This work was supported by ERC starting grants (ERC-2011-StG 280255 and ERC-2013-StG 337479) and by the Netherlands Organization for Health Research and Development (Vidi 91713319).

<ol>
	<li>Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+imaging+of+cell+signaling+from+in+vitro+to+in+vivo:+basis+of+biosensor+construction,+live+imaging,+and+image+processing.">Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: basis of biosensor construction, live imaging, and image processing.</a> Dev. Growth Differ. 55 (4), 515-522 (2013).</li><li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+imaging.">FRET imaging.</a> Nature Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change.">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li><li>Li, I. T., Pham, E., Truong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+biosensors+based+on+the+principle+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+for+monitoring+cellular+dynamics.">Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics.</a> J. Biotechnol. Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).</li><li>Stephens, D. J., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+techniques+for+live+cell+imaging.">Light microscopy techniques for live cell imaging.</a> Science. 300 (5616), 82-86 (2003).</li><li>Merkx, M., Golynskiy, M. V., Lindenburg, L. H., Vinkenborg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+FRET+sensor+proteins+based+on+mutually+exclusive+domain+interactions.">Rational design of FRET sensor proteins based on mutually exclusive domain interactions.</a> Biochem. Soc. Trans. 41 (5), 1201-1205 (2013).</li><li>Lindenburg, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Stickiness:+Thermodynamic+Characterization+of+Intramolecular+Domain+Interactions+To+Guide+the+Design+of+Fo&#776;rster+Resonance+Energy+Transfer+Sensors.">Quantifying Stickiness: Thermodynamic Characterization of Intramolecular Domain Interactions To Guide the Design of Fo&#776;rster Resonance Energy Transfer Sensors.</a> Biochem. 53 (40), 6370-6381 (2014).</li><li>van der Velden, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+bile+acid+transport+in+single+living+cells+using+a+genetically+encoded+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+sensor.">Monitoring bile acid transport in single living cells using a genetically encoded F&#246;rster resonance energy transfer sensor.</a> J. Hepatol. 57 (2), 740-752 (2013).</li><li>Dawson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heteromeric+organic+solute+transporter+&#945;-&#946;,+Ost&#945;-Ost&#946;,+is+an+ileal+basolateral+bile+acid+transporter.">The heteromeric organic solute transporter &#945;-&#946;, Ost&#945;-Ost&#946;, is an ileal basolateral bile acid transporter.</a> J. Biol. Chem. 280 (8), 6960-6968 (2005).</li><li>Meier, P. J., Stieger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+salt+transporters.">Bile salt transporters.</a> Annu. Rev. Physiol. 64 (1), 635-661 (2002).</li><li>Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mTurquoise-based+cAMP+sensor+for+both+FLIM+and+ratiometric+read-out+has+improved+dynamic+range.">A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range.</a> PLoS One. 6 (4), e19170 (2011).</li><li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy.">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Curr. Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).</li><li>Plass, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farnesoid+X+receptor+and+bile+salts+are+involved+in+transcriptional+regulation+of+the+gene+encoding+the+human+bile+salt+export+pump.">Farnesoid X receptor and bile salts are involved in transcriptional regulation of the gene encoding the human bile salt export pump.</a> J. Hepatol. 