עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות של GTEC (2731336 ו 1411318), ה- NIH (K01DK081351), ואת NSF (1,354,837) כדי CHS אנו מודים Alem גיורגיס לקריאה ביקורתית של כתב היד.

<ol>
	<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> J Cell Physiol. 213 (2), 286-300 (2007).</li><li>Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+and+liver+regeneration.">Stem cells and liver regeneration.</a> Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).</li><li>Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+epidemiology+of+hepatitis+C+virus+infection.">Global epidemiology of hepatitis C virus infection.</a> Lancet Infect Dis. 5 (9), 558-567 (2005).</li><li>Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+liver+fibrosis.">Pathogenesis of liver fibrosis.</a> Annu Rev Pathol. 6, 425-456 (2011).</li><li>Bataller, R., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+fibrosis.">Liver fibrosis.</a> J Clin Invest. 115 (2), 209-218 (2005).</li><li>Kisseleva, T., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-fibrogenic+strategies+and+the+regression+of+fibrosis.">Anti-fibrogenic strategies and the regression of fibrosis.</a> Best Pract Res Clin Gastroenterol. 25 (2), 305-317 (2011).</li><li>Constandinou, C., Henderson, N., Iredale, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+liver+fibrosis+in+rodents.">Modeling liver fibrosis in rodents.</a> Methods Mol Med. 117, 237-250 (2005).</li><li>Gabele, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+interactive+effects+of+alcohol+and+high-fat+diet+on+hepatic+fibrosis.">A new model of interactive effects of alcohol and high-fat diet on hepatic fibrosis.</a> Alcohol Clin Exp Res. 35 (7), 1361-1367 (2011).</li><li>Lieber, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alcoholic+fatty+liver:+its+pathogenesis+and+mechanism+of+progression+to+inflammation+and+fibrosis.">Alcoholic fatty liver: its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis.</a> Alcohol. 34 (1), 9-19 (2004).</li><li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals.">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).</li><li>Jang, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling+of+an+alcoholic+fatty+liver+in+zebrafish+(Danio+rerio).">Metabolic profiling of an alcoholic fatty liver in zebrafish (Danio rerio).</a> Mol Biosyst. 8 (7), 2001-2009 (2012).</li><li>Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+steatosis+in+response+to+acute+alcohol+exposure+in+zebrafish+requires+sterol+regulatory+element+binding+protein+activation.">Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation.</a> Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).</li><li>Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+helix-loop-helix+transcription+factor,+heart+and+neural+crest+derivatives+expressed+transcript+2,+marks+hepatic+stellate+cells+in+zebrafish:+analysis+of+stellate+cell+entry+into+the+developing+liver.">The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver.</a> Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).</li><li>Lin, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+animal+model+for+alcoholic+liver+disease+in+zebrafish.">Development of an animal model for alcoholic liver disease in zebrafish.</a> Zebrafish. 12 (4), 271-280 (2015).</li><li>Huang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+interaction+between+Wnt+and+Notch+activity+modulates+the+regenerative+capacity+of+a+zebrafish+fibrotic+liver+model.">Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model.</a> Hepatology. 60 (5), 1753-1766 (2014).</li><li>Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroreductase-mediated+cell/tissue+ablation+in+zebrafish:+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies.">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).</li><li>Parsons, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-responsive+cells+initiate+the+secondary+transition+in+larval+zebrafish+pancreas.">Notch-responsive cells initiate the secondary transition in larval zebrafish pancreas.</a> Mech Dev. 126 (10), 898-912 (2009).</li><li>Baker, K., Warren, K. S., Yellen, G., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+'pacemaker'+current+(Ih)+in+a+zebrafish+mutant+with+a+slow+heart+rate.">Defective 'pacemaker' current (Ih) in a zebrafish mutant with a slow heart rate.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4554-4559 (1997).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196 (2012).</li><li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish.">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (37), (2010).</li><li>Paku, S., Schnur, J., Nagy, P., Thorgeirsson, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+structural+evolution+of+the+early+proliferating+oval+cells+in+rat+liver.">Origin and structural evolution of the early proliferating oval cells in rat liver.</a> Am J Pathol. 158 (4), 1313-1323 (2001).</li><li>Turner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatic+stem+cell+and+maturational+liver+lineage+biology.">Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology.</a> Hepatology. 53 (3), 1035-1045 (2011).</li><li>Kodama, Y., Hijikata, M., Kageyama, R., Shimotohno, K., Chiba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+notch+signaling+in+the+development+of+intrahepatic+bile+ducts.">The role of notch signaling in the development of intrahepatic bile ducts.</a> Gastroenterology. 127 (6), 1775-1786 (2004).</li><li>Ryback, R., Percarpio, B., Vitale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibration+and+metabolism+of+ethanol+in+the+goldfish.">Equilibration and metabolism of ethanol in the goldfish.</a> Nature. 222 (5198), 1068-1070 (1969).</li><li>Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+zebrafish+chemical+screening+technologies.">Advances in zebrafish chemical screening technologies.</a> Future Med Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).</li><li>Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=zebraflash+transgenic+lines+for+in+vivo+bioluminescence+imaging+of+stem+cells+and+regeneration+in+adult+zebrafish.">zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish.</a> Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).</li><li>Westhoff, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+automated+imaging+pipeline+for+the+analysis+of+the+zebrafish+larval+kidney.">Development of an automated imaging pipeline for the analysis of the zebrafish larval kidney.</a> PLoS One. 8 (12), e82137 (2013).</li><li>Perlman, Z. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+drug+profiling+by+automated+microscopy.">Multidimensional drug profiling by automated microscopy.</a> Science. 306 (5699), 1194-1198 (2004).</li><li>Chu, J., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+school+in+liver+development:+lessons+from+zebrafish.">New school in liver development: lessons from zebrafish.</a> Hepatology. 50 (5), 1656-1663 (2009).</li><li>Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+conversion+of+hepatic+biliary+epithelial+cells+to+hepatocytes+after+near+total+loss+of+hepatocytes+in+zebrafish.">Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish.</a> Gastroenterology. 146 (3), 776-788 (2014).</li><li>He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+liver+after+extreme+hepatocyte+loss+occurs+mainly+via+biliary+transdifferentiation+in+zebrafish.">Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish.</a> Gastroenterology. 146 (3), 789-800 (2014).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+structure,+enzyme+histochemistry,+and+immunohistochemistry+of+liver+in+zebrafish.">Fine structure, enzyme histochemistry, and immunohistochemistry of liver in zebrafish.</a> Anat Rec (Hoboken). 295 (4), 567-576 (2012).</li><li>Yovchev, M. I., Xue, Y., Shafritz, D. A., Locker, J., Oertel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repopulation+of+the+fibrotic/cirrhotic+rat+liver+by+transplanted+hepatic+stem/progenitor+cells+and+mature+hepatocytes.">Repopulation of the fibrotic/cirrhotic rat liver by transplanted hepatic stem/progenitor cells and mature hepatocytes.</a> Hepatology. 59 (1), 284-295 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

