This work was funded in part by NIH R01 #DE021475 to CTM and an NSF Graduate Research Fellowship to NAE. Thanks to Miles Johnson for assistance with imaging and Priscilla Erickson for critical reading of the manuscript.

כל העבודה דגים אושרה על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש מאוניברסיטת קליפורניה-ברקלי (מספר פרוטוקול R330). המתת חסד בוצעה באמצעות טבילה 0.025% Tricaine-S שנאגרו עם 0.1% נתרן ביקרבונט 39. כל השלבים מבוצעים בטמפרטורת החדר. 1. הכנה הערה: בצע את פעולות 1.1-1.5 צינורות חרוטים או צלוחיות נצנץ שיכול לאטום בחוזקה להיות מונח אופקי. דגים לא צריכים להיות מזועזע כל הזמן, אבל מנסה לערבב הפתרון לעתים קרובות ככל האפשר על ידי היפוך בעדינות או טלטול מתלה של צינורות או צלוחיות לחשוף את כל הצדדים של הדג לפתרון מכתים ולאפשר כתם לחדור לרקמה שווה. אל תניחו קבוצה גדולה של דגים על שייקר פלטפורמה, כמו המשקל הכבד של הנוזל ישבור שייקר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן או דג טרי מורדם או דגים מאוחסן אתנול עם 10% Neutral שנאגר פורמלין (NBF) הלילה. לחלופין, להשתמש 4% paraformאלדהיד בתמיסה 1x PBS במקום 10% NBF. הערה: אם להפיק ממנה DNA, קליפ חלק קטן של סנפירי זנב או חזה לפני הקיבוע ולאחסן באתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך לתקן כראוי במנדף כימי ולהחליף עם מי ברז (כלומר ~ pH 7.0) עבור 2 שעות. הימנע משימוש במי דה מיונן כפי שקרה לעתים קרובות יכול להיות חומצי יכול decalcify עצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר מים ודגי כתם עם 0.008% Alizarin האדום S ב 1% KOH במים למשך 24 שעות. עבור דגים פחות מ -20 מ&quot;מ אורך סטנדרטי, השתמש 0.004% Alizarin האדום ס (ערוך 100x (פתרון מניות 0.8%) של Alizarin האדום S אז מה שיכול להיות מדולל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כתם (הצבת מיכל פסולת המתאים במנדף) ודגים המקום במי ברז למשך מספר שעות. שינוי מים לפי הצורך עד לשטוף במים הוא בעיקר ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סור דגי מים ומקום לתוך 50% גליצרול, 0.25% KOH לסליקה עדינה לנתיחה שלאחר מכן. הערה: פרוטוקול מכתים זה שונה מן השיטות שתוארו קודם לכן 40,41. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Dissection הערה: ראה איור 1 עבור סקירה של מורפולוגיה שלד ראש רלוונטי. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54056/54056fig1.jpg" /> איור 1:. קוצן ראש מורפולוגיה שלד Alizarin האדום מוכתם ראש קוצן threespine צלם עם קרינה תחת סט מסנן rhodamine B. מורפולוגיה שימושיים מתויג: אופ = opercle, Subop = subopercle, BSRs = branchiostegal קרני, Preop = preopercle, Infraorb 1-3 = 1-3 infraorbital (circumorbitals המכונה גם או suborbitals), דנט = dentary, Premax = premaxilla, מקס = maxilla נאס, = אף, לאט. ethm = לרוחב כִּברָתִי, Psph = parasphenoid, Fron = העצם הפרונטלית. לתיאור מפורט יותר של השלד ראש קוצן, לראות אנקר (1974) 31. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54056/54056fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של</a>נתון זה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הדג השטוח (איור 2 א) וכנס המלקחיים של השען # 5 חד לתוך הצד של העין בזווית של 45 מעלות ~ לנקב את הקרום המכסה את העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקלף את הקרום הרחק מן העין, דומה לקליפת מכסת יוגורט (איור 2 ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מלקחיים פתוחים מאחורי העין, לאחוז את עצב הראייה מאחורי העין, ולהסיר את העין (איור 2 ג). אין לנקב את העין כפי שהוא ידלוף מלנין. אם ניקב, מלנין ניתן נשטף במהלך השלבים מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על צד שני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל האחורי, למקום להב מספריים לנתח קטן אחד תחת כנף opercle, להב מספריים גרור dorsally מעל opercle, ואז לחתוך רקמות רכות ועד ארובת העין (איור 2 ד). חותכים הגבו עד עצם opercle. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את העצם הפרונטלית (גב אל ארובת העין) (איור 2E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את העצם parasphenoid קו האמצע סביב tהוא המרכז של ארובת העין (איור 2F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך opercle חוזר על הצד שכנגד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מלקחיים תחת opercle ולאט לאט לקלף את הפנים מהגוף, זמירה כל רקמות רכות עדיין מחוברות (2G איור - H). שים לב שלא לשבש את השורה הראשונה של rakers זימים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מלקחיים, לנתק את ceratohyals משני הצדדים מן basihyal קו האמצע תוך קילוף והסרה של שלד craniofacial קדמית (הלסת כולה כולל dentary, premaxilla, ו maxilla; השלד hyoid כולו כולל opercle עורי החיצוני, preopercle, subopercle, ו קרן branchiostegal ואת הגב שבבסיס ואלמנטי endochondral גחון; והחלק הקדמי של הגולגולת כולל האף, כִּברָתִי לרוחב, ועצמות infraorbital, ראה איורים 1 ו 2I). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קוצי אגן יכולים להיות מקופלים החוצה מהגוף, ויכולים לשמש כידית עבור מלקחיים לאחוז of כאשר ההווה. שדרות ננעלו במקומו. כדי לבטל את הנעילה, משוך בעדינות את עמוד שדרה עם מלקחיים ישירות מגוף דגים, אז בעדינות לכופף בדיעבד ללחוץ עמוד שדרה שטוחה נגד דגים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכניסו נסגר מלקחיים אחוריים גחון לשלד branchial (ממש מתחת צינור מעיים) ו מלקחיים גרורים קדמי, מתגרים לגזרים את השרירים ורצועות הנותרים המקובעים לשלד branchial (האיור 2J - K). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קצות מלקחיים סגורים, לגרד ממנו את שרירי הצמדת השלד הגבה branchial אל braincase הגחון בתוך אחורי לכיוון קדמי (האיור 2L). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על 2.9 ו 2.10 על הצד שכנגד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחוז בבסיס צינור המעיים ולמשוך anteriorly להסיר את הצינור שלד ובמעיים branchial (איור 2M - N). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את צינור המעיים על ידי יצירת האחורי חתך בניצב סוף ceratobranchial החמישי (איור 2 טו </strong&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת כל שברי עצמות שנותרו מן braincase בצד הגבי של שלד branchial, הכנס מספריים לתוך סל branchial לעשות חתך הגבה (חיתוך קדמי אל אחורי) בין הסטים הבילטרליים של צלחות שן הגבה (איור 3 א - ד). ודא לחתוך מרוכז כדי למנוע נזק לוחות השן הגבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות שני חתכים לרוחב רדודים לומן המעי גומי בקצה האחורי של השלד branchial (הקצה הקדמי של צינור המעיים) כדי לסייע עם פתיחת שלד branchial (איור 3E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח דגים וכל פיסות הרקמה לתוך צנצנת והניח שלד branchial לתוך צינור microcentrifuge עם גליצרול 50%, 0.25% KOH להמשיך סליקה עדינה, או גליצרול 100% אם לא סליקה נוספת נדרשת. צנצנות וצינורות תווית עם מזהה ייחודי, כך שניתן יהיה לעקוב. סכום סליקה הנדרש הוא בעיקר פונקציה של הגודל של הדגים, דגים בוגרים גדולים (מעל 40 מ &#39;מ &#39;אורך סטנדרטי) בדרך כלל לחייב סליקה נוספת. </li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54056/54056fig2.jpg" /> איור 2:. לנתיחת שלד branchial קוצן Alizarin האדום מוכתם דגי קוצן threespine מוכנים לנתיחה. עין depigmented מ סליקה נרחבת. חצים כחולים מציינים את כיוון התנועה. (א) להציג לרוחב של ראש קוצן, הקדמי הוא בצד ימין. (ב) הסרת קרום המכסה את העין. (ג) הסרת העין. (ד) הגבה לחתוך מעל opercle. (E) לחתוך עצם פרונטאלית. (F) Parasphenoid לחתוך. (G - אני) הסרת שלד הפנים. (J) הסרת חיבורי רקמות רכות שלד branchial גחון. (K - L) הסרת חיבורי שלד הגבה branchial. (&lt;strong&gt; M - N) הסרת שלד branchial. (O) הפרד את צינור המעיים מן השלד branchial. עיין בשלבים 2.1 דרך 2.16 לפרטים נוספים. סרגל קנה מידה = 5 מ&quot;מ. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54056/54056fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 3. שלד branchial מחדש מכתים (במידת הצורך) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכתים את כהה שלד branchial או רקמות ברורות יותר, להסיר גליצרול 50%, פתרון KOH 0.25% ולשטוף עם 1% KOH פעמים (לשטוף אחד חמש דקות ואחריו לשטוף את שני 24 שעות תוך רעד אופקי על שייקר פלטפורמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר 1% KOH מחדש כתם עם 0.008% Alizarin האדום S ב KOH 1% למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כתם ולהחליף עם KOH 1% למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון KOH ולהחליף עם 50% גליצרול, 0.25% KOH. </li></ol> 4. הרכבת branchial שלד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר שלד branchialמ גליצרול 50%, 0.25% KOH או 100% גליצרול מקום קרוב לתחתית של תלוש כיסוי זכוכית 22 מ&quot;מ x 60 מ&quot;מ עם הצד הגבי פונה כלפי מעלה (איור 3F). הוסף כמה טיפות של גליצרול 50%, 0.25% KOH או 100% גליצרול על גבי שלד branchial. אם מעבר מ 50% גליצרול, 0.25% KOH ל -100% גליצרול, פתרון שינוי בצינור microcentrifuge ולנער עבור&gt; 5 דקות לפני הרכבה לאזן רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרדדי שני כדורים קטנים של פלסטלינה ומניח על קצוות של להחליק את המכסה לפעול כמו מפרידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רופף במקום coverslip שני על גבי בלחץ חזק מספיק כדי לשטח את שלד branchial הקדמי (האיור 3G). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיל לפתוח את דש הגבי עזב כולל צלחות שן מגבות, לרדד, וחלק בין coverslips (האיור 3H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טכניקה חזור עם דש הגבי תקין ולדחוף השלד כולו branchial מהקצה של coverslip (איור 3I). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנותבאופן מקורי, להחזיק דשי הגבי של חלל פתוח עם מלקחיים ובזהירות מקום coverslip על, משטח את שלד branchial בתנועה אחת חלקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, הר השלד branchial הפוך על תלוש לכסות אחד, מפשק אותן למעלה ולמטה בכל צד הגב החוצה רוחבית כך כוח המשיכה אינו מאפשר השלד branchial לסגור לגבות. ואז לכסות עם תלוש כיסוי הזכוכית שני 22 מ&quot;מ x 60 מ&quot;מ ו להפוך הכנה. הערה: טכניקות הרכבה שונות נוהגות לעבוד טוב יותר או גרוע יותר עבור כל אדם. נסה כל ולראות מה מרגיש הכי נוח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ קל על coverslip העליון לשטח כדורי חימר מספיק כדי לשמור על שלד branchial הרכוב שטוח, אך היזהרו שלא למחוץ את הדגימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תהליך ההרכבה, ceratobranchials יכול לסובב לטשטש שורה של rakers. תרופה זו על ידי הזזה מלקחיים בין coverslips מחדש המכוונת את ceratobranchials או שלד branchial כולו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות preps שטוחה במגשי שקופית roטמפרטורת אום. רכוב גליצרול 100%, ניתן לאחסן preps בין coverslips לגשר במשך עשור לפחות. מלקחיים ומספריים נקיים עם isopropanol או אתנול וטיפי כיסוי. </li></ol><img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54056/54056fig3.jpg" /> איור 3:. שטוח הרכבת שלד branchial המניפולציה ואת ההרכבה של שלד branchial מוצג. חצים כחולים מציינים את כיוון התנועה. (א) branchial הגבה שלד למעלה בצד. (B - D) סיבוב חתך בין לוחות שן הגבה. (E), קיצוץ רוחבי ברקמות רכות להמשיך לפתוח את הבסיס של צינור הבטן. (F) שלד branchial ממוקם בחלק התחתון של coverslip מוכן גובר. (G) coverslip השנייה מונחת על החצי הקדמי של שלד branchial (מעל צלחות שן מגבות). (H - I)הרכבה שטוחה של שלד branchial ידי דשי צלחת שן הגבה פתיחת זזה בין שני תלושים לכסות. עיין בשלבים 4.1 עד 4.6 לפרטים נוספים. סרגל קנה מידה = 5 מ&quot;מ. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54056/54056fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<ol>
	<li>Cooper, W. J., Westneat, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Form+and+function+of+damselfish+skulls:+rapid+and+repeated+evolution+into+a+limited+number+of+trophic+niches.">Form and function of damselfish skulls: rapid and repeated evolution into a limited number of trophic niches.</a> BMC Evol. Biol. 9 (24), (2009).</li><li>Albertson, R. C., Kocher, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+developmental+basis+of+cichlid+trophic+diversity.">Genetic and developmental basis of cichlid trophic diversity.</a> Heredity. 97 (3), 211-221 (2006).</li><li>Martin, C. H., Wainwright, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophic+novelty+is+linked+to+exceptional+rates+of+morphological+diversification+in+two+adaptive+radiations+of+cyprinodon+pupfish.">Trophic novelty is linked to exceptional rates of morphological diversification in two adaptive radiations of cyprinodon pupfish.</a> Evolution. 65 (8), 2197-2212 (2011).</li><li>Wainwright, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+pharyngognathy:+A+phylogenetic+and+functional+appraisal+of+the+pharyngeal+jaw+key+innovation+in+labroid+fishes+and+beyond.">The evolution of pharyngognathy: A phylogenetic and functional appraisal of the pharyngeal jaw key innovation in labroid fishes and beyond.</a> Syst. Biol. 61 (6), 1001-1027 (2012).