35 (3), 589-596 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לשימוש בחיישן של חומצות מרה רומן מקודדים גנטי מסוגל ניטור דינמיקת spatiotemporal תחבורת חומצות מרה בתאים חיים. biosensor זה מורכב מחלבוני ניאון תכלת וסיטרין שהם התמזגו לFXR-LBD, וכך יוצרים חיישן מבוסס סריג חומצות מרה (BAS). חומצות מרה החיישן הוא יחסית פשוט ונוח בשימוש בעת צורך ניסיון בסיסי עם תרבות תא וFACS או במיקרוסקופ (confocal). עם זאת, כמה היבטים עשויים לדרוש קצת ירי צרות. בעת שימוש בחיישן של החומצות מרה בשילוב עם מובילי חומצות מרה, מומלץ לתאי תרבות במדיום עם סרום-מסונן פחם. פחם נוסף מפחית את רמות חומצות מרה על ידי ספיחה מהסרום. במיוחד בנוכחות יבואנים כגון NTCP, זה הוא חיוני כדי למנוע הרוויה של החיישן במהלך culturing, שכן זה הוא הגורם השכיח ביותר של חיישן רגישבמהלך ניסויים. לכן, חיישן אחר נוצר (NucleoBAS N354K / I372V) המכיל מוטציות לשנות את הרגישות לחומצות מרה, יצירת טווח דינמי גדול יותר 8. כדי להגדיר אם החיישן כבר רווי, סיטרין / יחס התכלת ניתן להשוות את היחס בתאי שליטה לא להביע כל מובילי חומצות מרה, שכן תאים אלה הם הניחו לי רמות חומצות מרה תאיות נמוכות. לחלופין, מיקרוסקופיה הדמיה הקרינה-חיים (FLIM) מדידות יכולה להתבצע לחקור סריג באופן עצמאי עוצמת-12. טכניקה זו היא מעבר להיקף של מאמר זה, ודורשת ציוד מיוחד יותר. סיבות נוספות לחיישן רגיש כוללות את השימוש בתאים שהם אוטומטיים ניאון ו / או NucleoBAS איבדו ביטוי. ראוי לציין, תנודות בעוצמת התכלת וסיטרין (למשל בשל משמרות מוקד) במהלך הניסוי יכולות לטשטש הדמיה ישירה של סריג שינויים במהלך הדמיה, ואילוטבע ratiometric של החיישן עדיין מאפשר לניטור של דינמיקה של חומצות מרה. לעתים קרובות שינויים בעוצמה מוחלטים צנועים לfluorophores הפרט על תוספת של ligands FXR, תוך העלייה בשיעור ניכרת. לניתוח סריג בתאי transfected עם חיישן BAS, אור הלייזר מתאים ומסננים יש לבחור. הגידול של עוצמת סיטרין בסריג יש למדוד עם לייזר דיודה סגולה (405 ננומטר) עם פליטת פיקוח על 450-520 (תכלת) ו520-580 (סיטרין). היבט חשוב לקחת בחשבון הוא את הרגישות של החיישן לphotobleaching. כאשר עוצמת fluorophores אחד או שניהם יורדת לאט בזמן ללא תוספת של ligands, זה לעתים קרובות מציין photobleaching. תופעה זו מתרחשת בעיקר כאשר כוח הלייזר הוא גבוה מדי. כדי למנוע השפעה לא רצויה זו, כוח הלייזרים לא יעלה על 5% מהכוח המלא והתאים צריכים להיות כל הזמן בחושך ככל האפשר. הגבלזמן לחפש את התאים תקין. תנודות בעוצמת הקרינה יכולות להיגרם גם על ידי סחיפת מוקדי בציר z. כדי לנטרל את זה, את גודל חריר ניתן להגדיל ורצוי לצייר ROIs לא קרובה מאוד למתחם התא. חיישן סריג לחומצות מרה נבדק בסוגי תאים מרובים (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK ותאי HEK293T) שניתן transfected ויש לי הפנוטיפ יציב. עם זאת, תאים ראשוניים ומובחנים כגון hepatocytes קשים transfect ולשמור על יציבות במונחים של מאפיינים. התמרה ויראלי יכולה לעזור עם תאים קשה-transfect (לבנות זמין על פי בקשה). כרגע אנחנו מייצרים קו עכבר כדי לאפשר שימוש בחיישן בתאים ראשוניים מבודדים טרי שמהירות dedifferentiate על בידוד. כדי לבצע את ניסוי confocal תאר, קיים הכרח כי שורת התאים שנבחרו היא חסיד למנת תרבות וגדל בsiשכבת תאי ngle. עם זאת, תאים שגדלים בהשעיה, או תאים חסיד שניתן trypsinized די בקלות, ניתן גם למדוד באמצעות FACS. לבסוף, מומלץ לבחור שורת תאים ללא תחבורת חומצות מרה אנדוגני או סינתזה בעת ניתוח מסלול תחבורה ספציפית. כלומר, כאשר מודד את הפעילות של חלבונים מסוימים transfected (מוטציה) טרנספורטר. מוצג BAS biosensor ניאון המקודדים גנטי הוא כלי רב ערך לניטור תעבורת חומצה בודדת חי מרה תא. BAS מכיל FXR-LBD אשר מופעל על ידי מגוון גדול של חומצות מרה, המאפשר הדמיה של דינמיקת subcellular של חומצות מרה 8. זה נותן יתרון גדול ביחס לשימוש בטכניקות אחרות. לדוגמא, במבחני כתב בלוציפראז מונע אמרגן, אות בלוציפראז תלויה ביציבותו של הכתב בתוך תאים, אינו תומכת במידע subcellular, ודורשת את ההרס של המדגם <sעד&gt; 13. גישה נוספת למדידת תחבורת חומצות מרה היא השימוש בניאון שכותרתו או ligands רדיואקטיבי. עם זאת, תיוג הניאון של חומצות מרה יכול לשנות קינטיקה תחבורת חומצות מרה ואת הזמינות של חומצות מרה רדיואקטיבי היא מוגבלת. בנוסף, שילוב של החיישן עם ביטוי של מובילי חומצות מרה, זרם וזרימה של חומצות מרה ספציפיות סלולריים ניתן לטפל. למשל, הגדיל את הרמות תאיות של חומצות מרה מצומדות כמו TCDCA לספק תובנה על פעילות תחבורה. זה גם מאפשר להשתמש BAS לבחון את ההשפעה על תחבורת חומצות מרה לאחר התערבות עם מסלולים ספציפיים, למשל באמצעות מסכי מעכב מולקולריים או תרכובת, או בוחנים את ההשפעה של ligands FXR האחר. לבסוף, יישום אחר של חיישן שילוב עם חלבוני ניאון אחרים לניתוח או לוקליזציה של חלבונים כמותי, למשל הדמיה של ביטוי מובילי קרום פלזמה והפעלת FXRבאותו התא.