צפינו התחדשות hepatocyte בתיווך HPC ב EtOH / MTZ שטופלו כבדי מחלים, דבר המצביע על כך אפילו בנוכחות של כמות משמעותית של חלבונים ECM כולל סוג סיבי לי קולגן, HPCs לשמור וכשירותו להתחדש כמו hepatocytes. הטיפול בלבד MTZ לא להגדיל בתצהיר של חלבוני ECM משמעותי, ואילו הטיפול רק EtOH לא לגרום HPC הפעלת 15. על ידי ניצול של טיפול EtOH / MTZ בשילוב, הצלחנו לחקור התחדשות HPC מונחה בכבד fibrotic. כמו חיסול כמעט מוחלט של hepatocyte מעורר התחדשות hepatocyte מונחה HPC, חשוב לברר זחלי MTZ שטופל על פי הקריטריונים של היעדרות של קרינה ספציפי hepatocyte ונפח כבד קטינה באופן משמעותי על ידי NRCS אשכולות. בדגים, כלי הדם של הזימים העור לספוג את האלכוהול 24, כך שאין צורך לאפשר חיות לשתות כרצונך או לדרוש intragaעירוי stric כמו במודלים יונקים. אנחנו שוכנו EtOH- ו MTZ שטופלו מבוגר דגים שלאחר מכן במיכלים נפרדים ללא במחזור המים. זה חיוני כדי להעביר דגי פתרון EtOH טרי מדי יום ולשמור את המכסה על מנת למזער את ההתאדות של EtOH. למרות 48-72 שעות EtOH / MTZ טיפול יעיל גורם סינתזת החלבון ECM בפרוטוקולים שלנו, לא סיסטיק ולא שחמת מתקדמת פותחה בדגים אלה. לכן, השילוב של MTZ עם חשיפה ממושכת של אתנול כגון 12 שבועות טיפול 14, במיוחד דגים בוגרים, עלול לגרום נזק כבד חמורה יותר כדי לדמות כראוי ולחקור התחדשות HPC מונחה בכישלון כבד כרונית. דג זברה משמשת במודל חיה יוצא דופן עבור in vivo בדיקות מתחם בשל גודלו הקטן, צאצאים גדולים, שקיפות, וחדירות למולקולות קטנות 25. שימוש במודל הכבד fibrotic דג זברה, זיהינו מספר acti Wnt הידוע רומןvators ומעכבי Notch שהאיצו התחדשות hepatocyte 15. פרוטוקול הסינון כימי הקרינה המבוססת הנוכחי שלנו מורכב מכמה שלבים המבוצעים באופן ידני כולל הכנה של חומרים כימיים, העברת זחלי EtOH שטופל / ablated-hepatocyte כדי 24 גם צלחות, בטיפול כימיקלים, וניתוח ההשפעות של כימיקלים על התחדשות hepatocyte. זה דווקא מעסיק epifluorescence ו / או מיקרוסקופ confocal ללכוד תמונות עבור בעלי חי פרט, שהוא מייגע זמן רב. פלטפורמות תפוקה גבוהה באופן אוטומטי להתמודד ולרכוש הדמיה הסלולר ברזולוציה של דג זברה בשילוב עם איסוף נתונים כמותיים יקל תתחזקנה הקרנה בקנה מידה גדולה 26,27 תכונות אלה תלמדנה אם בשילוב עם מערכת מינון תרופה אוטומטית שמקובעת את טווח ריכוזים כימיים 28, אשר יכול לתת רעילות מינימלית עם יעילות מקסימלית עבור שיפור התחדשות hepatocyte. למרות אלה limitaמשא, כמו הרבה שחקנים קריטיים סוגי התא עיקריים של הכבד שמורה בין דג הזברה ויונק 29, העסקת in vivo מבוסס מולקולה קטנה הקרנה באמצעות המודל הכבד fibrotic דג הזברה יהיה לזרז גילוי תקף של אסטרטגיות טיפוליות חדשניות למחלות כבדות כרוניות. שתי קבוצות נוספות באופן עצמאי הוכיחו כי לאחר אובדן כמעט מוחלט של hepatocytes בלי עלבונות fibrogenic, BECs transdifferentiated לתוך hepatocyte באמצעות צעד של dedifferentiation 30,31 עם ההנחה כי cholangiocytes, BECs הבדיל באופן מלא, בעיקר מהווים NRCS / BECs דג הזברה. למרות transdifferentiation יכול להיות אחד המנגנונים של נהיגה התחדשות hepatocyte, התוצאות שלנו מצביעות על כך HPCs, אשר ידועים מהווים את הרוב של BECs בכבד דג הזברה 32, downregulate פעילות Notch להתמיין hepatocytes. בינתיים, סביר לשער כי הדואר מלא BECs הבדיל, cholangiocytes, לשמור על רמות גבוהות יותר של פעילות Notch ללא המרה hepatocytes במהלך רגנרציה. מעניין לציין, שיש בנוכחות EtOH, כפי שדווח בעבר 13, מצאנו כי HSCs גדל מספר עם מורפולוגיה שונה מתצורת כוכב דמוי לצורה myofibroblast דמוי עם תהליכים cytoplasmic לאיבוד. HSCs מופעל מאופיין סינתזה של חלבוני ECM הם הגורם העיקרון אחראי ריפוי פצע נורמלי בתהליך המשולב של כבד תיקון 4. למרות פציעה כרונית לעתים קרובות עוקפת את יכולת מרשימה של הכבד לרגנרציה המושתלים HPCs בהצלחה אוכלס מחדש בכבד חולדה fibrotic / שחמת 33. לפיכך, המודל הכבד fibrotic דג הזברה שלנו יהיה כלי חיוני עבור הבהרת המנגנונים המולקולריים ו הסלולר אשר מתווכים את ההשפעות של סיסטיק מתמשכת על התחדשות hepatocyte בתיווך HPC. יתר על כן, הגדרת ג רב התאיrosstalk שמאזנת התחדשות סיסטיק על ידי ניצול המודל הכבד fibrotic דג הזברה שלנו תקל עוד יותר לעצב אסטרטגיות טיפוליות מעשיות עבור אי ספיקת כבד כרונית in vivo.

