עבודה זו נתמכה על ידי הסוכנות למדע, טכנולוגיה Reasearch מימון Core (כדי JEC).

Open access fees for this article were provided by, Agilent Technologies.

מאמר זה מתאר שיטה להפקה מ moDCs מונוציטים בשלה, moDCs tolerogenic ו moDCs הבוגרת. הצעדים החשובים בפרוטוקול זה נדונים בהרחבה בפסקאות הבאות. חשוב לציין כי דם היקפי אדם משמש כחומר החל בפרוטוקול זה ואמצעי זהירות אוניברסלית לטיפול דם אדם צריך להיות מתורגל. למרות זאת קיים היתכנות טכנית לגזור DCs ממח עצם בבני האדם 24, הבידול במבחנת DC מתאי נמצא בדם היקפי עדיף בשל הזמינות של דם היקפי לעומת מח עצם. בין התאים הנמצאים בדם היקפי, תאי CD34 + גזע hematopoietic ומונוציטים משמשים עבור הדור במבחנה של DCs. CD34 Hematopoietic + תאי גזע בתרבית עם GM-CSF ו- TNF-α לגזור CD1a + ו- CD14 + תת אשר לאחר מכן הם מובחנים יותר לתוך לנגרהנסכמו תאים ותאים דנדריטיים. לעומת זאת, מונוציטים הם בתרבית GM-CSF ו- IL-4 כדי ליצור moDCs בשלה. פרוטוקולים כמה משמשים להעשרת מונוציטים מדם היקפי; למשל, על ידי דבקות צלחות פלסטיק, elutriation וערכות בידוד 25, 26 היתרונות של הפרוטוקול הדבק הם ניזק מינימאלי תאים יחסית חסכוניים תא אולם הטוהר עלול להיות בסיכון.; אשר היוו צעד נוסף נדרש כדי לנתק את התאים עבור ניסויים נוספים. Elutriation היא טכניקה שמפרידה תאים בהתבסס על הגודל והצפיפות שלהם. היתרונות של elutriation הם כדאי תא מונוציטים יכול לשמש בקלות עבור ניסויים נוספים; טכניקת אולם זה מוגבל על ידי הזמינות של elutriator וחוסר היכולת להפריד אוכלוסיות שונות של תאים (T תאים מונוציטים) עם פרמטרי שקיעה דומים. מסחרי ערכות בידוד זמינות לנצל microbeads מגנטי או חיובי לבחור אולבחור את אוכלוסיית monocytic שלילית. כמה פרוטוקולים מוטים כלפי בידוד מונוציטים באמצעות הסלקציה השלילית כמו מונוציטים המבודדים להישאר &quot;נגעו&quot; (לא כבול על ידי סמנים או microbeads). בפרוטוקול זה, חרוזי CD14 שמשו מונוציטים אדם בחרו חיוביים PBMCs. CD14 חסר תחום ציטופלסמית ומחייבת של נוגדנים CD14 אינה מפעילה הולכת אותות. יתר על כן, microbeads יהיה להתנתק מונוציטים אחרי תרבות ומכאן לא לעכב את תהליך הבידול. בנוסף, CD14 מתבטא בחריפות על רוב מונוציטים ו חלוש על נויטרופילים וכמה תאי דנדריטים מיאלואידית, ומכאן שיטה זו של תוצאות בידוד בטהרת תא גבוהה יותר מאשר השיטות האחרות 17. מונוציטים בדם יכול להיות מובחן לתוך DCs או מקרופאגים ועל גורל מונוציטים תלוי במידה רבה על הסביבה ציטוקינים. במאמר זה, moDCs מופקים על ידי הוספת גורם מגרה המושבה מקרופאג-גרנולוציט (GM-CSF) ו- interleukin 4 (IL-4) כדי מונוציטים בדם היקפיים אנושיים. GM-CSF נדרש להישרדות מונוציטים ו- IL-4 מפעילה פעילות מעכבת על בידול מקרופאג; והתוספת קומבינטורית של GM-SCSF ו- IL-4 מונוציטים להניב אחוז גבוה יותר של moDCs בשלה לעומת ציטוקינים הפרט 27. ישנם פרוטוקולים אחרים שיוצרים moDCs ידי הוספת אלפא tumor necrosis factor (TNF-α), אינטרפרון אלפא (IFN-α) ו -13 Interleukin (IL-13) כדי מונוציטים בדם ההיקפי 28, 29, 30. השילוב של GM-CSF ו- IL-4 היה מותאם בשנת 1990 ועכשיו פרוטוקול מקובל שיוצר DCs בשלה פלסטיק מובחן לתוך moDCs immunogenic או tolerogenic ומקוטבת לתוך Th1, moDCs קידום Th2 או TH17. moDCs בשלה הם מובחנים לתוך moDCs tolerogenic על ידי תוספת של ויטמין D3 ו dexamethasone. ישנם מספר פרוטוקולים ליצור DCs tolerogenic למשל, באמצעותגורם-kappa B גרעיני (NF-kB) עיכוב, הפעלה β-קטנין, ויטמין D3, Dexamethasone ו -31 Rapamycin, 32, 33, 34, 35, 9, 36, 37. למרות ששני הוויטמין D3 ו dexamethasone לבד דווחו לגרום שפעת tolerogenic על DCS, השילוב של ויטמין D3 ו תוצאת dexamethasone בתוך דיכוי גדול יותר של alloproliferation מאשר כאשר תרופות פרט משמשות. לכן, בפרוטוקול הקיים עבור הדור של tolerogenic DCs שונה כדי שילוב של ויטמין