העברת פורסטר תהודת אנרגיה (סריג) היא בשימוש נרחב כדי להשיג הבנה טובה יותר של תפקודים תאיים בתאים חיים עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה 1. בסריג, אנרגיה מfluorophore תורם נרגש מועברת לfluorophore acceptor. סריג יעילות הוא תלוי מאוד על המרחק בין התורם fluorophore acceptor והאוריינטציה שלהם, ולכן קריאת נתונים רגישות של שינויי קונפורמציה המשפיעים על שני fluorophores. תופעה זו מנוצלת ליצירת חיישנים מבוססי סריג להדמיה של מולקולות קטנות. שינויים בריכוזם יכולים להיות במעקב עם עלייה / ירידה בשיעור של עוצמת פליטה של acceptor לעומת fluorophore התורם 2. לדוגמא, חיישני סידן מבוססי סריג מאפשרים זיהוי מהיר ויציב של ריכוזי סידן חופשיים בתאים חיים 3. יתרונות אחרים של חיישנים מבוססי סריג הם הדמיה בתאי חיים יחידים, לאיורש אינה הפולשנות, היכולת שלהם להיות ממוקד לסוגי תאים שונים ותאים סלולריים 4. היבטים של דינמיקה של חומצות מרה תאיים רבים עדיין הם הבינו היטב. לדוגמא, מעט מאוד ידוע על בסיס תקנת המנגנון של תחבורת חומצות מרה מצומדות וunconjugated. קיימים טכניקות כדי לפקח על תחבורה זה בעיקר לעשות שימוש בכתבים מבוסס לוציפראז, חומצות מרה רדיואקטיבי, או אנלוגים של חומצות מרה ניאון. האחרון דורש שינוי של חומצות מרה, אולי משפיע על תכונותיהם. יש עיתונאים המבוסס על לוציפראז רזולוציה זמן עני. חוץ מזה, בטכניקות אלה לגרום לאובדן של המדגם ואינם ישימים להדמיה בתאים בודדים. לכן, זה יהיה מועיל להשתמש בשיטות המאפשרות הדמיה תא בודדת חי של פעילות תחבורה באמצעות חיישני סריג, במיוחד משום שהיא כוללת את היתרון של זיהוי 5 ratiometric, 6. בעוד גרסאות של CFP / טופס YFP הנפוץ ביותר בשימוש זוגות סריג, אסטרטגיות חדשות באמצעות Morange וmCherry נושא מוטציות עמותה עצמית-התרמה הובילה להרחבת ארגז הכלים סריג עם חיישני רומן, כוללים חיישן חומצות מרה אדום העביר 7. יצרנו חיישן גנטי מקודד סריג מרה חומצה (BAS), שמורכב מfluorophore תורם (תכלת) וfluorophore acceptor (סיטרין) שהתמזגו עם תחום קולט X farnesoid (FXR) יגנד מחייב בעבר (FXR-LBD) ופפטיד המכיל מוטיב LXXLL 8. מקורבים זה פפטיד עם FXR-LBD באופן חומצה תלויה מרה. עם הפעלת FXR, המרחק בין סיטרין והתכלת ישנה עקב שינוי קונפורמציה. בשורות תאי יונקים, תוצאות FXR הפעלה בעלייה להבחין בבירור בסיטרין / היחס תכלת, בעוד החיישן המטוהר עובד בכיוון ההפוך וגורם ליחס סריג ירד על הפעלת FXR. חיישן זה (CytoBAS)מאפשר ניטור של דינמיקה של חומצות מרה cytosolic. על ידי תוספת carboxyl הטרמינל של מוטיבים מיקוד subcellular, מבנה BAS יכול להיות ממוקד לגרעין (NucleoBAS) וperoxisomes (PeroxiBAS), המאפשר מדידות של ריכוזי חומצות מרה בתאים סלולריים שונים. למרות התוספת של מוטיב מיקוד peroxisomal אינה פוגעת היענותה לחומצות מרה, FXR-ligands החדיר תאים לא לגרום לכל סריג שינויים של PeroxiBAS בתוך peroxisomes 8. כטבעו של פער זה אינו ידוע, הפרוטוקול להלן מתמקד בCytoBAS וNucleoBAS. השימוש בחיישן סריג מקודדים גנטי זה הודגם לאחרונה בתאים המכילים את מובילי כבד חומצות מרה Na פוליפפטיד שיתוף הובלה / taurocholate + (NTCP) ואלפא טרנספורטר המומס אורגני / בטא (OSTαβ) 8. NTCP היא היבואנית של חומצת מרה בכבד הקרן וOSTαβ הוא מרה מעיים basolateralטרנספורטר חומצה שיכול לתפקד גם כיבואן ויצואן תלוי בשיפוע של החומצות מרה אלקטרוכימיים הריכוז 9, 10. נתונים אחרונים הראו כי על תחבורת חומצות מרה על ידי NTCP ו / או OSTαβ, ניתן לצפות תגובות חזקות ומהירה ביחס סריג כתוצאה מאינטראקצית יגנד-FXR-LBD. כאן אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים לשיטות למדידת סריג כגון ניתוח confocal מיקרוסקופי ותא מופעל הקרינה מיון (FACS), לסמן את השלבים קריטיים, לטפל בבעיות פוטנציאליות ולדון שיטות חלופיות. שימוש בחיישן סריג מקודדים גנטי זה, אינטראקציה עם חומצות מרה FXR-LBD ניתן לכמת ופיקוח ישיר בתאים חיים ומספקת שיטה מהירה ופשוטה של ​​הדמיה תחבורת חומצות מרה ודינמיקה בזמן אמת. פלסמידים ביטוי יונקים קידוד CytoBAS וNucleoBAS זמינים מסחרי. לכן, biosensor זה יכול עוד לתרום להבנה של מובילי חומצות מרה או תרכובות המפעילות FXR ולספק הבנה עמוקה יותר של ביולוגיה של חומצות מרה ואיתות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="867">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">CytoBAS&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Addgene</td>
			<td align="right" style="width:145px;">62860</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NucleoBAS&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Addgene</td>
