר 6. בנוסף, אנו חקרנו את תכונות מורפולוגיות ביולוגיות של MPCs. MPCs הראה להיות nestin החיובי, איטי ב אופניים, Ki-67-שליליים, ועם הכרומוזומים מאופיינים טלומרים ארוכים 5. הם הביעו plurשעתוק הקשורים ipotency גורמי אוק-4 ו Nanog ולא רגולטורים MSC Runx2 ו Sox9 7. Phenotypically, MPCs הביע endoglin (CD105) ברמה נמוכה יותר מאשר MSCs כאשר לא היתה להם mesenchymal סמנים CD73, CD90, CD166. MPCs גם הראה בדפוס ייחודי של מולקולות הדבקה מאופיין ביטוי עקבי של PECAM (CD31), integrins αL (CD11a), αM (CD11b), αX (CD11c) וכן β2 integrin (CD18) באופן ספציפי ומקיים מבנים podosome דמוי 8 . במדיה הרחבים MSC סטנדרטיים, MPCs הבדיל מייד לתוך MSCs דרך שלב ביניים המציג את הפעלת תא Wnt5 / calmodulin איתות 9. MPCs גם שומרים על תכונותיהם angiogenic, כפי שהוכח על ידי יכולתם צומחים מתוך spheroids ב מטריקס בעכברים (ECM) תרבויות 3D חלבון. פוטנציאל angiogenic אבד במהירות לאחר בידול MPC לאורך שושלת mesengenic. כאן אנו מציגים פרוtocols אופטימיזציה לבודד ולאפיין MPCs נקיים במיוחד מדגימות דם HBM. פרוטוקולים לשחזור עבור mesengenic MPC והבחנה angiogenic מתוארים גם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1201">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:309px;">Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td style="width:327px;">BD Bioscience (San Jose, CA-USA)</td>
			<td style="width:149px;">354230</td>
			<td style="width:416px;">Murine ECM proteins 
			Stock Concentration: 100% (9-12 mg/ml) 
			Final Concentration: 100%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS)</td>
			<td style="width:327px;">Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td style="width:149px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">70 &#956;m Filters</td>
			<td style="width:327px;">Miltenyi Biotec (BergischGladbach, Germany)</td>
			<td style="width:149px;">130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ficoll-Paque PREMIUM&#160;</td>
			<td>GE Healthcare (Uppsala, Sweden)</td>
			<td style="width:149px;">17-5442-03</td>
			<td>medium for discontinuos density gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pooled human AB type serum (PhABS)</td>
			<td>LONZA (Walkersville MD-USA)</td>
			<td style="width:149px;">14-490E</td>
			<td style="width:416px;">Final Concentration: 10%</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;">Glutamax-I</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher (Waltham,&#160; MA USA)</td>
			<td style="width:149px;">35050-038</td>
			<td style="width:416px;">Stabilized L-Glutamine 
			Stock Concentration: 100X 
			Final Concentration: 2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:327px;">Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td style="width:149px;">A8412</td>
			<td style="width:416px;">Stock Concentration: 7.5% 
			Final Concentration: 0.5%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:327px;">Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td style="width:149px;">S8032</td>
			<td>Final Concentration: 0.02%</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:309px;">Penicillin/Streptomycin (Pen Strep)</td>
			<td style="width:327px;">Gibco (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td style="width:149px;">15070-063</td>
			<td style="width:416px;">Antibiotics 
			Stock Concentration: 5,000 UI/mL penicillin, 5,000 ug/mL Streptomycin 
			Final Concentration: 50 UI/mL penicillin, 50 ug/mL Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">T-75 culture flask for suspension cultures</td>
			<td style="width:327px;">Greiner Bio-one&#160; (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td style="width:149px;">658 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">T-75 culture flask TC treated</td>
			<td style="width:327px;">Greiner Bio-one&#160; (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td style="width:149px;">658170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:309px;">TrypLE Select</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher (Waltham,&#160; MA USA)</td>
			<td style="width:149px;">12563-011</td>
			<td style="width:416px;">Animal- free proteases detaching solution 
			Stock Concentration: 1X 
			Final Concentration: 1X</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:309px;">Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher (Waltham,&#160; MA USA)</td>
			<td style="width:149px;">15400-054</td>
			<td style="width:416px;">Phenol red free 
			Stock Concentration: 0.5% 
			Final Concentration: 0.25%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">anti-CD90 APC antibody&#160; (CD90)</td>
			<td style="width:327px;">MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td>
			<td style="width:149px;">130-095-402</td>
			<td>Final Concentration: 1:40</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">anti-CD45 APC-Vio770 antibody (CD45)</td>
			<td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td>
			<td style="width:149px;">130-096-609</td>
			<td>Final Concentration: 1:40</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">anti-CD73 PE antibody (CD73)</td>
			<td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td>
			<td style="width:149px;">130-095-182</td>
			<td>Final Concentration: 1:40</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">anti-CD31 PE Vio-770 antibody (CD31)</td>
			<td style="width:327px;">MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td>
			<td style="width:149px;">130-105-260</td>
			<td>Final Concentration: 1:40</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Mouse IgG1 APC antibody</td>
			<td style="width:327px;">MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td>
			<td style="width:149px;">130-098-846</td>
			<td>Final Concentration: 1:40</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Mouse IgG2a APC Vio770 antibody</td>
			<td style="width:327px;">MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td>