למרות יכולת ההתחדשות המרשימה של hepatocytes 1, שהם סוג תא parenchymal העיקרי של הכבד, אי ספיקת כבד כרונית פוגעת ביכולת הזאת, מה שמובילה תאים ובתאים בכבדים (HPC) התחדשות תלויה 2. נזק כבד כרונית נגזרת בעיקר שימוש לרעה באלכוהול, וירוס הפטיטיס C כרונית (HCV) 3 ו מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD) 4. זה מוביל פיברוזיס כבד מתמשך, אשר מזוהה עם ההצטברות של תאי מטריקס חלבונים (ECM). מתמיד הצטברות ECM מעווה אדריכלות כבדה ללא פגעה על ידי יצירת רקמת צלקתית סיבית 5, לאחר מכן וכתוצאה מכך שחם עם תחלואה ותמותה גבוהות. ניסיונות רבים נעשו כדי למתן את התגובה fibrotic בעיקר על ידי התמקדות מעכב ציטוקינים profibrogenic והופעל myofibroblasts 6. האחרון נגזר בעיקר מתאי stellate כבדים (Hגיל), התאים הלא parenchymal הכבד עקרון אחראי צלקת בכבד היווצרות 4. אף על פי כן, טיפולי משובי מעודדי מקורות הסלולר אנדוגני כולל HPCs להתחדש hepatocytes בנוכחות עלבונות fibrogenic מתמשכים מחכים לחקירה נוספת. דגמים ניסיוניים רבים סיסטיק הכבד תוארו ביונקים. הזרקה חוזרת ונשנית של פחמן טטרא (CCL 4) כבר בשימוש נרחב כדי לגרום פיברוזיס כבד מודלים בעכברים וחולדה 7. בשילוב עם תזונה עתירת שומן (HF), אלכוהול הובילה upregulation משמעותית של ביטוי גנים profibrogenic ואת הכבד סיסטיק 8. בעוד steatosis (הצטברות שומנים בדם) הנובעת מחשיפת אלכוהול חריפה, זה הופך את הכבד רגיש פציעה בכבד חמורה יותר 9. דג הזברה, Danio rerio, התפתחה כמערכת מודל חוליות יסולא בפז ללימוד התחדשות. למרותחוליות אחרות תחתונות כגון סלמנדרות ויש axolotls יכולת מרשימה לרגנרציה הדג הזברה יש יתרונות על פני מערכות מודל אחרות לגבי אסטרטגיות מניפולציה וויזואליזציה גנים הדרושים לביצוע מניפולצית משובי פוטנציאל גורמי 10. דג הזברה גם מייצג מודל חוליות אטרקטיבי ללימוד מחלת כבד אלכוהולית (ALD) פשוט על ידי הוספת אתנול (EtOH) למים שלהם. חשיפה אקוטית EtOH כדי דג הזברה הזחל והבוגר שנגרם steatosis בכבד 11-13. כאשר דג זברה מבוגר זכתה לחשיפת EtOH מורחבת, בתצהיר קולגן נצפה עם גברת ביטוי של גנים הקשורים סיסטיק 14. עם זאת, קיים צורך בפיתוח מודלים ללמוד התחדשות כבדה בתגובת EtOH כגירוי fibrogenic. לאחרונה, פיתחנו מודל הכבד fibrotic הנגרמת EtOH דג הזברה 15. שילבנו מערכת אבלציה הגנטי הספציפי hepatocyte עם טיפול EtOH ב הזחל adulדג הזברה t. יצרנו שני קווים מהונדסים, Tg (fabp10a: CFP-NTR) Gt1 ו Tg (fabp10a: mCherry-NTR) GT2, שבו nitroreductase E.coli (NTR) הם התמזגו ציאן חלבון פלואורסצנטי mCherry, בהתאמה, בשליטה של חומצת השומן ספציפי hepatocyte מחייבת 10a חלבון, אמרגן בסיסי כבד (fabp10a). במערכת זו, NTR ממירה metronidazole prodrug רעילה (MTZ) לתוך סוכן ה- DNA בין-גדיל מקשרים צולב 16, גרימת מוות מפורש של hepatocytes. באמצעות מודל זה, הראינו כי אוכלוסייה של תאים כבדים, אשר מגיבים Notch signaling, מומר hepatocytes בהעדר ליד של hepatocytes וב העודף ECM. אנחנו המיועד תאים אלה HPCs. יתר על כן, באמצעות מסכים כימיים, זיהינו activators מולקולה הקטן של איתות Wnt ומעכבים של איתות Notch שמרחיב התחדשות hepatocyte בכבד fibrotic. Therefoמחדש, המודל הכבד fibrotic שלנו דג הזברה מייצג מערכת סינון הכימי מעולה בהשוואה לתא ביותר בתרבות או מערכת סינון מבוסס יונקים. זוהי מערכה in vivo עם עלות משמעותית והטבות לחיסכון בזמן. כאן אנו מתארים את ההליכים המפורטים להקמת מודל כבד fibrotic נגרם EtOH ועל ביצוע מסכים כימיים באמצעות מודל זה דג זברה. יתר על כן, ניתוחי מנות הזמן בוצעו כדי לחקור כיצד hepatocyte התחדשות מתרחש בכבד fibrotic. פרוטוקול זה יספק כלי רב ערך כדי לחקור את המנגנונים ואסטרטגיות של שיפור התחדשות hepatocyte בכבד fibrotic.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4)</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC385355000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>EMD</td>
			<td>MX0075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metronidazole (MTZ)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) tablet</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E404</td>
			<td>Dissolve one tablet with 100 ml distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melting agarose&#160;</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>BP165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem Cell Signaling Compound Library</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>L2100</td>
			<td>10mM stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ActiProbe-1K Library</td>
			<td>Timtec</td>
			<td>ActiProbe-1K</td>
			<td>10mM stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB 415286</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S2729</td>
			<td>Dissolve with DMSO to 10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S2924</td>
			<td>Dissolve with DMSO to 10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen I antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab23730</td>
			<td>Use at 1:100 for immunostaining, reacts with fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A31573</td>
			<td>Use at 1:200 for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media (Vectorshield)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td>Dumont #55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48312-003</td>
			<td>75x25 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-045</td>
			<td>18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic wrap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22305654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1213100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluoresent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205 FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocol microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an ethanol-induced fibrotic liver model in zebrafish to study progenitor cell-mediated hepatocyte regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