			<td align="right">62861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Dulbecco&#39;s modified Eagles media (DMEM)</td>
			<td style="width:173px;">Lonza</td>
			<td>BE12-614F</td>
			<td>High glucose without L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Penicillin-Streptomycin (pen/strep)</td>
			<td style="width:173px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">L-glutamine (200mM)</td>
			<td style="width:173px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:173px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:145px;">102-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td style="width:173px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">CC-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">T-25 cell culture flask</td>
			<td style="width:173px;">VWR international</td>
			<td style="width:145px;">392-0253</td>
			<td>Laminin coated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">T-175 cell culture flask</td>
			<td style="width:173px;">VWR international</td>
			<td style="width:145px;">392-0238</td>
			<td>Laminin coated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">6-well plate</td>
			<td style="width:173px;">VWR international</td>
			<td style="width:145px;">734-0229</td>
			<td>Poly-L-lysine and Laminin coated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">10cm dish</td>
			<td style="width:173px;">VWR international</td>
			<td style="width:145px;">392-0243</td>
			<td>Laminin coated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Diethylaminoethyl (DEAE) - Dextran</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">D9885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Polyethylenimine (PEI)&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Brunschwig</td>
			<td style="width:145px;">23966-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">G418 (geneticin) 50 mg/ml</td>
			<td style="width:173px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:145px;">10131-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Hygromycin B, 50 mg / ml</td>
			<td style="width:173px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:145px;">10687-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Cloning cylinder (6x8 mm)</td>
			<td style="width:173px;">Bellco</td>
			<td style="width:145px;">2090-00608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">L-15 Leibovitz culture medium</td>
			<td style="width:173px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:145px;">21083-027</td>
			<td>No phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:300px;">Polystyrene round bottom tube (5 ml) Facs tube</td>
			<td style="width:173px;">Falcon BD</td>
			<td style="width:145px;">352008</td>
			<td>No cap, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Falcon 2063 tubes (5 ml)</td>
			<td style="width:173px;">Falcon BD</td>
			<td align="right" style="width:145px;">352063</td>
			<td>Snap cap, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Nunc Lab-Tek 8 well coverglass</td>
			<td style="width:173px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:145px;">155409</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Charcoal-filtered FBS</td>
			<td style="width:173px;">Life technologies</td>
			<td style="width:145px;">12676011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">GW4064</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">G5172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">TCDCA</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">T6260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">CDCA</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">C9377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Other chemicals</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">n.v.t.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time monitoring of intracellular bile acid dynamics using a genetically encoded fret-based bile acid sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