</li><li>Sibbing, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+capture+and+oral+processing.">Food capture and oral processing.</a> Cyprinid Fishes. , 377-412 (1991).</li><li>Bell, M., Foster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Evolutionary Biology of the Threespine Stickleback. , (1994).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+development+of+facial+bone+morphology+in+threespine+sticklebacks.">Evolution and development of facial bone morphology in threespine sticklebacks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (16), 5791-5796 (2005).</li><li>Mcgee, M. D., Wainwright, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+evolution+as+a+generator+of+phenotypic+diversity+in+threespine+stickleback.">Convergent evolution as a generator of phenotypic diversity in threespine stickleback.</a> Evolution. 67 (4), 1204-1208 (2013).</li><li>McGee, M. D., Schluter, D., Wainwright, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+basis+of+ecological+divergence+in+sympatric+stickleback.">Functional basis of ecological divergence in sympatric stickleback.</a> BMC Evol. Biol. 13, 277 (2013).</li><li>McGuigan, K., Nishimura, N., Currey, M., Hurwit, D., Cresko, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+genetic+variation+in+static+allometry+in+the+threespine+stickleback.">Quantitative genetic variation in static allometry in the threespine stickleback.</a> Integr. Comp. Biol. 50 (6), 1067-1080 (2010).</li><li>Caldecutt, W. J., Bell, M. A., Buckland-Nicks, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+dimorphism+and+geographic+variation+in+dentition+of+threespine+stickleback,+Gasterosteus+aculeatus.">Sexual dimorphism and geographic variation in dentition of threespine stickleback, Gasterosteus aculeatus.</a> Copeia. 2001 (4), 936-944 (2001).</li><li>Berner, D., Moser, D., Roesti, M., Buescher, H., Salzburger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+architecture+of+skeletal+evolution+in+european+lake+and+stream+stickleback.">Genetic architecture of skeletal evolution in european lake and stream stickleback.</a> Evolution. 68 (6), 1792-1805 (2014).</li><li>Jamniczky, H. a., Barry, T. N., Rogers, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eco-evo-devo+in+the+study+of+adaptive+divergence:+examples+from+threespine+stickleback+(Gasterosteus+aculeatus).">Eco-evo-devo in the study of adaptive divergence: examples from threespine stickleback (Gasterosteus aculeatus).</a> Integr. Comp. Biol. 55 (1), 166-178 (2015).</li><li>Magnuson, J., Heitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gill+raker+apparatus+and+food+selectivity+among+mackerels,+tunas,+and+dolphins.">Gill raker apparatus and food selectivity among mackerels, tunas, and dolphins.</a> Fish. Bull. 69 (2), 361-370 (1971).</li><li>Kahilainen, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+gill+raker+number+variability+in+adaptive+radiation+of+coregonid+fish.">The role of gill raker number variability in adaptive radiation of coregonid fish.</a> Evol. Ecol. 25 (3), 573-588 (2011).</li><li>Arnegard, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+ecological+divergence+during+speciation.">Genetics of ecological divergence during speciation.</a> Nature. 511 (7509), 307-311 (2014).</li><li>Gross, H. P., Anderson, J. M., Gross, H. P., Anderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geographic+variation+in+the+gillrakers+and+diet+of+European+threespine+sticklebacks,+Gasterosteus+aculeatus.">Geographic variation in the gillrakers and diet of European threespine sticklebacks, Gasterosteus aculeatus.</a> Copeia. 1984 (1), 87-97 (1984).</li><li>Hagen, D., Gilbertson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geographic+variation+and+environmental+selection+in+Gasterosteus+aculeatus+L+in+the+Pacific+Northwest,+America.">Geographic variation and environmental selection in Gasterosteus aculeatus L in the Pacific Northwest, America.</a> Evolution. 26 (1), 32-51 (1972).</li><li>McPhail, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecology+and+evolution+of+sympatric+sticklebacks+(Gasterosteus):+morphological+and+genetic+evidence+for+a+species+pair+in+Enos+Lake,+British+Columbia.">Ecology and evolution of sympatric sticklebacks (Gasterosteus): morphological and genetic evidence for a species pair in Enos Lake, British Columbia.</a> Can. J. Zool. 62 (7), 1402-1408 (1984).</li><li>Schluter, D., McPhail, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+character+displacement+and+speciation+in+sticklebacks.">Ecological character displacement and speciation in sticklebacks.</a> Am. Nat. 140 (1), 85-108 (1992).</li><li>Robinson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trade+offs+in+Habitat-specific+foraging+efficiency+and+the+nascent+adaptive+divergence+of+sticklebacks+in+lakes.">Trade offs in Habitat-specific foraging efficiency and the nascent adaptive divergence of sticklebacks in lakes.</a> Behaviour. 137 (7), 865-888 (2000).</li><li>Glazer, A. M., Cleves, P. A., Erickson, P. A., Lam, A. Y., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+developmental+genetic+features+underlie+stickleback+gill+raker+evolution.">Parallel developmental genetic features underlie stickleback gill raker evolution.</a> Evodevo. 5 (1), (2014).</li><li>Miller, C. T., Glazer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+skeletal+evolution+in+sticklebacks+is+controlled+by+additive+and+clustered+quantitative+trait+loci.">Modular skeletal evolution in sticklebacks is controlled by additive and clustered quantitative trait loci.</a> Genetics. 197 (1), 405-420 (2014).</li><li>Glazer, A. M., Killingbeck, E. E., Mitros, T., Rokhsar, D. S., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+assembly+improvement+and+mapping+convergently+evolved+skeletal+traits+in+sticklebacks+with+Genotyping-by-Sequencing.">Genome assembly improvement and mapping convergently evolved skeletal traits in sticklebacks with Genotyping-by-Sequencing.</a> G3. 5, 1463-1472 (2015).