This work was supported by National Eye Institute Grant R01 EY017724 (VMF) and National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases Grant K99 AR066534 (DSG).

הנהלים כל חיה בוצעו בהתאם ההמלצות מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות ותחת פרוטוקול שאושר על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש במכון המחקר סקריפס. 1. עדשות Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים על פי המלצות המכונים הלאומיים לבריאות &quot;מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה&quot; ופרוטוקולי שימוש בבעלי חיים במוסד שאושר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Enucleate העין מעכברים באמצעות מלקחיים מעוקלים. לדכא את הרקמה סביב העין עם מלקחיים כדי להביא את העין מתוך השקע, ואז לקטוף את העין מהשקע עם מלקחיים. עבר עיניים בופר פוספט 1x הטרי (PBS) בצלחת לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את עצב הראייה קרוב גלגל העין ככל האפשר. בעדינות ובזהירות להכניס פינצטה ישר עדין אל תוך גלגל העין דרך wher חורדואר עצב הראייה יוצא האחורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות עושים חתך במספריים לתוך גלגל העין מן אחורי אל הקצה של הקרנית. עדשות מכרסמות לכבוש ~ 30% של העין. ודא חתכים אלה בזהירות, ואל תכניס פינצטה או מספריים עמוק מדי לתוך העין כדי למנוע נזק העדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים לאורך המפגש בין הקרנית בלובן העין בבית חצי הדרך לפחות סביב גלגל העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחוף בעדינות את הקרנית כדי להסיר את העדשה מהעין דרך הפתח שנעשה צעדי 1.4 ו -1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים ישר טיפ נאים כדי להסיר כל פסולת גדולה בזהירות כי הוא עדיין מחובר העדשה. ראייה לבדוק את העדשה לכל נזק לפני שתמשיך המדידות נוקשות. </li></ol> 2. מדידות נוקשות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול לפחות 10 coverslips מאותה תיבה באמצעות איזון אנליטיים. מצא את המשקל הממוצע של coverslips. לקבלת עקביות, השתמש באותה קופסת coverslips עבור כל הניסויים. טרום רטובבמראה coverslips ו-זווית ישרה ב PBS 1x בטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות 2 לפני תחילת הניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלא את החדר המדיד (ראה איור 1) עם 65 - 75 מיליליטר של 1x PBS. תא המדידה נעשה מתוך פרספקס ידי חנות מכונת in-house, ואת divots בתא נעשה על ידי מקדחה מוגדרת לעומק הרצוי עם מקדח מתאים. עדשות לשמור על שקיפות ב 1x PBS בטמפרטורת החדר למשך בדיקות מכניות. </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53986/53986fig1.jpg" /> איור 1:. נוקשות מדידת לשכת תצלום מראה את הממדים של חדר המדידה נוקשת מחוייט עם מגוון רחב של divots עומקים שונים ובצורות שונות. Divots העגול 200 מיקרומטר או 300 מיקרומטר עמוק (ראשי חץ צהובים) משמש את המידות על עדשות עכבר. Divots הם 2 מ&quot;מ בקוטר ~ 13-. 14 מ&quot;מ מהקצה של החדר <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53986/53986fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים המראים בזווית ישר לתוך התא במרחק קבוע מן השקע אשר ישמש כדי להחזיק את העדשה. ודא במראה לא זז במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עדשות העברת גזור לתא מדידה בקפידה עם מלקחיים לתפוס או מלקחיים מעוקלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונה עליונה לאור העדשה פרקה ישר מלמעלה. קח תמונות העדשה העכבר 30X הגדלה עם תאורה מ מיקרוסקופ לנתח (למטה) ומקור אור סיבים אופטיים על הצדדים על ימין ועל שמאל. הגדר את אספקת החשמל סיבים אופטיים עד 80% של עוצמת האור המקסימלית. התאם את פלט אספקת החשמל מבוסס על תאורה מפוזרת, העדפות המשתמש ואת איכות התמונה לפי הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונת נוף בצד של העדשה לא הטעונה, אשר ניתן לראות דרך רימראה ght-זווית. אם המצלמה אינה מכוילת, לצלם תמונה של הקצה המראה בפוקוס. קצה המראה באורך 5 מ&quot;מ, מדידה זו ניתן להשתמש מאוחר יותר כדי לקבוע את הפיקסלים / מ&quot;מ ולשמש סרגל קנה המידה של תמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עדשת מקום לתוך השקע, ולאשר כי העדשה מונחת כהלכה ו ישר את השקע. קח תמונה של העדשה לפני הטעינה. העדשה צריכה להיות נחה את השקע על הקדמי שלה או בקוטב אחורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 1 