Diese Arbeit wurde teilweise durch die Scripps Microarray-Core Facility, und einen Vertrag von den Centers for Disease Control (JCP) unterstützt. RPdV ist ein Empfänger eines Rubicon und VENI Zuschuss von der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO). Das Konsortium für Funktionelle Glycomics (http://www.functionalglycomics.org/) finanziert von NIGMS Zuschuss GM62116 (JCP), die mehrere Glykane in dieser Studie verwendet. Dies ist die Veröffentlichung 29113 von The Scripps Research Institute.

HINWEIS: Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nichts anderes angegeben ist. 1. Array Construction <ol><li> Glycan Vorbereitung und Teller-Setup <ol><li> Bereiten Sie einen Vorrat an Druckpuffer. machen Zuerst wurden 500 ml einer 150 mM Stammlösung von Natriummonohydrogenphosphat. Stellen Sie außerdem 50 ml einer 150 mM Stammlösung von Natriumdihydrogenphosphat Lösung. In einem Kolben mit einem Magnetrührstab und einem pH-Meter, langsam die dibasische Natriumphosphatlösung mit der einbasigen Lösung titriert, bis ein pH von 8,5 erreicht ist. Hinzufügen, Tween-20 0,005%. </li><li> Bereiten Sie die Glykan Proben. Verdünnte PAA konjugierten Glykane (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA), 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA) und 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA (1A )) aus step1.1.1 in Druckpuffer verdünnt auf 100 ug / ml werden. Monovalent Glykane,diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ- (CH 2) 3 NH 2, 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2) und 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2)) bis 100 um in Druckpuffer aus Schritt 1.1.1. Schließlich bereiten die Amin-funktionalisierte Farbstoffe, als Gittermarkierungen / Landelichter zu verwenden. Dye Marker Spots werden bei 1 uM gedruckt. HINWEIS: Atto488-NHS Farbstoff wird in unserer Drucke verwendet. Jedoch kann jedes Amin-funktionalisierten Farbstoff, lesbar durch den Objektträger-Scanner ist für diesen Zweck geeignet ist. </li><li> Transfer 10 ul jeder Probe Glycan auf 384-well Mikrotiterplatten für die Druckroboter verwendet. Nicht verwendete Glykane in Druckpufferlösung bei -20 ° C in verschlossenen Röhren. Tansfer 10 ul der Farbstoffmarker auf der Druckplatte. </li></ol></li><li> Drucken HINWEIS: Alle steps, die Sorge zu berühren oder die Folien bewegen müssen mit Handschuhen erfolgen. <ol><li> Legen Sie Arrayers Stifte in den Druckkopf nach der korrekten Konfiguration des Layouts. Für dieses Layout einen Stift verwenden, um alle Proben und Arrays zu drucken. Drucken Sie die Glykane in Blöcken von sechs, das Überspringen einer Funktion (eine Funktion als einzelner Punkt einer bestimmten Verbindung definiert ist), auf jeder Seite, so dass Flecken von derselben Probe nicht genau nebeneinander gedruckt werden. HINWEIS: Der Endbenutzer die Konfiguration entscheiden muss. </li><li> Die Objektträger aus Taschen, offene Felder, und entfernen Sie alle Staubpartikel oder kleine Stücke aus Kunststoff, die durch Einblasen von ultrahochreinem Stickstoffgas auf jeder Folie auf ihren Oberflächen sein könnten. Legen Sie die gewünschte Anzahl der Folien, beschichtete Seite nach oben, auf der Arrayers Bühne. </li><li> Programm die Arrayer, verwenden, um die Parameter von 27 Flecken pro Besuch der Quellenplatte, 3 unter Verwendung von &quot;pre-spots&quot; auf Poly-L-Lysin beschichteten Objektträger, um überschüssige Flüssigkeit an der Spitze der Drucknadeln zu entfernen <ol><li> Schalten Sie MPU (Hauptstromeinheit) und Climate Control Unit. Offene Tiling Analyse-Software auf dem Computer. </li><li> Wählen Sie das Layout auf den Druck. 1 Einzel Stift - für den Druck des Array 1 x 1 Druckwerkzeug Wählen Sie Optionen → Pin-Werkzeug verwendet werden soll. Wählen Sie die Registerkarte Ziel → Werkzeug Array Definition → Druck-Muster und fügen Sie die Tonhöhe (Spot-zu-Spot-Abstand), die Anzahl der Zeilen und Spalten, die Proben aufzunehmen gedruckt werden, und das Druckmuster der Proben (für dieses Array ein 8 x 8 Druckmuster wird auf 340 um Platz für insgesamt 7 Proben). </li><li> Wählen Sie Ziel → Folienlayout und programmieren Sie den Block-zu-Block-Abstand zu ermöglichen, Drucken jedes Replikat Arrays in die 48-Well (4 x 12) Dia-Vorlage. Quelle auswählen und fügen Sie die Anzahl von Source-Pickups (1 für jede Probe bei der Verwendung von 1-polig) (für diesen Druck 7 Quelle Pickups verwendet werden, um Platz für 6 Probenvertiefungen und 1 Farbstoff Marker gut). HINWEIS: Der Dialog Quelle sollte GRÜN zu zeigen, dass die Zahlvon Quelle Besuche entspricht die Proben in dem Druckmuster gedruckt werden. </li><li> Ziel → Adapterplatte auswählen und Layout schieben und die Foliennummer einstellen (5 Dias werden mit 1 Vorbehandlungs Folie gleichzeitig für diesen Druck gedruckt). </li><li> Lassen Sie das Fach durch Klicken auf die T1-Taste, um das Fach zu aktivieren und fügen Sie die gewünschte Anzahl von Dias auf dem Tablett, aufmerksam auf die Standorte der Vordetachierung Schieber (BLAU) und &quot;echten&quot; Dias. </li><li> Legen Sie Normalglasträger bei den restlichen Vakuumanschlüsse um das Vakuum zu blockieren und klicken Sie auf OK, um das Vakuum zu aktivieren. Überprüfen Sie, ob alle Objektträger in Position gehalten werden, und klicken Sie auf OK, um das Tablett in die Ausgangsposition zurückzukehren. </li><li> Legen Sie die Druckplatte in den Plattenhalter und sicherzustellen, dass das Gestell richtig an Ort und Stelle festgelegt ist. Klicken Sie auf GO und lassen Sie den Druckvorgang fortzufahren. </li></ol></li><li> Drucken Sie die restlichen 24 Punkte in Replikaten von 6 Punkten pro Array (4 Arrays / Quelle besuchen). </li><li> Legen Sie die 384-Well-Plattenin den Drucker und das Drucken. Pflegen Sie relative Luftfeuchtigkeit, während des Druckens, während des gesamten Druck zwischen 55 und 65%. Der Drucker stoppt nach 5 Folien drucken. HINWEIS: Während der Mikroarray in diesem Test in einem bestimmten 8 x 8 Muster gedruckt wird, werden verschiedene Microarray-Druckroboter Ausrüstung spezifische Programmierung erfordern das gewünschte Layout zu erzielen. Es liegt Benutzer an das Ende des am besten geeigneten Muster ihre Ausrüstungen Spezifikationen &quot;gegeben, um zu bestimmen. </li></ol></li><li> Luftbefeuchtung / Immobilisierende HINWEIS: Sobald die Folien Druck fertig sind, durchlaufen sie eine vorübergehende Stillegung Schritt, auch genannt Befeuchten. Befeuchten nach dem Druck hilft, die Probe Befestigung durch erneutes Benetzen der Flecken und gewährleisten vollständige Blockierung zu homogenisieren. <ol><li> Setzen Sie gleitet in einer 100% Feuchtigkeitskammer unmittelbar nach dem Druck für einen Zeitraum von 30 min. Konstruieren Sie die Kammer durch eine sehr nasse Handtücher flach in den Boden einer großen Glasschale platzieren, platzieren Sie die Folienauf irgendeine Art von Rack, wie ein Reagenzglasgestell, Druckseite nach oben und mit Plastikfolie zu stoppen in der Feuchtigkeit abzudichten. </li><li> Anzahl gleitet mit einem Alkohol / lösungsmittelbeständigen Markierungsstift und an einem Austrocknungs Box. über Nacht trocknen. </li></ol></li><li> Nummerierung, Sperrung und Lagerung <ol><li> Bereiten Sie den Blockierungspuffer - 50 mM Ethanolamin in 50 mM Boratpuffer. Zunächst lösen Borsäure, in ddH 2 O zu einer Endkonzentration von 50 mM in einen Kolben mit einem magnetischen Rührstab enthält. Rühren Sie die Lösung kräftig auf einer Rührplatte, bis alle Feststoff gelöst hat. Unter ständigem Rühren die entsprechende Menge an Ethanolamin aus einer 16,54 M Stammlösung Fügen Sie die gewünschten 50 mM Konzentration zu erreichen. Hinzufügen konzentriertem Natriumhydroxid auf einen endgültigen pH von 9,2 einzustellen. </li><li> Tauchen Sie die bedruckten Folien in der Blockierungspufferlösung für 1 Stunde. </li><li> Nach 1 h Spülen Sie die Folien in ddH 2 O überschüssige Spuren von Blockierungspuffer zu entfernen.Entsorgen Puffer in einem geeigneten Abfallbehälter zu blockieren. </li><li> Die Objektträger in Glasfärbung Halter und trocken schleudern. Trocken Arrays von ihnen in einer Zentrifuge mit Schwingplattenhalter, mit einer Geschwindigkeit von 10 g für 5 min setzt. </li><li> Sobald die Objektträger trocken sind, können sie sofort oder gelagert inkubiert werden. Lagerbedingungen sind 20 ° C in einem verschlossenen Plastikbeutel. </li></ol></li></ol> 2. Analysieren von Glycan-Bindungsproteine <ol><li> Bereiten einer befeuchteten Kammer, in der die Arrays hybridisiert werden sollen, passen. Eine einfache Kammer besteht aus einem Pyrexschale, mit angefeuchteten Papiertüchern