</li><li>Wainwright, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+morphology+of+the+pharyngeal+jaw+apparatus.">Functional morphology of the pharyngeal jaw apparatus.</a> Fish Physiol. Fish Biomech. , 77-102 (2006).</li><li>Hulsey, C. D., Fraser, G. J., Streelman, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+development+of+complex+biomechanical+systems:+300+million+years+of+fish+jaws.">Evolution and development of complex biomechanical systems: 300 million years of fish jaws.</a> Zebrafish. 2 (4), 243-257 (2005).</li><li>Lauder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+design+and+evolution+of+the+pharyngeal+jaw+apparatus+in+euteleostean+fishes.">Functional design and evolution of the pharyngeal jaw apparatus in euteleostean fishes.</a> Zool. J. Linn. Soc. 77, 1-38 (1983).</li><li>Fraser, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ancient+gene+network+is+co-opted+for+teeth+on+old+and+new+jaws.">An ancient gene network is co-opted for teeth on old and new jaws.</a> PLoS Biol. 7 (2), e1000031 (2009).</li><li>Stock, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+dentition+in+comparative+context.">Zebrafish dentition in comparative context.</a> J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 308, 523-549 (2007).</li><li>Liem, K., Greenwood, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+approach+to+the+phylogeny+of+the+pharyngognath+teleosts.">A functional approach to the phylogeny of the pharyngognath teleosts.</a> Am. Zool. 21 (1), 83-101 (1981).</li><li>Anker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+kinetics+of+the+head+of+the+stickleback,+Gasterosteus+aculeatus.">Morphology and kinetics of the head of the stickleback, Gasterosteus aculeatus.</a> Trans. Zool. Soc. London. 32 (5), 311-416 (1974).</li><li>Meyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometrics+and+allometry+in+the+trophically+polymorphic+cichlid+fish,+Cichlusomu+citrinelfum:+Alternative+adaptations+and+ontogenetic+changes+in+shape.">Morphometrics and allometry in the trophically polymorphic cichlid fish, Cichlusomu citrinelfum: Alternative adaptations and ontogenetic changes in shape.</a> J. Zool., Lond. 221, 237-260 (1990).</li><li>Huysseune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+plasticity+in+the+lower+pharyngeal+jaw+dentition+of+Astatoreochromis+alluaudi+(Teleostei:+Cichlidae).">Phenotypic plasticity in the lower pharyngeal jaw dentition of Astatoreochromis alluaudi (Teleostei: Cichlidae).</a> Arch. Oral Biol. 40 (11), 1005-1014 (1995).</li><li>Muschick, M., Indermaur, A., Salzburger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+Evolution+within+an+adaptive+radiation+of+cichlid+fishes.">Convergent Evolution within an adaptive radiation of cichlid fishes.</a> Curr. Biol. 22 (24), 2362-2368 (2012).</li><li>Cleves, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolved+tooth+gain+in+sticklebacks+is+associated+with+a+cis-regulatory+allele+of+Bmp6.">Evolved tooth gain in sticklebacks is associated with a cis-regulatory allele of Bmp6.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (38), 13912-13917 (2014).</li><li>Ellis, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+developmental+and+genetic+mechanisms+underlie+convergently+evolved+tooth+gain+in+sticklebacks.">Distinct developmental and genetic mechanisms underlie convergently evolved tooth gain in sticklebacks.</a> Development. (142), 2442-2451 (2015).</li><li>Tucker, A. S., Fraser, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+developmental+diversity+of+tooth+regeneration.">Evolution and developmental diversity of tooth regeneration.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 25-26, 71-80 (2014).</li><li>Erickson, P. A., Glazer, A. M., Cleves, P. A., Smith, A. S., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+developmentally+temporal+quantitative+trait+loci+underlie+convergent+evolution+of+increased+branchial+bone+length+in+sticklebacks.">Two developmentally temporal quantitative trait loci underlie convergent evolution of increased branchial bone length in sticklebacks.</a> Proc. R. Soc. B. 281, (2014).</li><li>Leary, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. , (2013).</li><li>Bell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+phenetics+and+genetics.">Evolutionary phenetics and genetics.</a> Evol. Genet. Fishes. , 431-528 (1984).</li><li>Taylor, W. R., Van Dyke, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+procedures+for+staining+and+clearing+small+fishes+and+other+vertebrates+for+bone+and+cartilage+study.">Revised procedures for staining and clearing small fishes and other vertebrates for bone and cartilage study.</a> Cybium. 9 (2), 107-119 (1985).</li><li>Erickson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+190+base+pair,+TGF-&#946;+responsive+tooth+and+fin+enhancer+is+required+for+stickleback+Bmp6+expression.">A 190 base pair, TGF-&#946; responsive tooth and fin enhancer is required for stickleback Bmp6 expression.</a> Dev. Biol. 401 (2), 310-323 (2015).</li><li>Miller, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cis-Regulatory+changes+in+Kit+ligand+expression+and+parallel+evolution+of+pigmentation+in+sticklebacks+and+humans.">cis-Regulatory changes in Kit ligand expression and parallel evolution of pigmentation in sticklebacks and humans.</a> Cell. 131 (6), 1179-1189 (2007).</li><li>Aigler, S. R., Jandzik, D., Hatta, K., Uesugi, K., Stock, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+constraint+underlie+irreversibility+of+tooth+loss+in+cypriniform+fishes.">Selection and constraint underlie irreversibility of tooth loss in cypriniform fishes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (21), 7707-7712 (2014).</li><li>Pasco-Viel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+trends+of+the+pharyngeal+dentition+in+Cypriniformes+(Actinopterygii+Ostariophysi).">Evolutionary trends of the pharyngeal dentition in Cypriniformes (Actinopterygii Ostariophysi).</a> PLoS One. 5 (6), e11293 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