חיישן סריג-BAS מוצג מבוסס על יגנד המחייב תחום של FXR (LBD-FXR) מחובר לשני fluorophores סיטרין ותכלת) ומוטיב LXXLL. חיישן זה מאפשר חקירות תחבורת חומצות מרה בתאים חיים עם רזולוציה מרחב ובזמן גבוהה (איור 1). מוטציות בתכלת וסיטרין יושמו כדי לקדם את הקמתו של מתחם intramolecular (איור 1 B). חומצות מרה וligands FXR האחר להיקשר לFXR ובכך לשנות את המרחק בין סיטרין ותכלת על ידי שינוי קונפורמציה. בחיים תאי יונקים, זה תוצאות ביעילות סריג מוגברת (עליית סיטרין, ירידה תכלת) (איור 1 ג, 1 ד &#39;). במהלך ניסוי תא חי כמותיים המבוסס על עוצמת סריג עם מיקרוסקופ confocal, אנילא נצפה שחומצת taurochenodeoxycholic (TCDCA) -treated תאי U2OS (30 מיקרומטר) להביע NucleoBAS חסר מובילי חומצות מרה לא מראה שום שינויים בסריג, בעוד סיטרין / יחס התכלת הממוצע עלה פלאים לאחר הטיפול בGW4064 (5 מיקרומטר) (איור 1 C). לעומת זאת, תאי U2OS NucleoBAS להביע שיתוף, NTCP וOSTαβ לא להראות עלייה ברורה בסיטרין / יחס תכלת על תוספת של TCDCA, ועלייה גדולה עוד יותר ביחס לאחר תוספת של GW4064 (איור 1 ד &#39;). זה מוכיח כי TCDCA אינו מסוגל לעבור דרך קרום התא ודורש מובילים ספציפיים להיכנס לתא. לוקליזציה סלולרית של החיישן נקבעה על ידי הנוכחות של אותות לוקליזציה ספציפיים. NucleoBAS מיועד לגרעין על ידי אות הלוקליזציה הגרעינית (איור &lt;strong&gt; 2 ב &#39;), ואילו CytoBAS אינו מכיל כל אות לוקליזציה ולכן נשאר בcytosol (איור 2). Biosensor יכול גם להיות משולב עם הדמיה של חלבוני ניאון אחרים, המאפשר מדידות של חלבון ביטוי / לוקליזציה והפעלת FXR באותו התא. לדוגמא, איור 2 C תערוכות התאים U2OS שיתוף transfected עם NucleoBAS וNTCP-mKate2. בנוסף, החיישן יכול גם להיות משולב עם חיישנים אחרים הדמיה subcellular של פרמטר אחד או יותר בו זמנית. לדוגמא, NucleoBAS בא לידי ביטוי יחד עם (IMAGE # שיבוט EST 5,221,127) TGR5 וחיישן cytosolic cAMP (T Epac VV) 11 למדוד TGR5 והפעלת FXR באותו התא באותו הזמן. על TGR5 מחייב, רמות cAMP עלו בcytosol שזוהתה על ידי חיישן המחנה, תוך הפעלת FXR בגרעין הייתה מולualized בו זמנית. דמויות 2D-F &#160; להראות סדרת זמן מורכבת מ6 תמונות confocal של תאי NucleoBAS-TGR5- T VV Epac לאחר הטיפול בGW4064 (5 מיקרומטר) (איור 2 D), עם TCDCA (10 מיקרומטר) (איור 2 E) או בחומצת chenodeoxycholic (CDCA) (איור 2 F) בזמן t = 0. הצבע הירוק מייצג אזורים שבם יחס פליטת 525/450 ננומטר הוא ירד (המייצגים העלאת cAMP) והצבע הוורוד (10 מיקרומטר) מייצג עלייה בשיעור פליטה (הפעלת FXR), בהשוואה ל היחסים בתחילת הניסוי. בנוסף, cytometry הזרימה יכול לשמש מסך בריכה של תאים ברמת תא בודדת או כהקרנת תפוקה גבוהה באוכלוסייה כולה. תאי U2OS להביע NucleoBAS היו Excitאד עם לייזר ננומטר סגול 405 והקרינה נאסף בטווח 450/40 לטווח תכלת ולסיטרין 525/20. על מנת לשפר את היעילות של ניסויי סריג מבוסס FACS, יש להגדיר שערים נאה (איור 3). שער P1 כולל פסולת תא ושער P2 מסיר duplets מניתוח. בשלב הבא, הניתוח מוגבל לסיטרין (נרגש עם 488 לייזר) ותכלת (נרגשת עם 405 לייזר) תאים חיוביים בשער 3. לבסוף, P4 השער מייצג את אחוז התאים עם סיטרין הגבוה / יחס פליטת תכלת (באמצעות עירור של תכלת עם 405 ננומטר לייזר). עבור כל דגימה, לפחות 10,000 תאים שנפלו בתוך שער 3 נמדדו. בהמשך לכך, cytometry זרימת סריג מבוסס FACS שימש לחישוב גידול בסריג בתאים חיים לאחר דגירה 30 דקות עם TCDCA וGW4064. תאי U2OS טופלו ללא להביע NucleoBAS הראו &lt;5 תאי% בשער P4 (סיטרין / גתאי erulean-גבוה). בהעדר כל מובילי חומצות מרה, אחוז דומה נצפה ב -30 מיקרומטר תאי TCDCA טופל (איור 4). לעומת זאת, תא שיתוף להביע NucleoBAS, NTCP וOSTαβ עשו להראות כמות מוגברת של סיטרין / תאים תכלת-גבוהים של כ -38%. לאחר תוספת של 10 מיקרומטר GW4064, כמעט 90% מהתאים היו סיטרין / בלי קשר תכלת-גבוה של ביטוי של OSTαβ או NTCP (איור ב &#39;4). ניתן להציג נתונים בגרפים בר (תאי% בשער 4, אוכלוסיית 4) (איור 4 ג &#39;, ד) או כהיסטוגרמות אוכלוסייה של יחס סיטרין-תכלת (E איור 4, F). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53659/53659fig1.jpg" /> Figure 1. עיצוב של חומצות מרה החיישן (BAS). (א) ייצוג מבני של אופן פעולה של חומצות מרה חיישן מקודד גנטי. הוא מורכב מfluorophore תורם (תכלת) וacceptor fluorophore (סיטרין) צמוד באמצעות FXR-LBD והתמזג לפפטיד FXR-הקו-הפקטורים (מוטיב LXXLL). אדריכלות תחום סכמטי של BAS (B). מוטציות fluorophore Q204F / V224L לקדם את הקמתה של אינטראקציות בין intramolecular התכלת וסיטרין. מבנה NucleoBAS מכיל אות ג-מסוף לוקליזציה גרעינית (NLS) ולכן מצטבר בגרעין, ואילו מבנה CytoBAS חסר כל רצף מיקוד ולכן מציג לוקליזציה cytosolic. (ג) ניסוי סריג נציג מבוסס confocal עם BAS ככלי לניטור תעבורת חומצות מרה מצומדות. אין שינוי בסיטרין / יחס תכלת הוא ציין לאחר בנוסף TCDCA 30 מיקרומטר בתאים רק Expressing NucleoBAS. כאשר 5 מיקרומטר GW4064 נוסף, סיטרין / יחס תכלת מאוד מוגבר נצפה. (ד) יבוא של TCDCA (30 מיקרומטר) תוצאות בהפעלה ניכרת של החיישן בתאים-שיתוף transfected NTCP וOSTαβ. טיפול לאחר GW4064 (5 מיקרומטר) מוביל לעלייה נוספת בסיטרין / יחס תכלת. תוצאות באות לידי ביטוי כממוצע ± סטיית תקן, n = 6 תאים בודדים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53659/53659fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53659/53659fig2.jpg" /> איור 2. סריג-BAS לוקליזציה לבנות בתאים חיים. תמונות מיקרוסקופ Confocal של תאי U2OS transfected עם CytoBAS () או NucleoBAS (B). שיתוף טראן תאים (C) U2OSsfected עם NucleoBAS וNTCP-mKate2. סרגל קנה המידה מייצג 10 מיקרומטר. (D - F) סדרת זמן של תאי transfected NucleoBAS-TGR5- T EPAC VV. (ד) GW4064 מפעיל FXR (יחס ננומטר עלה 525/450), אך לא TGR5. (ה) TCDCA מפעיל TGR5 על קרום הפלזמה (ירד 525/450 יחס ננומטר), אבל הוא לא הצליח להיכנס לתא כדי להפעיל FXR בגרעין. (F) CDCA מפעיל TGR5 על קרום הפלזמה, כמו גם FXR בגרעין (עלה 525/450 יחס ננומטר בגרעין, ירד בציטופלסמה). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53659/53659fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53659/53659fig3.jpg" /> איור 3. Cytometry הזרימה paramete gatingRS. שער P 1 בSSC-/ FSC-החלון () משמש כדי לא לכלול את התאים המתים. (ב) בFSC-H / FSC-חלון, שער P2 נמשך לחסל אירועי כפיל מניתוח. (ג) בסיטרין (525/20 ננומטר) / תכלת (450/40 ננומטר) חלון, NucleoBAS (וCytoBAS) תאים חיוביים נבחרים (שער P3). (ד) לבסוף, בסיטרין (525/20 ננומטר) / תכלת (450/40 ננומטר) חלון, שער P4 מכיל סיטרין / תאים תכלת-גבוהים של ניסוי FACS. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53659/53659fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53659/53659fig4.jpg" /> איור 4. ניסוי נציג FACS מדידת תחבורת חומצות מרה באמצעות NucleoBAS. ( </strong<html> &gt;, B) FACS-חלקות המציגות את כמות סיטרין / תאי U2OS () ותאי U2OS להביע NucleoBAS-חיים תכלת-גבוה, OSTαβ וNTCP (ב &#39;) לאחר NucleoBAS להביע שיתוף טיפול עם חיץ שליטה (משמאל), 30 מיקרומטר TCDCA (באמצע) או 10 מיקרומטר GW4064 (מימין). (C, D) אחוז מראה גרף בר של סיטרין / תאים תכלת-גבוהים לאחר דגירה 30 דקות עם TCDCA או GW4064 בתאי U2OS להביע NucleoBAS ושיתוף transfected עם (ד) או בלי OSTαβ (C) וNTCP. (E, F) היסטוגרמה המציגה את ההתפלגות של סיטרין / יחס תכלת באוכלוסייה של תאי U2OS להביע NucleoBAS עם או בלי OSTαβ וNTCP לאחר 30 דקות עם דגירה TCDCA (צהוב), GW4064 (אדום) או חיץ שליטה (כחול). כל התנאים נמדדו שלוש פעמים. ברים מייצגים + סטייה ממוצעת ערכים סטנדרטיים (SD) (n = 3).דף ttps: //www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53659/53659fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. קובץ נוסף 1:. כללי BAS תבנית <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53659/Supplemental_File_1._template_BAS_general.xls" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a> קובץ נוסף 2:. תבנית BAS Zeiss יקה מיובא נתונים <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53659/Supplemental_File_2._template_BAS_Zeiss_Leica_imported_data.xls" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor at JoVE.com