			<td style="width:149px;">130-096-637</td>
			<td>Final Concentration: 1:40</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Mouse IgG1 PE antibody</td>
			<td style="width:327px;">MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td>
			<td style="width:149px;">130-098-845</td>
			<td>Final Concentration: 1:40</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Mouse IgG1 PE Vio-770 antibody</td>
			<td style="width:327px;">MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td>
			<td style="width:149px;">130-098-563</td>
			<td>Final Concentration: 1:40</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:309px;">Low Glucose Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#160; (DMEM)</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher (Waltham,&#160; MA USA)</td>
			<td style="width:149px;">13-1331-82</td>
			<td style="width:416px;">Phenol red-free minimal essential medium 
			Stock Concentration: 1&#39;000 mg/l glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Fetal Bovine Serum&#160; (FBS)</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher (Waltham,&#160; MA USA)</td>
			<td style="width:149px;">10500</td>
			<td style="width:416px;">Stock Concentration:0.2 mg/mL 
			Final Concentration: 2 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Prolong Gold antifade reagent with 4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole</td>
			<td style="width:327px;">Invitrogen (Waltham, MA,&#160; USA)</td>
			<td style="width:149px;">P-36931</td>
			<td style="width:416px;">Aqueous mounting medium + DAPI 
			Final Concentration: 1X</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:327px;">Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td style="width:149px;">P6148</td>
			<td style="width:416px;">Fixative 
			Final Concentration: 4%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">LAB-TEK two-well chamber slides</td>
			<td style="width:327px;">Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td style="width:149px;">C6682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Anti-Nestin antibody [clone 10C2]</td>
			<td style="width:327px;">Abcam (Cambridge, UK)</td>
			<td style="width:149px;">ab2035</td>
			<td style="width:416px;">Stock Concentration: 1 mg/ml 
			Final Concentration: 7 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Alexa Fluor 555 Phalloidin</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher (Waltham,&#160; MA USA)</td>
			<td style="width:149px;">A34055</td>
			<td style="width:416px;">Stock Concentration: 200 UI/ml 
			Final Concentration: 5 UI/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:327px;">Euroclone (Milan, Italy)</td>
			<td style="width:149px;">EMR237500</td>
			<td style="width:416px;">Final Concentration: &#39;0,05%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">MesenPRO RS Medium&#160; (MSC-RS medium)</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher (Waltham,&#160; MA USA)</td>
			<td>12746-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:309px;">Alexa Fluor 488 anti-mouse SFX kit</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher (Waltham,&#160; MA USA)</td>
			<td style="width:149px;">A31619</td>
			<td style="width:416px;">Goat anti-mouse secondary antibody + Signal enhancer 
			Stock Concentration: 2 mg/ml 
			Final Concentration: 2 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:327px;">Kartell Labware&#160; (Noviglio (MI), ITALY )</td>
			<td>329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">StemMACS AdipoDiff&#160; Media</td>
			<td style="width:327px;">MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td>
			<td style="width:149px;">130-091-679</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">StemMACS OsteoDiff&#160; Media</td>
			<td style="width:327px;">MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td>
			<td style="width:149px;">130-091-678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Osteoimage Bone mineralization Assay</td>
			<td style="width:327px;">LONZA (Walkersville MD-USA)</td>
			<td style="width:149px;">PA-1503</td>
			<td>Hydroxyapatite specific fluorescent staining solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">50mL Polystyrene conical tube</td>
			<td style="width:327px;">Greiner bio-one (Kremsm&#252;nster 
			Austria)</td>
			<td style="width:149px;">227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:309px;">Nile Red</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher (Waltham,&#160; MA USA)</td>
			<td style="width:149px;">N1142</td>
			<td style="width:416px;">Fluorescent staining solution for lipids 
			Stock Concentration: 100 mM 
			Final Concentration: 200 Nm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Glycerin</td>
			<td style="width:327px;">Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td style="width:149px;">G2289</td>
			<td>Final Concentration: &#39;50%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Polistirene Petri dishes</td>
			<td style="width:327px;">Sigma (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td style="width:149px;">P5606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">24-well plates TC-treated</td>
			<td style="width:327px;">Greiner Bio-one GmbH (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td style="width:149px;">662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Endothelial Growth Medium, EGM-2 BulletKit&#160; (EGM-2)</td>
			<td style="width:327px;">LONZA (Walkersville MD-USA)</td>
			<td style="width:149px;">CC-3162</td>
			<td>VEGF-rich endothelial cell growth medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Leica Qwin Image Analisys Software</td>
			<td style="width:327px;">Leica (Wetzlar, Germany)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating mesangiogenic progenitor cells (mpcs) from human bone marrow