The branchial skeleton is a complex set of bones in the throat of a fish that manipulates, filters, and masticates food items on their way to the esophagus. Many interesting trophic traits including the patterning of gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones vary across and within species. The majority of these traits are difficult to near impossible to accurately measure with the branchial skeleton in situ (e.g., gill raker length, branchial bone length). This flat-mounting protocol places all branchial skeletal elements in a simple two-dimensional plane for ease of imaging and quantification of multiple traits. 
One limitation of this protocol is that although teeth, gill rakers, and most endochondral bones within this flat-mounted two-dimensional prep can be easily imaged and quantified, the second through fourth epibranchials, that have much more three-dimensional shapes, are not easily visualized and would require additional dissection to accurately measure. A second limitation of this protocol is the method is minimally destructive to the fish head. However, only two bones are damaged with a single cut each, the parasphenoid and the frontal bone. All other craniofacial skeletal elements can be returned to and measured at later points in time.
This protocol, although developed for sticklebacks, can be used in many other fish species, although sometimes modifications are necessary. For example, some fish species like zebrafish have a non-ossified dorsal chewing pad44 requiring the dorsal cut to be lateral, around this plate. The posterior end of the fifth ceratobranchial is curved is some species (e.g., zebrafish and other Cypriniformes) and must be trimmed or much larger clay spacers used to allow flat mounting. Particularly large specimens can be mounted between two pieces of glass or acrylic in the same manner. Species with a particularly thick epithelial layer covering tooth plates can be restained and cleared after dissection or more aggressively cleared with 2% KOH. Fish in this situation may also be presoaked in 1 or 2% KOH prior to Alizarin staining to increase dye penetrance. 
An alternative more technologically advanced method for imaging the branchial skeleton is Micro Computed Tomography (&#181;CT)23,45. However, &#181;CT requires an expensive scanner, is much more time consuming, and requires considerable training. Instead, this dissection protocol is inexpensive, quick, and amenable to high throughput studies required for quantitative studies such as quantitative trait loci (QTL) mapping genomic regions controlling evolved changes in craniofacial patterning. Additionally, these dissections can be performed at any larval or adult time point22,35,36,38 to study skeletal development. Although fish head anatomy is complex, this simple protocol allows easy visualization of the internal branchial skeleton, a critically important component of trophic morphology.