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

ניטור בזמן אמת של תאיים חומצות מרה Dynamics שימוש חומצות מרה חיישן מבוסס סריג גנטי מקודד

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

real-time-monitoring-intracellular-bile-acid-dynamics-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.8K Views.  Academic Medical Center. We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types. 

Video: Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

חיישן הולו Microneedle מבוסס על מרובב דרך העור אלקטרוכימי חישה

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

Cytometry המוני: פרוטוקול לכוונון יומי ודגימות תאים פועלים על Cytometer המוני CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for biological molecules became available in the past 15 years, some of which became indispensable tools that are used routinely in many laboratories.
One of the exciting applications of genetically encoded sensors is the use of these sensors in investigating cellular transport processes. Properties of transporters such as kinetics and substrate specificities can be investigated at a cellular level, providing possibilities for cell-type specific analyses of transport activities. In this article, we will demonstrate how transporter dynamics can be observed using genetically encoded glutamine sensor as an example. Experimental design, technical details of the experimental settings, and considerations for post-experimental analyses will be discussed.

This article will demonstrate how to monitor glutamine dynamics in live cells using FRET. Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. Experimental design, technical details of the experimental settings, and considerations for post-experimental analyses will be discussed for genetically encoded glutamine sensors.

גלוטמין שטף הדמיה באמצעות חיישני מקודדים גנטיים

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An oscillatory motion is generated at the focus of a 93-element and 4.5 MHz center frequency HIFU transducer by applying a 25 Hz amplitude-modulated signal using a function generator. A 64-element and 2.5 MHz imaging transducer with 68kPa peak pressure is confocally placed at the center of the HIFU transducer to acquire the radio-frequency (RF) channel data. In this protocol, real-time monitoring of thermal ablation using HIFU with an acoustic power of 7 W on canine livers in vitro is described. HIFU treatment is applied on the tissue during 2 min and the ablated region is imaged in real-time using diverging or plane wave imaging up to 1,000 frames/second. The matrix of RF channel data is multiplied by a sparse matrix for image reconstruction. The reconstructed field of view is of 90&#176; for diverging wave and 20 mm for plane wave imaging and the data are sampled at 80 MHz. The reconstruction is performed on a Graphical Processing Unit (GPU) in order to image in real-time at a 4.5 display frame rate. 1-D normalized cross-correlation of the reconstructed RF data is used to estimate axial displacements in the focal region. The magnitude of the peak-to-peak displacement at the focal depth decreases during the thermal ablation which denotes stiffening of the tissue due to the formation of a lesion. The displacement signal-to-noise ratio (SNRd) at the focal area for plane wave was 1.4 times higher than for diverging wave showing that plane wave imaging appears to produce better displacement maps quality for HMIFU than diverging wave imaging.