איור 1 מציג את התפתחות מודל הכבד fibrotic הנגרמת EtOH דג הזברה הזחל. כדי לייעל את פרוטוקול על חשיפת זחלי דג זברת EtOH, אנו מעריכים הראשון רעיל EtOH. 2.5 ימים שלאחר ההפריה (DPF) הזחלים נחשפו ריכוז 1% EtOH, 1.5%, או 2% למשך 24 שעות ואחריו טיפול EtOH במקביל 24 שעות / MTZ. חשיפת 2% EtOH נגרמת תמותה גבוהה, בעוד שכמעט כל זחלים חשופים 1% EtOH או פחות הראו שינויי fibrogenic מינימאליים עם בתצהיר נדיר של חלבונים תאים מטריקס כמו קולגן. בהתבסס על תוצאות אלו, הזחלים טופלו קודם 1.5% EtOH למשך 24 שעות (2.5-3.5 DPF) ומאז הם ראו בו זמנית עם MTZ למשך 24 שעות (3.5-4.5 DPF) (איור 1 א). EtOH / MTZ שטופלו הזחלים הראה ליקויים מורפולוגיים כולל עקמומיות כלפי מעלה של המטען והזנב, בצקת קרום הלב, ואי לנפח בשלפוחית ​​השחייה. (איור 1 ב). אָנוּהשתמש בשלושה קווים מהונדסים כדי לנתח שינויי fibrogenic ב כבד הזחל שטופל MTZ EtOH /: 1) Tg (fabp10a: CFP-NTR) קו Gt1 מבטא את גן NTR התמזג עם חלבון פלואורסצנטי ציאן תחת אמרגן fabp10a ספציפי hepatocyte 15; 2) Tg (TP1: mCherry) קו jh11 סימני תאים עם איתות Notch פעיל (תאים Notch-תגובה, NRCS) או לתאי האפיתל המרה (BECs) עם mCherry גרעיני 17, אשר הביטוי הוא בשליטת מודול TP1 המכיל RBP- מרובים JK-אתרי קישור; ו -3) Tg (hand2: EGFP) קו pd24, אשר תוויות בתאי stellate הכבד (HSCs) 13. DMSO שטופלו מלאה [Tg (fabp10a: CFP-NTR) Gt1; Tg (TP1: mCherry) jh11; Tg (hand2: EGFP) pd24 כבד] לא הראה סוג סיבי קולגן שאני בתצהיר 4,6,9 (איור 1 ג, ג &#39;), ואילו EtOH / MTכבדים שטופל Z מוצגים סוג גבוה ואני קולגן הצטברות של 25 ו -50 שעות שלאחר-אבלציה (hPa) (האיור 1D, ד &#39;, ה&#39;, ה &#39;). בנוסף, לעומת כבדים מלאים שטופל DMSO (איור 1 ג &#39;&#39;), HSCs גדל מספר עם המורפולוגיה השונה מתצורת כוכב דמוי לצורת myofibroblast הדמוי עם תהליכי cytoplasmic לאיבוד כבד EtOH / MTZ שטופל ההתחדשות ( 1D איור &#39;&#39;, אי &#39;&#39;). צפינו שתי אוכלוסיות נפרדות של mCherry לבטא NRCS ב 25 hPa ב כבדי התחדשות שטופלו MTZ EtOH /: עמום NRCS אדום (איור 1D &#39;&#39; &#39;, הבלעה, חצים לבנים) ו NRCS אדום בוהק (איור 1D&#39; &#39;&#39;, הבלעה , ראשי חץ צהוב). בגיל 50 hPa, hepatocyte ספציפי CFP החלו לשתף מפורשת NRCS עם ביטוי mCherry עמום ברחבי כבדי התחדשות (איור 1E &#39;&#39; &#39;, הבלעה, חצים לבנים). CFP אלה mCherry-coexpre עמוםNRCS ssing הם כנראה להבחין בין NRCS אדום בוהק כי הם שליליים עבור CFP (איור 1E &#39;&#39; &#39;, הבלעה, ראשי חץ צהוב). מחקרים קודמים הראו כי כאשר התפשטות hepatocyte דוכאה לאחר כריתה חלקית (PHX), HPCs מורחבת עם התפשטות קשורה של HSCs 21. בנוסף, HPCs ואת BECs משותף סמנים histochemical 22. לפיכך, התוצאות שלנו מצביעות על כך NRCS להביע שיתוף mCherry CFP ואפלולי מתארים עמיתו-דג הזברה של HPCs כי להתמיין hepatocytes ידי נתקלים downregulation Notch. NRCS שמירה על רמות גבוהות יותר של איתות Notch עשוי להישאר cholangiocytes, שכבר מוינו BECs 23. איור 2 מציג את התפתחות המודל כבד fibrotic נגרם EtOH ב דג זברה מבוגרת. ראשית, חשפנו דג הזברה מבוגר ל -1%, 