Work in the Ait-Si-Ali lab was supported by the Association Fran&#231;aise contre les Myopathies T&#233;l&#233;thon (AFM-T&#233;l&#233;thon); Institut National du Cancer (INCa); Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Fran&#231;aises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS; Universit&#233; Paris Diderot and the ''Who Am I?'' Laboratory of Excellence #ANR-11- LABX-0071 funded by the French Government through its ''Investments for the Future'' program operated by the ANR under grant #ANR-11-IDEX-0005-01. EB was supported by an INCa grant.

<ol>
	<li>Ait-Si-Ali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Suv39h-dependent+mechanism+for+silencing+S-phase+genes+in+differentiating+but+not+in+cycling+cells.">A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells.</a> Embo J. 23 (3), 605-615 (2004).</li><li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+development+and+the+role+of+the+myogenic+regulatory+factors.">Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors.</a> Biochem Soc Trans. 24 (2), 506-509 (1996).</li><li>Arnold, H. H., Winter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+differentiation:+more+complexity+to+the+network+of+myogenic+regulators.">Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators.</a> Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 539-544 (1998).</li><li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+formation+in+vertebrates.">Skeletal muscle formation in vertebrates.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 440-448 (2001).</li><li>Yun, K., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+determination+and+differentiation:+story+of+a+core+regulatory+network+and+its+context.">Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context.</a> Curr Opin Cell Biol. 8 (6), 877-889 (1996).</li><li>Molkentin, J. D., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+regulatory+networks+for+muscle+development.">Defining the regulatory networks for muscle development.</a> Curr Opin Genet Dev. 6 (4), 445-453 (1996).</li><li>Arnold, H. H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+inactivation+of+myogenic+factor+genes+reveals+their+role+during+mouse+myogenesis:+a+review.">Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review.</a> Int J Dev Biol. 40 (1), 345-353 (1996).</li><li>Puri, P. L., Sartorelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+muscle+regulatory+factors+by+DNA-binding,+interacting+proteins,+and+post-transcriptional+modifications.">Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications.</a> J Cell Physiol. 185 (2), 155-173 (2000).</li><li>Tapscott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circuitry+of+a+master+switch:+Myod+and+the+regulation+of+skeletal+muscle+gene+transcription.">The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription.</a> Development. 132 (12), 2685-2695 (2005).</li><li>Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+a+DNA+locus+that+mediates+the+conversion+of+10T1/2+fibroblasts+to+myoblasts.">Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 47 (5), 649-656 (1986).</li><li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts.">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51, 987-1000 (1987).</li><li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD1:+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts.">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242, 405-411 (1988).</li><li>Weintraub, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+muscle-specific+genes+in+pigment,+nerve,+fat,+liver,+and+fibroblast+cell+lines+by+forced+expression+of+MyoD.">Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (14), 5434-5438 (1989).</li><li>Mal, A., Harter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+is+functionally+linked+to+the+silencing+of+a+muscle-specific+regulatory+gene+prior+to+skeletal+myogenesis.">MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1735-1739 (2003).</li><li>Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+specification+by+myogenin+and+Mef2D+via+the+SWI/SNF+ATPase+Brg1.">Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1.</a> Embo J. 25 (3), 490-501 (2006).</li><li>Ling, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysine+methyltransferase+G9a+methylates+the+transcription+factor+MyoD+and+regulates+skeletal+muscle+differentiation.">Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (3), 841-846 (2012).</li><li>Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+class+II+histone+deacetylases+with+heterochromatin+protein+1:+potential+role+for+histone+methylation+in+control+of+muscle+differentiation.">Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation.</a> Mol Cell Biol. 22 (20), 7302-7312 (2002).</li><li>Forcales, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal-dependent+incorporation+of+MyoD-BAF60c+into+Brg1-based+SWI/SNF+chromatin-remodelling+complex.">Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex.</a> The EMBO journal. 31 (2), 301-316 (2011).</li><li>Nakatani, Y., Ogryzko, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+purification+of+mammalian+protein+complexes.">Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes.</a> Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).</li><li>Ouararhni, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+variant+mH2A1.1+interferes+with+transcription+by+down-regulating+PARP-1+enzymatic+activity.">The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity.</a> Genes Dev. 20 (23), 3324-3336 (2006).</li><li>Fritsch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subset+of+the+histone+H3+lysine+9+methyltransferases+Suv39h1,+G9a,+GLP,+and+SETDB1+participate+in+a+multimeric+complex.">A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex.</a> Mol Cell. 37 (1), 46-56 (2010).</li><li>Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+of+histones+H3+and+H4+associated+with+the+histone+methyltransferases+Suv39h1+and+G9a.">Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a.</a> Genome Biol. 8 (12), R270 (2007).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources.">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+enrichment+tools:+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists.">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).</li><li>Ohta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+composition+of+mitotic+chromosomes+determined+using+multiclassifier+combinatorial+proteomics.">The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics.</a> Cell. 142 (5), 810-821 (2010).</li><li>Yahi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cooperation+between+heterochromatin+protein+HP1+isoforms+and+MyoD+in+myoblasts.">Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts.</a> J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).</li><li>Philipot, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+core+binding+factor+CBF+negatively+regulates+skeletal+muscle+terminal+differentiation.">The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation.</a> PloS one. 5 (2), (2010).</li><li>Joliot, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SWI/SNF+subunit/tumor+suppressor+BAF47/INI1+is+essential+in+cell+cycle+arrest+upon+skeletal+muscle+terminal+differentiation.">The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation.</a> PloS one. 9 (10), e108858 (2014).</li><li>Tanese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-scale+density+gradient+sedimentation+to+separate+and+analyze+multiprotein+complexes.">Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes.</a> Methods. 12 (3), 224-234 (1997).</li><li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+KAP1+phosphorylation+switch+controls+MyoD+function+during+skeletal+muscle+differentiation.">A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation.</a> Genes Dev. 29 (5), 513-525 (2015).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modification+and+muscle+differentiation.">Chromatin modification and muscle differentiation.</a> Expert Opin Ther Targets. 10 (6), 923-934 (2006).</li><li>Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt+binds+prohibitin+2+and+relieves+its+repression+of+MyoD+and+muscle+differentiation.">Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation.</a> J Cell Sci. 117. 117 (Pt 14), 3021-3029 (2004).</li><li>Caretti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+helicases+p68/p72+and+the+noncoding+RNA+SRA+are+coregulators+of+MyoD+and+skeletal+muscle+differentiation.">The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation.</a> Dev Cell. 11 (4), 547-560 (2006).</li><li>Knoepfler, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+motif+N-terminal+to+the+DNA-binding+domains+of+myogenic+bHLH+transcription+factors+mediates+cooperative+DNA+binding+with+pbx-Meis1/Prep1.">A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1.</a> Nucleic Acids Res. 27 (18), 3752-3761 (1999).</li><li>Albini, S., Puri, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SWI/SNF+complexes,+chromatin+remodeling+and+skeletal+myogenesis:+it's+time+to+exchange!.">SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange!.</a> Exp Cell Res. 316 (18), 3073-3080 (2010).</li><li>Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Cooperation+between+Heterochromatin+Protein+HP1+Isoforms+and+MyoD+in+Myoblasts.">Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts.</a> J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