coverslip בעדינות על העדשה. חכה 2 דקות כדי לאפשר שרץ, ולקחת עוד תמונת הצד להציג של העדשה הטעונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממשיכים להוסיף coverslips כמו בשלב 2.8 וצילמו-מבט מהצד לאחר תוספת של כל coverslip כמו בשלב 2.8 עד סך של 10 coverslips מוחלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל coverslips. חכה 2 דקות, ולצלם תמונת נוף בצד של העדשה (ומחוץ לה את השקע) לאחר הסרת כל coverslips. </li></ol> 3. מדידת העדשה Nucleus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי determine בגודל גרעין העדשה, להזיז את העדשה אל צלחת נקייה פטרי מלא 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות decapsulate העדשה באמצעות מלקחיים ישר בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיל את תאי סיבי קליפת המוח על ידי גלגול העדשה בין אצבע עטוית כפפה. גרעין העדשה הנותר ירגיש כמו גולה קשה. השתמש בהליך זה כדי לבודד את הגרעין על עדשות מבוגרות מתחיל ב -1 לחודש של גיל. מאז הגרעין המבודד הוא גוף נוקשה, בדיקה מכאנית נוספת של גרעין העדשה לא יכולה להתבצע באמצעות שיטה מתוארת זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות את גרעין העדשה 1x PBS בצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את גרעין העדשה בחזרה לתוך תא המדידה (לא את השקע), ולקחת תמונה של גרעין העדשה דרך המראה בזווית ישרה. </li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53986/53986fig2.jpg" /> איור 2:. עדשות עכבר דחוסים ידי Coverslips (א) סכמטי ו- (ב) תצלום של האקסהתקנת perimental מראה עדשת עכבר 2 בן חודש בתוך שקע 200 מיקרומטר עמוק בתוך תא המדידה מלא 1x PBS. מראה זווית נכונה ומצלמה דיגיטלית רכובה על מיקרוסקופ לנתיחה שמשו כדי לאסוף תמונות של העדשה במהלך דחיסה על ידי coverslips. (C) תמונות של נופי sagittal של עדשת wild-type 2-בן חודש הדחוסה על ידי מספר הגדל והולך של coverslips ברציפות ספקו את הנתונים הגולמיים למדידת קטרים ​​ציריים משווניים וחישוב זנים ציריים משווניים במהלך בדיקת דחיסה מבוססת coverslip. השתקפות של העדשה ניתן לראות לפעמים את coverslips (רוב נראה בבירור בתמונה 1 coverslip). בעת ביצוע מדידות, להתעלם ההשתקפות ולמדוד אל הקודקוד של העדשה. (ד) תמונות של נופי sagittal של עדשת wild-type בן חודש 2-דחיסת הדואר ועל גרעין העדשה המבודד. עדשת פוסט-דחיסת הגרעין מבודד ישב מחוץ את השקע. ברי סולם, 1 מ&quot;מ. נתון זה שונה מן Gokhב, et al. PLoS ONE, 2012 19. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53986/53986fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> ניתוח תמונה 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד בקטרים ​​משווניים ו ציריים של עדשות לפני טעינה ואחרי כל שלב טעינה באמצעות ImageJ או תוכנה דומה. מדוד את הקוטר של כל גרעין העדשה. גרעין העדשה כמעט כדורי כך מדידה בכל אורינטציה תספיק 19,21. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את העדשה צירית בקטרים ​​ידי הוספת עומק השקע בשימוש. בתא המדידה, את השקע הסתיר 200 מיקרומטר (עדשות עכבר 2-בן חודש) או 300 מיקרומטר (4 בן חודש ו -8 חודשים ישנות עדשות עכבר) של העובי הצירי של העדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשבת את צירית זנים משווניים מן מדידות קוטר עדשה באמצעות המשוואה, ε = (d - d 0) / ד 0, שם ε הוא זן, d הוא צירי או דוארקוטר quatorial בעומס נתון, ד 0 הוא בקוטר צירי או משווני המקביל בעומס אפס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש את צירית זנים משווניים כפונקציה של העומס המוטל (במ&quot;ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש את צירי, הקו משווה ובקטרים ​​גרעיניים. לחשב ולתכנן את יחס ממדי עדשה על ידי חלוקה בקוטר הצירי ידי הקוטר המשווני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב ולתכנן את היקף העדשה באמצעות המשוואה, נפח = 4/3 × π × r E 2 × r A, כאשר r E הוא רדיוס r המשווני הוא הרדיוס הצירי נמדד על פי התמונה לקחה צעד 2.6. משוואה זו מניחה העדשה היא אליפטית oblate (אליפסואיד) 1,22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב ולתכנן את היקף גרעיני באמצעות המשוואה, נפח = 4/3 × π × r N 3, כאשר r N הוא רדיוס של גרעין העדשה כפי שהן נמדדות תמונה לקחה צעד 3.5. משוואה זו מניחה את i גרעין העדשהsa בתחום 19,21. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב ולתכנן את השבר גרעיני כיחס בין היקף גרעיני בהיקף העדשה. </li></ol>