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel cell population specifically selected for growth in human serum supplemented medium. These cells are characterized by morphological, phenotypic, and molecular features distinct from MSCs and we named them Mesodermal Progenitor Cells (MPCs). MPCs are round, with a thick highly refringent core region; they show strong, trypsin resistant adherence to plastic. Failure to expand MPCs directly revealed that they are slow in cycling. This is as also suggested by Ki-67 negativity. On the other hand, culturing MPCs in standard medium designed for MSC expansion, gave rise to a population of exponentially growing MSC-like cells. Besides showing mesenchymal differentiation capacity MPCs retained angiogenic potential, confirming their multiple lineage progenitor nature. Here we describe an optimized highly reproducible protocol to isolate and characterize hBM-MPCs by flow cytometry (CD73, CD90, CD31, and CD45), nestin expression, and F-actin organization. Protocols for mesengenic and angiogenic differentiation of MPCs are also provided. Here we also suggest a more appropriate nomenclature for these cells, which has been re-named as "Mesangiogenic Progenitor Cells".

התנאים תרבות סלקטיבית המתואר כאן אפשרו את הבידוד של רומן חסיד וכמעט חַד צוּרָתִי אוכלוסיית תאים כמו 1.0% של HBM-MNCs (0.5 - 2.0 x 10 6 HBM-MNCs מן 5 - 10 מ&quot;ל של דגימות BM טרי) 5,6 . זיהינו הגדולות האלה (40 - 60 מיקרומטר קוטר), מעוגל, שוקט, תאים Ki-67-שליליים כמו MPCs 5. מורפולוגית, הם מאופיינים בכושר-ביצת עין ייחודי עם אזור ליבה עבה מוקף בפריפריה דקה שטוחה מראה המון filopodia בהספק בהגדלה גבוה יותר (חצים לבנים ב א 1. איור 1). התארכות פולאר של גבול התא החיצוני הוא נצפה לעיתים קרובות (חיצים שחורים ב א 1. איור 1). מורפולוגיה כזו היא שונה בבירור מן מראה תא סטרומה mesenchymal הטיפוסי בצורת הכישור דיווח בתרבויות MSC סטנדרטיות. Cytometry זרימה הראתה מעל 95% של MPCs המבודד טרי להביע CD31 ו CD45 בעוד מ &#39;esenchymal סמנים הקשורים CD90 ו CD73 13 היו (א .2 איור 1) לגילוי. אנו רואים קבוצה המוגבלת הזאת של ארבעה אנטיגנים כמו אינדיקציות על MPCs. בהמשך סימני ההיכר של MPCs הם הפצה המקווקו F- אקטין חושף מספר מבנים דמויי podosome (אדום באיור 1 א .3) וביטוי אינטנסיבי של nestin (ירוק באיור 1 א .3), אשר לא זוהה בתאים מוכתם נוגדן שליטה isotypic (מידע לא מוצג). MPCs Culturing ב RS סטנדרטי שנועד בינוני עבור תוצאות הרחבה MSC התמיינות מהירה לתאים MSC דמוי גדל באופן אקספוננציאלי (איור 1 ב&#39;1). לאחר שני קטעים תאים לבסוף לעבור הפנוטיפ שלהם CD73 נג CD90 נג CD45 + CD31 + כדי CD73 + CD90 + CD45 נג CD31 נג (איור 1 ב .2). תוך כדי כך, MPCs