השיטה המוצגת מאפשרת זיהוי ממצה של שותפים של גורם שעתוק, Myod. הוא גילה שותפי Myod במערכת Heterologous עמידה בידול נגרם Myod, כלומר תאי הלה-S3. לפיכך, על פי הגדרתו, שותפי Myod מזוהים באים לידי ביטוי בכל מקום בגוף. אלה כוללים גורמי שעתוק בכלל רצף ספציפי, אנזימי שינוי-הכרומטין, חלבוני עיבוד RNA, קינאזות (לוחות 1 ו -2). מאחר ותאי הלה-S3 עמידים בידול-trans-induced Myod, פעילות Myod היא בעיקר דכאניים השותפים המזוהים צפויים להיות-repressors שיתוף Myod. העניין הזה מודגש על ידי נוכחות של חלבונים עיד (לוחות 1 ו -2, איור 2), ידוע כמעכב transactivation Myod היכולת 8. חשוב לציין, מדינה מדכאת כזאת תואמת את מצב Myod ב מתרבים myoblasts. ואכן, אנו מאשרים כי אינטראקציות Myod עם CBFβ, Myodשותף שזוהו על ידי השיטה המתוארת, ניתן לאתר מתרבים myoblasts C2C12, אבל הולכים לאיבוד כאשר תאים שעברו התמיינות (ראה איור 3D). עם זאת, חשוב לציין כי אחת המגבלות העיקריות של המתודולוגיה המוצג הינו חוסר הזדהות שיתוף activators Myod. באופן עקבי, באמצעות אף שיטה זו של שיתוף activators Myod הידוע, כגון היסטון acetyltransferases 32 זוהו. טיהור של מתחמי Myod גם מן השבר המסיס (המלח גרעיני שניתן להפיק, SE) של הגרעין או השבר מועשר הכרומטין (הנוקלאוזום המועשר, NE) (איור 1A) משמשת לפחות שתי פונקציות עיקריות. ראשית, חלוקה כזו מגדילה את בייצוג השותפים הלא stoichiometric זה יהיה רעול פנים אם טיהור Myod בצעה מתמציות גרעיניות הכוללת. שנית, זה מאפשר הפרדה בין שתי תת-אוכלוסיות תפקודיות של Myod: טרום שהופקד / evicטד (SE) ו נכנס הכרומטין (NE). בין interactors הספציפית Myod DNA-מאוגד, רבים קינאזות, גורמי שעתוק, סחר בבני אדם חלבונים, כמו גם כמה remodelers הכרומטין זוהה (איור 2). לאחר אימות מלאה, כגון רשת יכולה לספק תובנה המצב של ויסות פעילות של Myod מאוגד-DNA. חיפוש נוסף עבור Myod שלאחר translational שינויים בשני אלה תאים גרעיניים על ידי ספקטרומטריית מסה, יכול עוד לפענח רגולצית פעילות Myod. לבסוף, חלוקה של מתחמי Myod מסיסים וכרוך-הכרומטין על שיפוע גליצרול גילתה כי בעוד Myod נכנס הכרומטין הוא הכיל בעיקר במתחם אחד, מאוגד-DNA Myod מופץ בשלושה תתי-מתחמים (איור 1B). אפיון של תת-קומפלקסים אלה או על ידי MS ו / או כתם המערבי נגד מועמדים חלבון צריך להבהיר עוד יותר את מצב הרגולציה Myod. כמו הדגיש לעיל, תאים הלה לא טבעי express Myod גורם שעתוק שריר. זה היה לפיכך חשוב לאשר את האינטראקציות נמצאות מודל שרירי שלד (איור 3). דיווחים רבים אשרו במודלים רלוונטיים אינטראקציות תפקודיות כגון בין Myod וחלק השותפים שזוהו assay TAP-התג שהוצג. זהו למשל המקרה של prohibitin 33, 34 DDX17, 35 Meis1, 27 CBF, HP1 26, ו SWI / SNF-הכרומטין שיפוץ 36,28,30 מורכבים. שים לב כי ניתן לבצע טיהור TAP-תג כזה סכום נמוך של תאים, כגון מן myoblasts, בשילוב ל- MS רגיש. ואכן, נייר אחרון תאר אפיון שותפי Myod לאחר ביטוי מושרה של Myod הדגל-מתויג myoblasts 30. מאז ביטוי יתר Myod יציב ומתמשך myoblasts הוא מזיק, גישה חלופית תהיה הוספת תגי הדגל-HA לתוך אלל Myod אנדוגני (הים) ב myoblastsבאמצעות שיטות עריכת הגנום, כגון CRISPR-Cas9 31. יש לציין, תוספת של התג (הים) עלולה לשנות את תפקוד חלבון ו / או בשיתוף עם שותפים מחייבים, ולכן המקום של התג (N- או C- סופי) צריך להיבחר בזהירות. Assay תפקודית של חלבון ההיתוך במערכת רלוונטית חייבת להתבצע לפני סטפס תג טיהור כדי להבטיח את החלבון המתויג הוא פונקציונלי. Immunoprecipitation של חלבונים אנדוגניים ימנע בעיות אלה, עם זאת, היא מסתמכת על זמינותו של נוגדן זיקה ספציפית גבוהה, דבר שקורה לעתים רחוקות זמין. עוד ערך מוסף של הגישה המתוארת הוא האפשרות לזהות שינויים שלאחר translational (PTMs) של החלבון המטוהר עוצמה ושל שותפיה בשפע. ובכך, עם תכונה זו טיהור TAP-התג מתאימה לזהות שותפי אינטראקציה חדשים לא רק אלא גם פונקציות האנזימטית חדשות הקשורים לחלבון ריבית ו / או שותפיה. בבמקרה של חלבון קושר הכרומטין (כלומר., גורמי שעתוק, אנזימים), שיטה זו ובכך מותאמת לצורך זיהוי של &quot;קוד היסטונים&quot; הקשור. ואכן, זנבות היסטון מסוף-אמינו, אשר נחשפים על פני השטח הנוקלאוזום, כפופים PTMs קוולנטיים מרובים. PTMs היסטון להעניק חתימה ייחודית נוקלאוזום מעורב. שילוב של שינויים שונים על זנבות היסטון-מסוף N ולכן יכול לשנות את מבנה הכרומטין לאפשר ויסות ביטוי גנים. לפיכך, אפיון שינויים כאלה הקשורים לחלבון נתון יכול לספק תובנות התפקידים ומנגנוני פעולה של החלבונים למדו מחייב הכרומטין 22. לסיכום, המתודולוגיה הציג ניתן לזהות מקיף של שותפי Myod. טיהור TAP-התג מספקת אלטרנטיבה לגישות אחרות כגון ומורדות למשוך GST, שמרים מבחני השני היברידי ותצוגה הפאג. גם אם מסיבות מעשיות (production של כמות גדולה של תמציות גרעיני) אנחנו צריכים להשתמש במערכת התאית Heterologous, הצלחנו לאשר את מעורבותם של השותפים Myod מזוהים בידול שרירי השלד. הנתונים המתקבלים מראה כי הגורם myogenic Myod נראה אינטראקציה עם שפע של חלבונים החל הרגולטורים תעתיק לחלבונים RNA מחייב, דבר המצביע על מנגנונים שונים המסדירים את הפעילות של גורם שעתוק. לסיכום, אותה הגישה המתודולוגית יכולה לשמש כדי לזהות שותפים הביעו בכל מקום בגוף גורמים גרעיניים רבים שיכולים להיות קשה ללמוד בהקשר הסלולר הספציפי שלהם.