auf dem Boden geschichtet und einem Gestell, auf dem die Schlitten ruhen wird. </li><li> Verwenden biotinylierten Lectinen SNA (Sambuca nigra agglutinin) und ECA (Erythrina cristagalli Agglutinin) bei 10 &amp; mgr; g / ml + 2 &amp; mgr; g / ml Streptavidin-555 - Farbstoff, in Sondierungspuffer (PBS + 0,01% Tween-20). Für HA (A / Vietnam / 1203-1204 H5N1 und A / KY / 07 H1N1, in diesem Beispiel), die Verwendungeine Ausgangskonzentration von 20 ug / ml vor-komplexierte, wie zuvor beschrieben 34. Kurz gesagt, eine HA machen: Mouse-α-Strep: Ziege-α-Maus-Alexa647 Mischung Puffer (PBS + 3% BSA + 0,01% Tween-20) bei einer 4 in Blockierungs: 2: 1-Molverhältnis. HINWEIS: Das Array wird mit Lektinen sondiert , um festzustellen , daß Glycane immobilisiert und nachweisbar (Abbildung 1B). </li><li> Übertragen Sie die Glykan-Bindungsprotein-Antikörper-Mischlösung von 20 &amp; mgr; l zu einer 384-Well-Platte und Inkubation auf Eis für 30 min. verdünnte seriell Lektin und HA Proben 1: 1, in den entsprechenden Puffer, 8-mal, um 10 &amp; mgr; l Probe mit 10 ul Puffer gemischt wird. </li><li> Pipette 8 &amp; mgr; l der Probe auf den Mikrovertiefungsoberfläche und inkubiere in dem abgedichteten Befeuchtung (100% RH) Kammer für 90 min. </li><li> Waschen Sie die Folien einzeln nacheinander an den Rändern halten und sie viermal in einem Gemisch aus PBS und 0,05% Tween, dann viermal in PBS und schließlich viermal in entionisiertem H 2 O getaucht Mitdas gleiche Trocknungsprotokoll in dem Blockierungsschritt beschrieben, drehen sich die Anordnungen in einer Zentrifuge für 5 Minuten bei 10 x g trocknen. </li></ol> 3. Scannen und Datenanalysen HINWEIS: Die Glycan-Mikroarrays können bei unterschiedlichen Einstellungen gescannt werden, je nach Angaben des Herstellers Microarray-Scanner. Durch Variation der Laserleistung und Auflösung, kann das Gerät ein Bild zu erzeugen , mit so vielen Signalen wie möglich innerhalb seines Dynamikbereichs (Abbildung 1C). <ol><li> Verwenden Sie einen fluoreszierenden Dia-Scanner und scannen die Arrays unmittelbar nach der Inkubation mit den Glycan Bindungsproteine. Achten Sie darauf, die Rutsche, um sicherzustellen, richtig in das Scan-Gerät eingesetzt wird. <ol><li> Öffnen Sie Scan-Software. Klicken Sie auf Start, das Programm zu öffnen. Eine Verbindung mit Scanner: Scanner → Verbinden oder grüne Taste in der Scanner-Navigationsfeld-Menü. </li><li> Öffnen Sie Autoloader Tür des Scanners. Die Objektträger in Schlitze in Autoloader in einer bestimmten Reihenfolge. Schließen Autoloader Tür. Click &quot;lesen loader&quot; im Tools-Navigationsfeld automatische Erkennung Dias in den Scanner. </li><li> Stellen Sie Scan - Parameter: Scanner → Scan - Parameter entsprechend dem Experiment (zB 635 Laserleistung hoch, Erfassungsverstärkung 50%). Scannen von Dias: Scanner → Scan. Wählen Sie den Pfad durch das Erstellen eines Ordners die Scan-Bilder und Namen einzelnen Scans zu speichern. Tun Sie dies vor dem eigentlichen Scannen. Wiederholen Sie für jede einzelne Folie. Klicken Sie auf OK, um das Scannen zu starten. </li></ol></li><li> Verwenden Sie die Scanner-Software das Gerät einzurichten und zu scannen, um die Dias. Stellen Sie Scanner scannen iterativ bei niedrigen Laserleistung (5 mW) mit zunehmender Gain-Einstellungen von 25%, 50% und 75%. HINWEIS: Die Einstellungen können getestet und optimiert werden, aber bedenken Sie, dass jeder Scan möglicherweise die Fluoreszenz Ausgabe der Farbstoffe aufgrund Photobleaching senken kann. <ol><li> Offene Datenerfassung und Analyse-Software wie MAPIX Software. Klicken Sie auf Start, das Programm zu öffnen. Öffnen Sie Scan-Bild: Datei → Öffnen imAlter. Öffnen Sie GAL-Datei: Analysieren → Öffnen Raster und wählen Sie den entsprechenden GAL-Datei. </li><li> Geben Sie Blöcke Modus: Bild → Blöcke Modus, um das Raster zu bewegen. Verwenden Sie die Gittermarkierungen das Gitter an der entsprechenden Stelle auf der Folie einzustellen. Passen Sie einzelne Blöcke als notwendig, um die gedruckte Array entsprechen. </li><li> Geben Sie Flecken-Modus: Bild → Spots Modus Lage und Größe der einzelnen Spots innerhalb des Blocks einzustellen. Sobald alle Blöcke und Spots eingestellt und an Ort und Stelle, messen Signalintensitäten durch Analysieren → Photometrische Berechnungen. Speichern Sie die Ausgabedatei. </li></ol></li><li> Sobald die Dias Scannen fertig sind, werden die Bilder für die Bindung von Signalen mit dem Bildbearbeitungsprogramm installiert ist (- G 1D) analysiert. Für die Bildanalyse, legen Sie eine GAL (Array-Liste) Datei über das TIFF-Bild gescannt. HINWEIS: Die GAL-Datei enthält sowohl das Punktlayoutmuster und Identitäten jedes Spots Lage. GAL-Dateien für Arrays sind created durch die Druckersoftware ein Tab-separierte Textdatei, die die Identität der Proben enthält und ihre Position in der 384-Well-Source-Platte. </li><li> Verwenden Sie die Raster-Marker / Landelichter auf den Mikroarrays gedruckt, um richtig die GAL Gitter platzieren. Einzelnen Spots müssen einzeln bewegt werden, sondern ein gut gedruckten Arrays werden im Allgemeinen Blöcke innerhalb des Gitters ermöglichen, mit Leichtigkeit zu platzieren. Nach Gitter Platzierung, sammeln Spotintensitäten von der Software und als Tab-getrennte Textdatei (.txt) gespeichert. <ol><li> Mit Tabellenkalkulationsprogramm, öffnen Sie die Ausgabedatei vom Scanner. Öffnen Sie das entsprechende Makro-Datei aus dem Ordner. Klicken Sie auf Ansicht → Makro → RunMacro. HINWEIS: Die Pre-geschrieben, um die rohen Ausgangsdaten kopiert, entfernen Sie unnötige Zeilen und Spalten sortieren Sie die Daten, die von Probe, berechnen die durchschnittliche mittlere Signal minus Hintergrundwerte und zeichnen Sie die resultierenden Werte in zu einem Tabellenkalkulations-Arbeitsblatt die Graphen für die jeweils der sechs samples auf dem Array getestet. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Tumpey, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-amino+acid+change+in+the+hemagglutinin+of+the+1918+influenza+virus+abolishes+transmission.">A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission.</a> Science. 315 (5812), 655-659 (2007).</li><li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+balance+of+the+hemagglutinin+and+neuraminidase+activities+accompanies+the+emergence+of+the+2009+H1N1+influenza+pandemic.">Functional balance of the hemagglutinin and neuraminidase activities accompanies the emergence of the 2009 H1N1 influenza pandemic.</a> J Virol. 86 (17), 9221-9232 (2012).</li><li>Bouvier, N. M., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+influenza+viruses.">The biology of influenza viruses.</a> Vaccine. 26, D49-D53 (2008).</li><li>Freidl, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+at+the+animal-human+interface:+a+review+of+the+literature+for+virological+evidence+of+human+infection+with+swine+or+avian+influenza+viruses+other+than+A(H5N1).">Influenza at the animal-human interface: a review of the literature for virological evidence of human infection with swine or avian influenza viruses other than A(H5N1).</a> Euro Surveill. 19 (18), (2014).</li><li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+recognition+of+avian-like+receptors+in+human+influenza+A+H7N9+viruses.">Preferential recognition of avian-like receptors in human influenza A H7N9 viruses.</a> Science. 342 (6163), 1230-1235 (2013).</li><li>Paulson, J. C., de Vries, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H5N1+receptor+specificity+as+a+factor+in+pandemic+risk.">H5N1 receptor specificity as a factor in pandemic risk.</a> Virus Res. 178 (1), 99-113 (2013).</li><li>Tzarum, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+receptor+binding+of+the+hemagglutinin+from+a+human+H6N1+influenza+virus.">Structure and receptor binding of the hemagglutinin from a human H6N1 influenza virus.</a> Cell Host Microbe. 17 (3), 369-376 (2015).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human-Infecting+H10N8+Influenza+Virus+Retains+a+Strong+Preference+for+Avian-type+Receptors.">A Human-Infecting H10N8 Influenza Virus Retains a Strong Preference for Avian-type Receptors.</a> Cell Host Microbe. 17 (3), 377-384 (2015).</li><li>Carroll, S. M., Higa, H. H., Paulson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+cell-surface+receptor+determinants+of+antigenically+similar+influenza+virus+hemagglutinins.">Different cell-surface receptor determinants of antigenically similar influenza virus hemagglutinins.</a> J Biol Chem. 256 (16), 8357-8363 (1981).