מחדש organize F- אקטין לתוך סיבי מתח תוך ביטוי nestin הופך מרותק כמה תאים נדירים (איור 1 ב .3). בידול MPC mesengenic לתוך פנוטיפ MSC הדמוי מובהק מתרחש באמצעות שני צעדים ברורים שעולים מורפולוגיה תאים שונות. לאחר שבוע במדיום MSC RS אוכלוסייה שיורית של תאים דמויי MPC עדיין לזיהוי בתוך שכבת ומחוברות של שטוח, תאים רב-קנים מצולעים (P1-MSCs באיור 2 א). קטע נוסף נדרש כדי להשיג תרבות חַד צוּרָתִי כמעט של תאי MSC הדמוי דמוי כישור (P2-MSCs באיור 2 א). אקספוננציאלית גדל אלה תאים יכולים להתמיין אוסטאובלסטים או adipocytes בקלות כאשר מועברים לתוך התקשורת סלקטיבית עבור 2 שבועות לפחות, ובכך אישר הטבע MSC שלהם. בתרבויות מושרות osteogenic, משקעי סידן יכולים להיות מזוהים על ידי או כתם Alizarin-S colorimetric או צבעי ניאון ספציפיים (ירוק B איור 2). לאחר תאים אינדוקציה adipogenicלהראות הצטברות אגל השומנים כפי שעולה גם כתם אדום אדום שמן colorimetric או פלורסנט הנילוס (אדום B איור 2). הקלדת MPC אושרה על ידי הנבטת assay אנגיוגנזה. MPCs הראה יכולתם לפלוש (למעלה מ -50 מיקרומטר) ג&#39;ל murine ECM חלבון מן spheroids 3D לאחר 24 שעות VEGF-גירוי (איור 2 ג). לאחר תאים פולשים שבוע התגלו ב 300 - 600 מרחק מיקרומטר. לעומת זאת, יכולת פלישה אבדה P2-MSCs לאחר בידול mesengenic (איור 2 ד). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54225/54225fig1.jpg" /> איור 1. MPCs מבודדים טרי יש מאפיינים ייחודיים. Culturing HBM-MNCs ב DMEM / 10% PhABS במשך שבעה ימים מוליד אוכלוסייה של MPCs שקט (א) להבחין בקלות בין MSCs (B) </strong&gt; מבחינת מורפולוגיה (א .1, ב&#39;1, ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר), פנוטיפ (א .2, ב .2), הפצה F- אקטין (אדום א .3, ב .3), ו ביטוי nestin (ירוק A.3, ב .3, ברים בקנה מידה = 20 מיקרומטר). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54225/54225fig1large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54225/54225fig2.jpg" /> איור 2. MPCs להתמיין MSCs Standard ו- הצג הנבטה אנגיוגנזה במבחנה. החלפת DMEM / PhABS עם RS זמינים מסחרית שנועדה בינוני להרחבת MSC מפעילה אינדוקציה mesengenic של MPCs. אחרי שבוע בתרבות כמה MPCs שיורית עדיין לגילוי (P1-MSCs) תוך מעבר נוסף במדיום MSC-RS מוביל אוכלוסייה של תאים MSC דמוי ומחוברות (P2-MSCs, ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר). P2-MSCs סופני להתמיין osteocytes או adipocytes תחת הגירוי הנכון, כפי שהיא מתגלה על ידי בתצהיר סידן (ירוק B) וצבירת אגל השומנים (אדום B, ברים בקנה מידה = 200 מיקרומטר), בהתאמה. MPCs להראות הנבטה עקבית spheroids ב ג&#39;ל חלבון murine ECM (C) בשעה הבדל עם P2-MSCs (D, ברים בקנה מידה = 1.0 מ&quot;מ). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54225/54225fig2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow at JoVE.com

