Research supported by Alberta Livestock and Meat Agency, Alberta Innovates - BioSolutions, Alberta Milk, and Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry.

החלק החי של מחקר זה נערך על יחידת המחקר מטבולית מאוניברסיטת אלברטה, אדמונטון, קנדה, עם כל הפרוצדורות חיה אישרה (פרוטוקול # AUP00000131) על ידי אוניברסיטת טיפול בבעלי חיים אלברטה ועדת שימוש, וחיות טיפלה פי אל המועצה הקנדית של הנחיות טיפול בבעלי חיים (1993). 1. ייצור העובר, בידוד של רנ&quot;א סך טיפול DNase <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור פרוטוקולי ניסוי בבעלי חיים ואיסוף עובר מתייחס בפרסומים הקודמים שלנו 17, 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברכה ולהצמיד להקפיא עובר בשלב דומה מכל פרא בחנקן נוזלי ולאחר מכן לשמור ב -80 ° C עד מיצוי RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ סך RNA באמצעות ערכת חילוץ RNA מבוסס עמודה המאפשרת לחלץ RNA ממדגמים פיקו בקנה מידה (מידע ערכה זמין רשימת חומר). הערה: מומלץ הערכה מכילה: מיזוג הצפה, הפקת buffer, 70% אתנול, לשטוף הצפת 1, לשטוף הצפת 2, הצפת elution, עמודות טיהור RNA עם צינורות איסוף צינורות microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μL הפקת הצפת עוברים המכילים צינור דגירה במשך 30 דקות ב 42 מעלות צלזיוס. צינור צנטריפוגה ב 800 XG למשך 2 דקות כדי לאסוף תאים לחלץ לתוך הצינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 250 μL אויר חוצץ על הממברנה מסנן טור טיהור. דגירת עמודת טיהור RNA עם מיזוג הצפה במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. צנטריפוגה עמודת הטיהור בצינור האוסף ב XG 16,000 דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 μL של אתנול 70% לתערובת של הצפת ועוברים הפקת RNA. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. תערובת פיפטה לתוך טור טיהור preconditioned. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאגד RNA, צנטריפוגות העמודה טיהור 2 דקות ב 100 XG ומיד בצע על ידי צנטריפוגה ב XG 16,000 למשך 30 שניות כדי להסיר הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10081; L של הצפה לשטוף 1 לתוך טור טיהור צנטריפוגות דקות 1 ב 8000 x ז. הערה: טיפול DNase מומלץ אם ביצוע שעתוק או הגברה הפוך לאחר בידוד RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל הדנ&quot;א הגנומי מיד אחרי צעד 1.8. הערה: ערכת DNase המומלצת זמינה רשימת חומר. ערכה מומלצת כוללת: פתרון מניות DNase אני הצפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין תערובת דגירת DNase על ידי ערבוב 5 מניות פתרון μL DNase אני עם 35 μL הצפה. מערבבים על ידי היפוך בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה את תערובת דגירת μL DNase 40 ישירות לתוך קרום טור טיהור. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 40 μL הצפת לשטוף 1 לתוך קרום טור טיהור ואז צנטריפוגות ב 8000 XG במשך 15 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 100 μL הציפו לשטוף 2 לתוך טור טיהור צנטריפוגות דקות 1 ב 8000 x ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה עוד 100 לשטוף μL הצפת 2 לתוך הטור טיהור צנטריפוגותבמשך 2 דקות ב 16,000 x ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את העמודה טיהור לצינור 0.5 מ&quot;ל microcentrifuge חדש. פיפטה 11 μL של הצפת elution ישירות על הממברנה של עמודת הטיהור. כדי להבטיח ספיגה מקסימלית של הצפת elution לתוך קרום, לגעת בעדינות את קצה פיפטה אל פני השטח של הממברנה תוך מחלק למאגר elution. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עמודה עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה העמודה דקות 1 XG ב 1000 על חלוקת הצפת elution בעמודה, ואז ספין דקות 1 ב 16,000 XG כדי elute רנ&quot;א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מכשיר bioanalyzer פי הוראות היצרן כדי להעריך את איכות RNA וכמות 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות המדגם RNA ב -80 ° C עד השימוש. </li></ol> 2. RNA הגברה וסימון לניתוח microarray הערה: עבור המשתמש בפעם הראשונה עובדים עם RNA הגברה ונהלים תיוג, השתמש חמש ng של ספייק-ב RNA along עם דגימות ארנה בפועל לפקח על המדידה ובקרת איכות של הגברת RNA כלאה. ספייק-בתמהיל RNA מכיל עשרה במבחנה מסונתז, תמלילי polyadenylated ביחסים שנקבעו מראש. כאשר ההליך מבוצע כראוי, את התמלילים שכותרתו במיוחד להכליא רק בדיקות בקרה משלים במערכים והנתונים ניתן לסרוק לעקוב אבטחת בקרת איכות עם עצמי מינימאלי או הכלאת צלב. תיאור פרטים נוספים לגבי עוצמות ממוסמר-ב מלאה הליך נורמליזציה לאחר סריקת ניתוח מערך והנתונים מתייחסים לפרסומים קודמים 20, 21. ההליך הבא ניתן משתמשי microarray השיגרתי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 100 pg מדגם RNA באיכות גבוהה (מספר Integrity RNA (רין ערך) לפחות&gt; 7.0) בהיקף כולל של 10 - 11 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר את הדגימות רנ&quot;א עם ערכת הגברת יכולתלעבוד עם דגימות פיקו בקנה מידה (קטן כמו 100 pg). הערה: מידע ערכת הגברה מומלצת זמין חומר רשימה ועוקב אחר הוראות היצרן ללא כל שינוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש quantitation קרינה המבוסס להעריך את הפרופיל של מגוון הגודל של ארנה המוגבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש במכשיר ספקטרופוטומטר (מבוסס על הספיגה ב ננומטר 260 ו -280) כדי למדוד את הריכוז של ארנה המוגבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את ארנה מוגבר ב -80 ° C עד מוכן תיוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 2 מיקרוגרם של רנ&quot;א מוגבר עבור תיוג פלורסנט פי מדריך למשתמש ערכת תיוג ULS ארנה. הערה: מאז Cyanine 547 ו Cyanine 647 לצבוע רגישים שפלת תמונה לצבוע Cyanine 647 נפגע בקלות על ידי אוזון, הליך התיוג מתרחשת כמות מינימאלית של אור תחת סביבת אוזון חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תיבת האוזון (איור 1 א) עד לרמה של אוזון הוא 0.001 ppm. </li><li&gt; האם התקנת התגובה בתוך קופסא האוזון (איור 1B) על ידי הוספת 2 μL של Cyanine 547 או Cyanine 647, 2 μL של חיץ תיוג, ולאחר מכן להתאים לנפח סופי של 20 μL עם מי RNase ללא תחת safelight. הוסףמסנן החושך אל מקור האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות דגירה צינורות ב thermocycler ב 85 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. דגימות מקום על קרח דק 1 לפחות. ספין למטה כדי לאסוף תוכן של צינורות לפני שתמשיך עם ערכת חילוץ RNA, למעט השלבים הקשורים טיפול DNase (מ 1.9 ל 1.11), לנקות את RNA מוגבר שכותרתו סיי-צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש במכשיר ספקטרופוטומטר למדוד ולקבוע את ריכוז RNA מוגבר שכותרתו ולשמור ארנה שכותרתו במקסימום -80 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים לפני השימוש. </li></ol> 3. הכלאה microarray ו כביסה הערה: השלבים החשובים הבאים מותאמים על פי שני צבעים מבוססים Microarray Gene Expression ניתוח פרוטוקול (גרסה6.5, מאי 2010). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כמות שווה של 825 ng מכל Cyanine 547- ו Cyanine 647 שכותרתו ארנה ומערבב עם 25x פיצול 10x מאגרי חסימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחמם את התערובת על 60 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות ומצננים על קרח דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כמות שווה של חיץ הכלאה 2x ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 13,000 סל&quot;ד, ולאחר מכן את התערובת מוכנה הכלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 100 μL מהתערובת לשקופית המערך ולאטום את השקופית בתוך החדר הכלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את התא התאסף לתוך תנור הכלאה במשך 17 שעות ב 65 מעלות צלזיוס מסתובב ב 10 סל&quot;ד בתנור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את המערכים פי פרוטוקול טיפול גינת אוזון על ידי טבילה לתוך ייצוב וייבוש פתרון למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המערכים מהפתרון ולוודא שטח המערך הוא יבש ללא חלקיקי אבק </li></ol> 4. שקופיות microarray סריקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על מערכים במקום חשוך ולהדליק scannאה עד שהוא מוכן לשימוש (זמן המתנה 15 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הברקוד מערך בצד שמאל, לתוך הסורק ולהתחיל סריקה. האם ניתוח הנקודה על פי המדריך למשתמש תוכנה ולשמור את הנתונים בפורמט קובץ (GPR). </li></ol> 5. ניתוח סטטיסטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הורד את תוכנת FlexArray http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php לחץ על &quot;נתונים גולמיים לייבא&quot; ו לטעון את קבצי GPR לתוך FlexArray. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעו את הנורמליזציה וניתוח סטטיסטי במידת הצורך על ידי ביצוע ההוראות. הערה: חישוב הסף לבחירת נקודה חיובית במחקר זה כפי שתואר קודם לכן 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר הנפתח ידני מצופת העלילה של FlexArray כדי להציג את כל מקומות הכלאת אותות רקע. הערה: תמונה דומה של ממוסמר בבקרה לאחר הכלאה אל microarray ניתן לראות במחקר הקודם 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תבחרנורמליזציה הלס בתוך המערך הבאה על ידי בחמישון בין תהליך נורמליזציה מערכים מן FlexArray הנפתחת ידנית בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את כל הנתונים המנורמלים FlexArray לתוך קובץ Excel לשימוש נוסף. </li></ol> 6. ביואינפורמטיקה ניתוח ההערה המקורית של הרצפים החלליים מתמלילים עובריים ספציפי שור (BESTv1) microarray תוארה בעבר 8. במחקר הנוכחי, 20,403 סמלים ג&#39;ין ייחודי (GS) התקבלו ( <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53754/Supplement_file_1.xlsx">מוסף File1</a> ) דרך מערכת ניהול מידע EmbryoGENE מעבדה (LIMS) ELMA (http://elma.embryo-gene.ca). רשימת 6765 גנים ייחודיים ( <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53754/Supplement_file_2.xlsx">מוסף file2</a> ) נבחרה תואם את אותות חיוביים כל לאחר תהליך נורמליזציה microarray (שלב 5.5) מפרופיל ביטוי גנים העוברים יום 7 שור. סף איתות חיובי חושב על בסיס הפרסום חדיר 16 מעוצמת האות של ערך A. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע אנליזה פונקציונלית עם פנתר (חלבון ניתוח באמצעות קשרים אבולוציונית) סיווג מערכת 23, 24, פתח את הקישור הבא (http://www.pantherdb.org/about.jsp). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העלאת רשימת 6765 GS עובר ספציפי לזהות תהליך ביולוגי ספציפי במהלך ההתפתחות עוברית באמצעות בדיקה לייצוג יתר סטטיסטית ולהשתמש הגדרת ברירת מחדל של taurus Bos (כל הגנים במאגר) כרשימת התייחסות 25. הערה: פעולה זו מאפשרת זיהוי של תהליכים התפתחותיים הקשורים מתנאי GO כי הם סטטיסטית יתר או תת לידי ביטוי באמצעות מבחן הבינומי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> P-ערך נקבע סף &lt;0.05 כברירת מחדל תוכנה. ניתן להוריד נתונים ו Exported לתוך קובץ Excel לבחירה נוספת 16. </li></ol>