D3 ו dexamethasone. שיטה זו מתבצעת מקובל כיום כמודל DCs tolerogenic אדם עם תועלת טיפולית. כמו כן, חשוב לציין כי ויטמין D3 מחדש ו dexamethasone יש חיי מדף קצרים. בפרוטוקול זה, lipopolysaccharides (LPS) נוסף כמו inducer התבגרות DC. moDCs בשלה יכולה להיגרם גם בשלה באמצעות קוקטייל פרו-דלקתי:(TNF-α), בטא Interleukin 1 (IL-1β), Interleukin 6 (IL-6) ו- E2 פרוסטגלנדין) או ציטוקינים פרו-דלקתיים (TNF-α ו גמא אינטרפרון (IFN-Γ)). קוקטייל פרו-דלקתיים מייצר moDCs בוגרת עם גבוה שיתוף גירוי ופונקציות נודדות אבל הם מייצרים רמות נמוכות יחסית של IL-12 38. TNF-α או IFN-Γ לבדו אינו מסוגל לעורר פנוטיפ הדנדריטים יציב 39. LPS מגרה כמו-אגרה קולטן 4 (TLR4), מתווכת את ההפעלה של NF-kB ו קינאזות חלבון מופעל mitogen (MAPKs) כדי לגרום התבגרות DC. התבגרות DC המושרה על ידי LPS מראה בתקנה עד סמני התבגרות DC (CD83, CD86, HLA-DR) וגם הובילה את הייצור של IL-12p70. בנוסף, שלב זה יכול להיות שונה יותר לשייך LPS עם אגוניסטים TLR3 לייצר DCs בוגרת חיסונים לסרטן קליניים. במאמר זה, DCS tolerogenic מוצג להיות עמיד בפני התבגרות על טיפול LPS. אלה למחצה להתבגר כמו DCs אינם immunogenic ולעשות לא release הפרו דלקתי ציטוקינים 40. המגבלות של פרוטוקול זה לשכב את תהליך הבידול. התהליך לוקח 8 ימים מהיום 0 עד יום 7 שמהווה קושי להיות מותאם לתוך תפוקה גבוהה מנתח. שינוי בפרוטוקול נדרש לקצר את תהליך הבידול עדיין להניב מספר רב של DCs קיימא במדינות השונות. שנית, הקל DCS מופק על ידי תוספת של ציטוקינים בפרוטוקול זה וציטוקינים אלה לא לקיים אוכלוסיית DC עבור תקופה ארוכה של זמן. יתר על כן, ציטוקינים משמשים בריכוזים גבוהים בהרבה in vivo ועלולה לגרום להתפתחות מוטה של המסלולים שאינם זהים מבחינה פיזיולוגית in vivo DCs. לדוגמא בתרבויות במבחנה של מבשרי DC הוכח להגיב GM-CSF, שאינו ציטוקינים חיוני לבידול נורמלי DC in vivo 41. אף על פי כן, גירוי ציטוקינים יכול להיות שיטה שימושית גןלדרג מספרים גבוהים של DC במבחנה לניסויים. היכולת להכפיף תאים אלה המופקים בפרוטוקול זה כדי ניתוחים אחרים כגון מכתים immunofluorescence, cytometry זרימה, allo מחקרי תגובה ואת חילוף חומרי מחקרים מגדילים את התועלת של שיטה זו. DCs במבחנה אלה לשמש מודל טוב כדי לשפר את הידע של פיתוח DC, התבגרות והצגת אנטיגן וזה קשה לעשות בעבר עם המספרים הנדירים של in vivo DCs. יכולתם של DCs להסדיר חסינות אימונולוגיים לעומת סובלנות גורם להם מועמדים אטרקטיביים הרפוי נגד סרטן ומחלות אוטואימוניות 42, 43, 44, 45. DCs immunogenic שנוצר בפרוטוקול זה יכול לשמש כדי לשפר את יעילות החיסון נגד מחלות זיהומיות וגידולים; בעוד שניתן להשתמש DCs tolerogenic לשלוט בתגובות תא T הרצוי ולמנוע דחיות לאחר השתלה. המורכבאיזון בין חסינות וסובלנות תלוי מאוד על מצב בידול DC. בידול DC הוא תכנית הסלולר ומתואמת נשלטת על ידי מסלולי איתות מרובים גורל מטבולים. מדינות בידול שונים של DC שונה בצרכים bioenergetic וביוסינטזה; למשל, DCS מופעל דורש עיבודים מטבולית אנרגטיים יותר חשובים להישרדות והגירה לעומת DCs ב נח מדינה. חשוב לציין כי ויטמין D3, dexamethasone ו rapamycin ידועים ביכולתם לגרום DCs tolerogenic, תוארו להשפיע מטבוליזם DC. במאמר זה, את חילוף החומרים האנרגטיים של moDCs ממדינות בידול שונות אופיינו באמצעות מנתחי שטף תאיים ו moDCs tolerogenic הציג פלסטיות המטבולית הגבוהה ביותר LPS-induced התבגרות ירד פלסטיות זו. מטבוליזם אנאבוליים תומך התבגרות DCs תוך השפעות חילוף החומרים קטבולי tolerogenic DC מתפקד 46. קל DCSהמופק פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להעריך האם לשנות את המצב מהטבולים של DCs טומן בחובם את מפתח השינוי חסינות וסובלנות רפויה. לסיכום, הצגנו פרוטוקול הדור של בוסר, tolerogenic ובוגרת moDCs חיוני ללימוד פונקציות immunoregulatory &#39;DCs.

