The authors have no acknowledgements.

פרוטוקול זה פועל בהתאם להנחיות אתיות המוסדיות למחקר על דגימות אנושיות והסכמתם התקבלה מכל התורמים מעורבים. אישור הניסויים שתוארו כאן הושג מלוח הסקירה המוסדי של בית החולים האוניברסיטאי אנטוורפן. הערה: סימנים טמפרטורה הם תמיד בטמפרטורת החדר, אלא אם כן צוין. 1. הגדרה קאמרית הכנת תזרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lanes הכנה, Tubing סיכות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס ההשעיה קולגן במרץ לדלל 1/20 בפתרון גלוקוז איזוטוני שקיבלת מספק לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל. הערה: אנו משתמשים קולגן גיד סוסים, בעיקר מורכבים מסוג I סיבים. אני קולגן מסוג הסוס הוא המכונה לעתים קרובות כמו &quot;הורם&quot; קולגן הוא תקן הזהב עבור סוג זה של assay 9 הם הסטוריות כמו גם סיבות ביולוגיות. סוג האדם III קולגן יכול לשמש גם, אבל הדואר הסיבים מעיל פחות טוב והתגובה טסיות אינה כה חזקה. משטחים ציפוי אחר יכול לשמש גם, למשל פון Willebrand Factor (VWF), פיברינוגן, פיברונקטין, laminin, vitronectin, thrombospondin-1 או שילובים של אלה 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח biochip הפנויה חדשה מהמכל של הספק. מידות biochips כאן הם השתמשו 0.4W x 0.1H 20L x במ&quot;מ 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 0.8 μl לנתיב (ים) של biochip microfluidic על קצה אחד של השבב ולסמן כמו לשקע. ודא כי השביל מלא 5/6 עם קולגן המכיל פתרון ציפוי ערוך 1.1.1. ודא שאין בועות אוויר. הערה: ערוצים הם מצופים חלקית כדי למנוע הצטברות של סיבי קולגן בכניסה של הערוץ (ראה דיון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות או לילה במכל humidified והסגור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את ערוצי מצופה ידי pipetting חסימת חיץ (1.0% (w / v) בסרום שור אלבומיןד 0.1% (w / v) גלוקוז 10 מ&quot;מ 4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) שנאגרו מלוחים (HBS; 0.9% (w / v) NaCl, pH 7.4) בקצה השני ומארק כמו מפרצון. ודא כי השביל מלא לחלוטין עם למאגר חסימת הימנעות בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים צינורות באריכות שווה (12 ס&quot;מ). השתמש באחת לכל ליין ולהתחבר כל צינורות עם סיכה. לדוגמא, ניסוי השוואת שני תנאים, לרוץ בשני עותקים ידרוש מארבע רצועות צינורות וארבע סיכות כדי להיות מוכנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את צינורות עם מים מזוקקים באמצעות מזרק ומחט G 26 או המחברים המצורפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות את הצינורות עם חסימת חיץ. חנות במיכל סגור humidified למשך תקופה מינימלית של 1 שעה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת שאיבת יריעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את המשאבה ואת סעפת עם מים מזוקקים, להסיר בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב למאגר החסימה לרדת מנתיב biochip (ים) באמצעות קצה 10 μl קבועים במוצא. נקה את פני השטח שלbiochip עם אבק דיוק חינם לנגב ואלכוהול מפוגל טכנולוגיה להסרת טביעות ואבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את biochip על במת מיקרוסקופ אוטומטית. אם יותר נתיב אחד משמש בו זמנית בטווח אחד, לחבר את מפצל סעפת שמונה נתיבים לשקע biochip. הערה: מפצל שמונת נתיבי הסעפת הוא חתיכת החומרה (איור S1) מחובר למשאבה ואת biochip. היא מאפשרת הפעלת כל הכניסה (שמונה) הנתיבים על biochip או שילוב של נתיבים אשר יכול להיות מוגדר מפעיל התוכנה הנלווית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סיכות בצינור כדי לתקן אותם כניסת biochip. מניחים את הקצה השני של הצינור (ללא פינים) במבחנה חרוטי 1.5 מ&quot;ל מלא HBS. יש לשטוף את כל צינורות נתיבי המחוברים שלהם עם 1 מיליליטר HBS באמצעות המשאבה, כדי להסיר שארית חיץ חסימה גרועה דבקה קולגן. </li></ol></li></ol> 2. הכנת דגימות דם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוסף והפרדהדם מלא טרי מן מתנדב בריא. 17 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את מיליליטר דם הראשון בצינור פוניו המכיל חומצת Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) כפי קרישה ובאופן בלעדי להשתמש מדגם זה עבור ספירת דם מלאה (CBC) עם נתח המטולוגיה אוטומטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף נפח של דם בתוך קרישה מתאימה באמצעות צינורות פונו. תרופות נגד קרישת דם סטנדרט לניסויי תא זרימה הם הפרין או הירודין כאשר הפיברין היווצרות אינו חלק מפרוטוקול הניסוי ו נתרן ציטרט כאשר הוא. הערה: הפרין שמש נוגד קרישה לכל הניסויים שתוארו בתוצאות. הערה: כמות הדם תלויה במספר ניסויים להתבצע. כ 1 צינור (7 מ&quot;ל) במשך 3 נתיבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הצינורות על כינון מחדש דם ממתינים מסובב. הערה: assay אמור להסתיים בתוך 3 שעות של phlebotomy. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 250 גרם להכין פלזמה עשירה בטסיות (PRP). אין להשתמש ההפסקה צנטריפוגות כדי למנוע הפרעה של הגלולה הארוזה בצורה רופפת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר יותר מ צינור אחד נאסף, לרכז את הדם בתוך שפופרת צנטריפוגה חרוטי יחיד. הערה: צנטריפוגה יכול להיעשות לאט יותר או פחות זמן, בהתאם לתשואות PRP ו דיפרנציאלי תא &quot;זיהום&quot; עדיף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר וזורק את PRP ומעייל באפי מניב תאי דם אדומים ארוזים עם כמה טסיות. הערה: ספירת הטסיות בשבריר התא האדום הארוז היא 13 ± 5 x 10 3 לכל μl (ממוצע ± סטיית התקן, n = 12) בממוצע בידינו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כינון דם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבוצת דם ההפשרה AB (רזוס D שלילי) פלזמה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ו -20 שניות לעמוד 4 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את ההמטוקריט של כדוריות הדם האדומות הארוזות ערוכות 2.1.5 באמצעות מנתח המטולוגיה אוטומטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הריכוז של טסיות דם בבנק הדם מוכן tha תרכיז הטסיותt ישמש כדי לשקם את שבר התא האדום לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את נפח תאי הדם האדומים ארוז ותרכיז טסיות שיניבו 40 המטוקריט% ו -250 x 10³ טסיות / μl במדגם 1 מ&quot;ל. הערה: כותרות יעד אחרות של תאים ניתן להגדיר באופן שרירותי, בהתאם לפרוטוקול המחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ארוז כדוריות דם אדומות ופלזמה לתוך צינור טרי באמצעות קצה pipet מקוטע ולהוסיף תרכיז הטסיות עד נפח דגימה של 1 מיליליטר הוא הגיע. הערה: בהתאם המשתנים שנבחנו, חלק פלזמה צריך להיות שווה בכל דגימות מחדש כי יש פלזמה השפעה משמעותית על קצב היווצרות פקיק. למשל, חזר הפשרה הקפאה או פלזמה שנלקחו מתורמים שונים או על תרופות נגד קרישת דם שונים עשויים להשפיע על התוצאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הדם מחדש בעדינות על ידי היפוך ולבצע CBC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן מדגם שליטה &quot;ריק&quot;, שבו היקף חלק טסיות מוחלףעל ידי אותו נפח של 0.9% (m / v) נתרן כלורי במים כדי לקבוע את הריכוז של טסיות אנדוגני (כלומר טסיות בנקאית בלתי דם) בדם מחדש באמצעות CBC. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תִיוּג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 1 מ&quot;ל מחדש דם במבחנה המכילה 1 μl 5 מ&quot;מ Calcein AM (5 מיקרומטר הריכוז הסופי). הערה: צבעי תאים אחרים יכולים לשמש 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. </li></ol></li></ol> 3. Assay זלוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס האובייקטיבי על סיבי הקולגן הדבקים בתחתית הנתיבים. באופן אידיאלי, להשתמש שלב בניגוד או התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) הגדרות עבור האסטרטגיה מתמקד הפעם. בחר &#39;גדר Z הנוכחי עבור אזורי אריח נבחרים&#39; בתוכנת הניסוי כדי לתקן את העמדות-Z שנבחרו באופן דיגיטלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אזור של עניין (ROI) בנתיב (XY) בתוכנת הניסוי של מ &#39;icroscope שיירשמו במהלך הניסוי. הערה: ROI יכול להיות כל שטח הפנים נבחר באופן שרירותי בתוך סמטה זלוף. רצוי לא לנתח היווצרות פקיק קרוב in- ו לשקע של נתיב כך כדי למנוע תופעות לוואי של פרופיל הזרימה משתנה באזור זה, גם אם זה קטן יחסית. שטח הפנים ROI צריך להכיל מספר לא מבוטל של טסיות או thrombi לאפשר פילוס של האות. בפרוטוקול זה ההחזר על ההשקעה הוא המצרפי תפור דיגיטלית של שלוש תמונות שוות בגודלן Side-by-side וכתוצאה מכך 0.62 מ&quot;מ 2 באמצע השביל 2 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב את הדגימות בעדינות על ידי היפוך ולמקם הבאים אלה אל biochip על הבמה האוטומטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הצינורות שמחוברים כשהמפרצון של biochip ב המבחנות המכילות דגימות הדם מחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את משאבת סנטימטר / 50 דיין 2 (או מדגיש גזירה אחר כרצונך) לערוצים צמודים בקבוקוניםהמכיל את דגימות הדם מחדש באמצעות התוכנה של המשאבה. הערה: מאמצי גזירה אחרים יכולים לשמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות שיא כל 15 שניות למשך 5 דקות בזמן אמת באמצעות תוכנת הרכישה ולהתנסות של המיקרוסקופ. הערה: סדרות עתיות אחרות יכולות לשמש תלוי ניסוי ההגדרה. הערה: אנו משתמשים בדרך כלל בהגדלת 100X (אובייקטיבי 10X ו 10X עדשות), אך גבוהה (או נמוכה) גדלה יכולה לשמש בקלות כחלופה. </li></ol> 4. יש לשטוף היטב את <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף היטב את כל הצינורות מחוברים לשקע ומחובר הסעפת הרבה או משאבת שימוש במים מזוקקים, ואחריו חומצת נתרן (אקונומיקה) 0.5% (v / v) ולבסוף 0.1 M NaOH במים. מחק את הצינורות מוצמדים כניסת biochip כפסולת מסוכנת. </li></ol> ניתוח 5. נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע קינטיקה צמיחה פקיק עם תוכנת ניתוח התמונה. הפקודות הבאות הן ספציפיות עבור ZEN2012. <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את ניתוח תמונת תוסף כדי לקבוע את כיסוי השטח של טסיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את סף הקרינה על כרטיסיית ניתוח אינטראקטיבית כדי להגדיר את עוצמת פיקסל כי בקורלציה עם איתות חיובית, כלומר טסיות דבקה או טסיות דבקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש צור שולחנות ליצור גיליון אלקטרוני באופן אוטומטי שיכיל את פני שטחים הנפרדים (ב מיקרומטר 2) של אלה &quot;אובייקטים&quot; המכילים פיקסלים עם אות בין הספים שנבחרו. זה מבוצע עבור כל נקודת זמן. הערה: לאחר ספי קרינה כבר בחרו, תוכנת הניתוח מזהה אוטומטית &#39;חפצים&#39; בשדה הנוף אשר עונים על הקריטריונים. אובייקטים אלה הם thrombi, אגרגטים טסיות קטנים או טסיות אחת ולכסות מספר פיקסלים. כל אובייקט מופיע בגיליון האלקטרוני בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור לגיליונות אלו בפורמט XML ולפתוח אותם בתוכנית גיליון אלקטרוניעבור חישובים נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחומים סה&quot;כ השטח של האובייקטים שנבחרו על ידי סיכום ולחלק את התוצאה על ידי השטח הכולל של השדה המדיד (מיקרומטר 2). זה יניב את כיסוי שטח היחסי (%). האם כך עבור כל נקודת זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש כיסויי משטח אלה בתפקוד של זמן זלוף לחשב את השיפוע על ידי רגרסיה ליניארית, מניב את הקינטית הצמיחה פקיק של מצב מסוים. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Broos, K., Feys, H. B., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K., Deckmyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets+at+work+in+primary+hemostasis.">Platelets at work in primary hemostasis.</a> Blood Rev. 25, 155-167 (2011).</li><li>Stalker, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+organization+in+the+hemostatic+response+and+its+relationship+to+the+platelet-signaling+network.">Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network.</a> Blood. 121, 1875-1885 (2013).</li><li>Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+blood+platelet+adhesion+to+artery+subendothelium+is+mediated+by+factor+VIII-Von+Willebrand+factor+bound+to+the+subendothelium.">Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium.</a> Nature. 279, 636-638 (1979).</li><li>Savage, B., Saldivar, E., Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+platelet+adhesion+by+arrest+onto+fibrinogen+or+translocation+on+von+Willebrand+factor.">Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor.</a> Cell. 84, 289-297 (1996).</li><li>Westein, E., de Witt, S., Lamers, M., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+in+vitro+thrombus+formation+with+novel+microfluidic+devices.">Monitoring in vitro thrombus formation with novel microfluidic devices.</a> Platelets. 23, 501-509 (2012).</li><li>Varga-Szabo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+calcium+sensor+STIM1+is+an+essential+mediator+of+arterial+thrombosis+and+ischemic+brain+infarction.">The calcium sensor STIM1 is an essential mediator of arterial thrombosis and ischemic brain infarction.</a> J Exp Med. 205, 1583-1591 (2008).</li><li>Westein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerotic+geometries+exacerbate+pathological+thrombus+formation+poststenosis+in+a+von+Willebrand+factor-dependent+manner.">Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner.</a> Proc Natl Acad Sci USA. , (2013).</li><li>Grabowski, E. F., Yam, K., Gerace, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+hemostasis+in+flowing+blood.">Evaluation of hemostasis in flowing blood.</a> Am J Hematol. 87 (Suppl 1), S51-S55 (2012).</li><li>Roest, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+chamber-based+assays+to+measure+thrombus+formation+in+vitro:+requirements+for+standardization.">Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization.</a> J Thromb Haemost. 9, 2322-2324 (2011).</li><li>Heemskerk, J. W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+surfaces+to+measure+thrombus+formation+under+flow:+possibilities+for+standardization.">Collagen surfaces to measure thrombus formation under flow: possibilities for standardization.</a> J Thromb Haemost. 9, 856-858 (2011).</li><li>Shrivastava, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+platelet+storage+lesion.">The platelet storage lesion.</a> Transfus Apher Sci. 41, 105-113 (2009).</li><li>Miyaji, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+platelet+aggregation+of+platelet+concentrate+during+storage+recovers+in+the+body+after+transfusion.">Decreased platelet aggregation of platelet concentrate during storage recovers in the body after transfusion.</a> Transfusion. 44, 891-899 (2004).</li><li>Goodrich, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+in+vitro+platelet+quality+measurements+with+in+vivo+platelet+viability+in+human+subjects.">Correlation of in vitro platelet quality measurements with in vivo platelet viability in human subjects.</a> Vox Sang. 90, 279-285 (2006).</li><li>Van Aelst, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riboflavin+and+amotosalen+photochemical+treatments+of+platelet+concentrates+reduce+thrombus+formation+kinetics+in+vitro.">Riboflavin and amotosalen photochemical treatments of platelet concentrates reduce thrombus formation kinetics in vitro.</a> Vox Sang. 108, 328-339 (2015).</li><li>Van Aelst, B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V., Feys, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+c+light+pathogen+inactivation+treatment+of+platelet+concentrates+preserves+integrin+activation+but+affects+thrombus+formation+kinetics+on+collagen+in+vitro.">Ultraviolet c light pathogen inactivation treatment of platelet concentrates preserves integrin activation but affects thrombus formation kinetics on collagen in vitro.</a> Transfusion. , (2015).</li><li>de Witt, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+platelet+function+defects+by+multi-parameter+assessment+of+thrombus+formation.">Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation.</a> Nat Commun. 5, 4257 (2014).</li><li>Cazenave, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+washed+platelet+suspensions+from+human+and+rodent+blood.">Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood.</a> Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).</li><li>Jackson, S. P., Nesbitt, W. S., Westein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+platelet+thrombus+formation.">Dynamics of platelet thrombus formation.</a> J Thromb Haemost. 7 (Suppl 1), 17-20 (2009).</li><li>Diedrich, B., Remberger, M., Shanwell, A., Svahn, B. M., Ringden, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prospective+randomized+trial+of+a+prophylactic+platelet+transfusion+trigger+of+10+x+10(9)+per+L+versus+30+x+10(9)+per+L+in+allogeneic+hematopoietic+progenitor+cell+transplant+recipients.">A prospective randomized trial of a prophylactic platelet transfusion trigger of 10 x 10(9) per L versus 30 x 10(9) per L in allogeneic hematopoietic progenitor cell transplant recipients.</a> Transfusion. 45, 1064-1072 (2005).</li><li>Neeves, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sources+of+variability+in+platelet+accumulation+on+type+1+fibrillar+collagen+in+microfluidic+flow+assays.">Sources of variability in platelet accumulation on type 1 fibrillar collagen in microfluidic flow assays.</a> PloS one . 8, e54680 (2013).</li><li>Born, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+blood+platelets+by+adenosine+diphosphate+and+its+reversal.">Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal.</a> Nature. 194, 927-929 (1962).</li><li>Cattaneo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+Standardization+of+Light+Transmission+Aggregometry:+A+Consensus+of+the+Working+Party+from+the+Platelet+Physiology+Subcommittee+of+SSC/ISTH.">Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH.</a> J Thromb Haemost. 11, 1183-1189 (2013).</li><li>Deckmyn, H., Feys, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+for+quality+control+of+platelets+for+transfusion.">Assays for quality control of platelets for transfusion.</a> ISBT Sci Series. 