<ol>
	<li>Royal, M. D., Smith, R. F., Friggens, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertility+in+dairy+cows:+bridging+the+gaps.">Fertility in dairy cows: bridging the gaps.</a> Animal. 2 (08), 1101-1103 (2008).</li><li>Diskin, M. G., Murphy, J. J., Sreenan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+survival+in+dairy+cows+managed+under+pastoral+conditions.">Embryo survival in dairy cows managed under pastoral conditions.</a> Anim. Reprod. Sci. 96 (3-4), 297-311 (2006).</li><li>Wrenzycki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+culture+system+and+protein+supplementation+on+mRNA+expression+in+pre-implantation+bovine+embryos.">Effects of culture system and protein supplementation on mRNA expression in pre-implantation bovine embryos.</a> Hum. Reprod. 16 (5), 893-901 (2001).</li><li>Menezo, Y. J., Herubel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+and+bovine+models+for+human+IVF.">Mouse and bovine models for human IVF.</a> Reprod. Biomed. Online. 4 (2), 170-175 (2002).</li><li>Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+monitoring+of+gene+expression+patterns+with+a+complementary+DNA+microarray.">Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray.</a> Science. 270 (5235), 467-470 (1995).</li><li>Patterson, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+comparison+of+one-color+and+two-color+platforms+within+the+MicroArray+Quality+Control+(MAQC)+project.">Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project.</a> Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).</li><li>Rhodes, D. R., Chinnaiyan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+analysis+of+the+cancer+transcriptome.">Integrative analysis of the cancer transcriptome.</a> Nat. Genetics. 37, 31-37 (2005).</li><li>Robert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+resources+to+obtain+a+comprehensive+survey+of+the+bovine+embryo+transcriptome+through+deep+sequencing+and+microarrays.">Combining resources to obtain a comprehensive survey of the bovine embryo transcriptome through deep sequencing and microarrays.</a> Mol. Reprod. Dev. 78 (9), 651-664 (2011).</li><li>Nygaard, V., Hovig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Options+available+for+profiling+small+samples:+a+review+of+sample+amplification+technology+when+combined+with+microarray+profiling.">Options available for profiling small samples: a review of sample amplification technology when combined with microarray profiling.</a> Nucleic Acids Res. 34 (3), 996-1014 (2006).</li><li>Kurn, N., Chen, P., Heath, J. D., Kopf-Sill, A., Stephens, K. M., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+isothermal,+linear+nucleic+acid+amplification+systems+for+highly+multiplexed+applications.">Novel isothermal, linear nucleic acid amplification systems for highly multiplexed applications.</a> Clin Chem. 51 (10), 1973-1981 (2005).</li><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (5), 1663-1667 (1990).</li><li>Phillips, J., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+RNA+Amplification:+A+linear+amplification+method+for+analyzing+the+mRNA+population+from+single+living+cells.">Antisense RNA Amplification: A linear amplification method for analyzing the mRNA population from single living cells.</a> Methods. 10 (3), 283-288 (1996).</li><li>Gilbert, I., Scantland, S., Dufort, I., Gordynska, O., Labbe, A., Sirard, M. A., Robert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+aRNA+production+during+T7+amplification+to+prevent+the+loss+of+sample+representation+during+microarray+hybridization+sample+preparation.">Real-time monitoring of aRNA production during T7 amplification to prevent the loss of sample representation during microarray hybridization sample preparation.</a> Nucleic Acids Res. 37 (8), 65 (2009).</li><li>Gijlswijk, R. P., Talman, E. G., Jansse, P. J., Snoeijers, S. S., Killian, J., Tanke, H. J., Heetebrij, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+Linkage+System:+versatile+nucleic+acid+labeling+technique.">Universal Linkage System: versatile nucleic acid labeling technique.</a> Expert Re. Mol. Diagn. 1 (1), 81-91 (2001).</li><li>Gilbert, I., Scantland, S., Sylvestre, E. L., Dufort, I., Sirard, M. A., Robert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Providing+a+stable+methodological+basis+for+comparing+transcript+abundance+of+developing+embryos+using+microarrays.">Providing a stable methodological basis for comparing transcript abundance of developing embryos using microarrays.</a> Mol. Hum. Reprod. 16 (8), 601-616 (2010).</li><li>Tsoi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+porcine+(Sus+scofa)+embryo-specific+microarray:+array+annotation+and+validation.">Development of a porcine (Sus scofa) embryo-specific microarray: array annotation and validation.</a> BMC Genomics. 13, 370 (2012).</li><li>Salehi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superovulatory+response+and+embryo+production+in+Holstein+cows+fed+diets+enriched+in+oleic,+linoleic+or+&#945;-linolenic+acid.">Superovulatory response and embryo production in Holstein cows fed diets enriched in oleic, linoleic or &#945;-linolenic acid.</a> Reprod. Fertil. Dev. 26 (1), 218-218 (2013).</li><li>Thangavelu, G., Colazo, M. G., Ambrose, D. J., Oba, M., Okine, E. K., Dyck, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diets+enriched+in+unsaturated+fatty+acids+enhance+early+embryonic+development+in+lactating+Holstein+cows.">Diets enriched in unsaturated fatty acids enhance early embryonic development in lactating Holstein cows.</a> Theriogenology. 68 (7), 949-957 (2007).</li><li>. Agilent 2100 Bioanalyzer User's Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack)">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack)</a> (2016)</li><li>Kerr, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+analysis+of+benchmark+datasets+for+Agilent+two-color+microarray.">Extended analysis of benchmark datasets for Agilent two-color microarray.</a> BMC Bioinformatics. 8, 371 (2007).</li><li>Zhu, Q., Miecznikowski, J. C., Halfon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+wholly+defined+Agilent+microarray+spike-in+dataset.">A wholly defined Agilent microarray spike-in dataset.</a> Bioinformatics. 27 (9), 1284-1289 (2011).</li><li>Vallee, M., Gravel, C., Palin, M. F., Reghenas, H., Stothard, P., Wishart, D. S., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+and+known+oocyte-specific+genes+using+complementary+DNA+subtraction+and+microarray+analysis+in+three+different+species.">Identification of novel and known oocyte-specific genes using complementary DNA subtraction and microarray analysis in three different species.