DC תוארה לראשונה על ידי פול לנגרהנס (תאי לנגרהנס) במאה התשע עשרה אשר בסימוכין ידי Jolles 1 ומאופיינת ראלף שטיינמן זנוויל כהן בשנת 1973 שזיהו אותם מציגי אנטיגן מקצועיים תאים 2. DCs נמצא בדם היקפי וברוב הרקמות של הגוף, במיוחד בשפע ברקמות חשופות לסביבה החיצונית כמו העור (בהווה כתאים לנגרהנס) ובסופו של רפידות האף, הריאות, הקיבה והמעיים המאפשרות אותם נתקלים אנטיגנים חיצוניים. יש בשלה DCs יכולת endocytic אך יכולת נמוכה יחסית כדי לעורר תאי T 3. בשלה DCs לבטא קולטנים זיהוי דפוסים שונים (PRRs) כי דפוסים מולקולריים ללכוד קשור הפתוגן (PAMPs) או דפוסים מולקולריים הקשורים ניזק (damps) 4. אותות סכנה הפעילו לנהוג הבשלה לקראת DCs immunogenic בעוד מולקולות עצמיות לגרום unresponsivene תא Tss אפופטוזיס 5. DCs immunogenic מאופיין גברת הביטוי של מולקולות MHC ומולקולות משטח שיתוף גירוי ויכולתי תאי T נאיביים ממשלת 6,7. בשלה DCs ניתן גם התבגר כלפי מדינה Treg וישכנע או tolerogenic בתגובה 1a המטבוליט ויטמין D3, 25 (O) 2 D 3 וסוכני אימונוסופרסיבי מסוימים כמו Interleukin-10 (IL-10), dexamethasone ו Rapamycin 8-9. DCs Tolerogenic מאופיין ביטוי immunoreceptor שלהם טירוזין מבוסס מוטיבים מעכבים (ITIMs) המכילים קולטנים ligands שטח. התמרה האות של ITIMs המכילים בני משפחה ILT, ILT3 ו ILT4 ב DCs tolerogenic לעכב alloproliferation ולנסוע Foxp3 + Treg הרחבת 10,11. תכונות ייחודיות אלה של DCs tolerogenic להוביל העצמה העמוקה שלהם in vivo, כלומר את יכולתו להשפיע על סובלנות עמידה שתלי אלוגנאית מושתלי supprESS להתפתחותן של מחלות אוטואימוניות. Tolerogenic DCs ניתן לראות אפוא כמו תת-סוג של DCs בוגרת מקוטב שבו לתפקד בלימת אקטיבציה החיסונית. נכון לעכשיו, יש שני תת הכללי של תאים דנדריטים בדם ההיקפי האנושי: DCS plasmacytoid ו DCs מיאלואידית 12. DCs במחזור הם המהווים נדירים פחות מ -2% של לויקוציטים בדם אנושי וזה מהווה קושי לבידודה של מספר מתאים של DCs ללמוד פונקציות immunoregulatory שלהם. כדי להתגבר על בעיה זו, DCS בדיל מונוציטים משמש מודל במבחנה לחקר תפקוד תאים דנדריטים. יש DCs במבחנה אלה קולטנים פונקציות דומות לעומת in vivo DCs. השוואה מפורטת של in vivo DCS ו ב DCs נגזר מונוציטים שנוצר במבחנה (moDCs) נחקרות על ידי מעבדות אחרות 13, 14, 15. הוא דיווח גם כי moDCs ו- CD1c + DCs היו מקביל ב אנטיגן בהצגת גרימת תפקוד תא T 15. במאמר זה, אנו מתארים שיטה להפקת moDCs בשלה מן מונוציטים בדם ההיקפי ולאחר מכן הבחנה אותם DCs immunogenic ו tolerogenic. מונוציטים נגזרים אלה תאים דנדריטים (moDCs) מאופיינים סמני פני השטח שלהם, פרופיל ציטוקינים, פונקציות immunoregulatory ומדינות מטבולית. תאים דנדריטים immunogenic ו tolerogenic לייצר ציטוקינים שונים אשר לגרום להתרחבות או של תאי T אלוגנאית או תאי T רגולטוריים. במאמר זה, פרופיל ציטוקינים מבוצע עם מערכות בטכנולוגיית זמנית. מדיום של תאי צמיחה מודגרת עם חרוזים בצבעים משותק נוגדן ולקרוא מנתח קומפקטי. מדינות מטבולית של DCs מנותחות באמצעות מנתחי שטף תאיים המודדים שיעור צריכת חמצן, אינדיקטור נשימה תאית, וקצב החמצה תאי משקף glycolyticשטף בתאים דנדריטיים. מדידת שיעורי bioenergetics אלה מספקת אמצעי כדי לעקוב אחר השינויים המטבוליזם תאי שחיוניים בפיתוח תאים דנדריטים ותפקוד.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td>PBMC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>302832</td>
			<td>PBMC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>PBMC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>PBMC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>PBMC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>PBMC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filter</td>
			<td>Sartorius stedim biotech</td>
			<td>17597</td>
			<td>PBMC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACs kit</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>Monocyte enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td>Monocyte enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070103</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15140</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate 
			Buffered Saline</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>10010-031</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>11140-040</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15575</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-093-868</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-093-924</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin D3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1530</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2915</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>l2755</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypan blue</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-conjugated HLADR&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>307628</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated CD80</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557227</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated CD83&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556855</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated CD86&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555665</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated CD11c</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340544</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated CD14&#160;</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-091-242</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated BDCA3&#160;</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-090-514</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated ILT3&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5139-73</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype matched 
			PerCP- conjugated Mab</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400250</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype matched 
			PE- conjugated Mab</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-091-835</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype matched 
			APC- conjugated Mab</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-091-836</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR II Flow Cytometer</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>BD LSR II&#160;</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytofix/cytoperm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/CY7-conjugated CD25</td>
			<td>BD pharmingen</td>
			<td>557753</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/CY7-conjugated CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300512</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-conjugated CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300428</td>
			<td>Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human CD4+ T cell enrichment kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>19052</td>
			<td>Alloreaction study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep magnet&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td>Alloreaction study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Trace CFSE cell proliferation kit</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>C34554</td>
			<td>Alloreaction study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td>Alloreaction study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-conjugated FoxP3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milliplex MAP Human 
			Cytokine/Chemokine 
			magnetic bead panel</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HCYTOMAG-60K</td>
			<td>Cytokine analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td>Cytokine analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Sheath Fluid&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SHEATHFLUID</td>
			<td>Cytokine analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEXMAP 3D system with xPONENT software</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td>FLEXMAP 3D</td>
			<td>Cytokine analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red CMXRos</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>9082</td>
			<td>Mitochondrial activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Mitochondrial activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Assay Medium (OCR)</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>102352-000</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Base Medium (ECAR)</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>102353-100</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrant</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100840-000&#160;</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Cell Mito Stress kit</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Glycolysis Stress kit</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>103020-100</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse&#160;</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>XFe96</td>
			<td>Metabolic adaptation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of immature, mature and tolerogenic dendritic cells with differing metabolic phenotypes