8, 221-224 (2013).</li><li>Andre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticoagulants+(thrombin+inhibitors)+and+aspirin+synergize+with+P2Y12+receptor+antagonism+in+thrombosis.">Anticoagulants (thrombin inhibitors) and aspirin synergize with P2Y12 receptor antagonism in thrombosis.</a> Circulation. 108, 2697-2703 (2003).</li><li>Casari, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=von+Willebrand+factor+mutation+promotes+thrombocytopathy+by+inhibiting+integrin+alphaIIbbeta3.">von Willebrand factor mutation promotes thrombocytopathy by inhibiting integrin alphaIIbbeta3.</a> J Clin Invest. 123, 5071-5081 (2013).</li><li>Gitz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+platelet+survival+after+cold+storage+by+prevention+of+Glycoprotein+Ib&#945;+clustering+in+lipid+rafts.">Improved platelet survival after cold storage by prevention of Glycoprotein Ib&#945; clustering in lipid rafts.</a> Haematologica. , (2012).</li><li>Maurer-Spurej, E., Labrie, A., Brown, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+Quality+Testing+of+Blood+Platelet+Transfusions+with+Dynamic+Light+Scattering.">Routine Quality Testing of Blood Platelet Transfusions with Dynamic Light Scattering.</a> Part Part Syst Char. 25, 99-104 (2008).</li><li>Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+whole+blood+thrombus+formation+using+parallel-plate+flow+chambers+-+a+practical+guide.">Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide.</a> Platelets. 23, 229-242 (2012).</li><li>Zwaginga, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-based+assays+for+global+assessment+of+hemostasis.+Part+2:+current+methods+and+considerations+for+the+future.">Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 2: current methods and considerations for the future.</a> J Thromb Haemost. 4, 2716-2717 (2006).</li><li>Zwaginga, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-based+assays+for+global+assessment+of+hemostasis.+Part+1:+Biorheologic+considerations.">Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 1: Biorheologic considerations.</a> J Thromb Haemost. 4, 2486-2487 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ניסויי תא זרימת microfluidic הם כלים מצוינים כדי לחקור את תפקוד הטסיות ב זורם דם משמשים כדי להעריך המוסטאסיס במבחנה בהקשרי ניסיוני. למרות סטנדרטיזציה עני מעבדתיות 9, אנו מראים כי בתוך המעבדה שלנו וריאצית ניסיוני מקובל. זה מאפשר להשוות באופן מהימן (זיווג) דגימות בתוך מחקר נתון. זו קבלה תוקף באמצעות התופעה מתועדת היטב של נגע אחסון טסיות, וזאת כפועל יוצא מזיק של אחסון טסיות בתנאי בנק דם 11. יתר על כן, פרסמנו את ההשפעה לאחרונה של שלוש טכנולוגיות איון הפתוגן נגישות תפקוד טסיות PC בתאי זרימת microfluidic הבאה כינון מחדש של 14,15 דם. טסיות מגיבים באופן שונה כאשר פרמטרי biophysical ו -chemical הם מגוונים 20. לכן, מאמץ גזירה, מספר תא composi הסלולרtion, טמפרטורה, ציפוי, קרישה וגורמים רבים נוספים ניתן לשנות בתוך פרוטוקול זה תלוי שאלת המחקר. פרוטוקול זה משתמש רק זמין מסחרי כלים קשים ו תוכנה, המאפשר מעבדות אחרות כדי לבצע assay דומה. למטרות מחקר בסיסיות זה יכול להיות חסרון בעיקר בגלל החומרה הזמינה פחות וברבגוניותם setups מחוייט. את assay כשלעצמה הוא איתן אך שחזור סובל וריאציה ביולוגית זמנית. לכן, דגימות assay יש לזווג ככל האפשר וללמוד בגדלים צריך להיות גדול מספיק. דוגמאות גם יש לזווג בזמן, כי הדם מחדש ניתן לאחסן רק לזמן קצר. למרות בתאי לזרום microfluidic ללימודי תפקוד טסיות שהגדילו את שדה המחקר, יש לנקוט זהירות כדי overinterpret התלות טסיות על rheology דם. ראשית, הצורה המלבנית של תא הזרימה אינה פיזיולוגית, but את הטוב ביותר שיש לנו כדי לאפשר אופטי התמקדות thrombi גדל. שנית, כלי הדם אינם עשויים פלסטיק השפעת גמישות כלי הדם על תפקוד טסיות יכול ולכן לא להיחקר בפרוטוקול זה. שלישית, בלב גורם זרימת pulsatile, בעוד משאבות מזרק יותר ליניארי (אך גם מעט pulsatile). לבסוף, סוג סיבי קולגן אני הוא החומר הסטנדרטי המשמש לימודי טסיות תחת זרם, שהוא מן החי. ראוי לציין עם זאת, סוג סיבי קולגן אני ותוצאות קליניות לתפקוד טסיות לתאם גם במקרים רבים כפי שמוצג על ידי עשרות שנות ניסיון (העברת אור) aggregometry 21,22. ישנם מבחני רבים ללמוד טסיות פונקציה 23. רוב הכתובות אלה אחד או כמה תכונות טסיות תוך טסיות לשים לעבוד (מודלים של) המוסטאסיס. הדמיה בזמן אמת של היווצרות פקיק כפי שהודגמו כאן היא כוללת ביותר, עד כה. משמעות הדבר היא ברוב ההיבטים של PLA<html> תגובת telet פציעת כולים כלולה. יתרונות ייחודיים הם הכללת זרימת הדם ואת הנוכחות של כל תאי הדם. Assay הוא רגיש תרופות המשמשות כיום לטיפול אנטי טסיות 24 כמו גם לשינויים גנטיים וכתוצאה מכך תפקוד טסיות סוטה 25. זו ממחישה הערך שלה כאינדיקטור רלוונטי של תפקוד הטסיות. האופי המקיף של assay זה בכל זאת גם מרמז שזה פחות אנליטיים מאלה מבחני מדידת תכונות ספציפיות של תגובת טסיות. השפעות של מניפולציות בנקאות דם על תרכיזים טסיות ולכן יכולות ידי נאספות על ידי מבחני תא זרימה, אך לפרש מה גורם להם, נדרש ניתוח נוסף. למשל, הנתונים שלנו מצביעים על כך טמפרטורה משפיעה הידבקות טסיות משמעותית בתאים לזרום microfluidic. אבל ניתוח מפורט נוסף הוכיח כי טסיות בקירור לשנות צורה אשכול GPIbα קולטני 26. ילדה = &quot;jove_content&quot;&gt; הרבגוניות של היתרי המשטח הדבק ללמוד מצעים או שילובים טסיות תגובתי שונים ממנו. מחקר שנערך לאחרונה על ידי דה ויט et al. 16 הוכיח את הרלוונטיות של הגדרת מצע טסיות ביולוגיה מערכתית. מעבר לכך, השילוב של משתנה שיעורי גזירה בתפקוד של המצע חשוב כי מחייב של טסיות משותק VWF ידרוש שיעורי גזירה גבוהים, גם אם זה פחות חשוב עבור מחייב קולגן. לכן, בהתאם לשאלת המחקר, בחירות יכולות להתבצע על מה מצעים והספיקות שלהם הן להיכלל. לסיכום, אנו מציגים פרוטוקול לניסויי תא זרימת microfluidic ללמוד תפקוד טסיות בהקשר של בנקאות דם ורפואת עירוי. מאמצי תקינה נמשכים 9,10,28-30 ואת רוב ההמלצות הללו כלולים בפרוטוקול שהוצג. את הכינון מחדש של דם הוא מודלעירוי אבל עבודת אימות נוספת צריך לציין את הרלוונטיות לתוצאות קליניות.