</a> Biol. Reprod. 73 (1), 63-71 (2005).</li><li>Thomas, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PANTHER:+a+library+of+protein+families+and+subfamilies+indexed+by+function.">PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function.</a> Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).</li><li>Mi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PANTHER+database+of+protein+families,+subfamilies,+functions+and+pathways.">The PANTHER database of protein families, subfamilies, functions and pathways.</a> Nucleic Acids Res. 33, 284-288 (2005).</li><li>Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+gene+function+analysis+with+the+PANTHER+classification+system.">Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system.</a> Nat. Protoc. 8, 1551-1566 (2013).</li><li>Ross, P. J., Wang, K., Kocabas, A., Cibelli, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+gene+transcript+abundance+in+bovine+fertilized+and+cloned+embryos.">Housekeeping gene transcript abundance in bovine fertilized and cloned embryos.</a> Cell Reprogram. 12 (6), 709-717 (2010).</li><li>Gilbert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+gene+products+fluctuation+during+bovine+pre-hatching+development.">The dynamics of gene products fluctuation during bovine pre-hatching development.</a> Mol. Reprod. Dev. 76, 762-772 (2009).</li><li>Vallee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+bovine+embryo+transcript+profiles+during+early+in+vivo+embryonic+development.">Revealing the bovine embryo transcript profiles during early in vivo embryonic development.</a> Reproduction. 138 (1), 95-105 (2009).</li><li>Dafforn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+mRNA+amplification+from+as+little+as+5+ng+total+RNA+for+global+gene+expression+analysis.">Linear mRNA amplification from as little as 5 ng total RNA for global gene expression analysis.</a> Biotechniques. 37 (5), 854-857 (2004).</li><li>Beaujean, N., Jammes, H., Jouneau, A., Dufort, I., Rovert, C., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Reprogramming.">Nuclear Reprogramming.</a> Studying Bovine Early Embryo Transcriptome by Microarray. , (2015).</li><li>Patterson, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+comparison+of+one-color+and+two-color+platforms+within+the+MicroArray+Quality+Control+(MAQC)+project.">Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project.</a> Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הבעיה הראשונה לבצע ניתוח microarray באמצעות עוברי שור יום 7 אינו מקבל כמות מספקת של RNA באיכות גבוהה ללימוד ביטוי גנים. מיצוי RNA פנול / כלורופורם מסורתי שיטת משקעי אתנול אינו מומלץ יום 7 עובר, וכתוצאה מכך תשואה נמוכה פנול שאריות האפשרית עיכוב תגובת הגברת RNA. במקום זאת, שיטה סטנדרטית מבוסס עמודה עדיפה לבודד רנ&quot;א מכיל ואז elute רנ&quot;א עם חיץ elution מינימום להגדיל את הריכוז. בממוצע 780 pg של רנ&quot;א הכל לכל העובר מתקבל במחקר הנוכחי אשר ניתן להשוות עם דיווחים אחרים באמצעות מתודולוגיה זהה 26 ואת ערכת חילוץ אותו RNA 27, 28 המשמש כיום. להפקת RNA, מומלץ לפזר משקע לפני שימוש על ידי ערבוב יסודי או לחמם את בקבוקון חיץ חילוץ מחדש לפזר את מיצוי החיץ לפנילהשתמש. יתר על כן, זמן הדגירה הוא גם חשוב עבור התשואה RNA בשלב החילוץ. זמן דגירה פחות 30 דקות מלאות ב 42 מעלות צלזיוס מופחתת תשואת RNA. על עמודת עיכול DNase יש צורך להסיר זיהום הדנ&quot;א הגנומי במהלך טיהור RNA מוחלטת. אנזים DNase רגיש מאוד מערבולת צנטריפוגות. לכן, DNase חיץ צריך להיות מעורב על ידי היפוך בעדינות. איכות RNA חשובה מאוד בניתוח microarray דגימות עם רין נמוך מ -7 לא צריכים להיחשב עבור כלאה. במחקר נוכחי, את הפרופילים רנ&quot;א הכל מתקבלים על ידי bioanalyzer דומים לאלו שנצפו בעבר במחקרים מן blastocysts שור 26, 27. ראוי לציין כי בעת שימוש בעוברים בשלב טרום בקע, במיוחד RNA שהוכן ביציות ועוברים לפני אימהי מעבר עוברי, ערך RIN הוא לעתים קרובות נמוך מ -7 לעומתאל RNA סך מעובר יום 7 וזה נובע השתנות ביחס 28S / 18S rRNA 27. כמות RNA חילוץ מעובר שור אינה מספיק עבור הכלאת פלטפורמה, ומכאן, הגברת RNA נדרשה. ישנן מספר שיטות זמינות עבור הגברת RNA כגון PCR, שעתוק במבחנה (IVT), ו Ribo-ספיה (הגברת isothermal פריימר יחיד). למרות השיטה השנייה היא מהירים ביום אחד מספקת מספיק חומר עבור מערכים, זה נדרש לפחות 5 ng כמו חומר המוצא 29. לפיכך, בחרנו בשיטת IVT שהוא מסוגל לעבוד עם חומרי מוצא נמוכים 12 (קטן כמו 100 pg). יתר על כן, זה כבר נבדק כדי להגביר RNA סך שחולצו מן העובר שור 29 בהצלחה. במחקר נוכחי, שיטת ההגברה שלנו מיוצרת ~ 28 מיקרוגרם RNA מוגבר לכל עובר מן 598 RNA סך pg לכל עובר. Additioסוף סוף, לאחר ההגברה בשני סיבובים, הדגימות שלנו הראו פרופיל דומה וטווח בגודל מתאים (בין 200 ל 800 נ&quot;ב) אשר עולים בקנה אחד עם מחקרים קודמים 13, 15. בפרוטוקול זה, השתמשנו cyanine פרוטוקול תיוג אנזימטית, צמודת פלטינה (Cyanine 547 ו Cyanine 647) צבעים. שיטה זו מאפשרת תיוג של רנ&quot;א מוגבר או לא מוגבר. לאחר שלב הגברה לפני התיוג מאפשר שימוש נוקלאוטידים טבעיים, מוביל לעליית התשואות המוגברות RNA, להפחית הטיה וליצור שברים ארוכים יותר לעומת שיטה האנזימטית. Cyanine 547 ו Cyanine 647 צבעים נפוצים צבעי ניאון ממליצים עבור מערך דו-צבע. עם זאת, לצבוע Cyanine 647 רגיש שפלת אוזון. יש להשתמש צג אוזון כף יד כדי לוודא את רמת האוזון מתחת ל -2 ppb. בנוסף, סביבת אבק חינם יש צורך להימנע חלקיקי אבק נופל לתוך פתרון כלה או דוריןסריקה גרם. יכול להיות מתוכנן ניסוי microarray בגישה אחת או שני צבע. יש גישה ניסויית כל כמה יתרונות וחסרונות. באמצעות עיצובי שני צבעים מפחית את רעש ההשתנות ורקע, המאפשר השוואה ישירה עבור לולאת עיצובים עם הגדרת מדגם התייחסות משותפת. למרות הטיות הצבע וספציפית על תוצאות באופן משמעותי כאשר ניסויים מבוצעים באמצעות עיצובי שני צבעים, הטיות אלה ניתנים למתן על ידי ביצוע עסקות חלף צבע. שכפול טכני כזה מוסיף עלויות ניסוי, אבל יכול לשפר הוא דיוק ורגישות במדידת ביטוי הפרש 31. השוואת לתוכנה ביואינפורמטיקה אחרים (כגון גורילה) PANTHER מאפשר השוואת הנתונים עם הגנום taurus Bos כנקודת התייחסות. התוצאות שלנו מעידות כי במהלך התפתחות עוברית שור יום 7 באות רכיבים ביולוגיים ופונקציות מעורבות: הסדרת metaphase / anapהמעבר hase של מחזור התא, הסדרת המעבר mitotic metaphase / anaphase, רגולציה של הפרדה כרומוזום, תרגום המיטוכונדריה, ubiquitination K48 צמודי חלבון, ER כדי Golgi תחבורה בתיווך שלפוחית, תהליך קטבולי mRNA-עיבד גרעיני, ייזום translational, הפרדה כרומטידה mitotic אחותו , חטיבת גרעיני mitotic. הפרוטוקולים שהוצגו במאמר זה, מן תיוג פלורסנט של RNA המוגבר סריקה של מערכים צריכים להיות מוצאים להורג עם מודעות נוספות של הגורמים הסביבתיים למעלה כדי לשמור על נתונים איכותיים.