<ol>
	<li>Lovicu, F. J., Robinson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development of the ocular lens. , (2004).</li><li>Piatigorsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lens+differentiation+in+vertebrates.+A+review+of+cellular+and+molecular+features.">Lens differentiation in vertebrates. A review of cellular and molecular features.</a> Differentiation. 19 (3), 134-153 (1981).</li><li>Glasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+accommodation:+surgical+options+for+correction+of+presbyopia.">Restoration of accommodation: surgical options for correction of presbyopia.</a> Clin Exp Optom. 91 (3), 279-295 (2008).</li><li>Keeney, A. H., Hagman, R. E., Fratello, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dictionary of ophthalmic optics. , (1995).</li><li>Millodot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dictionary of optometry and visual science. 7, (2009).</li><li>Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+increase+in+the+stiffness+of+the+human+lens+nucleus+with+age:+the+basis+for+presbyopia.">Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia.</a> Mol Vis. 10, 956-963 (2004).</li><li>Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presbyopia+and+heat:+changes+associated+with+aging+of+the+human+lens+suggest+a+functional+role+for+the+small+heat+shock+protein,+alpha-crystallin,+in+maintaining+lens+flexibility.">Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility.</a> Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).</li><li>Pierscionek, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+response+of+human+lenses+to+stretching+forces.">Age-related response of human lenses to stretching forces.</a> Exp Eye Res. 60 (3), 325-332 (1995).</li><li>Glasser, A., Biometric Campbell, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=optical+and+physical+changes+in+the+isolated+human+crystalline+lens+with+age+in+relation+to+presbyopia.">optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia.</a> Vision Res. 39 (11), 1991-2015 (1999).</li><li>Weeber, H. A., van der Heijde, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+relationship+between+lens+stiffness+and+accommodative+amplitude.">On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude.</a> Exp Eye Res. 85 (5), 602-607 (2007).</li><li>Weeber, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+mechanical+properties+of+human+lenses.">Dynamic mechanical properties of human lenses.</a> Exp Eye Res. 80 (3), 425-434 (2005).</li><li>Fisher, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+the+human+lens.">Elastic properties of the human lens.</a> Exp Eye Res. 11 (1), 143 (1971).</li><li>Krueger, R. R., Sun, X. K., Stroh, J., Myers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+increase+in+accommodative+potential+after+neodymium:+yttrium-aluminum-garnet+laser+photodisruption+of+paired+cadaver+lenses.">Experimental increase in accommodative potential after neodymium: yttrium-aluminum-garnet laser photodisruption of paired cadaver lenses.</a> Ophthalmology. 108 (11), 2122-2129 (2001).</li><li>Burd, H. J., Wilde, G. S., Judge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+spinning+lens+test+to+determine+the+stiffness+of+the+human+lens.">An improved spinning lens test to determine the stiffness of the human lens.</a> Exp Eye Res. 92 (1), 28-39 (2011).</li><li>Glasser, A., Campbell, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presbyopia+and+the+optical+changes+in+the+human+crystalline+lens+with+age.">Presbyopia and the optical changes in the human crystalline lens with age.</a> Vision Res. 38 (2), 209-229 (1998).</li><li>Pau, H., Kranz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increasing+sclerosis+of+the+human+lens+with+age+and+its+relevance+to+accommodation+and+presbyopia.">The increasing sclerosis of the human lens with age and its relevance to accommodation and presbyopia.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 229 (3), 294-296 (1991).</li><li>Hollman, K. W., O'Donnell, M., Erpelding, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+elasticity+in+human+lenses+using+bubble-based+acoustic+radiation+force.">Mapping elasticity in human lenses using bubble-based acoustic radiation force.</a> Exp Eye Res. 85 (6), 890-893 (2007).</li><li>Baradia, H., Nikahd, N., Glasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lens+stiffness+measurements.">Mouse lens stiffness measurements.</a> Exp Eye Res. 91 (2), 300-307 (2010).</li><li>Gokhin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tmod1+and+CP49+synergize+to+control+the+fiber+cell+geometry,+transparency,+and+mechanical+stiffness+of+the+mouse+lens.">Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens.</a> PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).</li><li>Sindhu Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Aquaporin+0+in+lens+biomechanics.">Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics.</a> Biochem Biophys Res Commun. , (2015).</li><li>Fudge, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermediate+filaments+regulate+tissue+size+and+stiffness+in+the+murine+lens.">Intermediate filaments regulate tissue size and stiffness in the murine lens.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3860-3867 (2011).</li><li>Kuszak, J. R., Mazurkiewicz, M., Zoltoski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+modeling+of+secondary+fiber+development+and+growth:+I.+Nonprimate+lenses.">Computer modeling of secondary fiber development and growth: I. Nonprimate lenses.</a> Mol Vis. 12, 251-270 (2006).</li><li>Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurement+of+age-related+stiffening+in+the+crystalline+lens+by+Brillouin+optical+microscopy.">In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy.</a> Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