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

Here we describe an optimized, highly reproducible protocol to isolate Mesodermal Progenitor Cells (MPCs) from human bone marrow (hBM). MPCs were characterized by flow cytometry and nestin expression. They showed the ability to give rise to exponentially growing MSC-like cell cultures while retaining their angiogenic potential.

תאי בידוד ובתאי Mesangiogenic (MPCs) מן האדם מח עצם

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

isolating-mesangiogenic-progenitor-cells-mpcs-from-human-bone-marrow

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

8.0K Views.  University of Pisa. Here we describe an optimized, highly reproducible protocol to isolate Mesodermal Progenitor Cells (MPCs) from human bone marrow (hBM). MPCs were characterized by flow cytometry and nestin expression. They showed the ability to give rise to exponentially growing MSC-like cell cultures while retaining their angiogenic potential.

Video: Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold. Thus, the application of MSCs in repair and tissue regeneration processes depends principally on the efficient implementation of the techniques for placing these cells in a host tissue. For this reason, the design of biomaterials and cellular scaffolds has gained importance in recent years because the topographical characteristics of the selected scaffold must ensure adhesion, proliferation and differentiation into the desired cell lineage in the microenvironment of the injured tissue. This option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) employs bovine bone matrix as a cellular scaffold and is an efficient culture technique because the cells respond to the topographic characteristics of the bovine bone matrix Nukbone (NKB), i.e., spreading on the surface, macroporous covering and colonizing the depth of the biomaterial, after the cell isolation process. We present the procedure for isolating and culturing MSCs on a bovine matrix.

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.

בידוד של תאי גזע mesenchymal האדם והטיפוח שלהם על עצם מטריקס הנקבובי

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

גזירה של תאי לב ותאים מתאי גזע עובריים

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to primary human adult neural cultures raises unique challenges. Recent developments in induced pluripotent stem cells (iPSC) provides an alternative approach to derive neural cultures from skin fibroblasts through patient specific iPSC, but this process is labor intensive, requires special expertise and large amounts of resources, and can take several months. This prevents the wide application of this technology to the study of neurological diseases. To overcome some of these issues, we have developed a method to derive neural stem cells directly from human adult peripheral blood, bypassing the iPSC derivation process. Hematopoietic progenitor cells enriched from human adult peripheral blood were cultured in vitro and transfected with Sendai virus vectors containing transcriptional factors Sox2, Oct3/4, Klf4, and c-Myc. The transfection results in morphological changes in the cells which are further selected by using human neural progenitor medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF). The resulting cells are characterized by the expression for neural stem cell markers, such as nestin and SOX2. These neural stem cells could be further differentiated to neurons, astroglia and oligodendrocytes in specified differentiation media. Using easily accessible human peripheral blood samples, this method could be used to derive neural stem cells for further differentiation to neural cells for in vitro modeling of neurological disorders and may advance studies related to the pathogenesis and treatment of those diseases.

A method was developed to directly derive human neural stem cells from hematopoietic progenitor cells enriched from peripheral blood cells.

אינדוקציה ישירה של תאי גזע עצביים אדם מתאי הדם היקפי Hematopoietic אב

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase - a clinically approved and readily available thrombolytic drug &#8211; clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.

Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

שיטה אנזימתי להציל תאי גזע mesenchymal מדוגמאות קרשו מח העצם

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of multipotent, self-renewing, and expandable neural stem cells. In serum conditions, these multipotent NSPCs will differentiate, generating neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. The harvested tissue is enzymatically dissociated in a papain-EDTA solution and then mechanically dissociated and separated through a discontinuous density gradient to yield a single cell suspension which is plated in neurobasal medium supplemented with epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), and heparin. Adult rat spinal cord NSPCs are cultured as free-floating neurospheres and adult human spinal cord NSPCs are grown as adherent cultures. Under these conditions, adult spinal cord NSPCs proliferate, express markers of precursor cells, and can be continuously expanded upon passage. These cells can be studied in vitro in response to various stimuli, and exogenous factors may be used to promote lineage restriction to examine neural stem cell differentiation. Multipotent NSPCs or their progeny can also be transplanted into various animal models to assess regenerative repair.

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

בידוד של תאי גזע / עצביים מהאזור סביב חדרי המוח של העכברוש למבוגרים וחוט השדרה אנושי

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

כימות תלת ממדיות של קוצים הדנדריטים מפירמידת נוירונים שמקורם בתאי גזע האנושי המושרה pluripotent