1.5%, או 2% EtOH להעריך כדאיות. רוב דג הזברה המבוגרת עשתה not לשרוד יותר מ -72 שעות של חשיפה לריכוזים EtOH גדול מ -1% (נתונים שלא פורסמו). לכן, עבור דג הזברה מבוגר, אנו pretreated הדג עם 1% EtOH במשך 72 שעות ו אחריו עם טיפול MTZ (איור 2 א). על ידי ביצוע זמן כמובן מנתח, הראינו סוג גבוה משמעותי ואני קולגן בתצהיר של כבדי התחדשות EtOH / MTZ שטופל ב 2, 3, ו -4 ימים-שלאחר אבלציה (DPA) (איור 2 ג &#39;, ד&#39;, ה &#39;) לעומת כבדי שטופלו DMSO (תרשים 2B &#39;). דומה לזה שנצפה הזחלים, את CFP ואפלולי mCherry לבטא שיתוף תאים אותרו כבדי EtOH / MTZ שטופלו התחדשות של 12 חודשים הישן [Tg (fabp10a: CFP-NTR) Gt1; Tg (TP1: mCherry) jh11] דגים בוגרים ב DPA 3 ו -4 (איור 2, E, שיבוצים, חצים לבנים). נתונים אלו מעידים כי HPCs, מגיב Notch signaling, לשימור היכולת שלהם להתחדש כמו hepatocytes בבנוכחות עלבון fibrogenic ב דג הזברה מבוגר. איור 3 מציג את תוצאות ההקרנה כימיים נציג באמצעות מודל הכבד fibrotic אתנול-induced שלנו דג הזברה הזחל. כדי לאתר תרכובות ביו המסייעים בהאצת התחדשות hepatocyte בכבד fibrotic, ביצענו מסכי גנטי כימיים. אנו הוקרננו ספרייה של 75 מולקולות קטנות עם פעילויות ביולוגיות ותרופות היטב מאופיינות (לתאי גזע איתות הספרייה מורכבת, Selleckchem) וספרייה של 1,000 מולקולות קטנות פחות מאופיין (ActiProbe-1K ספרייה, TimTec) באמצעות [Tg (fabp10a: CFP -NTR) Gt1; Tg (TP1: mCherry) jh11] הזחלים. אנחנו ablated את hepatocytes בנוכחות 1.5% EtOH / 15 מ&quot;מ MTZ ולאחר מכן נחשף הזחלים 50 מיקרומטר של תרכובות עבור 50 שעות (איור 3 א). מספר אגוניסטים Wnt כגון SB 415,286 ו CHIR-99021, מעכבי קינאז-3 synthase גליקוגן, התחדשות hepatocyte קידם (איור 3 ג, ד) לעומת DMSO (איור 3 ב). יתר על כן, [4- (1H-1,2,3,4-tetraazol-5-י.ל.) -1,2,5-oxadiazole-3-ylamine], ובקיצור HTOA, היא מפעילה מסלול הרומן Wnt, משופרת התחדשות hepatocyte ב הכבד fibrotic כפי שצוין על ידי הכבד מחדש גדול (איור 3E). נתונים אלה מראים כי מודל fibrotic המתמשך שלנו מספק כלי רב ערך כדי לגלות מולקולות קטנות המשפרות התחדשות hepatocyte. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54002/54002fig1.jpg" /> איור 1. פיתוח מודל כבד fibrotic הנגרמת אתנול דג זברת זחל. (א) תכנית הממחישה את התקופות של EtOH ו EtOH / MTZ טיפול ע&quot;מ להקים מודל כבד fibrotic זחלים. (ב) בשעה 50 שעות-פוסט-אבלציה (hPa), EtOH / MTZ שטופלו lדג הזברה Arval פיתחו הפרעות מורפולוגיים כולל עקמומיות כלפי מעלה של המטען והזנב, בצקת קרום הלב, ואי לנפח בשלפוחית ​​השחייה. (CC &#39;&#39; &#39;) ב כבד [Tg (fabp10a: CFP-NTR) Gt1; Tg (TP1: mCherry) jh11; Tg (hand2: EGFP) pd24] הזחלים שטופלו DMSO, 1a קולגן חלבון ECM היה כמעט בלתי ניתן לגילוי (C, C &#39;) ו HSCs שקט הראו בתצורת כוכב דמוי (ג&#39; &#39;), ואילו NRCS מופץ בקרב hepatocytes (C, C &#39;&#39; &#39;, הבלעה). (DE &#39;&#39; &#39;) ב כבדי זחלי EtOH / MTZ שטופל, בתצהיר 1a קולגן גבוה נצפה (ד, ד&#39;, ה &#39;, ה&#39;). HSCs גדל מספר ואיבד תהליכים cytoplasmic מורכבים (ד &#39;&#39;, ה &#39;&#39;). בגיל 25 hPa, mCherry לבטא NRCS מורכב משתי אוכלוסיות נפרדות<html> . ראשי חץ צהוב עולה NRCS אדום בוהק (ד &#39;&#39; &#39;, הבלעה), ואילו חצים לבנים מצביעים NRCS אדום עמום (ד&#39; &#39;&#39;, הבלעה). בגיל 50 hPa, Tg (fabp10a: CFP-NTR) ו Tg (TP1: mCherry) תאים להביע שיתוף נכתבו המתעוררים ברחבי כבדי התחדשות (E &#39;&#39; &#39;, הבלעה, חצים לבנים), בעוד NRCS אדום בוהק לא היה ביטוי CFP (E &#39;&#39; &#39;, הבלעה, ראשי חץ צהוב). כל תמונות confocal הן תמונות מטוס בודדות למעט C &#39;&#39;, ד &#39;&#39;, ה &#39;&#39;, שהן תמונות הקרנה. ברי סולם: B, 100 מיקרומטר; CE &#39;&#39; &#39;, 20 מיקרומטר. EtOH, אתנול; MTZ, metronidazole; hPa, שעות-פוסט-אבלציה; DPF, ימים-לאחר הפריה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54002/54002fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> her.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54002/54002fig2.jpg" /> איור 2. פיתוח מודל כבד fibrotic הנגרמת אתנול דג זברה מבוגרת. (א) תכנית הממחישה את התקופות של טיפול EtOH ו MTZ ע&quot;מ להקים מודל כבד fibrotic למבוגרים. (BE &#39;) Tg (fabp10a: CFP-NTR), Tg (TP1: mCherry), והביטוי 1a הקולגן vibratome קטעי DMSO- (B ו- B&#39;) ו EtOH / MTZ שטופלו (CE &#39;) מבוגר כבדי דג הזברה. (BB &#39;) ב הבקרות שטופלו DMSO, 1a קולגן היה כמעט בלתי ניתן לגילוי (ב&#39;) ללא Tg (fabp10a: CFP-NTR) ו Tg (TP1: mCherry) התאים המבטאים-שיתוף (B). (CE &#39;) ב כבדי התחדשות שטופלו MTZ EtOH /, בתצהיר 1a קולגן היה גבוה במידה ניכרת ב 2, 3, ו -4 DPA (ג&#39;, ד &#39;, ה&#39;) עםאוכלוסיית Tg (fabp10a: CFP-NTR) ו Tg (TP1: mCherry) התאים המבטאים-שיתוף ב DPA 3 ו -4 (D, E, שיבוצים, חצים לבנים). NRCS האדום הבוהק לא היה ביטוי CFP (D, E, שיבוצים, ראשי חץ צהובים). BE, תמונות מטוס בודדות confocal. B&#39;-E &#39;, תמונות הקרנת confocal. סרגל קנה מידה, 20 מיקרומטר. EtOH, אתנול; MTZ, metronidazole; DPA, ימים-שלאחר אבלציה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54002/54002fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54002/54002fig3.jpg" /> איור 3. תוצאות נציג ההקרנה כימי תוך שימוש במודל הכבד fibrotic הנגרמת אתנול דג הזברה הזחל. (א) תוכנית עבור המסך התחדשות hepatocyte בכבד fibrotic. (BE) ידוע Wnt רומןactivators להגדיל התחדשות hepatocyte בכבד fibrotic. תחזיות Confocal של כבדי שטופלו MTZ EtOH / ב [Tg (fabp10a: CFP-NTR) Gt1; Tg (TP1: mCherry) jh11] הזחלים כי נוהלו עם DMSO (B), SB415286 (C), CHIR-99,021 ( D), או מפעיל Wnt רומן [4- (1H-1,2,3,4-tetraazol-5-י.ל.) -1,2,5-oxadiazole-3-ylamine] (מקוצר כמו HTOA) (E). SB415286 ו CHIR-99,021 הם הגליקוגן מעכבי קינאז-3 synthase. כל התמונות הן תמונות הקרנת confocal. סרגל קנה מידה, 20 מיקרומטר. EtOH, אתנול; MTZ, metronidazole; hPa, שעות-פוסט-אבלציה; DPF, ימים-לאחר הפריה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54002/54002fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration at JoVE.com