</li><li>Gambaryan, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+receptor-binding+phenotypes+of+influenza+virus+isolates+from+different+hosts+using+synthetic+sialylglycopolymers:+non-egg-adapted+human+H1+and+H3+influenza+A+and+influenza+B+viruses+share+a+common+high+binding+affinity+for+6'-sialyl(N-acetyllactosamine).">Specification of receptor-binding phenotypes of influenza virus isolates from different hosts using synthetic sialylglycopolymers: non-egg-adapted human H1 and H3 influenza A and influenza B viruses share a common high binding affinity for 6'-sialyl(N-acetyllactosamine).</a> Virology. 232 (2), 345-350 (1997).</li><li>Rogers, G. N., D'Souza, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+binding+properties+of+human+and+animal+H1+influenza+virus+isolates.">Receptor binding properties of human and animal H1 influenza virus isolates.</a> Virology. 173 (1), 317-322 (1989).</li><li>Rogers, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+amino+acid+substitutions+in+influenza+haemagglutinin+change+receptor+binding+specificity.">Single amino acid substitutions in influenza haemagglutinin change receptor binding specificity.</a> Nature. 304 (5921), 76-78 (1983).</li><li>Paulson, J. C., Rogers, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resialylated+erythrocytes+for+assessment+of+the+specificity+of+sialyloligosaccharide+binding+proteins.">Resialylated erythrocytes for assessment of the specificity of sialyloligosaccharide binding proteins.</a> Methods Enzymol. 138, 162-168 (1987).</li><li>Paulson, J. C., Sadler, J. E., Hill, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+specific+myxovirus+receptors+to+asialoerythrocytes+by+incorporation+of+sialic+acid+with+pure+sialyltransferases.">Restoration of specific myxovirus receptors to asialoerythrocytes by incorporation of sialic acid with pure sialyltransferases.</a> J Biol Chem. 254 (6), 2120-2124 (1979).</li><li>Chutinimitkul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assessment+of+attachment+pattern+and+replication+efficiency+of+H5N1+influenza+A+viruses+with+altered+receptor+specificity.">In vitro assessment of attachment pattern and replication efficiency of H5N1 influenza A viruses with altered receptor specificity.</a> J Virol. 84 (13), 6825-6833 (2010).</li><li>Glaser, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+amino+acid+substitution+in+1918+influenza+virus+hemagglutinin+changes+receptor+binding+specificity.">A single amino acid substitution in 1918 influenza virus hemagglutinin changes receptor binding specificity.</a> J Virol. 79 (17), 11533-11536 (2005).</li><li>Herfst, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airborne+transmission+of+influenza+A/H5N1+virus+between+ferrets.">Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets.</a> Science. 336 (6088), 1534-1541 (2012).</li><li>Nobusawa, E., Ishihara, H., Morishita, T., Sato, K., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Change+in+receptor-binding+specificity+of+recent+human+influenza+A+viruses+(H3N2):+a+single+amino+acid+change+in+hemagglutinin+altered+its+recognition+of+sialyloligosaccharides.">Change in receptor-binding specificity of recent human influenza A viruses (H3N2): a single amino acid change in hemagglutinin altered its recognition of sialyloligosaccharides.</a> Virology. 278 (2), 587-596 (2000).</li><li>Gambaryan, A. S., Matrosovich, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+solid-phase+enzyme-linked+assay+for+influenza+virus+receptor-binding+activity.">A solid-phase enzyme-linked assay for influenza virus receptor-binding activity.</a> J Virol Methods. 39 (1-2), 111-123 (1992).</li><li>Totani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoenzymatic+synthesis+and+application+of+glycopolymers+containing+multivalent+sialyloligosaccharides+with+a+poly(L-glutamic+acid)+backbone+for+inhibition+of+infection+by+influenza+viruses.">Chemoenzymatic synthesis and application of glycopolymers containing multivalent sialyloligosaccharides with a poly(L-glutamic acid) backbone for inhibition of infection by influenza viruses.</a> Glycobiology. 13 (5), 315-326 (2003).</li><li>Gambaryan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+specificity+of+influenza+viruses+from+birds+and+mammals:+new+data+on+involvement+of+the+inner+fragments+of+the+carbohydrate+chain.">Receptor specificity of influenza viruses from birds and mammals: new data on involvement of the inner fragments of the carbohydrate chain.</a> Virology. 334 (2), 276-283 (2005).</li><li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+specificity+of+influenza+A+viruses+correlates+with+the+agglutination+of+erythrocytes+from+different+animal+species.">Receptor specificity of influenza A viruses correlates with the agglutination of erythrocytes from different animal species.</a> Virology. 227 (2), 493-499 (1997).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+human-type+receptor+binding+specificity+by+new+H5N1+influenza+virus+sublineages+during+their+emergence+in+birds+in+Egypt.">Acquisition of human-type receptor binding specificity by new H5N1 influenza virus sublineages during their emergence in birds in Egypt.</a> PLoS Pathog. 7 (5), e1002068 (2011).</li><li>Chandrasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+topology+determines+human+adaptation+of+avian+H5N1+virus+hemagglutinin.">Glycan topology determines human adaptation of avian H5N1 virus hemagglutinin.</a> Nat Biotechnol. 26 (1), 107-113 (2008).</li><li>Blixt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printed+covalent+glycan+array+for+ligand+profiling+of+diverse+glycan+binding+proteins.">Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (49), 17033-17038 (2004).</li><li>Childs, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-binding+specificity+of+pandemic+influenza+A+(H1N1)+2009+virus+determined+by+carbohydrate+microarray.">Receptor-binding specificity of pandemic influenza A (H1N1) 2009 virus determined by carbohydrate microarray.</a> Nat Biotechnol. 27 (9), 797-799 (2009).</li><li>Nycholat, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+Sialylated+Poly-N-acetyllactosamine+Chains+on+N-+and+O-Linked+Glycans+by+Human+and+Avian+Influenza+A+Virus+Hemagglutinins.">Recognition of Sialylated Poly-N-acetyllactosamine Chains on N- and O-Linked Glycans by Human and Avian Influenza A Virus Hemagglutinins.</a> Angew Chem Int Ed Engl. , (2012).</li><li>Rillahan, C. D., Paulson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+microarrays+for+decoding+the+glycome.">Glycan microarrays for decoding the glycome.</a> Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).</li><li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sialylated+glycan+microarray+reveals+novel+interactions+of+modified+sialic+acids+with+proteins+and+viruses.">A sialylated glycan microarray reveals novel interactions of modified sialic acids with proteins and viruses.</a> J Biol Chem. 286 (36), 31610-31622 (2011).</li><li>Gulati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+H3N2+Influenza+Viruses+Isolated+from+1968+To+2012+Show+Varying+Preference+for+Receptor+Substructures+with+No+Apparent+Consequences+for+Disease+or+Spread.">Human H3N2 Influenza Viruses Isolated from 1968 To 2012 Show Varying Preference for Receptor Substructures with No Apparent Consequences for Disease or Spread.</a> PLoS One. 8 (6), (2013).</li><li>Stevens, J., Blixt, O., Paulson, J. C., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+microarray+technologies:+tools+to+survey+host+specificity+of+influenza+viruses.">Glycan microarray technologies: tools to survey host specificity of influenza viruses.</a> Nat Rev Microbiol. 4 (11), 857-864 (2006).</li><li>de Vries, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+hemagglutinin+protein+of+the+new+pandemic+H1N1+influenza+virus:+maintaining+optimal+receptor+binding+by+compensatory+substitutions.">Evolution of the hemagglutinin protein of the new pandemic H1N1 influenza virus: maintaining optimal receptor binding by compensatory substitutions.</a> J Virol. 87 (24), 13868-13877 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+receptor+binding+preferences+of+recombinant+human+A(H3N2)+virus+hemagglutinins.">Structure and receptor binding preferences of recombinant human A(H3N2) virus hemagglutinins.</a> Virology. 477, 18-31 (2015).</li><li>de Vries, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influenza+A+virus+hemagglutinin+glycosylation+state+affects+receptor-binding+specificity.">The influenza A virus hemagglutinin glycosylation state affects receptor-binding specificity.</a> Virology. 403 (1), 17-25 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