סכום מדהים של מגוון קיים בשלד הראש בין חוליות, במיוחד בקרב דגים. במקרים רבים המגוון הזה הופך לפשוט אסטרטגיות האכלה שונות 1 - 4, והוא יכול לכלול שינויים משמעותיים הוא דפוסי craniofacial חיצוניים ופנימיים. שלד branchial ממוקם באופן פנימי בגרון של דג והמקיף ביותר של חלל buccal. שלד branchial מורכב 5 מקטעים הומולוגיים סדר, הקדמיים וארבעת מהם לתמוך הזימים. יחד חמישה קטעים אלה כממשק בין דגים ופירות שלהם 5. וריאצית שפע של תכונות כולל rakers זימים, שיני בלוע, ועצמות branchial לתרום ליקוט יעיל על סוגים שונים של מזון. הקוצנים עברו קרינה אדפטיבית לאחר צורות אושיאניק האבות יישבו אגמי מים מתוקים ונחלים ברחבי חצי הכדור הצפוני. המעבר בתזונהמ זואופלנקטון קטן באוקיינוס ​​כדי טרף גדול במים מתוקים הביא וריאציה trophic דרמטית תכונות כמה craniofacial 6. בעוד מחקרים רבים התמקדו על הבדלי craniofacial חיצוניים הקוצנים 7 - 13, שינויי craniofacial חשובים להתפתח שוב ושוב בשלד branchial הפנימי. היכולת ליצור כלאיים פורים בין אוכלוסיות קוצן ברורות מורפולוגית מספקת הזדמנות מצוינת כדי למפות את הבסיס הגנטי של שינויים התפתחו עד שלד branchial. תכונה אחת trophic של משמעות אקולוגית היא הדפוסים של rakers זימים, עצמות עורי תקופתיות המרפדות את פניהם הקדמיים וגם אחוריים של עצמות branchial ומשמשים לסנן פריטים טרפים. דגים כי בדרך כלל ניזונים טרף קטנים נוטים להיות יותר ויותר בצפיפות הזימים במרווחים rakers לעומת דגים הניזונים טרף גדול יותר 14,15. וריאציה rakers הזימים דווחה הן within ובין מיני 14-19, והיבטים של דפוסי מגרפות זימים לתרום נישות trophic וכושר 16. עשרות שנים של מחקר תיעדו בהרחבה מספר זיז הזים וריאציה בהרחבה הקוצנים threespine 17 - 21; עם זאת, מחקרים אלה מתמקדים בדרך כלל בשורה הראשונה של rakers זימים. מחקר שנערך לאחרונה הוכיח מודולריות בבקרה הגנטית של מספר מגרפות זימים פני שלד branchial 22,23 ועל פני שורה אחת מגרפות זימים ריווח 23 ואורך 24 המדגיש את החשיבות של לימוד יותר משורה אחת או מגרפות זימים אחת להבין את בסיס גנטי ההתפתחותי של הפחתת מגרפות זימים. אחת מתכונותיהן trophic שניות של שניהם המשמעות האקולוגית ביו הן הדפוסים של שיניים בלועות. שיני דגים יכולות להיות ממוקמות בשני הלסת האוראלית בשלד branchial, המכונות שיני בלוע. שיני Oral משמשות בעיקר עמ &#39;rey ללכוד בשיניים בלוע משמשים מניפולציה לעיסה וטרף 25 - 27. שתי הסדרות יוצרים באמצעות מנגנונים התפתחותיים משותף ונחשבים מבחינה התפתחותית הומולוגיים 28. מודולריות מעניין מתרחש תוך שלחלק מינים, כגון דג זברה, שיני בלוע פה ועל גב חוסר 29 בעוד מינים אחרים ceratobranchials מספר שיניים, pharyngobranchials, ולפעמים שיני basihyal ו hypobranchials 30. בשנת הקוצנים, שיניים בלוע נמצאים ventrally על ceratobranchial ו dorsally החמישי על הקדמי וגם האחורי pharyngobranchials 31. קינמטיקה על האכלת קוצן להראות הלסת האוראלית משמשת בעיקר עבור לכידת טרף והקלת האכלת יניקת 9 עוזב לעיסה ללסת הבלוע. בשנת ציקלידים, מורפולוגיה הלסת בלוע התחתון משתנה באופן דרמטי 32,33 ו הוכח להיות אדפטיבית בקורלציה עם נישה trophic 34. רַבאוכלוסיות קוצן מים מתוקים ple התפתחו מגדילה דרמטית במספר שן בלוע גחון 23,35,36. מחקר שנערך לאחרונה הוכיח כי הבסיס הגנטי ההתפתחותי של רווח השן התפתח זה הנו ייחודי, בעיקר בשתי אוכלוסיות נגזרות עצמאי של הקוצנים מים מתוקים 36. בניגוד שיניים יונקים, דגים להתחדש שיניהם ברציפות לאורך החיים הבוגרים 37. שתי אוכלוסיות מים מתוקות שיניים גבוהות שתוארו לעיל אלה התפתחו בקצב החלפת שן מואץ, ובכך יוצרים מערכת החולייתנים נדירה לחקר הבסיס הגנטי של התחדשות 36. אחת מתכונותיהן trophic שלישי התפתח שוב ושוב הקוצנים מים מתוקים ארוכה עצמות epibranchial ו ceratobranchial, את homologs קשת המגזרי branchial של הלסת העליונה והתחתונה, בהתאמה 38. עצמות branchial ארוכות להעניק חלל buccal גדול וסבירות הם אדפטיבית על שאפשרו פריטי טרף גדולים להיות גonsumed. יתר על כן, בדגים אחרים, עצמות epibranchial חשובות לדיכאון של צלחות שן בלוע הגבה 25. כמו זיז זים ושיני בלוע, עצמות branchial הן פנימיות ולכן, קשה לדמיין או לכמת בקלות. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לנתח שטוח הר שלד branchial, המאפשרים הדמיה קלה וכימות של מגוון תכונות craniofacial חשובים. בעוד פרוטוקול זה מתאר לנתיחת קוצן, באותה שיטה זו פועלת על מגוון רחב של דגים אחרים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>EMD</td>
			<td>PX1480-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>G7893-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin (NBF)</td>
			<td>Azer Scientific</td>
			<td>NBF-4-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S</td>
			<td>EMD</td>
			<td>116-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 22x60mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x10mm Glass Petri Dish</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>23064-10010</td>
			<td>To dissect samples on</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>Can be poured into glass or plastic petri dishes to make dissecting plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling Clay</td>
			<td>Sargent Art</td>
			<td>22-4000</td>
			<td>1lb cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Vials (case of 500)</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>66021-668</td>
			<td>Borosilicate Glass with Screw Cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps-Dumont #5 Inox (Biologie tip)</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Dumostars are an alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors&#160;</td>
			<td>FST</td>
			<td>15003-08</td>
			<td>Alternate sizes are available depending on size of sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S6E with KL300 LED</td>
			<td>Many other models work nicely, having a flat base helps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes 1.7mL</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C-2170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard slide tray</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-587-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and flat-mounting of the threespine stickleback branchial skeleton