המוסטאסיס מחייב פעילות המשולבת ומוסדר של תאים, חלבונים, יונים ורקמות בהקשר spatiotemporal הוגבל 1. פעילות מבוקרת עלולה להוביל לדימום או פקקת ותחלואה או תמותה בתוך הספקטרום של הפרעות הקשורות לקרישת דם. ניסוי תא זרימת microfluidic הוא טכניקה מאתגרת מחקה המוסטאסיס במבחנה. גישה זו מאפשרת חקירה של יחסי הגומלין המורכבים של תהליכים להשתתף המוסטאסיס עם תפקיד מוביל עבור טסיות דם. בעקבות פציעה של כלי דם, טסיות לדבוק מטריקס subendothelial החשוף (glyco) חלבונים על מנת למנוע אובדן דם. בעקבות הידבקות, טסיות להפעיל המצרפי בתגובה אוטומטית ואיתות paracrine אשר בסופו של דבר מוביל להיווצרות של רשת טסיות, על מנת לייצב את הפיברין וכתוצאה מכך משרד, פצע איטום פקיק 2. בניגוד לרוב בדיקות תפקוד טסיות אחרות, התנסותמפעלים עם תאי זרימה לקחת בחשבון את הפרמטר הפיזי של זרימת הדם ולכן השפעת rheology על תאים המשתתפים ביומולקולות 3,4. ניסויי תא זרימה יצרו תובנות ציון דרך המוסטאסיס ופקק על ידי שינוי פרמטרים מרכזיים משפיעים (תת) עוצר דמום תהליכים, כולל מטריצה ​​הדבקה, פרופילי rheology וזרימה, הרכב הסלולר, הנוכחות של רעלים או סמים, כוח יוני ועוד רבים. בשני העשורים האחרונים, ניסויי תא זרימה נמוכה תפוקה מחייבת כרכי מדגם גדולים (10-100 מיליליטר) התפתחו תאי microfluidic לעתים קרובות מורכב של תאי לוחות מקבילים קטנים וכוללים טכנולוגיה מודרנית עבור מרוססת דם מלא בתנאי גזירת קיר מבוקרים 5. Microscaling גדל באופן משמעותי את תפוקת assay בעיקר מפני התקנת החומרה פשטה ופחות נפח (דם) נדרש, טיוח הניסוי לנגיש יותר versatile. למשל, דם בחיות מעבדה קטנות כעת ניתן להשתמש ללא צורך להקריב בעלי חיים. דגימות דם של עכברים מהונדסים גנטית ובכך סייעו בזיהוי מולקולות מפתח קידום או עיכוב המוסטאסיס וב תובנות בסיסיות רומן 6. מעבדות מחקר מיוחדים לעתים קרובות עדיין להשתמש בתאי לזרום בהתאמה אישית למשל מ polydimethylsiloxane (PDMS) 7 כי polymerizes על תבניות lithographed אשר ניתן blueprinted ידי התוכנה. התא וכתוצאה מכך הוא זול, חד פעמי יכול להיות מפורקים בקלות לניתוח פוסט הוק. יתר על כן, בעצם כל עיצוב של כלי, bifurcations כולל או פניות חדות יכול להיבנות על פי פקודה. יתרון זה הוא גם החסרון שלה מאז סטנדרטיזציה כבר הייתה הבעיה העיקרית עם ניסויי תא זרימה, ו PDMS בהתאמה אישית בתאים לא סייעו זה. נוסף על הנושא המסוים הזה, ציפוי (תנאים), בדיקות ניאון, נוגד קרישה, טמפ &#39;erature והזמן בין דיגום ואנליזה כולם גרוע טופלו 8. התקינה של משתנים אלה הוא מאתגר, אבל בכל זאת נדרש להתיר השוואה של התוצאות בין המעבדות. נושא זה הוא הנושא העיקרי של האגודה הבינלאומית על פקקת ו haemostasis ב ועדת משנה מדעי ותקינה על Biorheology 9,10. תרכיזים טסיות (PC) הם בעירוי בחולים הסובלים ממחלות שונות הגורמות תרומבוציטופניה ו / או דימום. אבל טסיות PC ידועה להוריד את רמת רגישות, במיוחד פונקציה של זמן אחסון 11, תהליך הידרדרות צמוד הזדקנות המכונה גם נגע אחסון טסיות. לעתים הוא טען כי טסיות כגון לשחזר במחזור בעירוי פעם 12, אבל הראיות לכך הוא נדיר. יתר על כן, את הפונקציונליות של טסיות ממציא מחשב אינה נבחנה שיגרתית משום שהיחסים בין מבחנים כאלהיעילות טיפולית או מניעת מחלות היא 13 ברור. תאי זרימה microfluidic להציע אמצעי לחקור את תפקוד הטסיות במחשב כדי לייעל את שרשרת מניפולציות בין איסוף המנפיקה. זהו כלי מחקר רב עוצמה עבור השוואה ישירה (זיווג) של המחשב כפי שפרסמנו בעבר 14,15 והוא מתואר כאן.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1113">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BD vacutainer tube with EDTA&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:268px;">368856</td>
			<td style="width:409px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BD vacutainer tube with Heparin</td>
			<td style="width:220px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:268px;">368480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BD vacutainer tube with Sodium Citrate</td>
			<td style="width:220px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:268px;">366575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hirudin Blood tube</td>
			<td style="width:220px;">Roche</td>
			<td style="width:268px;">6675751 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BD vacutainer Eclipse</td>
			<td style="width:220px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:268px;">368650</td>
			<td>Blood collection needle with preattached holder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette tips 100-1000</td>
			<td style="width:220px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:268px;">740290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette tips 2-200</td>
			<td style="width:220px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:268px;">739280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette tips 1-10</td>
			<td style="width:220px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:268px;">A08928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tube 5mL</td>
			<td style="width:220px;">Simport</td>
			<td style="width:268px;">11691380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Conical tube 15mL</td>
			<td style="width:220px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:268px;">1888271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Conical tube 50mL</td>
			<td style="width:220px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:268px;">227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 mL Syringe</td>
			<td style="width:220px;">BD</td>
			<td style="width:268px;">309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Precision wipes</td>
			<td style="width:220px;">Kimtech</td>
			<td style="width:268px;">5511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vena8 Fluoro+ Biochips</td>
			<td style="width:220px;">Cellix</td>
			<td style="width:268px;">188V8CF-400-100-02P10</td>
			<td>Named in figure S1 A as &#39;Biochip&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vena8 Tubing</td>
			<td style="width:220px;">Cellix</td>
			<td style="width:268px;">TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F</td>
			<td>Named in figure S1 B as &#39;Disposable tubing&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vena8 Needles</td>
			<td style="width:220px;">Cellix</td>
			<td style="width:268px;">SS-P-B1IC-B1OC-PACK200</td>
			<td>Named in figure S1 B as &#39;Pin&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Connectors for single inlet cables of biochips</td>
			<td style="width:220px;">Cellix</td>
			<td style="width:268px;">CONNECTORS-B1IC-PACK100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Multiflow8 connect</td>
			<td style="width:220px;">Cellix</td>
			<td style="width:268px;">MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS</td>
			<td>Named in figure S1 B as &#39;Reusable tubing&#39; and &#39;Splitter&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Humidified box</td>
			<td style="width:220px;">Cellix</td>
			<td style="width:268px;">HUMID-BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Software microfluidic pump</td>
			<td style="width:220px;">Cellix</td>
			<td style="width:268px;">N/A</td>
			<td>Venaflux Assay</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Horm Collagen</td>
			<td style="width:220px;">Takeda/Nycomed</td>
			<td style="width:268px;">1130630</td>
			<td style="width:409px;">Native equine tendon collagen (type I) 
			Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES buffered saline (HBS)</td>
			<td style="width:220px;">in house preparation</td>
			<td style="width:268px;">in house preparation</td>
			<td style="width:409px;">10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Blocking buffer</td>
			<td style="width:220px;">in house preparation</td>
			<td style="width:268px;">in house preparation</td>
			<td style="width:409px;">1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Calcein AM</td>
			<td style="width:220px;">Molecular probes</td>
			<td style="width:268px;">C1430</td>
			<td style="width:409px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bleach 10%</td>
			<td style="width:220px;">in house preparation</td>
			<td style="width:268px;">in house preparation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.1M NaOH</td>
			<td style="width:220px;">in house preparation</td>
			<td style="width:268px;">in house preparation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Denaturated alcohol</td>
			<td style="width:220px;">Fiers</td>
			<td style="width:268px;">T0011.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mirus Evo Nanopump</td>
			<td>Cellix</td>
			<td>188-MIRUS-PUMP-EVO</td>
			<td>with Multiflow8. Named in figure S1 A as &#39;Pump&#39; and &#39;Manifold&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Observer Z1</td>
			<td>equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Software microscope&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Zeiss</td>
			<td style="width:268px;">N/A</td>
			<td>ZEN 2012</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hematology analyzer</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Table Top Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>521-0095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Platelet incubater</td>
			<td style="width:220px;">Helmer</td>
			<td style="width:268px;">PF-48i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Incubation water bath</td>
			<td>GFL</td>
			<td>1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette</td>
			<td>Brand</td>
			<td>A03429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube Roller</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>BTR5-12V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sterile docking device</td>
			<td style="width:220px;">Terumo BCT</td>
			<td style="width:268px;">TSCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubing Sealer</td>
			<td style="width:220px;">Terumo BCT</td>
			<td style="width:268px;">AC-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vortex</td>
			<td style="width:220px;">VWR</td>
			<td style="width:268px;">58816-121</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic flow chambers using reconstituted blood to model hemostasis and platelet transfusion in vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