אורגניזמים רבים תאי איקריוטיים מורכבים של איברים ורקמות שונים. לכל רקמה תפקודית ביטוי דפוס גן ספציפי, אשר נקבע בכל שלב התמיינות. התמיינות תאים כרוכה הפעלה של גנים ספציפיים, תחזוקת הביטוי שלהם, בדרך כלל, השתקה של סט של גנים כאלה המעורבים התפשטות תאים. בידול שרירי השלד, או myogenesis, הוא אפוא תהליך רב שלבי, המתחיל קביעת תאי גזע mesodermal לתוך myoblasts, ולאחר מכן מוביל בידול הטרמינל של myoblasts אלה לתוך מונו בעלי הגרעין הראשון, ולאחר מכן רב-גרעיני, myotubes . לפיכך, myoblasts הוא &quot;נקבע&quot; תאים, כי הם עדיין מסוגלים להתרבות, אבל הם מחויבים שושלת שרירי השלד, ובכך יכולים להבחין אך ורק לתאי שריר שלד גם במהלך התפתחות עוברית או התחדשות שריר מבוגרת. תהליך מסוף שרירי שלד שונהentiation הוא מתוזמר על ידי תוכנה גנטית מיוחדת שמתחילה ביציאת צמיתת מחזור התא של תאי מבשר myoblast שמוביל השתקה מוחלטת של גנים הקשורים התפשטות, כגון גני מטרת E2F 1. ואכן, במהלך התהליך של בידול הטרמינל, מעצר התפשטות myoblast הוא צעד חיוני שמקדים את הביטוי של גנים ספציפיים שריר שלד ואת ההיתוך של myoblasts לתוך myotubes 2. תכנית כזו מאפשרת תאי גזע שריר בוגרים, המכונים גם תאי לווין, להבדיל במהלך תהליך ההתחדשות בעקבות פציעה בשרירי שלד. Myogenesis יונקים תלויה באופן מכריע משפחה של לולאה בצורת סליל סליל בסיסית myogenic (bHLH) שעתוק גורמי Myod, Myf5, MRF4 ו Myogenin, מכונה לעתים קרובות כמו המשפחה של גורמים נחישות שרירי השלד או MRFs (גורמי תקינה שרירים) 3. כל אחד מהם ממלא תפקיד חיוני במפרט ו DIFferentiation של תאי שריר שלד ושיש לו דפוס ביטוי ספציפי 4 5-7. הפעלת Myf5 ו Myod מהווה את הצעד הקובע כי מתחייב לתאי שושלת myogenic, והביטוי הבא של Myogenin מפעיל myogenesis עם הפעלה של גנים ספציפיים שריר שלד, כגון MCK (שרירים קריאטין קינאז). גורמי שעתוק bHLH myogenic פעולה עם בני משפחת MEF2 בהפעלת גנים שריר מ לוקוסים שותק בעבר 8. הם גם מגרים שעתוק הגנים שרירי השלד כמו heterodimers עם חלבונים bHLH בכל מקום, E12 ו E47, המכונה חלבונים E, המחייבים כביכול E-תיבות 8 גנים רגולטוריים שונים אזורים. טוויסט, זיהוי (מעכב של בידול) וגורמים נוספים שלילי לווסת את התהליך הזה, על ידי מתחרה עם Myod עבור חלבוני E מחייבים 8. Myod נחשב לשחקן המרכזי מפעילת בידול מסוף שרירים 9 </sעד&gt; מאז יש לו את היכולת להשפיע על קביעת myogenic / בידול (טרנס-דיפרנציאציה) תכנית ברבים באופן מלא מערכות בדיל הלא שריר 10-13. אכן, ביטוי כפוי של Myod ומשרה את בידול טרנס מסוגים סלולריים שונים גם אלה נגזרו אחר ממוצא embryologic 12. לדוגמה, Myod יכול להמיר hepatocytes, פיברובלסטים, מלנוציטים, neuroblasts, ו adipocytes לתאים דמויי שריר. הפעולה חוצה בהתפלגותו של Myod כרוכה הפעלה תקינה של התכנית הגנטית myogenic (גני המטרה שלה בעיקר) בסביבה לא-שרירי, במקביל כדי השתקת התכנית הגנטית המקורית (בעיקר, גני התפשטות). בשנת מתרבים myoblasts, Myod מתבטאת אך אינו מסוגל להפעיל גנים היעד שלה גם כאשר הוא נקשר היזמים שלהם 14-16. לכן, הדרישה Myod להתבטא ברציפות myoblasts מובחן נשאר elu למדיsive. Myod יכול להדחיק גני ליעדו בשל הגיוס של אנזימי שינוי-הכרומטין דיכוי ב מתרבה myoblasts לפני הטעינה של הפעלת שיפוץ הכרומטין אנזימי 14,17. לדוגמה, ב מתרבים myoblasts, Myod קשורה תעתיק שיתוף מדכא KAP-1, deacetylases היסטון (HDACs) ו methyltransferases ליזין הדיכוי (KMTs), כולל היסטון H3 ליזין 9 או H3K9 ו H3K27 KMTs, פעיל לדכא ביטוי גנים היעד שלה על ידי הקמת 14,17 מבנה הכרומטין מקומית דיכוי. חשוב לציין כי הדו&quot;ח האחרון עולה כי Myod הוא עצמו מפוגל ישירות על ידי H3K9 KMT G9a וכתוצאה מכך עיכוב של transactivating שלה פעילות 16. המנגנונים אפיגנטיים המעורבים טרנס-הבחנה זו של תאים שאינם שריר ידי Myod הם ידועים ברובם. יש לציין, שורות תאים בעלי עמידות בידול טרנס-induced Myod. לכן, תאי הלה, Myod הוא גם פעיל אואפילו יכול לתפקד כמו מדכא ולא activator של שעתוק בשל חוסר ביטוי של למקטע BAF60C של הכרומטין שיפוץ המורכב SWI / SNF 18. מודל זה ולכן יכול להיות בחירה לאפיין את המנגנונים טובים יותר של דיכוי גני מושרה Myod. זה מתאים גם כדי assay את היכולת של Myod לגרום סביבת הכרומטין דיכוי בבית לוקוסי היעד שלה עם השותפים הקשורים אליו ולכן לחשוף את מנגנוני הדיכוי תלוי Myod ב מתרבה myoblasts מכוונן בידול סופנית. כאן אנו מתארים את הפרוטוקול לזיהוי שותפי Myod באמצעות טיהור טנדם זיקה (תג TAP) מצמידה ספקטרומטריית מסה (MS) אפיון. השימוש בתאי הלה-S3 להביע ביציבות הדגל-HA-Myod רשאי לקבל מספיק חומר כדי לטהר את מתחמי Myod מתמציות גרעיניות מופרדות. זיהוי שותפי Myod במערכת Heterologous לווה validatiעל במערכת רלוונטית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="543">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Cell lines</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">HeLa-S3</td>
			<td style="width:115px;">ATCC</td>
			<td style="width:101px;">CCL-2.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">C2C12</td>
			<td style="width:115px;">ATCC</td>
			<td style="width:101px;">CRL-1772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Name</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Equipment</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Spinner</td>
			<td style="width:115px;">Corning</td>
			<td style="width:101px;">778531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:177px;">Homogenizer :&#160; Dounce homogenizer&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Wheaton</td>
			<td style="width:101px;">432-1273 and 432-1271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Agitating device for spinners</td>
			<td style="width:115px;">Bellco</td>
			<td style="width:101px;">778531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Sonicator</td>
			<td style="width:115px;">Diagenode</td>
			<td style="width:101px;">UCD 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:115px;">Marienfeld Superior&#160;</td>
			<td style="width:101px;">640610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Low-binding tubes</td>
			<td style="width:115px;">Sorenson</td>
			<td style="width:101px;">27210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Empty spin column</td>
			<td style="width:115px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:101px;">7326204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Name</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Reagents</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:177px;">SDS-polyacrylamide 4-12 %&#160; gel</td>
			<td style="width:115px;">Life technologies</td>
			<td style="width:101px;">NP0336BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">4X loading buffer&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Life technologies</td>
			<td style="width:101px;">NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">10X reducing agent</td>
			<td style="width:115px;">Life technologies</td>
			<td style="width:101px;">NP0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Silver staining kit</td>