תוצאות תגובה חיסוניות של יחסי גומלין מורכבים בין מערכת החיסון המולדת הלא-specific antigen והמערכת החיסונית אדפטיבית אנטיגן ספציפי. המערכת החיסונית היא איזון מתמיד בשמירה סבילה מולקולות עצמיות ותגובה במהירות לפתוגנים. תאי דנדריטים (DCS) הם תאי מציגי אנטיגן מקצועיים חזקים מקשרים מערכת החיסון המולדת למערכת חיסון אדפטיבית ולאזן את התגובה מסתגלת בין העצמי שאינו עצמי. בהתאם אותות התבגרות, תאים דנדריטים בשלים יכול להיות מגורה באופן סלקטיבי להתמיין DCs immunogenic או tolerogenic. תאי דנדריטים immunogenic לספק אותות התפשטות לתאי T אנטיגן ספציפי עבור שיבוטים; תוך התאים הדנדריטים tolerogenic להסדיר סובלנות על ידי אנטיגן ספציפי T-cell המחיקה או הרחבת המשובטים של תאי T רגולטוריים. בשל מאפיין ייחודי זה, תאים הדנדריטים הם בקשו במיוחד לאחר סוכנים טיפוליים כמו לסרטן dise אוטואימוניותases. תאים דנדריטים ניתן לטעון עם אנטיגנים ספציפיים במבחנה מוזרק לגוף האדם לעלות תגובה חיסונית ספציפית הן immunogenic ו tolerogenic. עבודה זו מציגה אמצעי ליצירת במבחנה מן מונוציטים, תאים דנדריטים בשלים נגזר מונוציטים (moDCs), tolerogenic ו moDCs בוגרת, הנבדלים זה מזה ביטוי סמן פני השטח, פונקציה פנוטיפים מטבוליים.