כדי להדגים וריאצית תוך assay, שלוש דגימות דם כולו זהות מחדש היו perfused זמנית מעל משטחים מצופים קולגן (איור 1). זה הביא מקדם השונה של 8.7%. נתון זה מצביע על וריאצית תוך assay מקובל intralaboratory המתיר השוואה מהימנה בין דגימות קשורות. המפרצון של תא הזרימה המסחרי אנו מתארים כאן הוא בניצב תא המדידה וזה יכול לגרום מעט סוער במקום זרימה למינרית בשלב זה. במיוחד בניסויים ללא קרישה זה עלול לגרום סתימה בגלל זמן המגע גדל בין דם אגוניסט המשותק. כניסת סתומים יכול לבלבל את ההודעה במורד הזרם בתא. לכן, את ההתקנה הייתה מותאמת באופן חלקי על ידי ציפוי תא הזרימה (איור 2) השארהצריכת אוויר נטול אגוניסט טסיות, ובכך למנוע הפעלה בטרם עת של המוסטאסיס ראשוני ומשניים. ציפוי חלקי של משטחים דבקים יתר על כן משמש בהצלחה על ידי קבוצות מחקר אחרות בתחום 16. בנוסף, טריק מעשי פשוט שמדובר בנכס ללמוד את האזור &quot;המעבר&quot; שבו דם זורם על פני השטח הלא מגיב (ללא ציפוי) ממשיך מעל החלק תגובתי (המצופה). עירוי היה מדומה על ידי reconstituting דם עם הרכיב הלקוי. לשם כך, anticoagulated דם כל מתורם בריא ניתן thrombocytopenic ידי טסיות צנטריפוגה ו- PC הפרש נוסף להגדיל הטסיות. שאלה חשובה כאן היה מה טסיות לספור עד לשאוף? ברוב המקרים, עירויי חיים אמיתיים לא לגרום נורמליזציה של רמת טסיות אצל מטופל thrombocytopenic. במקום זאת ערך מעל לסף מסוים מיועד,למרות שערך היעד המדויק הוא 19 שהגדרתה. כדי להבין את ההשפעה של משתנים הטסיות על תוצאות בתאים לזרום microfluidic בהקשר של כינון מחדש דם, כמה reconstitutions בוצע עם ההפחתה ריכוזית טסיות (איור 3). כצפוי, רמת טסיות נמוכה הביאה הידבקות פחות פונקציה של זמן זלוף. לכן, בתוך לימודים שניתן, רמת טסיות צריכה להיות אחידה להתיר השוואה בין תנאי מדגם 20. עצם העובדה שיש הידבקות פחות כאשר רמת טסיות נמוכות עושה זאת לא לרמוז כי assay לא ניתן להשתמש כדי למדוד בתצהיר טסיות בדגימות thrombocytopenic בגלל הגדרות מיקרוסקופיה המצלמה ניתן להתאים להגביר את הרגישות. לבסוף, ברוב המקרים, מדגם thrombocytopenic המשמש כינון מחדש מכיל טסיות עצמיים ויתרה דומה למצב ברוב העירוי בדרישה חולה 19. זה currently ברור אם ומה תפקידו של טסיות עצמיים הוא בהקשר של עירוי עם טסיות אלוגנאית אבל שאלה מעניינת למחקר עתידי. לאחר איסוף של דם מתורמים מרצון בריאים, דם מלא לעתים קרובות הוא מקורר והמשיך בטמפרטורת חדר קבועה לפני הכנת רכיב. Platelets הם לעומת זאת רגיש לשינויי טמפרטורה. איור 4 מראה את ההשפעה של טמפרטורות ירד לאחר איסוף הדם ובמהלך זלוף. Thrombi נמצא לבנות לאט יותר כאשר הדם קורר (איור 4 א) בטמפרטורת חדר לעומת מדגם זהה (זיווג) שומר על 37 מעלות צלזיוס לאורך כל תקופת המחקר (איור 4). שבמחזור, טסיות להיקשר לאתרי פציעת כלי בתנאים של מאמץ גזירת קיר מוגבה. שיעורי גזירה שונים ב ג תאי זרימה microfluidicoated עם VWF / פיברינוגן הביא הבדלי הידבקות טסיות הכוללת בשלב הסוף (איור 5 א) ו קינטיקה צמיחת פקיק (איור 5 ב). לבסוף, כדי להדגים כיצד תאי הזרימה microfluidic יכול לשמש כדי לחקור PC המשמש עירוי, קינטיקה צמיחה פקיק בתפקוד של אחסון במחשב נחקר. כל משתני הכנת מדגם הגדרת ניסוי היו טופלו לאורך כל תקופת המחקר. לפיכך, הפרמטר המשתנה היחיד היה PC אחסון זמן. איור 6 מציין ירידה בצמיחה פקיק בתפקוד של זמן אחסון הוכחת השפעת נגע אחסון טסיות על המוסטאסיס במבחנה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53823/53823fig1.jpg" /> איור 1:. Intra-assay וריאציה בניסויי זרימת תא microfluidic פלה Microfluidic<html> ניסויי תא w בוצעו על קולגן משותק ב 50 dynes / cm². כל שלוש דגימות הדם כולו הזהות מחדש היו perfused במקביל ובאותו הזמן. התוצאות מוצגות כפי טווח (שפם) לכיסוי שטח כפונקציה של זמן זלוף. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53823/53823fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53823/53823fig2.jpg" /> איור 2:. ערוץ מצופה חלקית (א) סיבי קולגן מדמיינים ידי מיקרוסקופ לעומת שלב נמצא יחידה באזור המצופה. (ב) תמונת מצב לאחר 5 דקות של זלוף עם AM Calcein שכותרתו דגימת דם שלם מחדש ביניקה 50 dynes / 2 ס&quot;מ מוצג. שתי התמונות צולמו בהגדלה 100X.<html> ig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53823/53823fig3.jpg" /> איור 3: קינטיקה צמיחה פקיק תלוי הטסיות בדם מחדש (א) דם מחדש באמצעות טסיות בנק הדם להתרכז מניב ריכוזים טסיות שונים:. 245 x 10³ / μl (●), 42 x 10³ / μl (■) ו -12 x 10³ / μl (▲). ניסויי תא זרימת microfluidic עם ערוצי קולגן מצופים בוצעו בו זמנית עבור כל שלוש דגימות בכל מאמץ גזירה של 50 dynes / cm². (ב) המדרונות מחושבים על ידי רגרסיה ליניארית של הנתונים הגולמיים בפנל מתוארים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53823/53823fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> ontent &quot;FO: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53823/53823fig4.jpg" /> איור 4:. טמפרטורה ותאי זרימה microfluidic דם מלא שנאספו vacutainers הפרין נשמר במשך 15 דקות באמבט מים בטמפרטורת החדר (א) או על 37 מעלות צלזיוס (B). זלוף microfluidic על קולגן משותקת בכל מאמץ הגזירה של 50 dynes / 2 ס&quot;מ בוצע. צמד יריות לעבר נקודת סיום (5 זלוף דקות) מתוארים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53823/53823fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53823/53823fig5.jpg" /> איור 5: תפקידה של מאמץ הגזירה על הידבקות טסיות כדי משותקת VWF / פיברינוגן (א). ארבעה זהה, calcein AM שכותרתו, מחדש כולו דםהדגימות היו perfused מעל משטח מצופה VWF / פיברינוגן עם מאמץ הגזירה משתנה: 4.5 dynes / cm² (●), 50 dynes / cm² (■), 90 dynes / cm² (▲) ו 225 dynes / cm² (♦). לאחר 3 דקות של זלוף, זריקת צמד נלקחת מכל ארבעת הערוצים. (ב) כיסויי Surface בתפקוד זמן של הדגימות מתוארות (א) מוצגי הממחישים הבדלי קינטיקה צמיחת פקיק. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53823/53823fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/53823/53823fig6.jpg" /> איור 6:. היווצרות פקיק של טסיות מתרכז פונקציה של זמן אחסון כל הניסויים תא הזרימה microfluidic בוצעו בתנאים סטנדרטיים על משטחים מצופים קולגן בקצב גזירה של 50 dynes / 2 ס&quot;מ. הדם היה reconstituted עם דגימות טסיות של אותו להתרכז נבדק בשני עותקים ביום שלוש (●), שבע (■) ועשרה (▲) תרומה פוסט. כיסויי Surface בתפקוד זמן זלוף מתואר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53823/53823fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="S איור 1" src="/files/ftp_upload/53823/53823sfig1.jpg" /> האיור S1:. התקנת חומרת תא זרימת Microfluidic (א) biochip נבוב 8 Fluoro + הוא רכוב על הבמה האוטומטית של המיקרוסקופ מחובר דרך צינורות גמישים כדי משאבת מזרק עם סעפת לפצל האחראים לפעולת השאיבה לשמונה ערוצים נפרדים. (ב) דם מחדש זורם דרך הצינורות הפנויים בצד ימין לתוך הערוצים שנבחרו של biochip (כניסה). הצינורות הפנויים מתוקן הכניסה באמצעות נירוסטה מזפלדת ESS סיכה פנויה שמצורפת ההתקנה. זרימת דם (B) הוא מימין לשמאל והוא נאסף ב וצינור ארוך וגמיש. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53823/53823sfig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro at JoVE.com