אובדן עוברי מוקדם בפרות חולבות גבוהות בהפקה הוא אחד האתגרים המרכזיים בתעשיית חלב 1, 2. שור הפך מודל מעניין ללמוד פיתוח עובר preimplantation אדם בשל תהליך התפתחותי הדומה שלהם 3, 4. עם זאת, מחקרים נוספים נדרשים להיות בעלי הבנה טובה יותר על גנים המעורבים בהתפתחות העוברית המוקדמת שור. אחרי עשרים שנה מאז טכנולוגית microarray הראשונה שפותחה בשנת 1995 5, התפתחות שגיאות דפוס מופחת טכנולוגיית ייצור בדיקה מתוחכמות יותר ושונה של שבבי מערך בתוך ובין פלטפורמות microarray השונות 6. טכנולוגית microarray משופרת הביאה יישום נרחב של טכנולוגיה זו במחקר קליני 7 ולאחרונה, ב q עובר המוקדםuality הערכה 8. הכמות הגדולה של חומר הנדרש עבור טכנולוגית microarray היא הסיבה העיקרית מדוע טכנולוגית microarray בתחילה נכשלה להזין מספר של תחומי מחקר כגון התפתחות עוברית מוקדמת. לאחרונה, שיטות הגברה RNA שופרו כדי להגביר באופן ליניארי RNA עד רמת מיקרוגרם מ-ננוגרם תת החל RNA חומר 9. ישנן מספר הגברת RNA המסחרית ערכות קיימות בשוק; עם זאת, הערכות המפותחות יותר הפופולריות קשורות Ribo-יחיד פריימר איזו תרמים הגברת 10 ו אמרגן T7 מונע 11 שיטות. הגברת RNA antisense הפופולרית ביותר משתמשת ב שעתוק במבחנה עם פריימר אוליגו dT קשר אמרגן T7 ב 5 &#39;סוף 12. טכנולוגיה זו מאפשרת שמירה על רוב תמלילי אנטי תחושה נציג לאחר f הגברה ליניאריתאו מערכי הכלאה 13. שיטה זו הותאמה כדי להגביר רמת picogram של רנ&quot;א הכל מופק שור עובר 8. הצמדת יוניברסל מערכת (ULS) היא שיטת התיוג אשר ישירות משלבת את ה- DNA או RNA מוגבר עם צבע פלואורסצנטי צמוד פלטינה או Cyanine 547 או Cyanine 647, על ידי יצירת קשר קואורדינטיבית על מצבת N7 של גואנין 14. שיטה זו הותאמה במחקר עובר כדי ליצור יותר יציב מוגבר ארנה ללא שינוי לעומת aminoallyl שהשתנה ארנה שנוצרה על ידי שיטה אנזימטית 15. שני שיטות לצבוע וסימון שני צבעים יחידים הותאמו באמצעות מערכת הצמדת יוניברסל microarray. מחקר השוואות microarray גדול היה כי קיימת קורלציה טובה של איכות נתונים בין פלטפורמות מערך אחד ושני צבע 6. לאחרונה, הוא כונן אמרגן T7n antisense RNA הגברה וסימון ULS שיטות פותחו כדי לספק פרוטוקול אמין יותר כדי לייצר כמות מספקת של איכות גבוהה שכותרתו חומרי ארנה כלת microarray 8, 16. לכן, מחקר זה מספק פרוטוקול להפגין חלק מן הצעדים החשובים של מיצוי RNA לניתוח נתונים מעורבים microarray שני צבעים באמצעות עוברי שור יום 7 כדוגמה.