IAV Rezeptorspezifität Die Beurteilung ist ein wichtiger Schritt in Pandemie-Potenzial von Vogelviren zu analysieren. Sialinsäure-Erkennung durch das Virus auf mehrere biologische Eigenschaften verbunden, wie beispielsweise die Bindung an und die Freisetzung aus der Zelle. Deren Kenntnis Aminosäure Mutationen sind notwendig für die Vogelviren zu erreichen α2-6 Bindung und überqueren die Speziesbarriere Pandemievorsorge ermöglicht. Verschiedene Assays werden verwendet Rezeptorspezifität zu bestimmen; aber alle haben ihre Nachteile, einschließlich nur Avidität zu messen und nicht die Spezifität und umgekehrt. Hier beschreiben wir eine neuartige miniaturisierte Werkzeug basiert auf dem weit verbreiteten und anerkannten ELISA, die PAA-Linked-Terminal Fragmente komplexer Glykane verwendet. Unter Verwendung von 4 gut definierten Lektine, 2 von Pflanzen- und 2 von Influenza-A-Virus Herkunft, zeigen wir, dass wir die Spezifität und der relativen Avidität halten. Wenn wir berechnen die Höhe der Reduzierung von Chemikalien und Biologschen, die von den ELISA auf eine Glycan-Array-Chip zu miniaturisieren, erreichen wir auffallend große Unterschiede. Zuerst werden die biologische Präparate; wir verwenden 10x weniger Testvolumen und 6 Testverbindungen in 6 Wiederholungen verwenden; dies kann das Äquivalent von 36x Reihen zu sein in 96-Well-Platten berechnet werden. Das Ergebnis ist, dass wir 360x weniger Biologicals verwenden. Kritische Schritte umfassen richtigen Druck und die Gefahr des hohen Hintergründe ungereinigtem Glykan Bindemittel oder schlechte Nachweis von Antikörpern verwendet wird. Die Verbindungen in diesem Test verwendet, obwohl immer noch verfügbar sind, werden nicht leicht durch chemo-enzymatische Synthese hergestellt. Mit Microarray-Drucktechnologie, jeder Punkt ist nur 2 nl, im Vergleich zu 100 &amp; mgr; l pro Vertiefung einer Mikrotiterplatte. Drucken einer einzigen Folie mit 48 Vertiefungen und 6 Verbindungen, in 6 Wiederholungen, verbrauchen wir etwa 1152 nl. Die gleiche Beschichtungsverfahren in 96-Well-Platten führt die Beschichtung insgesamt 1.842 Vertiefungen mit 100 &amp; mgr; l der Verbindung in der gleichen Konzentration. Daher Druck ter Verbindung im Vergleich zum Plattentest, wir eine auffällige Reduktion von 1,500x erreichen. Daher werden insgesamt Biologicals 360-fach und Glykan Verbrauch um 1.500-fache reduziert. Mit Roboter-Liquid-Handling, stellen wir uns vor, dass die meisten Schritte automatisiert werden, so dass der gesamte Test als Bildschirm mit hohem Durchsatz verwendet werden. Obwohl Druckmicroarrays und nachfolgende Bildanalysen Sondermaschinen und Werkzeuge erfordern, sind diese Instrumente nicht selten und liegen an vielen Universitäten und Instituten. Der Druck ist direkt und erfordert keine chemischen Veränderungen. Deshalb glauben wir, dass bei dieser minimalen Menge von Verbindungen und einfache Drucktechnik, dieser Assay allgemeiner anwendbar sein könnte. Da es die Inkubation Volumen reduziert, die Kosten von Antikörpern und Edel Biologicals, wird diese Technik es für Labore mit begrenzten Ressourcen möglich machen Spezifität von IAV oder andere Glykan Bindungsproteine ​​mit hoher Genauigkeit zu beurteilen, während niedrigere Kosten beibehaltens.