			<td style="width:115px;">Life technologies</td>
			<td style="width:101px;">A8592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Centrifugal filter units, 10K</td>
			<td style="width:115px;">Millipore</td>
			<td style="width:101px;">UFC501024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Protein G agarose beads</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">P4691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Protein A/G&#160; Resin</td>
			<td style="width:115px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">53132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:177px;">Flag resin (anti-Flag M2-agarose affinity gel)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:177px;">HA resin (monoclonal Anti-HA agarose)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A2095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">MNase</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">N3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:177px;">Flag free peptide (DYKDDDDK)</td>
			<td style="width:115px;">Ansynth Service BV</td>
			<td style="width:101px;">Custom synthesis</td>
			<td>Resuspend up to 4 mg/mL in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:177px;">HA free peptide (YPYDVPDYA)</td>
			<td style="width:115px;">Ansynth Service BV</td>
			<td style="width:101px;">Custom synthesis</td>
			<td>Resuspend up to 4 mg/mL in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:177px;">Bicinchoninic acid based protein assay kit : BCA kit</td>
			<td style="width:115px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Protease inhibitors</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">S8830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:177px;">Luminol-based enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate</td>
			<td style="width:115px;">Life technologies</td>
			<td style="width:101px;">34075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">BSA</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;">Sheared salmon sperm DNA (Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Spermine tetrahydrochloride</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">S1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Spermidine</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">S0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glycerol</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">PBS</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MOPS running buffer</td>
			<td style="width:115px;">Life technologies</td>
			<td style="width:101px;">NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DMEM (high glucose)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D0822</td>
			<td>Pre-warm&#160; at 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Trypsin-EDTA (0.05% phenol red</td>
			<td style="width:115px;">Life technologies</td>
			<td style="width:101px;">25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;">Serum</td>
			<td>GE healthcare life sciences&#160;</td>
			<td style="width:101px;">PAA A15-102</td>
			<td style="width:151px;">Each lot of serum has to be first tested for your cells.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin and Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Life technologies</td>
			<td style="width:101px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:115px;">Life technologies</td>
			<td style="width:101px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Water (sterile-filtered)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">W3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Name</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Antibodies</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">HA from rat (12CA5)</td>
			<td style="width:115px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11583816001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Flag</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A8592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">MyoD</td>
			<td style="width:115px;">Santa Cruz</td>
			<td>sc-32758</td>
			<td>To use for western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">MyoD</td>
			<td style="width:115px;">Santa Cruz</td>
			<td>SC-760</td>
			<td>To use for immunoprecipitation and western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">CBFbeta</td>
			<td style="width:115px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:101px;">FL-182&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">HP1alpha</td>
			<td style="width:115px;">Euromedex</td>
			<td style="width:101px;">2HP2G9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">HP1beta</td>
			<td style="width:115px;">Euromedex</td>
			<td style="width:101px;">1MOD1A9AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">HP1gamma</td>
			<td style="width:115px;">Euromedex</td>
			<td style="width:101px;">2MOD1GC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:177px;">Suv39h1</td>
			<td style="width:115px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:101px;">8729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">BAF47</td>
			<td style="width:115px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:101px;">612111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Myf5</td>
			<td style="width:115px;">Santa Cruz</td>
			<td>SC-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Tubulin</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T9026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Actin</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A5441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">IgG Mouse</td>
			<td style="width:115px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:101px;">SC-2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">IgG Rabbit</td>
			<td style="width:115px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:101px;">SC-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Goat anti-rat -HRP</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A9037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Goat anti-rabbit -HRP</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A6154&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Goat anti-mouse -HRP</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A4416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of myod interactome using tandem affinity purification coupled to mass spectrometry