טיהור מונוציטים ו התמיינות תאים דנדריטים מונוציטים היו מטוהרים מן PBMCs ידי צנטריפוגה צפיפות של דם ההיקפי (איור 1 א), ואחריו CD14 + הפרדה מגנט סלקציה חיובית (איור 1B) ו בתרבית בינונית מלא בנוכחות GM-CSF ו- IL-4 להשיג תאי דנדריטים בשלים ( איור 2 א). תוספת של ויטמין D3 ו dexamethasone פוסט GM-CSF ו- IL-4 הביא את הבידול של moDCs בשלה לתוך moDCs tolerogenic (איור 2 ב). LPS התווסף לגרום להבשלת moDCs בשלה להבשיל moDCs (איור 2 ג) ו moDCs tolerogenic היו מגורה עם LPS לאמת עמידות התבגרות (איור 2 ד). דגימות הדם המשמשות בעבודה זו התקבלו מתורמים בריאים עם קודם הודיעו<html> הַסכָּמָה. אפיון moDC Surface מרקר אפיון על ידי cytometry זרימה ניתוח של סמני משטח DC הראה כי moDCs הבוגרת הביעה את הרמות הגבוהות ביותר של סמני התבגרות HLA-DR, CD83 ו CD86 לעומת moDCs tolerogenic שטופל LPS, moDCs tolerogenic ו moDCs המפותח (איור 3). תוצאות אלו הראו כי moDCs tolerogenic היו עמידים התבגרות לעומת moDCs בשלה בעקבות גירוי LPS. בנוסף, LPS שטופלו moDCs tolerogenic ו moDCs tolerogenic מוצג ביטוי מוגבר של CD14, BDCA3 (CD141) ותעתיקים אימונוגלובולין דמוי (ILT) 3 לעומת moDCs בשלה ובוגרת. MoDCs tolerogenic זה שעוררו כאן עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים 23. יפ-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; אפיון פונקציונלי של moDCs moDCs המושרה על התבגרות להיות immunogenic ולשחרר ציטוקינים המקדמים התפשטות של CD4 + T-תאי. החוקרים העריכו את immunogenicity של תת moDC השונה על ידי מדידת ההתפשטות של תאי T שיתוף תרבותי. MoDCs Tolerogenic היו גרוע immunogenic לעומת moDCs הבוגרת, כפי שמוצג על ידי alloproliferation הנמוך של CD4 + T-תאי (איור 4 א). MoDCs Tolerogenic מאופיין IFN-Γ, נמוך IL-12p40, וגבוה IL-10 ציטוקין ייצור הנמוך שלהם alloreaction שיתוף תרבויות עם CD4 + T לתאים (איור 4B). יתר על כן, הגדלת מספר moDCs tolerogenic ב שיתוף תרבויות של moDCs בוגרת המושרה allospecific CD4 + T-תאים הגדילו את תדירות Foxp3 גבוהה CD25 + תאי T רגולטוריים (איור 4C). <pclass = &quot;jove_content&quot; FO: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; ניתוח של פעילות מיטוכונדריאלי האדום CMXRos משמש כדי לשקף את פעילות המיטוכונדריה לנתח את רמות פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה ב moDCs. MoDCs Tolerogenic נצפה להיות פעילות המיטוכונדריה גבוהה בהשוואה תת הבדיל moDC האחר (איור 5 א). לאחר מכן, שיעור צריכת חמצן המיטוכונדריה (OCR) נבחן עבור תת-הסוגים השונים moDC באמצעות bioanalyzer. מדידות OCR לאפשר תובנה ברזולוציה גבוהות על הפרופיל המטבולי, מתן מידע כולל אך לא מוגבל נשימה בסיסית, קיבולת נשימת חילוף, דליפת פרוטון ונשימה הלא המיטוכונדריה. מדידת OCR מספק אמצעי כדי להעריך את היכולת של התאים להגיב ללחץ. התאים מוטרדים מבחינת מטבולית על ידי התוספת של שלוש תרכובות שונות ברציפות. הזריקה הראשונה היא Oligomycin (מצמד ATP) אשר מעכב V המורכבת של שרשרת העברת אלקטרונים (ETC), מעכב סינתזת ATP. צעד זה שמייחד את אחוז החמצן הנצרך לסינתזת ATP ואחוז החמצן נצרך להתגבר דליפת פרוטון על פני קרום המיטוכונדריה הפנימי. הזריקה השנייה היא FCCP (ETC מאיץ) משבש סינתזת ATP על ידי העברת יוני מימן על פני הקרום המיטוכונדריה במקום דרך ערוץ הפרוטון של V. קומפלקס קריסת פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה מובילה לצריכה מהירה של אנרגיה וחמצן, ללא דור של ATP. טיפול FCCP ניתן להשתמש כדי לחשב את קיבולת הנשימה חילוף של תאים. תחזוקה של קיבולת הנשימה חילוף בתנאי קיצון היא קריטית להישרדות התא. יכולת זו נקבעת על ידי מספר גורמים, לרבות הזמין של מצע היכולת התפקודית של האנזימים מעורבים וכו הזריקה השלישית היא שילוב של Rotenone, Complלשעבר הייתי מעכב, ו Antimycin A, מעכב III מורכב. שילוב זה נכבה נשימת המיטוכונדריאלי ו- OCR הוא ציין להקטין כתוצאה במיטוכונדריה לקויה (איור 5 ג). MoDCs Tolerogenic גילה רמות