Wilde Wasservögel sind das natürliche Reservoir für IAV, aber IAV ist in der Lage die Artengrenze zu Geflügel und Säugetieren, zu überqueren, einschließlich Menschen. Avian iAVS erkennen α2-3 verknüpften Sialinsäuren (aviäre-Typ-Rezeptoren), während menschliche Viren α2-6 verknüpften Sialinsäuren (human-Typ-Rezeptoren) binden. In der Lage sein, effizient zu replizieren , und zwischen Menschen ein avian IAV zu binden muss human-Typ - Rezeptoren 1 übertragen. IAVS basieren auf Serologie unterteilt, die die Antigenität ihrer Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) Hüllglycoproteine ​​charakterisiert. HA bindet an Sialinsäuren, während NA der Rezeptor zerstörende Enzym am anderen Ende des viralen Lebenszyklus und spaltet Sialinsäure 2 ist. Alle menschlichen infizierenden Viren, einschließlich H1N1, H2N2 und H3N2, haben einen aviären Ursprungs 3. In den letzten zwei Jahrzehnten mehrere avian für die menschliche Crossovers aufgetreten sind, mit H5N1, H7N7 und H7N9 die bekanntesten sind; however, haben andere Subtypen Menschen mehr sporadisch infiziert (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. Glücklicherweise scheint es , dass keine dieser Viren vollständig konnten bis zu α2-6-verknüpfte Sialinsäure - Rezeptoren 5-8 human-Typ anzupassen. Die Anpassung von Vogel- oder anderen zoonotischen Viren-Replikation und Übertragung in menschlichen Wirten aufnehmen eine verheerende Wirkung auf die menschliche Gesundheit haben könnten. Daher sollten Sie vor Wissen, wie diese Viren Mensch-Typ-Rezeptoren zu binden, werden weiterentwickelt werden weltweite Überwachung von Schwellen Influenza-Viren helfen. Bestimmung der Rezeptor bevorzugt wurde aufgeklärt erste Erythrozyten verschiedener Arten verwendet und bleibt ein beliebtes Test unter Grippe Forscher 12.09. Die Demonstration, die Vogelviren α2-3 Sialinsäure und menschlichen Viren erkennen α2-6 Sialinsäure verknüpft wurde auf einem Test basierte ursprünglich enzymatisch konstruiert unter Verwendung von Hämagglutination von Erythrozyten jeder der li enthaltennkages 13,14. Obwohl die Auslese Hämagglutination, ein Standardtest für virologists ist, werden die zugrundeliegenden Glykanstrukturen nicht definiert, sondern nur die terminaler Verknüpfung. Zusätzlich kann die beschränkte Verfügbarkeit der Sialyltransferasen, verwendet , um die Zellen erneut sialylieren, haben die Verwendung dieses Assays 15-18 begrenzt. Anschließend andere Verfahren zur Bestimmung der Rezeptorbindungspräferenzen wurden unter Verwendung von sialylierten Glycanstrukturen auf poly-acrylamid (PAA) oder Poly-Glutamat (PGA) Strukturen in plattenbasierten Assays 19,20 verknüpft eingeführt. Verschiedene Varianten sind möglich , entweder die Glykane oder Viren auf Mikrotiterplatten in der Beschichtung, von denen jede ergibt eine robuste, zuverlässige und sehr empfindlichen ELISA-Typ - Assay 21-23. Alternativ können Biotin-gebundene Glykane können PAA / PGA ersetzen und kann auf 2,24 Streptavidin-beschichteten Platten konjugiert werden. Obwohl einige spezifische Seren erforderlich sein können, ELISAs sind Standard und mehrere an PAA verknüpften Glykanen leicht sind commercially und nicht im Handel erhältlich (Konsortium für Funktionelle Glycomics (http://www.functionalglycomics.org)). Glycan Microarray - Technologien haben als ein unschätzbares Werkzeug entstanden Rezeptorspezifität zu bestimmen, wie mehrere verschiedene Glykane gesichtet werden, und auf eine breite Palette von unterschiedlichen Strukturen Bindung kann 25-29 in einem einzigen Assay beurteilt werden. Die Bindung von IAV auf diese Strukturen ein besseres Verständnis der Glycan - Strukturen , die IAV bevorzugt 30-33 erkennt. Glycan-Mikroarrays erfordern geringe Mengen an Probenvolumen einen Bindungstest durchzuführen und verwendet nur winzige Mengen von Glycan pro Spot (2 nl). Allerdings sind in der Regel diese Arrays nur zu bewerten Spezifität von Glykane Rezeptoren verwendet. Analyse mehrerer Viren oder Hämagglutinin-Proteine, an mehreren Konzentrationsbereiche können aufgrund der Anzahl der Folien erforderlich prohibitiv sein. Darüber hinaus bis heute wurde keine relative Avidität Test unter Verwendung von Glycan ar entwickeltray-Techniken. Um den geringen Probenbedarf von Glycan-Mikroarray-Techniken und der Empfindlichkeit der PAA-Glycane in ELISA-basierten Assays lieferte kombinieren, haben wir versucht, eine Multi-Well-Glycan Array zu entwickeln, die für die Hochdurchsatzanalyse mit ähnlichen oder besseren Auflösung erlauben würde, im Vergleich zum herkömmlichen ELISA-basierenden Assay. Gleichzeitig wollten wir verbraucht, um die Menge von Biologika und Reporter Chemikalien zu minimieren. Das endgültige Ergebnis ist ein miniaturisiertes Avidität Assay, speziell entwickelt für die Überwachung der IAV Spezifität und ist gleichermaßen anwendbar andere Glykan Bindungsproteine ​​zu beurteilen. Mit einem Glasobjektträger getrennt in 48 Mikrovertiefungen durch eine Teflon-Maske, 6 verschiedene Glykane in 6 Wiederholungen gesichtet pro Vertiefung. Die Microarray-Plattform bietet die gleichen Trends in der Rezeptor im Makro-ELISA-Format mit mehreren Vorteilen gesehen Bindung. Dazu gehören (I) Druck der Verbindung in 6 Wiederholungen, minimale Probe mit, im Vergleich zu der Beschichtung von mehreren Reihen ina Platte, unter Verwendung von 100 &amp; mgr; l pro Vertiefung; (II) mehrere verschiedene Verbindungen analysiert gleichzeitig in einem einzigen gut, einschließlich der Kontrollen; (III) eine massive Verminderung der Inkubationsvolumen und; (IV) ein größerer Dynamikbereich ein Fluoreszenzsignal verwendet wird. Eine einzelne Folie kann berechnet werden zu 18-fach 96-Well-Platten äquivalent. Mit dem folgenden Protokoll, jedes Labor der Lage, die Herstellung und Analyse von spotted Microarrays Lage sein sollten, diese miniaturisierten ELISA-Format herzustellen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NEXTERION&#174; Slide H MPX-48&#160;</td>
			<td>Schott</td>
			<td>1091525</td>
			<td>Microwell slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProScanArray Plus&#160;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>confocal microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software</td>
			<td>Innopsys</td>
			<td>-</td>
			<td>confocal microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroGrid II&#160;</td>
			<td>Digilab</td>
			<td>-</td>
			<td>microaray printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNA</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>B-1305&#160;</td>
			<td>Plant Lectin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECA</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>B-1145&#160;</td>
			<td>Plant Lectin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Strep Antibody</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1509-001&#160;</td>
			<td>Anitbody for HA binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Alexa-647</td>
			<td>Life</td>
			<td>A-21235</td>
			<td>Anitbody for HA binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287&#160;</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-basic Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>255793</td>
			<td>printing buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mono-basic Sodium phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>229903&#160;</td>
			<td>printing buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-l-lysine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920&#160;</td>
			<td>pre-spotting slide component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221465</td>
			<td>pre-spotting slide component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>493546</td>
			<td>pre-spotting slide component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td>incubation/washing buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMP4B pins</td>
			<td>Telechem</td>
			<td>SMP4B</td>
			<td>printing pin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Nitrogen (Grade5)</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>UN1066</td>
			<td>general dusting/drying tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6768-500G</td>
			<td>Slide blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9508-500ML</td>
			<td>Slide blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto 488</td>
			<td>AttoTec</td>
			<td>AD 488-91</td>
			<td>Gridmarker on array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAA-LNLN</td>
			<td>Consortium for Functional Glycomics</td>
			<td>PA368</td>
			<td>Spotted glycans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAA-3SLNLN</td>
			<td>Consortium for Functional Glycomics</td>
			<td>PA362</td>
			<td>Spotted glycans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAA-6SLNLN</td>
			<td>Consortium for Functional Glycomics</td>
			<td>PA343</td>
			<td>Spotted glycans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LNLN</td>
			<td>Consortium for Functional Glycomics</td>
			<td>Te98</td>
			<td>Spotted glycans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3SLNLN</td>
			<td>Consortium for Functional Glycomics</td>
			<td>Te175</td>
			<td>Spotted glycans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6SLNLN</td>
			<td>Consortium for Functional Glycomics</td>
			<td>Te176</td>
			<td>Spotted glycans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well microtiter plate</td>
			<td>Matrix TechCorp</td>
			<td>4361</td>
			<td>Printing plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR lab marker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-150</td>
			<td>Slide Numbering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton slide staining dish</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z103969-1EA</td>
			<td>Blocking and Drying</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a miniaturized glycan microarray assay for assessing avidity and specificity of influenza a virus hemagglutinins