ישנם מספר שיקולים מרכזיים בעת שימוש בשיטה זו כדי למדוד נוקשות עדשה. ראשית, coverslips מוחלים על העדשה בזווית אלכסונית מעט (8 - 8.5 °) ביחס לחלק התחתון של החדר (θ). זה יחול מרכיב קטן מאוד של עומס equatorially ולא axially. עם זאת, עומס משווני זה נחשב זניח בגלל חטא θ ≈ 0.1 19. אם שיטה זו מותאמת עבור עדשות גדולות, את הזווית של coverslips אל החלק התחתון של החדר היה צריכה להימדד על מנת לקבוע האם עומס משווני יש בחשבון חישובי זן. שנית, חשוב לאפשר את העדשה כדי לאזן לאחר תוספת של כל coverslip. תקופת ההמתנה של 2 דקות מאפשרת עיוות תלוי זמן (כלומר., זחילה) להתרחש, כך תמונות נלקחות רק כאשר העדשה נמצאת צורת שיווי משקל 19. שלישית, פרוטוקול זה הוא מותאם למדידת מתח דחיסה על מ &#39;Ouse עדשות על פני טווח דינמי רחב של עומסים. במחקרים טייס, עומס להחיל של 1,293 מ&quot;ג (כלומר, עשרה 18 x 18 מ&quot;מ coverslips) דחוס העדשה בעכבר כדי זן מקסימלית, מעבר שהגדילה המון לא לגרום לעיוות נוסף ניכר. זאת בשל נוכחותם של גרעין העדשה הנוקשה שאינו לעוות ניכרת תחת דחיסת 19. רביעית, פרוטוקול זה ימנע נזק לרקמות בלתי הפיך. בניסויים שפורסמו בעבר, ללא כל שינוי, תכונות מכניות של עדשות העכבר נצפו בטעינה חוזרת, דבר המצביע על כך בשיטה זו אינו גורם נזק העדשה 19. כאשר בודקים עדשות מכאניות של מינים שונים או עדשות מוטציה, בדיקות טייס צריכים להיעשות כדי לקבוע את העומס המרבי דרוש זן מירבית על-ידי חזרה על שלבי 2.8 - 2.10 השוואת עקומות עומס זן, בקטרי עדשה ואמצעי אחסון עדשה בין הראשון ושני טוען. לבסוף, שיטה זו מספקת מדידה אמפירית של קשיחות o<html> f העדשה כולה ולא ניתן להבדיל בין תרומות של תאים מסוגים שונים (תאי אפיתל, סיבי קליפת המוח, סיבי גרעיני) ואת הקפסולה העדשה תכונות מכניות מחיטה העדשה. הזנים הציריים משווניים הם זממו כאן כפונקציה של העומס המוטל. המחקרים קודמים לכמת עדשת עכבר נוקש 19,21, חוסן 21 או השינוי בקוטר 18 על עומס מופעל. זנים הוא גודל חסר ממד המאפשר השוואה ישירה בין עדשות בגדלים שונים. שים לב רחבה משוונית (זן חיובי) מתרחשת בד בבד עם הדחיסה צירית מיושמת (זן השלילי) בשל שימור נפח עדשה (כלומר, השפעת Poisson). עם זאת, הזנים המשווניים שנצפו היו הרבה יותר קטנים ב בהירות מוחלטת מאשר הזנים הציריים, המציין כי בשיטה זו יש פחות ברזולוציה לזהות שינויים קטנים זן משווני לעומת זן צירי. NT &quot;&gt; לסיכום, זו שיטה פשוטה עם מכשיר התאסף בקלות למדידת קשיחות עדשת עכבר ניתן ליישם באופן כללי נרחב במחקר עדשה כדי להבין טוב יותר כיצד מוטציות בחלבונים, פתולוגיות ו / או הזדקנות להשפיע נוקשות עדשה. בעוד שעדשות עכבר לא להכיל, שיטה זו עדיין יכולה להבהיר את חלבוני שינויים הקשורים בגיל שתורמים נוקשות עדשה גדלו, ואפשרות לתרום ידע חדש לפיתוח טיפולים חדשניים פרסביופיה.