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

פיתוח מודל כבד אתנול-induced fibrotic דג הזברה ללמוד ובתאים בתיווך תא התחדשות Hepatocyte

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

development-an-ethanol-induced-fibrotic-liver-model-zebrafish-to

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.1K Views.  Georgia Institute of Technology. Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. 

Video: Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

שימוש במערכת טיטון לחקר מולקולרי מנגנוני התחדשות דג הזברה

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or biliary-driven liver regeneration. In hepatocyte-driven liver regeneration, regenerating hepatocytes are derived from preexisting hepatocytes, whereas, in biliary-driven regeneration, regenerating hepatocytes are derived from biliary epithelial cells (BECs). For hepatocyte-driven liver regeneration, there are excellent rodent models that have significantly contributed to the current understanding of liver regeneration. However, no such rodent model exists for biliary-driven liver regeneration. We recently reported on a zebrafish liver injury model in which BECs extensively give rise to hepatocytes upon severe hepatocyte loss. In this model, hepatocytes are specifically ablated by a pharmacogenetic means. Here we present in detail the methods to ablate hepatocytes and to analyze the BEC-driven liver regeneration process. This hepatocyte-specific ablation model can be further used to discover the underlying molecular and cellular mechanisms of biliary-driven liver regeneration. Moreover, these methods can be applied to chemical screens to identify small molecules that augment or suppress liver regeneration.

To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

אבלציה Hepatocyte הספציפי בדג הזברה לחקר התחדשות כבד מונע מרה

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. Although many efforts have been made to reveal the underlying mechanisms of decidualization, the exact signaling between the epithelial cells that are in contact with the embryo and the underlying stromal cells remains poorly understood. Therefore, studying decidualization in a way that takes both the epithelial and stromal cells into account could improve our knowledge about the molecular details of decidualization. For this purpose, in vivo models of artificial decidualization are physiologically the most relevant; however, manipulation of intercellular communication is limited. Currently, in vitro cultures of endometrial stromal cells are being used to investigate the modulation of decidualization by several signaling molecules. Conventionally, human or mouse endometrial stromal cells are used. However, the availability of human samples is very often limited. Furthermore, the use of murine tissues is accompanied with variety in the method of culturing. This study presents a validated and standardized method to obtain pure Endometrial Epithelial Cell (EEC) and Stromal Cell (ESC) cultures using adult intact mice treated with estrogen for three consecutive days. The protocol is optimized to improve the yield, viability, and purity of the cells and was further extended in order to study decidualization in a coculture of EEC and ESC. This model may be suitable to exploit the importance of both cell types in decidualization and to evaluate the contribution of significant signaling molecules secreted by EEC or ESC during the intercellular communication.

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a standardized and validated method for the isolation and culture of primary mouse endometrial stromal and epithelial cells, which can be used in a coculture system to study in vitro decidualization.

בידוד של עכבר רירית הרחם אפיתל סטרומה תאים עבור<em&gt; במבחנה</em&gt; Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related morbidity and mortality and affects more than 2 million people in the United States. A better understanding of the cellular and molecular mechanisms underlying alcohol-induced liver injury is crucial for developing effective treatment for ALD. Zebrafish larvae exhibit hepatic steatosis and fibrogenesis after just 24 h of exposure to 2% ethanol, making them useful for the study of acute alcoholic liver injury. This work describes the procedure for acute ethanol treatment in zebrafish larvae and shows that it causes steatosis and swelling of the hepatic blood vessels. A detailed protocol for Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) staining that is optimized for the histological analysis of the zebrafish larval liver, is also described. H&#38;E staining has several unique advantages over immunofluorescence, as it marks all liver cells and extracellular components simultaneously and can readily detect hepatic injury, such as steatosis and fibrosis. Given the increasing usage of zebrafish in modeling toxin and virus-induced liver injury, as well as inherited liver diseases, this protocol serves as a reference for the histological analyses performed in all these studies.

This protocol describes histological analyses of the livers from zebrafish larvae that have been treated with 2% ethanol for 24 h. Such acute ethanol treatment results in hepatic steatosis and swelling of the hepatic vasculature.