Influenza A-Virus (IAV) Hämagglutinine erkennen Sialinsäuren auf der Zelloberfläche als funktionelle Rezeptoren Eintritt in die Zellen zu gewinnen. Wilde Wasservögel sind das natürliche Reservoir für IAV, aber IAV können die Speziesbarriere zu Geflügel, Schweinen, Pferden und Menschen überqueren. Avian Viren erkennen zu einem vorletzten Galactose durch eine α2-3 Verknüpfung (aviäre-Typ-Rezeptoren) angebracht Sialinsäure während menschlichen Viren bevorzugt Sialinsäure mit einer α2-6 Verknüpfung (Mensch-Typ-Rezeptoren) erkennen. Zur Überwachung, ob Vogelviren für die menschliche Art der Anpassung sind Rezeptoren, können verschiedene Methoden verwendet werden. Glycan-Mikroarrays mit diversen Bibliotheken synthetischer Sialosiden werden zunehmend eingesetzt Rezeptorspezifität zu bewerten. Jedoch ist diese Technik zum Messen avidities nicht verwendet. Messung der Avidität wird durch Auswertung der Bindung von seriell verdünnt Hämagglutinin oder Virus Glykane adsorbiert zu herkömmlichen Polypropylen 96-Well-Platten typischerweise erreicht. In diesem Assay Glykane mit α2-3 oder α2-6 sind Sialinsäuren an Streptavidin Platten an Biotin und adsorbierte gekoppelt sind oder gekoppelt Polyacrylamid (PAA), die direkt an die Kunststoff adsorbieren. Wir haben diesen Test deutlich miniaturisiert durch direktes Drucken von PAA-linked Sialosiden und ihre nicht PAA gebundenen Pendants auf Mikro gut Objektträger aus Glas. Dieses Set-up, mit 48-Arrays auf einer einzelnen Folie, ermöglicht die gleichzeitige Assays von 6 Glycan Proteine ​​bei 8 Verdünnungen, abfrage 6 verschiedene Glykane, darunter zwei nicht sialylierten Kontrollen verbindlich. Dies ist äquivalent zu 18-fach 96-Well-Platten in der herkömmlichen Platten-Assay. Das Glycan Array-Format zur Verringerung der Kosten Verbindungen und biologische Präparate und steigert somit die Effizienz deutlich.