The lens is a transparent and avascular organ in the anterior chamber of the eye that is responsible for fine focusing of light onto the retina. A clear basement membrane, called the lens capsule, surrounds a bulk of elongated fiber cells covered by an anterior monolayer of epithelial cells1,2. Life-long growth of the lens depends on the continuous proliferation and differentiation of epithelial cells at the lens equator into new fiber cells that are added onto previous generations of fiber cells in a concentric manner2. Over time, lens fiber cells undergo compaction, resulting in a rigid center in the middle of the lens called the nucleus1. Accommodation, defined as a dioptric change in the optical power of the eye, occurs in humans when the ciliary muscles contract to deform the lens and allow a true increase in optical power to focus on near objects3-5. In the unaccommodated eye, the lens is held in a relatively flattened state due to tension from zonular fibers. When the ciliary muscles contract, the tension on the lens is released, leading to decreased lens equatorial diameter and increased axial thickness. Age-related changes in the lens cause presbyopia, a progressive loss of lens accommodation, which leads to the need for reading glasses. 
Several studies have linked presbyopia to age-related increase in the intrinsic stiffness of the lens6-11. Stiffness is defined as the resistance of an elastic object to deform under applied load. A variety of methods have been used to examine stiffness of human lenses, including spin compression12-14, actuator compression15, probe indentation16, dynamic mechanical analysis 6,10 and bubble-based acoustic radiation force17. While mouse lenses do not accommodate or develop presbyopia, mouse models for lens pathologies are valuable tools because mice are less expensive than larger animals, well characterized genetically and undergo accelerated age-related changes due to rapid aging. A handful of studies have examined mouse lens stiffness with compression methods and demonstrated changes in lens stiffness due to aging or targeted genetic disruptions18-21. Thus, mouse lenses are good models for studying age-related changes in lens stiffness. 
This protocol describes a simple and inexpensive, yet precise and reproducible, compression method for determining mouse lens stiffness based on application of glass coverslips onto the lens in conjunction with photographing the lens through a dissection microscope and mirror. This method yields robust strain and morphometric data with an easily fabricated and assembled apparatus. The representative results confirm that mouse lenses increase in stiffness with age.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="811">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Fine tip straight forceps</td>
			<td style="width:139px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:119px;">11252-40</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microdissection scissors, straight edge</td>
			<td style="width:139px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:119px;">15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Curved forceps</td>
			<td style="width:139px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:119px;">11272-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seizing forceps</td>
			<td style="width:139px;">Hammacher</td>
			<td style="width:119px;">HSC 702-93</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection dish</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12565154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60mm petri dish</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:139px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18mm x 18mm glass coverslips</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-542A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Measurement chamber with divots to hold lenses</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom-made (see Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Right-angle mirror</td>
			<td style="width:139px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">45-591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light source</td>
			<td style="width:139px;">Schott/Fostec</td>
			<td style="width:119px;">8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Illuminated dissecting microscope</td>
			<td style="width:139px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">SZX-ILLD100</td>
			<td>With SZ-PT phototube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital camera</td>
			<td style="width:139px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Coolpix 990</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses

עדשת העין היא איבר שקוף כי ומשגרת ומתמקד אור כדי ליצור תמונה ברורה על הרשתית. אצל בני אדם, שרירים מתכווצים ריסים כדי לעוות את העדשה, מה שמוביל לעלייה בכוחה האופטי &#39;העדשה להתמקד בעצמים קרובים, תהליך המכונה אירוח. גיל הקשורים שינויים נוקשים עדשה קושרו פרסביופיה, הפחתת העדשה &#39;היכולת להכיל, ובהרחבה, את הצורך במשקפי קריאה. למרות עדשות עכבר אינה להתאים או לפתח פרסביופיה, במודלים של עכברים יכולים לספק כלי רב ערך עבור גנטי פתולוגיות עדשת הבנה, וההזדקנות המואצת נצפתה בעכברים מאפשרת הלימוד של שינויים הקשורים בגיל בעדשה. פרוטוקול זה מדגים שיטה פשוטה, מדויקת, וחסכונית לקביעת נוקשות עדשת עכבר, באמצעות coverslips זכוכית ליישם ברצף הגדלת עומסי דחיסה על גבי העדשה. נציג נתונים לאשר עדשות העכבר להיות נוקשה עם הגיל, כמועדשות אדם. שיטה זו היא מאוד לשחזור ואף עלול להיות מדורג עד מכנית עדשות מבחן מחיות גדולות יותר.