The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology of the fish branchial skeleton is matched to a species' diet. Threespine stickleback fish (Gasterosteus aculeatus) have emerged as a model system to study the genetic and developmental basis of evolved differences in a variety of traits. Marine populations of sticklebacks have repeatedly colonized countless new freshwater lakes and creeks. Adaptation to the new diet in these freshwater environments likely underlies a series of craniofacial changes that have evolved repeatedly in independently derived freshwater populations. These include three major patterning changes to the branchial skeleton: reductions in the number and length of gill raker bones, increases in pharyngeal tooth number, and increased branchial bone lengths. Here we describe a detailed protocol to dissect and flat-mount the internal branchial skeleton in threespine stickleback fish. Dissection of the entire three-dimensional branchial skeleton and mounting it flat into a largely two-dimensional prep allows for the easy visualization and quantification of branchial skeleton morphology. This dissection method is inexpensive, fast, relatively easy, and applicable to a wide variety of fish species. In sticklebacks, this efficient method allows the quantification of skeletal morphology in genetic crosses to map genomic regions controlling craniofacial patterning.

<html> תוצאות פרוטוקול זה שלד branchial רכוב גזור ושטוח (איור 4) שבו מגוון של תכונות תזונתיות חשובות ניתן לכמת. מתוך תפיסת גב, כל השורות של rakers זימים, כל צלחות השן בלועה, וכמעט כל עצמות branchial ניתן מדמיינים בקלות לכמת 22 - 24,35,36,38,42. Alizarin האדום S גם מאיר על rhodamine או מסנן אדום דומה המאפשר תיוג כפול עם סמנים אחרים (למשל, מהונדס GFP 42) שיטה חלופית של ויזואליזציה. הקרינה דועכת במהירות האור, כך preps חנות בחושך אם מתוכננת הדמיה או phenotyping ניאון. מנקודת מבט גחון, הזימים ניתן דמיינו פיגמנטציה שלהם לכמת 43. Preps ניתן לאחסן 100% גליצרול במשך שנים. 4.jpg &quot;/&gt; איור 4:. שלד נציג קוצן branchial שתי דוגמאות של שלדי branchial מוכתמים ופינה מוצג. (א) עצם הצגת תמונת Brightfield שכותרתו אדום. (ב) תמונה פלורסנט תחת סט מסנן rhodamine B. דוגמאות rakers, שיניים, ועצמות מסומנות עם סימני כניסה, ראשי חץ, ו כוכביים, בהתאמה. ברי סולם = 2 מ&quot;מ. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54056/54056fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Flat-mounting of the Threespine Stickleback Branchial Skeleton at JoVE.com