Drucken, Scannen und Datenanalysen Um eine ordnungsgemäße Druck, ist es wichtig, die richtige Ausrichtung des gefleckten Gitter innerhalb der Teflonmaske zu haben, die jedes Array auf dem Schlitten abgrenzt. Während des Druckvorgangs aufgrund der Natur der Teflonbeschichtung, spots kann nicht mit dem bloßen Auge auf den MPX Folien gesehen werden. Augenmerk wird dann auf die Erscheinung der vorge Flecken auf den poly-L-Lysin beschichtete Objektträger gelegt. Direkt nach dem Drucken, sollte jede Folie mit dem Auge auf das Vorhandensein von jeder getupft Verbindung überprüft werden, dass aufgrund der Puffer-Salzen in der Stelle getrocknet sichtbar ist. Arrays sind für die korrekte Ausrichtung der Flecken innerhalb der Teflon Grenzen und korrekte Anzahl von spotted Merkmale geprüft. Die Objektträger werden in einem iterativen Prozess von niedrigeren zu höheren Scan-Leistung gescanntes Foto Bleichen zu vermeiden und ermöglicht den Vergleich von higihre Avidität Avidität bindende Proteine ​​zu senken, die höhere und niedrigere Ausgangssignale sind. Nach Abtastung werden die Fluoreszenzintensität jedes Punkts in der Ausgangsbilder gemessen, um ein Imaging-Programm verwendet wird. Jeder Array wird mit einer Rasterdatei überschichtet, die die Anzahl von Merkmalen auf der Array - Oberfläche (1D - G) gedruckt einstimmt. Verwendung gedruckten Fluoreszenzfarbstoffe sind die Ränder der gedruckten Glykane definiert und eine Maske, die mit der Identität der gedruckten Probe integriert ist Lassos jeder Stelle. Die Abbildungsmaske lasso wird alle Aspekte des abgebildeten Flecks aufzeichnen (Größe, Signalstärke, Koordinaten im Netz, etc.) und Ausgang , diese Informationen zu einem Tab-getrennte Textdatei. Mit Tabula Software (Tabelle) werden die Proben durch Identität sortiert und die mittlere Signalintensität minus Hintergrund wird über 4 der 6 Punkte für jede Probe gemittelt, die höchste und niedrigste Signal als Ausreißer auslassen. Ein Liniendiagramm des durchschnittlichen mittleren Signalminus Hintergrund gegen den acht Proteinkonzentrationen auf das Array aufgebracht aufgetragen und enthält eine Zeile für jede Probe. Die Endausgabe Graph wird geglättet , um eine nichtlineare Regressionsberechnung unter Verwendung von (1I). Glycan-bindende Proteine Die PAA-Array wird verwendet, Rezeptor-Bindungsspezifität von Influenza-A-Virus Hämagglutininarten zu bewerten. Ein weiteres Merkmal des Arrays und nicht in der analogen Plattentest, ist die Einbeziehung von nicht-sialylierten Kontrollen in der gleichen Mikro gut. Um zu beurteilen, dass gedruckte Verbindungen nach dem Druck vorhanden sind, häufig verwendete Pflanzenlektinen mit bekannten Spezifität verwendet wurden. ECA bindet an terminale Galactose β1-4 gebunden an N-Acetyl-Glucosamin (Galβ1-4GlcNAc oder LacNAc) und wird nicht binden, wenn das terminale Galactose mit Sialinsäure verkappt ist. ECA erkennt nur die nicht-sialylierte Glykane auf unserer miniaturisierten Glykan array (2A). Der Mangel an einem der sialylierte Glycane Proben der Bindung ist auch ein Hinweis, dass diese vollständig mit terminaler Sialinsäure begrenzt. Für α2-6 verknüpften Sialinsäure wurde SNA als Lektin - Steuerung (2B) verwendet. Wie erwartet, SNA bindet nur verknüpfte Sialinsäuren zu α2-6, aber mit bemerkenswerten Unterschiede in der Affinität für PAA-verbundene nicht PAA-verknüpften Di-LacNAc wiederholt. Dieser Unterschied spiegelt die Empfindlichkeit von PAA-verknüpften Glykane und ermöglicht die Unterscheidung von Proteinen, die mit niedriger Avidität binden. Für α2-3 Sialinsäure verknüpft, Hämagglutinin ein H5 vom Stamm A / Vietnam / 1203-1204 Virus , das α2-3 verknüpften Sialinsäuren bekannt ist , nur wurde 6 verwendet zu erkennen. Das Bindungsprofil der H5 HA zeigt tatsächlich Spezifität für α2-3 verknüpften Sialinsäuren, mit einer höheren Avidität für die PAA-verknüpften Strukturen (Abbildung 2C). Schließlich wurde das H1-Hämagglutinin von einem menschlichen saisonalen H1N1-Stamm verwendet, dass, wie erwartet, nurzu α2-6 verknüpften Sialinsäure enthaltenden Strukturen (2D) gebunden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53847/53847fig1.jpg" /> Abbildung 1: Drucken, Scannen und Bildanalysen (A) PAA-konjugierte 6SLNLN als repräsentativer Glykanstruktur gezeigt, die auf den Glasträger gedruckt wird.. (B) Inkubieren einer Glykan Bindungsprotein auf der Multi-Well - Glykan - Array wird mit einer 8 &amp; mgr; l Volumen gezeigt , dass ein Tröpfchen auf der Array - Oberfläche erzeugt. (C) Nach der Inkubation der Glycan - Bindungsproteine ​​auf dem Array und das Scannen in einem konfokalen Fluoreszenz Diascanners, ein repräsentatives Bild erhalten. (D) Das Bild mit einem Gitter und unter Verwendung von Raster - Marker für eine korrekte Ausrichtung überlagert wird, werden die einzelnen Spots analysiert werden. (E) Eine Nahaufnahme von einem kompletten Satz von 8 - Arrays, in denen ein einzelnes Glykan - bindendes Protein1 Verdünnungen: mit acht 1 wurde analysiert. (F) einem einzigen Array in einem einzigen Bohrloch dargestellt ist ; die Anordnung durch die Gittermarkierungen in der oberen rechten (3 spots) und unten links (2 spots) dieses Glykan Bindungsprotein bindet, eine einzige Verbindung auf dem Array als ein Replikat von sechs ist deutlich sichtbar abgegrenzt ist. (G) Das Gitter ist mit Lassos umschließenden spezifischen einzelnen Spots gezeigt. (H) Imaging - Software berechnet Signalwerte aus der Bilddatei und gibt eine durch Tabulatoren getrennte Datendatei. (I) können die Daten in eine Tabelle oder eine stastical Software tabellarisch werden , um eine repräsentative Leistungsdiagramm zu erstellen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53847/53847fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53847/53847fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53847/53847fig2.jpg" /> Abbildung 2: Ausgabe von Pflanzenlektinen (ECA, SNA) und IAV hemagglutinins mit unterschiedlichen Spezifitäten (H5 vom A / Vietnam / 1203-1204, H1 von A / Kentucky / 07). (A) bindet ECA Terminal LacNAc oder Galb1-4GlcNAc spezifisch und erkennt das Vorhandensein der nicht-sialylierten Verbindungen, als Kontrollen verwendet für IAV Hämagglutininarten. (B) SNA erkennt nur Glykane ein Terminal α2-6 Sialinsäure trägt. (C) Das rekombinante Hämagglutinin des H5N1 (A / Vietnam / 1203/04) Stamm bindet Sialinsäuren und liefert einen aviären Typ - Rezeptor - Bindungsprofil a2-3. (D) Das rekombinante Hämagglutinin eines menschlichen saisonalen H1N1 (A / Kentucky / 07) bindet an nur ein Mensch-Typ-Rezeptoren. Fluoreszierende Signalintensität wurde für jede Stelle gemessen, und die mittlere Intensität minus bedeuten Hintergrund berechnet wurde Tabellenkalkulationsprogramm. Für jede Glycan wird die mittlere Signalintensität berechnet aus 6 repliziert Flecken. Die höchsten und niedrigsten Signale der 6 Replikate werden entfernt und die restlichen 4 ReplikatTES verwendet, um die mittlere Signal, Standardabweichung (SD) und Standardfehler-Messung (SEM) zu berechnen. Die Diagramme stellen die gemittelte mittlere Signal minus Hintergrund für jede Probe und Fehlerbalken sind die SEM - Wert. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53847/53847fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53847/53847fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins at JoVE.com