OCR בסיס גבוהות moDCs הבוגרת (5D איור). בנוסף, tolerogenic, LPS-tolerogenic, ו moDCs בשלה והראו גדילת קיבולת נשימת חילוף לעומת moDCs הבוגרת (איור 5E). אפיון מטבולית של moDCs בגלל חומצה לקטית ופרוטונים משתחררים מתאי במהלך הגליקוליזה, ניתחנו את הפעילות glycolytic של moDCs על ידי ביצוע ניתוח בזמן אמת של שיעור החמצה תאיים (ECAR) (איור 6). בנוכחות גלוקוז, שיעור glycolytic של כל moDCs גדל לעומת השלב הבסיסי, עםmoDCs הבוגרת מפגין שיעור glycolytic גבוה moDCs המפותח (6D איור). Tolerogenic ו moDCs בשלה הציגו הגליקוליזה מקסימלי גבוהה (הנגרמת על ידי oligomycin בנוכחות גלוקוז) לעומת moDCs שטופל LPS (איור 6). קיבולת glycolytic של moDCs tolerogenic ובלתי הבשל הייתה גבוהה יותר מאשר moDCs הבוגרת (איור 6E). בניגוד שיעור glycolytic הגבוהה שלהם, מילואים glycolytic היה הנמוך ביותר מזה moDCs בוגרת (איור 6F). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig1.jpg" /> איור 1:. טיהור מונוציטים מן הדם היקפי (א) 25 מיליליטר של דם מצוי בשכבה בזהירות על 15 מיליליטר של Ficoll לכל 50 מ&quot;ל צינור לפני צנטריפוגה. PBMCs מרוכזים בשכבה מתחת פלזמה לאחר צנטריפוגה צפיפות. (ב) PBMCs מודגרת עם microbeads כי הם conj<html> ugated כדי monoclonal antibodies CD14 האדם (אלוטיפ: עכבר IgG2a). ולאחר מכן הועמסו על עמודה אשר ממוקם בשדה המגנטי של מפריד לבודד CD14 + מונוציטים <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54128/54128fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig2.jpg" /> איור 2: אפיון מורפולוגי של moDCs. (א) 200 ng / ml של GM-CSF ו- IL-4 מתווסף מונוציטים CD14 + מטוהרים ביום 0, 4 ו -6 כדי ליצור moDCs בשלה; ו- (ב) צעד נוסף של גירוי עם 100 ננומטר ויטמין D3 ו -10 ננומטר dexamethasone ביום 5 מייצר moDCs tolerogenic. MoDCs בשלה moDCs tolerogenic מגורה עם 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל LPS ביום 6 שיש להפיק (C) להבשיל moDCs ו (ד) moDCs LPS-tolerogenic.ttps: //www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54128/54128fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig3.jpg" /> איור 3:. אפיון מרקר Surface ידי cytometry זרימה רמות הביטוי של סמנים משטח HLA-DR, CD80, CD83, CD86, CD11, CD14, BDCA3 ו LT3 ב tolerogenic (ירוק), LPS-tolerogenic (שחור), לא בוגר (אדום), בוגרת (כחול) moDCs. שולטת אלוטיפ מוצגים באפור. היסטוגרמה אישי לכל סוג תא זמם עם ספירת תאי ציר Y נגד יומן ציר ה- X של עוצמת fluorophore ומצופית. כל היסטוגרמות מייצגים ארבעה ניסויים בלתי תלויים. נתון זה יש הבדל בין J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10.4049 / jimmunol.1303316 (1 ביוני 2015). לשכפל ו מחדש עם בעלי הזכויות. כל הזכויות שמורות 2015. האגודה האמריקאית שלאימונולוגים, Inc. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54128/54128fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig4.jpg" /> איור 4: אפיון פונקציונלי של moDCs. (א) כימות תדירות alloproliferation של CD4 + T-תאי המושרה על ידי שיתוף תרבות עם מספר גדל והולך של tolerogenic (TOL; ירוק), LPS-tolerogenic (L-TOL; שחור), לא בוגר (IMM; אדום) ובוגרת (MAT ; כחול) moDCs. הנתונים אספו מארבעה ניסויים בלתי תלויים; כלומר הבדלים סטטיסטיים SEM + בין כל moDCs לעומת moDCs בוגרת נותחו על ידי ANOVA דו סטרי עם ניתוח ציטוקין שלאחר מבחן השוואה מרובות Dunnett. (B) של IFN-Γ (פאנל משמאל), IL-12p40 (פאנל באמצע) ו אִי- 10 (בחלונית הימניתיא) supernatants מן alloreactions בין CD4 + T-תאי שיתוף תרבותי עם מספר גדל והולך של מי tolerogenic (ירוק), לא בוגר (אדום) או (כחול) moDCs בוגרת. נתונים היו נקווים משישה ניסויים בלתי תלויים; ממוצע ± SEM (ג) CD4 + T-cell alloproliferation והרחבת תאי T רגולטוריים המושרה על ידי שיתוף התרבות עם moDCs בוגרת בנוכחות של מספר גדל והולך של moDCs tolerogenic. ציר Y שמאלי, תדירות הפצת CD4 + T-cell. ציר