<table><tbody><tr><td>PicoPure RNA Isolation Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>KIT0204</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase Set (50)</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>KIT0505</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer Instruments</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>RNA Screen Tape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5576</td><td></td></tr><tr><td>ULS Fluorescent Labeling Kit</td><td>Kreatech Diagnostics</td><td>EA-021</td><td></td></tr><tr><td>Custom Gene Expression Microarrays</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2514F</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Gene Expression wash buffer 1</td><td>Agilent Technologies</td><td>Part #5188-5325</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Gene Expression wash buffer 2</td><td>Agilent Technologies</td><td>Part #5188-5326</td><td></td></tr><tr><td>2x Hi-RPM Hybridization buffer</td><td>Agilent Technologies</td><td>&amp;nbsp;Part #5190-0403</td><td></td></tr><tr><td>25x Fragment buffer</td><td>Agilent Technologies</td><td>Part #5185-5974</td><td></td></tr><tr><td>10x GE Blocking Agent</td><td>Agilent Technologies</td><td>Part #5188-5281</td><td></td></tr><tr><td>Stabilization and drying solution</td><td>Agilent Technologies</td><td>&amp;nbsp;Part #5185-5979</td><td></td></tr><tr><td>Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2524-60012</td><td>Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide</td></tr><tr><td>Two-Color RNA Spike-In Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>&amp;nbsp;Cat# 5188-5279</td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4000B array scanner</td><td>Molecular Devices</td><td>GENEPIX 4000B-U</td><td></td></tr><tr><td>Ozone Free Box</td><td>BioTray</td><td>OFB_100x200</td><td></td></tr><tr><td>GAL file</td><td>Agilent Technologies</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