בידול מסוף שרירי שלד מתחיל עם המחויבות של תאי מבשר mesodermal פלוריפוטנטיים כדי myoblasts. תאים אלה עדיין את היכולת להתרבות או שהם יכולים להבדיל הפתיל לתוך myotubes multinucleated, אשר לְהַבשִׁיל נוספת ליצירת myofibers. בידול מסוף שריר השלד בניצוחו של פעולה מתואמת של גורמי שעתוק שונים, בפרט חברי גורמים רגולטוריים שרירים או MRFs (Myod, Myogenin, Myf5, ו MRF4), המכונה גם משפחת גורמי שעתוק bHLH myogenic. גורמים אלה לשתף פעולה עם מתחמי שיפוץ-הכרומטין בתוך רשת רגולצית תעתיק משוכללת להשיג myogenesis שלד. לפי גישה זו, Myod נחשבת גורם שעתוק מאסטר myogenic המעוררים בידול מסוף שריר. רעיון זה מתחזק לנוכח היכולת של Myod להמיר תאים שאינם שרירים לתאי שריר שלד. כאן אנו מתארים גישה המשמשת לזיהוי Myodשותפי חלבון באופן ממצה על מנת להבהיר את הגורמים השונים המעורבים בידול מסוף שרירי שלד. המטרה לטווח הארוכה היא להבין את המנגנונים אפיגנטיים מעורבים בויסות גני שרירי שלד, כלומר., מטרות Myod. שותפי Myod מזוהים באמצעות טיהור טנדם זיקה (תג TAP) ממערכת Heterologous מצמידה ספקטרומטריית מסה (MS) אפיון, ואחריו אימות של תפקיד שותפים רלוונטיים במהלך בידול מסוף שרירי שלד. צורות Aberrant גורם myogenic, או התקנה הסוטה שלהם, קשורות עם מספר הפרעות שריר: מיאסטניה מולד, ניוון myotonic, ראדומיוסרקומה וליקויי התחדשות שריר. ככזה, גורמי myogenic לספק מאגר של מטרות טיפוליות פוטנציאליות בהפרעות שריר, הוא לעניין המכאניזם שיוצר מחלה עוצמה, מנגנון שיקום שיכול לשפר את הטיפול במחלה. לפיכך, להבין.&quot; המפורטדינג של האינטראקציות מולקולאריים ואת התוכניות הגנטיות בשליטת גורמי myogenic חיוני תכנון רציונל של טיפולים יעילים.