Y ימני, תדירות Foxp3 גבוהה CD25 + התאים מגודרים על שגשוג CD4 + T-תאי. הנתונים היו נקווה משלושה ניסויים עצמאיים; ממוצע ± SEM הבדלים סטטיסטיים בין נוכחות מול העדר נוכחות של moDCs tolerogenic נותחו על ידי ANOVA חד כיווני עם שיתוף שלאחר מבחן השוואה מרובות Dunnett. (ד) CD4 + T-cell alloproliferation (שמאל) ותדירות CD25highFoxP3 + תאים (מימין) הנגרמת על ידי תרבות עם moDCs tolerogenicבנוכחות של מספר גדל והולך של moDCs הבוגרת. הנתונים היו נקווים משניים לשלושה ניסויים בלתי תלויים; ± SEM מתכוון הבדלים סטטיסטיים בין הנוכחות מול עדר נוכחות של moDCs הבוגרת נותחו על ידי דו כיוונית ANOVA עם השוואה מרובה Dunnett שלאחר בדיקה. נתון זה יש הבדל בין J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10.4049 / jimmunol.1303316 (1 ביוני 2015). לשכפל ו מחדש עם בעלי הזכויות. כל הזכויות שמורות 2015. האגודה האמריקאית של אימונולוגים, Inc. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54128/54128fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig5.jpg" /> איור 5: ניתוח של מיטוכונדריאלי פעילות של moDCs. (א) רמות של פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה (CMXRos האדום) ב moDCs התקבלו על ידי fניתוח cytometric נמוך. הנתונים של ארבעה ניסויים בלתי תלויים היו נקווה. ממוצע ± SEM (ב) ייצוג סכמטי של נשימה המיטוכונדריאלי בזמן אמת. OCR ניתוח החל נשימת בסיס, לאחר התוספת של oligomycin (עיכוב V מורכב), FCCP (אינדוקצית נשימה מקסימלי), ו rotenone / antimycin תערובת (שרשרת העברת אלקטרונים [ETC] עיכוב). המיטוכונדריה SRC (basal המקסימלי מופחתות נשימה מקסימלי) נגזרת מעקום OCR. (C) מחקר הקינטית נציג של המיטוכונדריה OCR (pmol / min) ב tolerogenic (TOL, ירוק), LPS-tolerogenic (L-TOL, שחור) , לא בוגר (IMM, אדום) ובוגרת (MAT, כחול) moDCs ידי שימוש בחיבור רציף של oligomycin (OLIG), FCCP, ו rotenone / antimycin A (רוט-AA). (ד) כימות OCR הנשימה הבסיס של moDCs ו ( E) לחסוך קיבולת הנשימה של moDCs. הנתונים היו נקוו מחמישה ניסויים בלתי תלויים. ממוצע ± SEמ נתון זה יש הבדל בין J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10.4049 / jimmunol.1303316 (1 ביוני 2015). לשכפל ו מחדש עם בעלי הזכויות. כל הזכויות שמורות 2015. האגודה האמריקאית של אימונולוגים, Inc. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54128/54128fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig6.jpg" /> איור 6: אפיון מטבולית של moDCs. (א) ייצוג סכמטי של הגליקוליזה בזמן אמת. ניתוח ECAR מתחיל מ ECAR הבסיס, שבה התאים הודגרו בתקשורת גלוקוז ללא ואחריו תוספת של גלוקוז (אינדוקציה הגליקוליזה), oligomycin (אשר גורם הגליקוליזה תא מקסימלי ועיכוב V מורכבות), ולבסוף 2-deoxy-D- גלוקוז(עיכוב הגליקוליזה). שיעור glycolytic (האינדוקציה הגליקוליזה המופחתת עבור ECAR הבזליים), קיבולת glycolytic (הגליקוליזה מקסימלי המופחתת עבור ECAR הבזליים), ובמילואי glycolytic (מופחתי הגליקוליזה מקסימלי לזירוז הגליקוליזה) נגזרים מעקום ECAR. (ב) מחקר הקינטית נציג של הגליקוליזה תלויה ECAR (mPH / min) ב tolerogenic (TOL, ירוק), LPS-tolerogenic (L-TOL, שחור), לא בוגר (IMM, אדום), ובוגרת (MAT, כחול) moDCs ידי שימוש בחיבור רציף של גלוקוז (Gluc), oligomycin (OLIG), ו -2 DG. (C) ברים מראים רמות ECAR הבזליים (ד) שיעור glycolytic (E) קיבולת glycolytic, ו- (F) שמורת glycolytic של moDCs. הנתונים היו נקווה משלושה ניסויים עצמאיים; כלומר 6 SEM. הבדלים סטטיסטיים נותחו על ידי ANOVA חד כיווני עם פוסט-מבחן השוואה מרובה Tukey. נתון זה יש הבדל בין J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10.4049 / jimmunol.1303316 (1 ביוני 2015). לשכפל ו מחדש עם בעלי הזכויות. כל הזכויות שמורות 2015. האגודה האמריקאית של אימונולוגים, Inc. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54128/54128fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes at JoVE.com