transcriptome profiling of in-vivo produced bovine pre-implantation embryos using two-color microarray platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

תוצאת נציג של RNA סך ארנה מוגבר מעובר שור יום 7 מוצגת באיור 3 ו מסוכמת בטבלת 1. ניתן להעריך יושרה פרופיל RNA לאחר מיצוי RNA. הערכת איכות של RNA יכול להיעשות על ידי מכשיר bioanalyzer (איור 3 א) ורק דגימות אלה עם ערך רין גבוה יותר מאשר 7.0 כשירים לשמש הגברה (טבלה 1). האיכות והכמות של רנ&quot;א המוגבר יש להעריך לאחר הגברה. הדמיון של פרופיל RNA מוגבר בטווח גודל מתאים הם הגורמים העיקריים עבור בקרת איכות (איור 3 ב). לאחר ההגברה בשני סיבובים, שברי RNA המוגברים מאוד דומים בגודלם, הנעים בין 200 ל 800 נ&quot;ב (איור 3B) וכל aRNAs של מגוון בגודל דומה נבחר תיוג קרינה נוסף. כמו כן, הגברה מוצלחת של רנ&quot;א הכל מקורי תניב לפחות יותר מאלף גידול של פי של ארנה (טבלה 1). יעילות תיוג הקרינה ניתן לחשב על פי מידת יחס תיוג. הנוסחא זמינה במדריך למשתמש ערכת תיוג ULS ארנה. המדריך למשתמש מצביע על מידת יחס תיוג צריך להיות 1.0 - 3.6%, המציין כי בממוצע של 1 - 3.6 מולקולות ULS ל -100 נוקלאוטידים. קבצי התמונה לאחר הכלאה וסריקה ניתן לצפות FlexArray. תמונה הסרוקה באיכות טובה לאחר כלת microarray ושטיפה מוצגת באיור 4 א. אם חומרי שכותרתו נמוכה או גבוהים יותר מאשר בטווח זה, אותות יהיו נמוכים מדי כדי לזהות או רמות רקע גבוה תזוהינה לאחר scanning (איור 4B). במחקר נוכחי, סף איתות חיובי נקבע ל 7.6 (אות בדיקה גבוהה 7.6 או רקע &lt;7.6 נחשב חיובי). כ -46% של ערכות הבדיקה מייצגות 20,826 נקודות חיוביות מסומנים בצבע אדום יום שור 7 עוברים (איור 5). לאחר סילוק סמלי גן ללא ביאור ו הכפול, רק 6765 סימני גן ייחודיים נותרים לניתוח PANTHER. גנים 6765 אלה מייצגים את תעתיקי רנ&quot;א ייחודי לידי ביטוי הבלסטוציסט שור יום 7. על מנת למצוא את התהליך הביולוגי ספציפי הבלסטוציסט שור, PANTHER לייצוג יתר הבדיקה מבוצעת. 10 העליון ג&#39;ין אונטולוגיה (GO) מזהי הטווח עם מדד העשרה לקפל הגבוה ביותר מסומנים (איור 6). באופן כללי, תנאי GO ספציפיים אלה בעיקר מייצגים את תהליך חטיבת הסלולר הפעיל כגון mitosiים והפרדה כרומוזום, הסדרת מחזור התא וייזום התרגום cytoplasmic ו המיטוכונדריה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53754/53754fig1.jpg" /> איור 1: תיבה חינם-אוזון (א) ו Array תיוג תגובה (B). א) אוזון חינם Box מורכב יחידת ממיר קטליטי אשר ממחזרת את האוויר והורס אוזון חיישן אוזון רגיש מאוד לפקח על רמת האוזון בתוך הקופסה במהלך הופעת microarray. הליך B) סימון כלת מערך לבצע בתוך הקופסה כדי למנוע שפלת צבע פלואורסצנטי Cyanine 647 על ידי אוזון. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53754/53754fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53754/53754fig2.jpg" /> איור 2: PANTHER ג&#39;ין רשימת ניתוח. החיצים האדומים מציינים את האזור צריך להיות מלא. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53754/53754fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53754/53754fig3.jpg" /> איור 3: electropherogram נציג Bioanalyzer של סך RNA (א) ואת תמונה ג&#39;ל של Amplified RNA (B). א) מציג התוצאה הכוללת עם ערך רין, ריכוז RNA ויחס rRNA. ב) הפרופיל של רנ&quot;א המוגבר לאחר הגברה בשני סיבובים. שברי RNA מוגברים צפויים להיות בטווח שבין 200 ל -800 נ&quot;ב. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53754/53754fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> </a&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53754/53754fig4.jpg" /> איור 4: תמונה של מפת צפיפות Array. (א) תמונה טובה של שקופית מערך מראה ערוץ ירוק ואדום מתאים Cyanine 547 ו Cyanine 647 אותות לאחר סריקה באמצעות עוצמת נקודה גבוהה (מסומנת בצד שמאל עם צבע ירוק כחול) ורקע נמוך (מצוין על ימין עם כחול כהה צֶבַע). (ב) תדמית רעה של שקופית מערך הצגת תמונת רקע גבוהה מאוד מערוץ אדום (מסומנת המלוח העליון עם צבע ירוק הכחול הדומה מדמות עוצמת מקום Cyanine 647). תרשים צבעוני מציין את עוצמת האות עם ערכים מספריים המתאים בצבעים שונים. שווי עוצמת אות הוא הנמוך ביותר בטווח של צבע כחול כהה. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53754/53754fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גדול</a>גרסת r של נתון זה. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53754/53754fig5.jpg" /> איור 5: MA מגרש פרופיל ביטוי גנים עובריים יום 7 שור. 20,826 נקודות אדומות מיוצגות אותות חיוביים מעל אותות רקע. כתמי רקע מודגשים בצבע שחור. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53754/53754fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/53754/53754fig6.jpg" /> איור 6: The Top 10 ג&#39;ין אונטולוגיה (GO) מזהי טווח עם מדד והעשרה מקפלים הגבוה ביותר. במונחים GO ספציפיים אלה בעיקר מייצגים את תהליך חטיבת הסלולר פעיל כגון מיטוזה והפרדה כרומוזום, הסדרת מחזור התא וייזום cytoplasmic ו המיטוכונדריה טרנסאוכלוסייה. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53754/53754fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> לִטעוֹם </td><td> מספר העובר </td><td> סוּג </td><td> העובר איכות המורפולוגית </td><td> ריכוז RNA (pg / μL) </td><td> RIN </td><td> רנ&quot;א הכל משומש לגידול הגברה (PG) </td><td> ריכוז RNA מוגבר (ng / μL) </td></tr><tr><td> S1 </td><td> 4 </td><td> הבלסטוציסט </td><td> כיתה 1 &amp; 2 </td><td> 101 </td><td> 8.6 </td><td> 858.5 </td><td> 3498.4 </td></tr><tr><td> S2 </td><td> 1 </td><td> הבלסטוציסט </td><td> כיתה 2 </td><td> 142 </td><td> 7.4 </td><td> 1207 </td><td> 1682.4 </td></tr&gt; <tr><td> S3 </td><td> 2 </td><td> הבלסטוציסט </td><td> כיתה 1 </td><td> 135 </td><td> 8.8 </td><td> 1147.5 </td><td> 3185.3 </td></tr><tr><td> S4 </td><td> 3 </td><td> הבלסטוציסט </td><td> כיתה 1 </td><td> 177 </td><td> 9 </td><td> 1504.5 </td><td> 2906.4 </td></tr><tr><td> S5 </td><td> 5 </td><td> הבלסטוציסט </td><td> כיתה 1 </td><td> 636 </td><td> 8.3 </td><td> 5406 </td><td> 3437.5 </td></tr><tr><td> S6 </td><td> 3 </td><td> הבלסטוציסט </td><td> כיתה 1 &amp; 2 </td><td> 159 </td><td> 9.1 </td><td> 1351.5 </td><td> 1689.8 </td></tr><tr><td> S7 </td><td> 3 </td><td> הבלסטוציסט </td><td> כיתה 1 </td><td> 154 </td><td> 9 </td><td> 1309 </td><td> 4507.1 </td></tr><tr><td> S8 </td><td> 4 </td><td> הבלסטוציסט </td><td> כיתה 1 </td><td> 304 </td><td> 8.5 </td><td> 2584 </td><td> 3089.3 </td></tr><tr><td> S9 </td><td> 5 </td><td> הבלסטוציסט </td><td> כיתה 1 </td><td> 282 </td><td> 9.1 </td><td> 2397 </td><td> 3917.8 </td></tr><tr><td> S10 </td><td> 6 </td><td> הבלסטוציסט </td><td> כיתה 1 &amp; 2 </td><td> 374 </td><td> 9.4 </td><td> 3179 </td><td> 2979 </td></tr><tr><td> S11 </td><td> 5 </td><td> הבלסטוציסט </td><td> כיתה 1 </td><td> 272 </td><td> 9.3 </td><td> 2312 </td><td> 2576 </td></tr><tr><td> S12 </td><td> 3 </td><td> הבלסטוציסט </td><td> כיתה 1 </td><td> 206 </td><td> 9 </td><td> 1751 </td><td> 2567.9 </td></tr></tbody></table> טבלה 1: Sample ומידע RNA. ריכוז ואיכות RNA יש להעריך לאחר החילוץ. שלמות וריכוז RNA ניתן להעריך על ידי כל bioanalyzer. מספר שלמות RNA צריך להיות יותר מ 7.0. ריכוז RNA צריך להיבדק על ידי מכשיר ספקטרופוטומטר לאחר הגברה. אמבריאיכות o הוערכה לפי גדרות המדריך של האגודה עובר הבינלאומית (3 rd ed., סבוי, IL).