הנוקשות והממדים של 2, 4 ו 8 חודשים ישני עדשות עכבר נמדדו. עכברים היו כל wild-type חיות על רקע המתח טהור C57BL6 המתקבל מתקן גידול בעלי חיים TSRI, ואת כל עדשה היתה עמוסה 1 עד 10 coverslips. הזנים הציריים משווניים חושבו כפונקציה של עומס המופעל על ידי מדידה הצירית ובקטרי קו משווים של העדשה לאחר התוספת של כל coverslip, ולאחר מכן נרמול כל שינוי בקוטר לקוטר פרקו המקביל. שמונה עדשות מכל גיל נבדקו, והתוצאות באות לידי ביטוי בדברים ± סטיית התקן הממוצעת. כפי שניתן לראות 19 בעבר, זן צירי הוא פונקציה לוגריתמית של עומס המופעל (איור 3 א). חלה ירידה תלוית גיל מובהקת סטטיסטית זנים ציריים משווניים תחת העומס מופעל המרבי (איור 3), המציין כי עדשת העכבר מתקשחת עם גיל. רחובמדידות גשם היו מאוד לשחזור פני עדשות של הבנים אותו הגיל, כפי שהודגמו על ידי סטיות התקן הקטנות. נתוני הדמות שנאספו במהלך הניסוי הזה שימשו גם כדי לקבוע מאפיינים מורפולוגיים העדשה כמה אחרים (איור 4). כצפוי, צירי ובקטרים ​​משווניים ונפח עדשה עלה עם גיל (איור 4 א, ​​4 ב ו 4D). יחס ההיבט עולה כי העדשה בעל קוטר משווני מעט גדול יותר בקוטר צירי, ו פרמטר זה לא השתנה עם גיל (האיור 4C). הקוטר, נפח שבריר של גרעין העדשה עלתה עם הגיל (איור 4E, 4F ו 4G). תוצאות אלו מצביעות כי גרעין העדשה Remodels להגדיל את שטחו היחסי כפי הגילאים העדשה. נתונים אלה מראים כי עדשות עכבר להגדיל נוקשות עם גיל, בדומה לשינויים בתוך<html> גינג 9,15 עדשות אדם. נתונים אלה גם מסכים עם תצפיות קודמות שנעשו בשיטה דומה 18 ועל ידי מיקרוסקופיה אופטית ברילואן 23 כי עדשות העכבר להגדיל נוקשות עם הגיל. שני מחקרים אחרים השתמשו בשיטה המתוארת להראות tropomodulin-1 כי, גידול יקטין הצביע לקצה מכסת חלבון, CP49, חלבון סיבי ביניים חרוזים, ואת aquaporin 0 יש צורך לשמור על עדשה נוקשת 19,20. באמצעות שיטה זו, השפע של דגמי עכבר עבור פתולוגיות עדשה וההזדקנות המואצת עכברים יכול לשמש כדי להבין את השינויים נוקשים עדשה עקב וריאציה גנטית ו / או הזדקנות. שיטה זו יכולה גם להיות מותאמת עבור עדשות ממינים אחרים. הממדים של החדר המשמש בניסויים האלה מותאמים עבור עדשות עכבר, אבל יכולים להיות מדורג בקלות עבור עדשות ממינים גדולים. בעתיד, זה יהיה מעניין לקבוע אם גודל עדשת מאזניים עם קשיחות עדשה פני מינים. o: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; בעומס הנמוך ביותר (1 coverslip, 129.3 מ&quot;ג), לא היה הבדל ברור צירי זנים משווניים בין 2, 4 ו 8 חודשים ישני עדשות. הגידול נוקשה עדשה עם גיל הפך לברור יותר בעומסים גבוהים יותר. יתכן כי הקורטקס החיצוני של העדשה (~ 100 מיקרומטר) שנדחס על ידי coverslip הראשון אינו משנה נוקש עם גיל, או ששיטה זו אינה מסוגלת להבחין שינויים קטנים זן בעומסים נמוכים. נתוני morphometrics עולים כי עליות היא העדשה כולו והנפח גרעיני לתאם עם קשיחות עדשה מוגברת כפונקציה של גיל. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53986/53986fig3.jpg" /> איור 3:. הצירי המשווני זני עומס Curves עבור 2, 4 ו 8 חודשים הישן (2M, 4M ו 8M) עדשות עכבר wild-type (א) Axial זן דחיסה זמם כפונקציה של העומס המופעל ( מ&quot;ג). (ב) המשוונית compזן ressive זמם כפונקציה של העומס המופעל (מ&quot;ג). ארבע ושלושה חודשים בת 8 עדשות הציג פחות לחץ מאשר עדשות בן 2 חודשים בעומסים המקסימלית, מה שמצביע על עלייה נוקשות העדשה עם הגיל. ** P &lt;0.01. ראוי לציין, כי ציר Y שונה בין (א) ו- (ב). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53986/53986fig4large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53986/53986fig4.jpg" /> איור 4:. מאפיינים מורפולוגיים של 2, 4 ו 8 חודשים הישן (2M, 4M ו 8M) עדשות עכבר wild-type (א) Axial בקוטר (B) בקוטר המשוונית בהדרגה עם העלייה בגיל. היחס היבט העדשה (C) מראה כי עדשות העכבר רחבים מעט בקו המשווה העדשה. נפח העדשות (D), קוטר הגרעין (E), נפח גרעיני (F) שברים גרעיני (G) בהדרגה עם העלייה בגיל. **, P &lt;0.01. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53986/53986fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sequential Application of Glass Coverslips to Assess the Compressive Stiffness of the Mouse Lens: Strain and Morphometric Analyses at JoVE.com