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.

הדור של בוגר, בוגרת Tolerogenic דנדריטים תאים, עם שינוי פנוטיפים מטבולית

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

generation-immature-mature-tolerogenic-dendritic-cells-with-differing

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

22.9K Views.  Agency for Science, Technology and Research. Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.

Video: Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

פרוטוקול אופטימיזציה עבור transfection יעילה של תאים דנדריטים ללא ההבשלה Cell

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

הדור וסימון של Murine מח עצם הנגזרות תאים דנדריטים עם nanocrystals Qdot ללימודי מעקב

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

בידוד של ריאות תאים דנדריטים עכבר

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be established. The method described below, prepared in accordance with Good Manufacturing Process (GMP) guidelines, is an optimization of the most common ex vivo preparation method for generating large numbers of DCs for clinical studies 2.
Our method utilizes the synthetic TLR 3 agonist Polyinosinic-Polycytidylic Acid-poly-L-lysine Carboxymethylcellulose (Poly-ICLC) to stimulate the DCs. Our previous study established that Poly-ICLC is the most potent individual maturation stimulus for human DCs as assessed by an upregulation of CD83 and CD86, induction of interleukin-12 (IL-12), tumor necrosis factor (TNF), interferon gamma-induced protein 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1), and type I interferons (IFN), and minimal interleukin 10 (IL-10) production.
DCs are differentiated from frozen peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) obtained by leukapheresis. PBMCs are isolated by Ficoll gradient centrifugation and frozen in aliquots. On Day 1, PBMCs are thawed and plated onto tissue culture flasks to select for monocytes which adhere to the plastic surface after 1-2 hr incubation at 37 &deg;C in the tissue culture incubator. After incubation, the lymphocytes are washed off and the adherent monocytes are cultured for 5 days in the presence of interleukin-4 (IL-4) and granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) to differentiate to immature DCs. On Day 6, immature DCs are pulsed with the keyhole limpet hemocyanin (KLH) protein which serves as a control for the quality of the vaccine and may boost the immunogenicity of the vaccine 3. The DCs are stimulated to mature, loaded with peptide antigens, and incubated overnight. On Day 7, the cells are washed, and frozen in 1 ml aliquots containing 4 - 20 x 106 cells using a controlled-rate freezer. Lot release testing for the batches of DCs is performed and must meet minimum specifications before they are injected into patients.

The most commonly used method for generating large numbers of autologous dendritic cells (DCs) for use in tumor immunotherapy is described. The method uses IL-4 and GM-CSF to differentiate DCs from monocytes. The immature DCs are stimulated to mature and then loaded with antigens before they are injected back into the patient.

הכנת תאים דנדריטים גידול Antigen טעון בוגרים לחיסוניים

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H mice using ALDEFLUOR/ALDH as a marker, and tested their immunogenicity using the cell lysate as a source of antigens to pulse dendritic cells (DCs). DCs pulsed with ALDHhigh CSC lysates induced significantly higher protective antitumor immunity than DCs pulsed with the lysates of unsorted whole tumor cell lysates in both models and in a lung metastasis setting and a s.c.&#160;tumor growth setting, respectively. This phenomenon was due to CSC vaccine-induced humoral as well as cellular anti-CSC responses. In particular, splenocytes isolated from the host subjected to CSC-DC vaccine produced significantly higher amount of IFN&#947; and GM-CSF than splenocytes isolated from the host subjected to unsorted tumor cell lysate pulsed-DC vaccine. These results support the efforts to develop an autologous CSC-based therapeutic vaccine for clinical use in an adjuvant setting.

Evaluated in syngeneic immunocompetent hosts, cancer stem cell (CSC) based dendritic cell (DC) vaccine demonstrated significantly higher antitumor immunity than traditional DC vaccines pulsed with heterogeneous bulk tumor cells.

יצירת חיסון חדשני לתאים דנדריטיים באמצעות מלנומה ותאי גזע סרטניים קשקשיים

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

תאי T ללכוד חיידקים על ידי Transinfection מתאים דנדריטים

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during inflammatory responses. Unfortunately, study of pDC function is hindered by their low frequency in lymphoid organs, and existing methods for in vitro DC generation predominantly favor the production of cDCs over pDCs. Here we present a unique approach to efficiently generate pDCs from common lymphoid progenitors (CLPs) in vitro. Specifically, the protocol described details how to purify CLPs from bone marrow and generate pDCs by coculturing with &#947;-irradiated AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. A unique characteristic of this culture system is that the CLPs migrate underneath the AC-6 cells and become cobblestone area-forming cells, a critical step for expanding pDCs. Morphologically distinct DCs, namely pDCs and cDCs, were generated after approximately 2 weeks with a composition of 70-90% pDCs under optimal conditions. Typically, the number of pDCs generated by this method is roughly 100-fold of the number of CLPs seeded. Therefore, this is a novel system with which to robustly generate the large numbers of pDCs required to facilitate further studies into the development and function of these cells.

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

במבחנה הדור של תאי דנדריטים Murine Plasmacytoid מנפוצים הלימפה אבות באמצעות מערכת מזין AC-6

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

דור וזיהוי GM-CSF נגזר מכתשיים דמוי מאקרופאגים דנדריטים תאי עכבר מח עצם

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

דור של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים מן הדם מלא

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...