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Microfluidic זרימה צ&#39;יימברס שימוש מחדש דם למודל המוסטאסיס ואת טסיות עירוי<em&gt; במבחנה</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

microfluidic-flow-chambers-using-reconstituted-blood-to-model

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

9.3K Views.  Belgium Red Cross-Flanders. Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro. 

Video: Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

מכשיר microfluidic ליצירה מחדש של גידול microenvironment<em&gt; במבחנה</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting and counting cells. However, manipulating the cell within the fluidic domain remains a challenge and requires complicated fabrication protocols for forming valves and electrodes, or demands specialty equipment like optical tweezers. Here, we demonstrate that conventional printed circuit boards (PCB) can be used for the non-contact manipulation of cells by employing dielectrophoresis (DEP) for bead and cell manipulation in laminar flow fields for bioactuation, and for cell and bead separation in multichannel microfluidic devices. First, we present the protocol for assembling the DEP electrodes and microfluidic devices, and preparing the cells for DEP. Then, we characterize the DEP operation with polystyrene beads. Lastly, we show representative results of bead and cell separation in a multichannel microfluidic device. In summary, DEP is an effective method for manipulating particles (beads or cells) within microfluidic devices.

Dielectrophoresis (DEP) is an effective method to manipulate cells. Printed circuit boards (PCB) can provide inexpensive, reusable and effective electrodes for contact-free cell manipulation within microfluidic devices. By combining PDMS-based microfluidic channels with coverslips on PCBs, we demonstrate bead and cell manipulation and separation within multichannel microfluidic devices.