Sequential Application of Glass Coverslips to Assess the Compressive Stiffness of the Mouse Lens: Strain and Morphometric Analyses

יישום סדרתית של הזכוכית Coverslips להעריך את הדחיסה הנוקשת של עדשות העכבר: ניתוח זנים ואת morphometric

Age-related increases in eye lens stiffness are linked to presbyopia. This protocol describes a simple, cost-effective method for measuring mouse lens stiffness. Mouse lenses, like human lenses, become stiffer with age. This method is precise and can be adapted for lenses from larger animals.

The eye lens is a transparent organ that refracts and focuses light to form a clear image on the retina. In humans, ciliary muscles contract to deform the ...

sequential-application-glass-coverslips-to-assess-compressive

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

7.2K Views.  The Scripps Research Institute. Age-related increases in eye lens stiffness are linked to presbyopia. This protocol describes a simple, cost-effective method for measuring mouse lens stiffness. Mouse lenses, like human lenses, become stiffer with age. This method is precise and can be adapted for lenses from larger animals.

Video: Sequential Application of Glass Coverslips to Assess the Compressive Stiffness of the Mouse Lens: Strain and Morphometric Analyses

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development can be addressed. The zebrafish is useful for genetic studies due to several advantageous characteristics, including small size, high fecundity, short lifecycle, and ease of care. Lens development occurs rapidly in zebrafish. By 72 hpf, the zebrafish lens is functionally mature [3]. Abundant genetic and molecular resources are available to support research in zebrafish. In addition, the similarity of the zebrafish eye to those of other vertebrates provides basis for its use as an excellent animal model of human defects[4-7]. Several zebrafish mutants exhibit lens abnormalities, including high levels of cell death, which in some cases leads to a complete degeneration of lens tissues [8]. To determine whether lens abnormalities are due to intrinsic causes or to defective interactions with the surrounding tissues, transplantation of a mutant lens into a wild-type eye is performed. Using fire-polished metal needles, mutant or wild-type lenses are carefully dissected from the donor animal, and transferred into the host. To distinguish wild-type and mutant tissues, a transgenic line is used as the donor. This line expresses membrane-bound GFP in all tissues, including the lens. This transplantation technique is an essential tool in the studies of zebrafish lens mutants.

Lens development involves interactions with other tissues. Several zebrafish eye mutants are characterized by an abnormally small lens size. Here we demonstrate a lens transplantation experiment to determine whether this phenotype is due to intrinsic causes or defective interactions with tissues that surround the lens.

השתלת עדשה של דג הזברה Application שלה ניתוח של מוטאנטים העין

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

טיהור של מ magneticum מסננים השגריר-1 Magnetosome חלבון Associated MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

הוצאת הקרביים של הזגוגיות עכבר רשתית עבור ניתוח proteomic

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the physical properties of the nucleus contribute significantly to the overall biomechanical behavior of cells under physiological and pathological conditions. For example, in migrating neutrophils and invading cancer cells, nuclear stiffness can pose a major obstacle during extravasation or passage through narrow spaces within tissues.1 On the other hand, the nucleus of cells in mechanically active tissue such as muscle requires sufficient structural support to withstand repetitive mechanical stress. Importantly, the nucleus is tightly integrated into the cellular architecture; it is physically connected to the surrounding cytoskeleton, which is a critical requirement for the intracellular movement and positioning of the nucleus, for example, in polarized cells, synaptic nuclei at neuromuscular junctions, or in migrating cells.2 Not surprisingly, mutations in nuclear envelope proteins such as lamins and nesprins, which play a critical role in determining nuclear stiffness and nucleo-cytoskeletal coupling, have been shown recently to result in a number of human diseases, including Emery-Dreifuss muscular dystrophy, limb-girdle muscular dystrophy, and dilated cardiomyopathy.3 To investigate the biophysical function of diverse nuclear envelope proteins and the effect of specific mutations, we have developed experimental methods to study the physical properties of the nucleus in single, living cells subjected to global or localized mechanical perturbation. Measuring induced nuclear deformations in response to precisely applied substrate strain application yields important information on the deformability of the nucleus and allows quantitative comparison between different mutations or cell lines deficient for specific nuclear envelope proteins. Localized cytoskeletal strain application with a microneedle is used to complement this assay and can yield additional information on intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton. Studying nuclear mechanics in intact living cells preserves the normal intracellular architecture and avoids potential artifacts that can arise when working with isolated nuclei. Furthermore, substrate strain application presents a good model for the physiological stress experienced by cells in muscle or other tissues (e.g., vascular smooth muscle cells exposed to vessel strain). Lastly, while these tools have been developed primarily to study nuclear mechanics, they can also be applied to investigate the function of cytoskeletal proteins and mechanotransduction signaling.