כדי להבין את הסדרת פעילות Myod, ניטלנו האפיון הממצה של מתחמי Myod באמצעות טיהור ביוכימיים, מבוסס על immunopurification של צורה מתויגת כפולה של Myod ואחריו ספקטרומטריית מסה (MS). השימוש קו תא הלה-S3 להביע Myod דגל-HA-tagged וקו תאים בלתי מבוקרת להביע היתרי דגל-HA להשיג מספיק חומר כדי לטהר את מורכבות Myod ידי ביצוע טיהור פעמיים זיקה של דגל-HA-Myod. אנחנו מופרדים תמציות התא לשבריריים ציטופלסמית וגרעיני, אז עוד מופרדי השבר הגרעיני חילוץ מלח (מלח-שניתן להפיק גרעיני, SE) והעשיר עבור נוקלאוזום (מועשר הנוקלאוזום, NE) שברים. טיהור TAP-Tag מתוך שברים גרעיניים המופרדים אלה (איור 1, לוחות 1 ו -2) מותר נפרמי שותפים שיש יחסית נמוך abundance כאשר נקודות תא subnuclear ספציפי אחד. יתר על כן, אסטרטגיה כזו נוצלה לחשוף שותפים של מאוגד (SE) לעומת הנכנס DNA (NE) Myod לקבל תובנות על ויסות פעילות Myod. עבור טיהור TAP-Tag, מערכת epitope טנדם דגל-HA היה בשימוש. הדגל הידרופילי קטן אפיטופים HA להיות התערבות מינימלית עם תפקוד החלבון והם נגישים מאוד לאינטראקציה נוגדן-אנטיגן. Anti-Flag immunopurification הרציף אנטי-HA מבוסס השרף בוצע, ואחריו elution של מתחמי immunopurified באמצעות פפטידים דגל HA. חלבוני eluted היו אז לרוץ על עמוד-SDS לאפשר לכל החלבונים להיכנס ג&#39;ל. פיסות ג&#39;ל המכילות את כל החלבונים המטוהרים קוצצו; החלבונים חולצו, טריפסין-מתעכל וזוהה על ידי ספקטרומטריית מסה (MS). כפי שניתן לראות בתרשים 2, </strong&gt; מתחמי Myod מטוהרים מן חלק NE יש העשרה גבוהה גורמי שעתוק ו-repressors שיתוף. ניתוח MS נפרם סדרה של שותפים ידועים של Myod (כגון PBX, זיהוי, E12 / E47 (HTF4), BRG1 (SMCA4), MEIS1 ...) ושותפים חדשים אושרו במחקרים שנוצרו מהניתוח הזה (כגון HP1, CBF, MBD3, BAF47 (SNF5 / INI1) וכל יחידות משנה מורכבים SWI / SNF אחרים ...) (איור 2 ו -3) 26-28. זה שופך אור על שותפי Myod הנכנס דנ&quot;א וסת שיתוף אפשרי שיכול להקים סביבת דיכוי-הכרומטין. לדוגמה, חלבונים HP1, אשר זוהו כשותפים Myod ידי המתודולוגיה המתוארת, ידועים לאגד H3K9 מפוגל לשמור הדחקה הגן והמבנה heterochromatin. ואכן, HP1 מעכב פעילות תעתיק Myod וכתוצאה מכך ביטוי גן המטרה Myod לקוי והבחנה מסוף שרירים 26. חלוקה נוספת שלמתחמי Myod SE ו NE על שיפוע גליצרול (כמתואר 29) חשפו את תת-מתחמי Myod בשני התאים subnuclear (איור 1B). בפרט, SE Myod מופץ בשלושה תתי-מתחמים, בעוד Myod הנכנס הכרומטין שייך בעיקר מורכב אחד. חלק TAP-tag / MS חשף interactors אושרו על ידי כתם המערבי על מתחמי Myod. אלה כוללים את CBF גורם שעתוק, גאות, MTG8R ואת BAF47 למקטע SWI / SNF (SNF5) (איור 3 א, משמאל) וחלבונים HP1 (CBX1 ו CBX3) (איור 3 א, מימין). יודגש, כי בגלל תאים הלה אינם תאים שרירים אינם מבטאים Myod, יש צורך לאשר אינטראקציות בין interactors מזוהה החדש Myod ב myoblasts (איור 3 BD). יש לציין, עבור אימות כזה, התמציות הגרעיניות הכוללות (ללא הפרדה על SE ו NE) הן בדרך כלל מספיק, which מתיר הקטנת סכום של myoblasts משמש להכנת המדגם. מבחני האינטראקציה במבחנה כמו 26,27, עוזרים תוקף נוסף ממצאים אלה. לבסוף, המשמעויות התפקודיות של אינטראקציות אלה בתאי שריר להתייחס נוסף כמו 26-28. יחדיו, הציג נתונים מראים בראיה גלובלית של שותפי Myod הביעו בכל מקום בגוף ולסלול את הדרך למחקרים תפקודיים נוסף מודל שריר רלוונטי יותר. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53924/53924fig1.jpg" /> איור 1: מכלולי Myod מבודדים על ידי טנדם זיקת טיהור (א) צביעת כסף של מתחמי eMyoD זיקה-מטוהרים הכפולים המבודדים מלח-שניתן להפיק גרעיני (SE) או מועשר הנוקלאוזום (NE) שברים גרעיניים של שורות תאים הלה-S3 ביציבות. דגל-HA-Myod (מורכבים Myod) הבעתקו תאים בלתי מבוקרים ד (מוק). MW, סמן משקל מולקולרי בדלתון קילו (KDA). החץ מצביע על דגל-HA-Myod (eMyoD). מחקר זה פורסם במקור ב -37. זכויות יוצרים האגודה האמריקאית לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית. נתון זה יש הבדל בין 26: הנתיבים עם purifications המדומה eMyoD מורכב מבודדים שברים גרעיניים SE מוצגים כעת. זיקה-מטוהרים זוגיים (B) מתחמי eMyoD כמו ב (א) היו מופרדים על שיפוע גליצרול הנע בין 20% ל -41%. שברים נאספו באופן ידני, מרוכזים ונותחו על ידי כתם המערבי (WB) באמצעות נוגדנים אנטי-דגל. הערת הנוכחות של מספר eMyoD המכיל תת-מתחם-שניתן להפיק מלח גרעיני (SE) שבר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53924/53924fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" sRC = &quot;/ files / ftp_upload / 53,924 / 53924fig2.jpg&quot; /&gt; איור 2:. השוואה של הכרומטין הנכנס (הנוקלאוזום מועשר, NE) לעומת מסיסים גרעיני (מלח גרעיני שניתן להפיק, SE) Myod שותפים למעלה: דיאגרמת ון מראה חפיפה בין interactors eMyoD מבודד מלח-שניתן להפיק גרעיני (SE) ו הנוקלאוזום מועשר ( חלק NE). החלבונים ריבוזומלי, גורמי תרגום-ייזום, גורמי תיקון DNA ואת isoforms טובולין לא נכללו בניתוח כפי שהם נוכחים-ערכות נתונים שונות מתקבלות על ידי TAP ונחשבו הלא ספציפי תחתון:. Interactors Myod נמצא בשני SE ושברי NE (משותפים) או ספציפיים אחת של השברים (הייחודיים) חולקו בקבוצות מבוססות על הערות הפעילות שלהן. נוגדנים הקשורים וחלבונים שונים אחרים לא מתוארים. החלבונים הדגיש הם interactors Myod תוקף בין אם הלה ו / או myoblasts ידי שיתוף immunoprecipitation. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53924/53924fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53924/53924fig3.jpg" /> איור 3:. תיקוף קבוצה נבחרת של Myod interactors (א) אימות של interactors Myod, שזוהו על ידי ספקטרומטריית מסה, בתור תא הלה-S3 להביע ביציבות דגל-HA-Myod (eMyoD) פאנל שמאל:. ניתוח כתם המערבי של זיקה כפולה מתחמי Myod -purified מבודדים מלח-שניתן להפיק גרעיני (SE) או מועשר הנוקלאוזום (NE) שברים של קו תא הלה-S3 להביע קו eMyoD או תאים בלתי מבוקרים ביציבות (מוק) עם נוגדנים המצוינים. MW, סמן משקל מולקולרי פנל ימני:. ניתוח כתם המערבי של מתחמי Myod זיקה-מטוהרים כפולים מבודד שברי הנוקלאוזום מועשר גרעין של ים קו תא הלה-S3tably להביע שורת תאי eMyoD או שליטה (מוק) עם נוגדנים מצוינים. פאנל זה פורסם במקור בכתב העת לכימיה ביולוגית. Yahi H, פריטש L, פיליפו O, Guasconi V, Souidi M, רובין P, A Polesskaya, Losson R, הראל-Bellan A, איט-סי-עלי ס J Biol Chem. 2008 29 Aug; 283 (35): 23,692-700. doi: 10.1074 / jbc.M802647200. Epub 2008 2. יולי זכויות יוצרים האגודה האמריקאית לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית. נתון זה יש הבדל בין 26: השיטור וגודל שונה והטקסט היה מסובב לאחד את התיוג בתוך הדמות. Myod היה מתויג בתור eMyoD כדי למנוע את הבלבול עם IP אנדוגני המוצגים לוחות אחרים. (BD) אימות של interactors Myod ב myoblasts העכבר C2C12. (ב) תמציות הכולל מגרעיני מתרבים myoblasts C2C12 שימשו immunoprecipitation (IP) עם נוגדנים שהועלו כנגד BAF47 (SNF5) או Myod, או עם IgG שליטה. משקעים וכתוצאה מכך נותחו על ידי שנינות WBh הנוגדנים המצוינים. לנוגדנים מסוג anti-Myod יותר (אקספו ארוך.) ו (אקספו קצר.) קצר פעמי חשיפה מוצגות. תמציות קלט הועמסו להראות רמות חלבון אנדוגני. פאנל זה כבר פורסם ב 28 תחת רישיון Creative Commons (CC BY) רישיון (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). דמות זו שונתה מ -28: השיטור וגודל שונה והמבחן היה מסובב לאחד את התיוג בתוך הדמות. (C) תמציות הכוללות מגרעיני מתרבה myoblasts C2C12 שמשו immunoprecipitation עם נוגדנים שהועלו כנגד Myod, Suv39h1 (בקרה חיובית), או לשלוט IgG (שליטה שלילית). המשקעים וכתוצאה מכן היו נתוני WB עם נוגדנים המצוינים. פאנל זה פורסם במקור בכתב העת לכימיה ביולוגית. Yahi H, פריטש L, פיליפו O, Guasconi V, Souidi M, רובין P, A Polesskaya, Losson R, הראל-Bellan A, איט-סי-עלי ס J Biol Chem. 2008 29 Aug; 283(35): 23,692-700. doi: 10.1074 / jbc.M802647200. Epub 2008 2. יולי זכויות יוצרים האגודה האמריקאית לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית. נתון זה יש הבדל בין 26: השיטור וגודל שונה והטקסט היה מסובב לאחד את התיוג בתוך הדמות. (ד) תמציות הכוללות מגרעיני מתרבה (prolif.) ו C2C12 myoblasts ההבחנה (48 שעות, הצביעו כפי Diff.) שמשו immunoprecipitation (IP) עם נוגדנים שהועלו כנגד Myod ו Myf5, או עם IgG ארנב רגיל עם חרוזים ריקים כמו בקרה שלילית. המשקעים וכתוצאה מכך נותחו על ידי WB עם נוגדנים המצוינים. תמציות קלט הועמסו להראות רמות חלבון אנדוגני. פאנל זה כבר פורסם ב 27 תחת רישיון Creative Commons (CC BY) רישיון (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). נתון זה יש הבדל בין 27: השיטור וגודל שונה והטקסט היה מסובב לאחד את התיוג בתוך figure. הפאנלים עם התוצאות שהתקבלו מתרבים ומבדל C2C12 מופרדים בשני בניגוד לצורה המקורית. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53924/53924fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> טבלת 1:. רשימה של חלבונים זוהו באמצעות ניתוח MS ב זוגי זיקה-מטוהרי eMyoD המכלולים המבודדים מן שבר מלח-שניתן להפיק גרעיני לאחר החיסור של חלבוני הרקע (חלבונים המזוהים על ידי MS ב eluates מקו תאים בלתי מבוקרים נחשבו הלא ספציפי רקע ה.) הנתונים מייצגים הסכום של ארבעה purifications העצמאי. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53924/Table_1.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.</a> טבלה 2: רשימת חלבונים ליdentified ידי ניתוח MS ב זוגי זיקה-מטוהרי eMyoD המכלולים המבודדים מן שבר מועשר הנוקלאוזום לאחר החיסור של חלבוני הרקע. הנתונים מייצגים הסכום של שלושה purifications העצמאי. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53924/Table_2.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.</a> לוח 3. הצפת קומפוזיציות. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53924/Table_3.xls" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry at JoVE.com