חרוזים ועל הפרדת תאים ריבוי ערוצים מכשירים microfluidic שימוש dielectrophoresis ו זרימה למינרית

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of interest following intravenous or intraarterial infusion. Consequently, increasing cell homing is currently studied as a strategy to improve cell therapy. Cell rolling on the vascular endothelium is an important step in the process of cell homing and can be probed in-vitro using a parallel plate flow chamber (PPFC). However, this is an extremely tedious, low throughput assay, with poorly controlled flow conditions. Instead, we used a multi-well plate microfluidic system that enables study of cellular rolling properties in a higher throughput under precisely controlled, physiologically relevant shear flow1,2. In this paper, we show how the rolling properties of HL-60 (human promyelocytic leukemia) cells on P- and E-selectin-coated surfaces as well as on cell monolayer-coated surfaces can be readily examined. To better simulate inflammatory conditions, the microfluidic channel surface was coated with endothelial cells (ECs), which were then activated with tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), significantly increasing interactions with HL-60 cells under dynamic conditions. The enhanced throughput and integrated multi-parameter software analysis platform, that permits rapid analysis of parameters such as rolling velocities and rolling path, are important advantages for assessing cell rolling properties in-vitro. Allowing rapid and accurate analysis of engineering approaches designed to impact cell rolling and homing, this platform may help advance exogenous cell-based therapy.

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

This study used a multi-well plate microfluidic system, significantly increasing throughput of cell rolling studies under physiologically relevant shear flow. Given the importance of cell rolling in the multi-step cell homing cascade and the importance of cell homing following systemic delivery of exogenous populations of cells in patients, this system offers potential as a screening platform to improve cell-based therapy.

ניתוח שיטתי של<em&gt; במבחנה</em&gt; תא רולינג באמצעות מערכת microfluidic צלחת רב גם

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

גירוי מבחן העין (EIT) לסיכוני זיהוי כימיקלים עיניים מעצבנים באמצעות אפיתל דגם רקמות כמו-קרנית משוחזר אדם (RHCE)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards vascular disease pathologies. Unhealthy arteries often present with wall stiffening, scarring, or partial stenosis which may all affect fluid flow rates, and the magnitude of pulsatile flow, or pulsatility index. Replication of various flow conditions is the result of tuning a flow pressure damping chamber downstream of a blood pump. Introduction of air within a closed flow system allows for a compressible medium to absorb pulsatile pressure from the pump, and therefore vary the pulsatility index. The method described herein is simply reproduced, with highly controllable input, and easily measurable results. Some limitations are recreation of the complex physiological pulse waveform, which is only approximated by the system. Endothelial cells, smooth muscle cells, and fibroblasts are affected by the blood flow through the artery. The dynamic component of blood flow is determined by the cardiac output and arterial wall compliance. Vascular cell mechano-transduction of flow dynamics may trigger cytokine release and cross-talk between cell types within the artery. Co-culture of vascular cells is a more accurate picture reflecting cell-cell interaction on the blood vessel wall and vascular response to mechanical signaling. Contribution of flow dynamics, including the cell response to the dynamic and mean (or steady) components of flow, is therefore an important metric in determining disease pathology and treatment efficacy. Through introducing an in vitro co-culture model and pressure damping downstream of blood pump which produces simulated cardiac output, various arterial disease pathologies may be investigated.

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

This protocol replicates physiological or pathological blood flow in vitro to aid in determining cell response in disease pathologies. By introducing a pressure damping chamber downstream of a blood pump, blood flow across the vasculature can be recapitulated and imposed on a monolayer of vascular endothelium or a mimetic co-culture.

במבחנה הדגם של פיזיולוגי ופתולוגיים זרימת דם עם בקשה לחקירות של שיפוץ תא דם

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

מודל לשכת תזרים Microfluidic עבור עירוי טסיות המוסטאסיס מודד הפקדת טסיות והיווצרות הפיברין בזמן אמת

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם תרבות איברים של הדיסק הבין חולייתי Murine

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate flow chambers. Endothelial cells form the inner cellular lining of blood vessels and are chronically exposed to the frictional force of blood flow called shear stress. Under physiological conditions, endothelial cells function in the presence of various shear stress conditions. Thus, the application of shear stress conditions in in vitro models can provide greater insight into endothelial responses in vivo. The parallel-plate flow chamber previously published by Lane et al.9 is adapted to study endothelial gene regulation in the presence and absence of steady (non-pulsatile) laminar flow. Key adaptations in the set-up for laminar flow as presented here include a large, dedicated environment to house concurrent flow circuits, the monitoring of flow rates in real-time, and the inclusion of an exogenous reference RNA for the normalization of quantitative real-time PCR data. To assess multiple treatments/conditions with the application of shear stress, multiple flow circuits and pumps are used simultaneously within the same heated and humidified incubator. The flow rate of each flow circuit is measured continuously in real-time to standardize shear stress conditions throughout the experiments. Because these experiments have multiple conditions, we also use an exogenous reference RNA that is spiked-in at the time of RNA extraction for the normalization of RNA extraction and first-strand cDNA synthesis efficiencies. These steps minimize the variability between samples. This strategy is employed in our pipeline for the gene expression analysis with shear stress experiments using the parallel-plate flow chamber, but parts of this strategy, such as the exogenous reference RNA spike-in, can easily and cost-effectively be used for other applications.

Here, a workflow for the culture and gene expression analysis of endothelial cells under fluid shear stress is presented. Included is a physical arrangement for simultaneously housing and monitoring multiple flow chambers in a controlled environment and the use of an exogenous reference RNA for quantitative PCR.

ניתוח ביטוי גנטי של תאי אנדותל נחשף להטיית מתח באמצעות מרובות במקביל-plate זרימה צ'יימברס

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

שיטה אוטומטית לביצוע השימוש בשיטת ההדמיה באמצעות הדמיה רב ספקטקטרלית באמצעות זרימה

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion

There is currently great clinical interest in the use of autologous fibroblasts for skin repair. In most cases, culture of skin cells in vitro is required. However, cell culture using xenogenic or allogenic culture media has some disadvantages (i.e., risk of infectious agent transmission or slow cell expansion). Here, an autologous culture system is developed for the expansion of human skin fibroblast cells in vitro using a patient&#8217;s own platelet-rich plasma (PRP). Human dermal fibroblasts are isolated from the patient while undergoing abdominoplasty. Cultures are followed for up to 7 days using a medium supplemented with either fetal bovine serum (FBS) or PRP. Blood cell content in PRP preparations, proliferation, and fibroblast differentiation are assessed. This protocol describes the method for obtaining a standardized, non-activated preparation of PRP using a dedicated medical device. The preparation requires only a medical device (CuteCell-PRP) and centrifuge. This device is suitable under sufficient medical practice conditions and is a one-step, apyrogenic, and sterile closed system that requires a single, soft spin centrifugation of 1,500 x g for 5 min. After centrifugation, the blood components are separated, and the platelet-rich plasma is easily collected. This device allows a quick, consistent, and standardized preparation of PRP that can be used as a cell culture supplement for in vitro expansion of human cells. The PRP obtained here contains a 1.5-fold platelet concentration compared to whole blood together, with a preferential removal of red and white blood cells. It is shown that PRP presents a boosting effect in cell proliferation compared to FBS (7.7x) and that fibroblasts are activated upon PRP treatment.

This protocol presents a device that produces PRP to boost the in vitro expansion of cells in a 100% autologous fibroblast culture system.