Dissection and Flat-mounting of the Threespine Stickleback Branchial Skeleton

The branchial skeleton, including gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones, serves as the primary site of food processing in most fish. Here we describe a protocol to dissect and flat-mount this internal skeleton in threespine sticklebacks. This method is also applicable to a variety of other fish species.

Dissection ו-הרכבה שטוחה של שלד Threespine קוצן branchial

The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology ...

dissection-flat-mounting-threespine-stickleback-branchial

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K Views.  University of California, Berkeley. The branchial skeleton, including gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones, serves as the primary site of food processing in most fish. Here we describe a protocol to dissect and flat-mount this internal skeleton in threespine sticklebacks. This method is also applicable to a variety of other fish species. 

Video: Dissection and Flat-mounting of the Threespine Stickleback Branchial Skeleton

Dissection of Drosophila Ovaries

Dissection של תסיסנית השחלות

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

תסיסנית הזחל Dissection NMJ

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

Dissection ברוטו של קיבה של לובסטר, Homarus Americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Dissection של gyrus משוננת בהיפוקמפוס מתוך עכבר למבוגרים

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissection של איברים מן דג הזברה למבוגרים

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Dissection ו מכתים של תסיסנית הזחל השחלות

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissection של הכליה דג הזברה למבוגרים

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia1. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar2. Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells3. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

נתיחה והתקנה<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי דיסקי העין

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes.  It contains approximately 800 ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called the auditory bulla houses the ossicles, whereas the auditory capsule encloses the inner ear, namely the cochlea and semicircular canals. Murine ossicles are essential for hearing and thus of great interest to researchers in the field of otolaryngology, but their metabolism, development, and evolution are highly relevant to other fields. Altered bone metabolism can affect hearing function in adult mice, and various gene-deficient mice show changes in morphogenesis of auditory ossicles in utero. Although murine auditory ossicles are tiny, their manipulation is feasible if one understands their anatomical orientation and 3D structure. Here, we describe how to dissect the auditory bulla and capsule of postnatal mice and then isolate individual ossicles by removing part of the bulla. We also discuss how to embed the bulla and capsule in different orientations to generate paraffin or frozen sections suitable for preparation of longitudinal, horizontal, or frontal sections of the malleus. Finally, we enumerate anatomical differences between mouse and human auditory ossicles. These methods would be useful in analyzing pathological, developmental and evolutionary aspects of auditory ossicles and the middle ear in mice.

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

דיסקציה של בולה השמיעה של עכברים אחרי לידה: בידוד של עצמות באוזן התיכונה ניתוח היסטולוגית

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

Reverse Dissection and DiceCT Reveal Otherwise Hidden Data in the Evolution of the Primate Face

Facial expressions, or facial displays, of social or emotional intent are produced by many mammalian taxa as a means of visually communicating with conspecifics at a close range. These displays are achieved by contraction of the mimetic muscles, which are skeletal muscle attached to the dermis of the face. Reverse dissection, removing the full facial mask from the skull and approaching mimetic muscles in reverse, is an effective but destructive way of revealing the morphology of mimetic muscles but it is destructive. DiceCT is a novel mechanism for visualizing skeletal muscles, including mimetic muscles, and isolating individual muscle fascicles for quantitative measurement. Additionally, DiceCT provides a non-destructive mechanism for visualizing muscles. The combined techniques of reverse dissection and DiceCT can be used to assess the evolutionary morphology of mimetic musculature as well as potential contraction strength and velocity in these muscles. This study further demonstrates that DiceCT can be used to accurately and reliably visualize mimetic muscles as well as reverse dissection and provide a non-destructive method for sampling mimetic muscles.

Facial expressions are a mode of visual communication produced by mimetic muscles. Here, we present protocols for the novel techniques of reverse dissection and DiceCT to fully visualize and assess mimetic muscles. These combined techniques can examine both morphological and physiological aspects of mimetic musculature to determine functional aspects.

הפוך לנתיחה ונתונים DiceCT לחשוף אחרת מוסתרים באבולוציה של הפנים הפרימטים

Facial expressions, or facial displays, of social or emotional intent are produced by many mammalian taxa as a means of visually communicating with ...