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

בידוד תאי גזע זקיק שיער עוריות קרטינוציטים מן עור עכבר הגבה

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular niches modulating critical hematopoietic stem cell (HSC) functions1,2. Indeed, a more detailed picture of the hematopoietic microenvironment is now emerging, in which the endosteal and the endothelial niches form functional units for the regulation of normal HSC and their progeny3,4,5. New studies have revealed the importance of perivascular cells, adipocytes and neuronal cells in maintaining and regulating HSC function6,7,8. Furthermore, there is evidence that cells from different lineages, i.e. myeloid and lymphoid cells, home and reside in specific niches within the BM microenvironment. However, a complete mapping of the BM microenvironment and its occupants is still in progress.
Transgenic mouse strains expressing lineage specific fluorescent markers or mice genetically engineered to lack selected molecules in specific cells of the BM niche are now available. Knock-out and lineage tracking models, in combination with transplantation approaches, provide the opportunity to refine the knowledge on the role of specific &#34;niche&#34; cells for defined hematopoietic populations, such as HSC, B-cells, T-cells, myeloid cells and erythroid cells. This strategy can be further potentiated by merging the use of two-photon microscopy of the calvarium. By providing in vivo high resolution imaging and 3-D rendering of the BM calvarium, we can now determine precisely the location where specific hematopoietic subsets home in the BM and evaluate the kinetics of their expansion over time. Here, Lys-GFP transgenic mice (marking myeloid cells)9 and RBPJ knock-out mice (lacking canonical Notch signaling)10 are used in combination with IVFM to determine the engraftment of myeloid cells to a Notch defective BM microenvironment.

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Intravital fluorescence microscopy (IVFM) of the calvarium is applied in combination with genetic animal models to study the homing and engraftment of hematopoietic cells into bone marrow (BM) niches.

שילוב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי Intravital (IVFM) עם דגמים גנטיים בחקר דינמיקה Engraftment Hematopoietic תאים במח העצם נישות

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy

We have previously reported on the generation of plasma membrane vesicles (PMVs) through the mechanical extrusion of mammalian cells. The fusion of PMVs with mitochondrial deficient Rho0 cells restored mitotic activity under normal culture conditions. Atherosclerosis, type 2 diabetes, Alzheimer&#39;s disease, and cancer are age-related diseases that have been reported to be associated with multiple mechanical and functional defects in the cytosol and organelles of a variety of cell types. Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) represent a unique cell population from the bone marrow that possess self-renewal capabilities while maintaining their multipotency. The supplementation of senescence cells with young cytoplasm from autologous BMSCs via the fusion of PMVs provides a promising approach to ameliorate or even reverse age-associated phenotypes. This protocol describes how to prepare PMVs from BMSCs via extrusion through a polycarbonate membrane with 3 &#181;m pores, determine the existence of mitochondria and examine the maintenance of membrane potential within PMVs using a confocal microscope, concentrate PMVs by centrifugation, and carry out the in vivo injection of PMVs into the gastrocnemius muscle of mice.

Age-related diseases are associated with multiple defects in components of the cytoplasm. Here, we present a protocol to prepare plasma membrane vesicles from bone marrow mesenchymal stem cells. This technique could potentially be used as a means of cytoplasm replacement therapy to ameliorate or even reverse age-associated phenotypes.

הכנת שלפוחית ​​הממברנה פלסמה מן העצם Mesenchymal תאי גזע עבור פוטנציאל החלפת ציטופלזמה

We have previously reported on the generation of plasma membrane vesicles (PMVs) through the mechanical extrusion of mammalian cells. The fusion of PMVs ...

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the mature Schwann cell fate. We subjected rat and human MSCs to transient hypoxic conditions (1% oxygen for 16 h) followed by expansion as neurospheres upon low-attachment substratum with epidermal growth factor (EGF)/basic fibroblast growth factor (bFGF) supplementation. Neurospheres were seeded onto poly-D-lysine/laminin-coated tissue culture plastic and cultured in a gliogenic cocktail containing &#946;-Heregulin, bFGF, and platelet-derived growth factor (PDGF) to generate Schwann cell-like cells (SCLCs). SCLCs were directed to fate commitment via coculture for 2 weeks with purified dorsal root ganglia (DRG) neurons obtained from E14-15 pregnant Sprague Dawley rats. Mature Schwann cells demonstrate persistence in S100&#946;/p75 expression and can form myelin segments. Cells generated in this manner have potential applications in autologous cell transplantation following spinal cord injury, as well as in disease modeling.

Marrow stromal cells (MSCs) with neural potential exist within the bone marrow. Our protocol enriches this population of cells via hypoxic preconditioning and thereafter directs them to become mature Schwann cells.

Hypoxic Preonditioning של תאים יליד מארו נגזר כמקור לדור של תאים שוואן בוגרת

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...