ניתוח היסטולוגית של פגיעה חריפה בכבד אלכוהול דג הזברה

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

הקמתה של הזחל דג זברה כמודל חיה כדי Investigate Trypanosoma cruzi תנועתיות Vivo ב

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell lineages that comprise mature blood. Isolation and identification of these HSPCs is difficult because they are defined ex post facto; they can only be defined after their differentiation into specific cell lineages. Over the past few decades, the zebrafish (Danio rerio) has become a model organism to study hematopoiesis. Zebrafish embryos develop ex utero, and by 48 h post-fertilization (hpf) have generated definitive HSPCs. Assays to assess HSPC differentiation and proliferation capabilities have been developed, utilizing transplantation and subsequent reconstitution of the hematopoietic system in addition to visualizing specialized transgenic lines with confocal microscopy. However, these assays are cost prohibitive, technically difficult, and time consuming for many laboratories. Development of an in vitro model to assess HSPCs would be cost effective, quicker, and present fewer difficulties compared to previously described methods, allowing laboratories to quickly assess mutagenesis and drug screens that affect HSPC biology. This novel in vitro assay to assess HSPCs is performed by plating dissociated whole zebrafish embryos and adding exogenous factors that promote only HSPC differentiation and proliferation. Embryos are dissociated into single cells and plated with HSPC-supportive colony stimulating factors that cause them to generate colony forming units (CFUs) that arise from a single progenitor cell. These assays should allow more careful examination of the molecular pathways responsible for HSPC proliferation, differentiation, and regulation, which will allow researchers to understand the underpinnings of vertebrate hematopoiesis and its dysregulation during disease.

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Here, we present a simple method to quantitate hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) in embryonic zebrafish. HSPCs from dissociated zebrafish are plated in methylcellulose with supportive factors, differentiating into mature blood. This allows the detection of blood defects and allows drug screening to be easily conducted.

התפתחות במבחנה הנועד Quantitate גזע Hematopoietic, קדמון תאים (HSPCs) בפיתוח עוברי דג זברה

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult liver regeneration after 70% partial hepatectomy results in hepatocyte hypertrophy with some replication in remaining lobes with restoration of metabolic activity, but with permanent loss of the injured lobe&#39;s morphology and architecture. Here, we detail a new surgical method in the neonate that leaves a physiologic environment conducive to regeneration. This model involves amputation of the left lobe apex and a subsequent conservative management regimen, and lacks the necessity for ligation of major liver vessels or chemical injury, leaving a physiologic environment where regeneration may occur. We extend this protocol to amputations on juvenile (P7-14) mice, during which the injured liver transitions from organ regeneration to compensatory growth by hypertrophy. The presented, brief 30 min protocol provides a framework to study the mechanisms of regeneration, its age-associated decline in mammals, and the characterization of putative hepatic stem or progenitors.

Here, we present a new method for partial resection of the left hepatic lobe in neonatal (day 0) mice. This new protocol is suitable for studying acute liver injury and injury response in the neonatal setting.

Hepatectomy Lobular חלקית: מודל ניתוח עבור התחדשות הכבד מורפולוגיות

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

הר שלם בתוך היברידיזציה ב-Zebrafish עוברים ושיטת היווצרות צינור ב-iPSC-ECs ללמוד את התפקיד של אנגלין בפיתוח כלי דם

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United States. The innate immune response against C. difficile has been described, but the exact roles of neutrophils and macrophages in CDI are less understood. In the current study, Danio rerio (zebrafish) larvae are used to establish a C. difficile infection model for imaging the behavior and cooperation of these innate immune cells in vivo. To monitor C. difficile, a labeling protocol using a fluorescent dye has been established. A localized infection is achieved by microinjecting labeled C. difficile, which actively grows in the zebrafish intestinal tract and mimics the intestinal epithelial damage in CDI. However, this direct infection protocol is invasive and causes microscopic wounds, which can affect experimental results. Hence, a more noninvasive microgavage protocol is described here. The method involves delivery of C. difficile cells directly into the intestine of zebrafish larvae by intubation through the open mouth. This infection method closely mimics the natural infection route of C. difficile.

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Presented here is a safe and effective method to infect zebrafish larvae with fluorescently labeled anaerobic C. difficile by microinjection and noninvasive microgavage.

פיתוח מודל לזיהום של זחל בדג במשך שינוי קושי

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, the muscle stem cell is activated and undergoes cell proliferation to generate a pool of myoblasts, which subsequently differentiate to form new muscle fibers. In many muscle wasting conditions, including muscular dystrophy and ageing, this process is impaired resulting in the inability of muscle to regenerate. The process of muscle regeneration in zebrafish is highly conserved with mammalian systems providing an excellent system to study muscle stem cell function and regeneration, in muscle wasting conditions such as muscular dystrophy. Here, we present a method to examine muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. The first step involves the use of a genotyping platform that allows the determination of the genotype of the larvae prior to eliciting an injury. Having determined the genotype, the muscle is injured using a needle stab, following which polarizing light microscopy is used to determine the extent of muscle regeneration. We therefore provide a high throughput pipeline which allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Skeletal muscle regeneration is driven by tissue resident muscle stem cells, which are impaired in many muscle diseases such as muscular dystrophy, and this results in the inability of muscle to regenerate. Here, we describe a protocol that allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

בחינת התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...