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.

זיהוי של Myod Interactome שימוש טיהור טנדם זיקה מצמידים ספקטרומטריית מסה

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

identification-myod-interactome-using-tandem-affinity-purification

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.8K Views.  Centre National de la Recherche Scientifique CNRS - Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité. MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.

Video: Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and very simple lipidome, is a valuable model for studying biological functions of various lipid species in multicellular eukaryotes2,3,5. S. cerevisiae has 10 major classes of lipids with chain lengths mainly of 16 or 18 carbon atoms and either zero or one degree of unsaturation6,7. Existing methods for lipid identification and quantification - such as high performance liquid chromatography, thin-layer chromatography, fluorescence microscopy, and gas chromatography followed by MS - are well established but have low sensitivity, insufficiently separate various molecular forms of lipids, require lipid derivitization prior to analysis, or can be quite time consuming. Here we present a detailed description of our experimental approach to solve these inherent limitations by using survey-scan ESI/MS for the identification and quantification of the entire complement of lipids in yeast cells. The described method does not require chromatographic separation of complex lipid mixtures recovered from yeast cells, thereby greatly accelerating the process of data acquisition. This method enables lipid identification and quantification at the concentrations as low as g/ml and has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. Lipids extraction from whole yeast cells for using this method of lipid analysis takes two to three hours. It takes only five to ten minutes to run each sample of extracted and dried lipids on a Q-TOF mass spectrometer equipped with a nano-electrospray source.

We describe a new quantitative lipidomics method for identifying numerous lipid species in yeast using survey-scan electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS). This method exceeds currently available methods for lipid identification and quantification in the ability to resolve various molecular forms of lipids, sensitivity, and speed.

הערכה כמותית של Lipidome שמרים באמצעות Ionization electrospray ספקטרומטריית מסה

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

כימות של חלבונים באמצעות העשרה Immunoaffinity פפטיד יחד עם ספקטרומטריית מסה

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

חלבון טיהור אורתוגונלית בהנחיית תג זיקה קטנים Bispecific

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

פרופיל Proteome חיזור תיאול באמצעות תיוג איזוטופ ספקטרומטריית מסה

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

פרוטוקול לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים על הסמך<sup&gt; 15</sup&gt; תיוג N מטבולית, immunoprecipitation, כמותית המונית ספקטרומטריית וזיקת ​​אפנון

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

טיהור תפוקה גבוהה של חלבונים רקומביננטי זיקה מתויגת-

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...