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound HIFU Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound HMIFU

This article describes real-time monitoring of HIFU ablation in canine liver with high frame rate ultrasound imaging using diverging and plane wave imaging. Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound is used to image the decrease of acoustic radiation force induced displacement in the ablated region.

ניטור של עצימות גבוהות בזמן אמת אולטרסאונד ממוקד (HIFU) אבלציה של<em&gt; במבחנה</em&gt; כבדי כלבי שימוש הרמוני Motion הדמיה לאולטראסאונד הממוקד (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

מדידת TCR-pMHC כריכה<em&gt; באתר</em&gt; באמצעות assay מיקרוסקופית המבוסס על סריג

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the pancreatic &#946;-cells. In addition, biomaterial particles, hydrogels, and scaffolds also provide a unique opportunity to administer sustained, controllable drug delivery to &#946;-cells in culture and in transplanted tissue models. These technologies allow the study of candidate &#946;-cell proliferation factors using intact islets and a translationally relevant system. Moreover, determining the effectiveness and feasibility of candidate factors for stimulating &#946;-cell proliferation in a culture system is critical before moving forward to in vivo models. Herein, we describe a method to co-culture intact mouse islets with biodegradable compound of interest (COI)-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres for the purpose of assessing the effects of sustained in situ release of mitogenic factors on &#946;-cell proliferation. This technique describes in detail how to generate PLGA microspheres containing a desired cargo using commercially available reagents. While the described technique uses recombinant human Connective tissue growth factor (rhCTGF) as an example, a wide variety of COI could readily be used. Additionally, this method utilizes 96-well plates to minimize the amount of reagents necessary to assess &#946;-cell proliferation. This protocol can be readily adapted to use alternative biomaterials and other endocrine cell characteristics such as cell survival and differentiation status.

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

מנהל מתמשך של mitogens β-cell כדי איי עכבר Intact<em&gt; Ex Vivo</em&gt; שימוש פוליפוני מתכלה (לקטית-שיתוף גליקולית וחומצה) מיקרוסכמות

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing termini of oligo- and polysaccharides, as well as its unique chemical characteristics, sialic acid is involved in a multitude of different receptor-ligand interactions. By modifying the expression of sialic acid on the cell surface, sialic acid-dependent interactions will consequently be influenced. This can be helpful to investigate sialic acid-dependent interactions and has the potential to influence certain diseases in a beneficial way. Via metabolic glycoengineering (MGE), the expression of sialic acid on the cell surface can be modulated. Herein, cells, tissues, or even entire animals are treated with C2-modified derivatives of N-acetylmannosamine (ManNAc). These amino sugars act as sialic acid precursor molecules and therefore are metabolized to the corresponding sialic acid species and expressed on glycoconjugates. Applying this method produces intriguing effects on various biological processes. For example, it can drastically reduce&#160;the expression of polysialic acid (polySia) in treated neuronal cells and thus affects neuronal growth and differentiation. Here, we show the chemical synthesis of two of the most common C2-modified N-acylmannosamine derivatives, N-propionylmannosamine (ManNProp) as well as N-butanoylmannosamine (ManNBut), and further show how these non-natural amino sugars can be applied in cell culture experiments. The expression of modified sialic acid species is quantified by high performance liquid chromatography (HPLC) and further analyzed via mass spectrometry. The effects on polysialic acid expression are elucidated via Western blot using a commercially available polysialic acid antibody.

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Sialic acid is a typical monosaccharide-unit found in glycoconjugates. It is involved in a plethora of molecular and cellular interactions. Here we present a method to modify cell surface sialic acid expression using metabolic glycoengineering with N-acetylmannosamine derivatives.

Glycoengineering מטבולית של חומצה Sialic באמצעות N-acyl השומן-שונה Mannosamines

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

פרוטוקול לצורך מעקב בזמן אמת 3D חלקיק יחיד

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

הכנה, טיהור, השימוש ליפוזומים המכילים חומצת שומן

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...