Watch this Scientific Journal Video about Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform at JoVE.com

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transcriptome Profiling של<em&gt; In-Vivo</em&gt; עוברי אדם שור הופק באמצעות פלטפורמת microarray שני צבעים

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

transcriptome-profiling-vivo-produced-bovine-pre-implantation-embryos

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

7.7K Views.  University of Alberta. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Video: Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

We report here the robust and efficient expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of Branchiostoma lanceolatum. The development of the microinjection technique in this basal chordate will pave the way for far-reaching technical innovations in this emerging model system, including in vivo imaging and gene-specific manipulations.

ביטוי של חלבונים ניאון ב<em&gt; Lanceolatum מיתרני הראש</em&gt; על ידי הזרקת mRNA לביציות מופרה

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

לייזר בסיוע cytoplasmic Microinjection ב משק חי zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Genetics

Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, the ability to determine an embryo&#39;s sex is necessary in many experiments particularly regarding early development. The present protocol demonstrates an inexpensive, rapid and non-toxic preparation of pig genomic DNA for use with PCR. Day 30 embryos must be humanely collected according to the guidelines established by Institutional Animal Policy and Welfare Committees for the present protocol. The preparation of the whole embryo for this PCR based sexing technique simply involves grinding the frozen embryo to a fine powder using a pre-chilled mortar and pestle. PCR-quality DNA is released from a small amount of embryo powder by applying a hot incubation in an alkaline lysis reagent. Next, the DNA solution is mixed with neutralization buffer and used directly for PCR. Two primer pairs are generated to detect specific sex determining region of the Y- chromosome (SRY) and ZFX region of the X- chromosome with high accuracy and specificity. The same protocol can be applied to other elongated embryos (Day 10 to Day 14) earlier than Day 30. Also, this protocol can be carried with 96-welled plates when screening a large number of embryos, making it feasible for automation and high-throughput sex typing.

This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

חינם מדויק פנול DNA זיהוי מין של יום 30 חזירים העוברים על ידי PCR

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

שיבוט פונקציונלי שימוש<em&gt; Xenopus</emמערכת ביטוי ביצית&gt;

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Loss- ו-של-פונקצית רווח גישה לחקר תא מוקדם קובעי גורל preimplantation עכבר עובר

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. The high transfection efficiency permits at least 4 distinct mRNAs to be co-transfected with ~87% efficiency. Most of the electroporated mRNAs are degraded during the first 2 h post-electroporation, permitting time-sensitive experiments to be carried out in the developing embryo. Finally, we describe how to dynamically image live embryos electroporated with mRNAs that encode various subcellular targeted fluorescent proteins.

We report messenger RNA (mRNA) electroporation as a method that permits fast and efficient expression of multiple proteins in the quail embryo model system. This method can be used to fluorescently label cells and record their in vivo movements by time-lapse microscopy shortly after electroporation.

ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים מרובים בעוברי העופות באמצעות mRNA אלקטרופורציה

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental biology. It has been successfully used to identify rare cell populations, discover novel marker genes, and decode spatial and temporal developmental information. The single cell method has also evolved from the microfluidic based Fluidigm C1 technology to the droplet-based solutions in the last two to three years. Here we used the heart as an example to demonstrate how to profile the mouse embryonic tissue cells using the droplet based scRNA-Seq method. In addition, we have integrated two strategies into the workflow to profile multiple samples in a single experiment. Using one of the integrated methods, we have simultaneously profiled more than 9,000 cells from eight heart samples. These methods will be valuable to the developmental biology field by providing a cost-effective way to simultaneously profile single cells from different genetic backgrounds, developmental stages, or anatomical locations.

Here we presented a multiplexed single cell mRNA sequencing method to profile gene expression in mouse embryonic tissues. The droplet-based single cell mRNA sequencing (scRNA-Seq) method in combination with multiplexing strategies can profile single cells from multiple samples simultaneously, which significantly reduces reagent costs and minimizes experimental batch effects.

מרבב תא יחיד mRNA ניתוח הרצף של העכבר תאים עובריים

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that take place in the cytoplasm in preparation for fertilization and acquisition of totipotency. During oocyte maturation, changes in gene expression depend exclusively on the translation and degradation of maternal messenger RNAs (mRNAs) rather than on transcription. Execution of the translational program, therefore, plays a key role in establishing oocyte developmental competence to sustain embryo development. This paper is part of a focus on defining the program of maternal mRNA translation that takes place during meiotic maturation and at the oocyte-to-zygote transition. In this method paper, a strategy is presented to study the regulation of translation of target mRNAs during in vitro oocyte maturation. Here, a Ypet reporter is fused to the 3&#39; untranslated region (UTR) of the gene of interest and then micro-injected into oocytes together with polyadenylated mRNA encoding for mCherry to control for injected volume. By using time-lapse microscopy to measure reporter accumulation, translation rates are calculated at different transitions during oocyte meiotic maturation. Here, the protocols for oocyte isolation and injection, time-lapse recording, and data analysis have been described, using the Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3&#39; UTR reporter as an example.

This protocol describes a reporter assay to study the regulation of mRNA translation in single oocytes during in vitro maturation.

הגדרת התוכנית של תרגום mRNA אימהי במהלך התבגרות במבחנה באמצעות בדיקה של כתב ביצית יחיד

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

Transcriptome Profiling של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ביטוי של חלבונים ניאון ב