We present two independent, microscope-based tools to measure the induced nuclear and cytoskeletal deformations in single, living adherent cells in response to global or localized strain application. These techniques are used to determine nuclear stiffness (i.e., deformability) and to probe intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton.

מבחני Biophysical לחקור את תכונות מכניות של גרעין התא שלבי הביניים: מסננים תשתית יישומים מניפולציה Microneedle

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

גאפ junctional אינטר תקשורת: ביומרקר פונקציונלית להערכת תופעות לוואי של toxicants ורעלים, ואת היתרונות הבריאותיים של מוצרים טבעיים

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

מדידת הקשיחות של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עכבר Aortas באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

A Morphometric and Cellular Analysis Method for the Murine Mandibular Condyle

The temporomandibular joint (TMJ) has the capacity to adapt to external stimuli, and loading changes can affect the position of condyles, as well as the structural and cellular components of the mandibular condylar cartilage (MCC). This manuscript describes methods for analyzing these changes and a method for altering the loading of the TMJ in mice (i.e., compressive static TMJ loading). The structural evaluation illustrated here is a simple morphometric approach that uses the Digimizer software and is performed in radiographs of small bones. In addition, the analysis of cellular changes leading to alterations in collagen expression, bone remodeling, cell division, and proteoglycan distribution in the MCC is described. The quantification of these changes in histological sections - by counting the positive fluorescent pixels using image software and measuring the distance mapping and stained area with Digimizer - is also demonstrated. The methods shown here are not limited to the murine TMJ, but could be used on additional bones of small experimental animals and in other regions of endochondral ossification.

This manuscript presents methods for analyzing morphometric and cellular changes within the mandibular condyle of rodents.

Morphometric ושיטת ניתוח הסלולר עבור המפרקתי הנמוך מאתר הלסת

The temporomandibular joint (TMJ) has the capacity to adapt to external stimuli, and loading changes can affect the position of condyles, as well as the ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

ללא עדשה מיקרוסקופ וידאו עבור הדינמיקה וניתוח כמותי של תרבית תאים חסיד

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. These transport mechanisms are mediated by the activities of specialized transporter proteins. Specifically,pH dynamics are finely controlled by plasma membrane proton (H+) extrusion systems, such as the Na+/H+ exchanger (NHE) protein family. Despite extensive efforts to study the mechanisms underlying NHE regulation, our current understanding of the biophysical and molecular properties of the NHE family is inadequate because of the limited availability of methods to effectively measure NHE activity. In this manuscript, we used H+-selective electrodes during whole-cell patch clamping recording to measure NHE-induced H+ flux. We proposed this approach to overcome some limitations of typically used methods to measure NHE activity, such as radioactive uptake and fluorescent membrane permeants. Measurement of NHE activity using the described method enables high sensitivity and time resolution and more efficient control of intracellular H+ concentrations. H+-selective electrodes are based on the fact that transporter activity creates an ion gradient in close proximity to the cell membrane. An H+-selective electrode moving up to and away from the cell membrane in a repetitive, oscillatory fashion records a voltage difference that is dependent on H+ flux. While H+-selective electrodes are used to detect H+ flux moving out of the cell, the patch clamp method in the whole-cell configuration is used to control the intracellular ion composition. Moreover, application of the giant patch clamp technique allows modification of the intracellular composition of not only ions but also lipids. The transporter activity of NHE isoform 3 (NHE3) was measured using this technical approach to study the molecular basis of NHE3 regulation by phosphoinositides.

This manuscript describes the applications of proton-selective electrodes and patch clamping methods to measure the activity of proton transport systems. These methods overcome some limitations of techniques commonly used to study proton transport activity, such as moderate sensitivity, time resolution and insufficient intracellular milieu control.

יישום המדידה Electrophysiology ללמוד את הפעילות של מובילי אלקטרו-נייטרלי

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...