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Ein miniaturisiertes Glycan Microarray-Test zur Beurteilung der Avidität und Spezifität von Influenza-A-Virus Hämagglutininarten

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

a-miniaturized-glycan-microarray-assay-for-assessing-avidity

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.9K Aufrufe.  The Scripps Research Institute. Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Serie: A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Mit Bioluminescent Imaging, um Synergie von Untersuchen Streptococcus pneumoniae Und Influenza A Virus in Infant Mäuse

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Mit einem Pan-Viral Microarray-Assay (Virochip) zur klinischen Proben, die für virale Erreger Bildschirm

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5 For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus have been demonstrated.6-11 The identification and subtyping of influenza on DNA microarrays has applications in both public health and the clinic for early detection, rapid intervention, and minimizing the impact of an influenza pandemic. Traditional fluorescence is currently the most commonly used microarray detection method. However, as microarray technology progresses towards clinical use,1 replacing expensive instrumentation with low cost detection technology exhibiting similar performance characteristics to fluorescence will make microarray assays more attractive and cost-effective.
The ampliPHOX colorimetric detection technology is intended for research applications, and has a limit of detection within one order of magnitude of traditional fluorescence11, with a main advantage being an approximate ten-fold lower instrument cost compared to the confocal microarray scanners required for fluorescence microarray detection. Another advantage is the compact size of the instrument which allows for portability and flexibility, unlike traditional fluorescence instruments. Because the polymerization technology is not as inherently linear as fluorescence detection, however, it is best suited for lower density microarray applications in which a yes/no answer for the presence of a certain sequence is desired, such as for pathogen detection arrays. Currently the maximum spot density compatible with ampliPHOX detection is &tilde;1800 spots/array. Because of the spot density limitations, higher density microarrays are not suitable for ampliPHOX detection.
Here, we present ampliPHOX colorimetric detection technology as a method of signal amplification on a low density microarray developed for the detection and characterization of influenza viruses (FluChip). Although this protocol uses the FluChip (a DNA microarray) as one specific application of ampliPHOX detection, any microarray incorporating biotinylated target can be labeled and detected in a similar manner. The microarray design and biotinylation of the target to be captured are the responsibility of the user. Once the biotinylated target has been captured on the array, ampliPHOX detection can be performed by first tagging the array with a streptavidin-label conjugate (ampliTAG). Upon light exposure using the ampliPHOX Reader instrument, polymerization of a monomer solution (ampliPHY) occurs only in regions containing ampliTAG-labeled targets. The polymer formed can be subsequently stained with a non-toxic solution to improve visual contrast, followed by imaging and analysis using a simple software package (ampliVIEW). The entire FluChip assay from un-extracted sample to result can be performed in about 6 hours, and the ampliPHOX detection steps described above can be completed in about 30 min.

ampliPHOX colorimetric detection technology is presented as an inexpensive alternative to fluorescence detection for microarrays. Based on photopolymerization, ampliPHOX produces solid polymer spots visible to the naked eye in just a few minutes. Results are then imaged and automatically interpreted with a simple yet powerful software package.

ampliPHOX kolorimetrischen Nachweis einer DNA Microarray für Influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

Quantitative Analysen aller Influenza Typ A Viral Hämagglutininen und Neuraminidasen mit Universal Antikörper in Einfache Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-Immunopräzipitation der Maus Mx1 Protein mit dem Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Nasal Tücher für Influenza-A-Virus-Erkennung und Isolierung von Schweine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In - vitro - Zerlegung von Influenza - A - Virus Kapside durch Gradientenzentrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Fluoreszenz-basierte Neuraminidase-Inhibitionsassay die Empfänglichkeit der Influenza-Viren an die Neuraminidase-Inhibitor-Klasse von Anti-Virus zu beurteilen

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.