We thank Barbara Windschiegl for her help in establishing SOPs; Dennis Remme for his work on the NanoCalcFX software and Alina Kollmannsperger, Markus Braner and Milan Gerovac for helpful suggestions on the manuscript. The German-Israeli Project Cooperation (DIP) provided by the DFG and the Federal Ministry of Education and Research to R.T., as well as the Federal Ministry of Economics and Technology (ZIM R&amp;D Project) to R.T. and Nanospot GmbH supported this work.

<ol>
	<li>Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-target+network.">Drug-target network.</a> Nat Biotechnol. 25, 1119 (2007).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li><li>Osaki, T., Suzuki, H., Le Pioufle, B., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multichannel+simultaneous+measurements+of+single-molecule+translocation+in+&#945;-hemolysin+nanopore+array.">Multichannel simultaneous measurements of single-molecule translocation in &#945;-hemolysin nanopore array.</a> Anal. Chem. 81, 9866-9870 (2009).</li><li>Carrillo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+membrane+capacitance+measurements+for+studying+endocytosis+and+exocytosis+in+yeast.">High-resolution membrane capacitance measurements for studying endocytosis and exocytosis in yeast.</a> Traffic. , (2015).</li><li>Giacomini, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+transporters+in+drug+development.">Membrane transporters in drug development.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 9, 215-236 (2010).</li><li>Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+membrane+protein+inhibition+by+optical+ion+flux+in+a+droplet+interface+bilayer+array.">Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51, 3134-3138 (2012).</li><li>Zollmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+liposome+analysis+of+peptide+translocation+by+the+ABC+transporter+TAPL.">Single liposome analysis of peptide translocation by the ABC transporter TAPL.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 2046-2051 (2015).</li><li>Tamm, L. K., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+phospholipid+bilayers.">Supported phospholipid bilayers.</a> Biophys. J. 47, 105-113 (1985).</li><li>Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+membranes:+scientific+and+practical+applications.">Supported membranes: scientific and practical applications.</a> Science. 271, 43-48 (1996).</li><li>Castellana, E. T., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+supported+lipid+bilayers:+From+biophysical+studies+to+sensor+design.">Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design.</a> Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).</li><li>Wagner, M. L., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+polymer-supported+planar+lipid+bilayers+for+reconstitution+of+integral+membrane+proteins:+silane-polyethyleneglycol-lipid+as+a+cushion+and+covalent+linker.">Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker.</a> Biophys. J. 79, 1400-1414 (2000).</li><li>Naumann, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+polymer-supported+phospholipid+bilayer:+tethering+as+a+new+approach+to+substrate-membrane+stabilization.">The polymer-supported phospholipid bilayer: tethering as a new approach to substrate-membrane stabilization.</a> Biomacromolecules. 3, 27-35 (2002).</li><li>Weiskopf, D., Schmitt, E. K., Kl&#252;hr, M. H., Dertinger, S. K., Steinem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-BLMs+on+highly+ordered+porous+silicon+substrates:+Rupture+process+and+lateral+mobility.">Micro-BLMs on highly ordered porous silicon substrates: Rupture process and lateral mobility.</a> Langmuir. 23, 9134-9139 (2007).</li><li>Watanabe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrayed+lipid+bilayer+chambers+allow+single-molecule+analysis+of+membrane+transporter+activity.">Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity.</a> Nat. Commun. 5, (2014).</li><li>Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembled+Microarrays+of+Attoliter+Molecular+Vessels.">Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 115, 5738-5741 (2003).</li><li>Lohr, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Liposomes+Used+to+Study+the+Activity+of+Individual+Transporters.">Single Liposomes Used to Study the Activity of Individual Transporters.</a> Biophysical Journal. 106, 229a (2014).</li><li>Dunlop, J., Bowlby, M., Peri, R., Vasilyev, D., Arias, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+electrophysiology:+an+emerging+paradigm+for+ion-channel+screening+and+physiology.">High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and physiology.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 358-368 (2008).</li><li>Milligan, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robotic+multiwell+planar+patch-clamp+for+native+and+primary+mammalian+cells.">Robotic multiwell planar patch-clamp for native and primary mammalian cells.</a> Nat. Protoc. 4, 244-255 (2009).</li><li>Soga, N., Watanabe, R., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attolitre-sized+lipid+bilayer+chamber+array+for+rapid+detection+of+single+transporters.">Attolitre-sized lipid bilayer chamber array for rapid detection of single transporters.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li><li>Kleefen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+parallel+single+transport+recordings+on+nanopore+arrays.">Multiplexed parallel single transport recordings on nanopore arrays.</a> Nano Lett. 10, 5080-5087 (2010).</li><li>Wei, R., Gatterdam, V., Wieneke, R., Tamp&#233;, R., Rant, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+sensing+of+proteins+with+receptor-modified+solid-state+nanopores.">Stochastic sensing of proteins with receptor-modified solid-state nanopores.</a> Nat. Nanotechnol. 7, 257-263 (2012).</li><li>Urban, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+transport+recordings+on+a+membrane-on-nanopore+chip+at+single+molecule+resolution.">Highly parallel transport recordings on a membrane-on-nanopore chip at single molecule resolution.</a> Nano Lett. 14, 1674-1680 (2014).</li><li>Kusters, I., Van Oijen, A. M., Driessen, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-on-a-Chip:+Microstructured+Silicon/Silicon-Dioxide+Chips+for+High-Throughput+Screening+of+Membrane+Transport+and+Viral+Membrane+Fusion.">Membrane-on-a-Chip: Microstructured Silicon/Silicon-Dioxide Chips for High-Throughput Screening of Membrane Transport and Viral Membrane Fusion.</a> ACS Nano. 8, 3380-3392 (2014).</li><li>Hansen, J. S., Thompson, J. R., He&#769;lix-Nielsen, C., Malmstadt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+directed+intrinsic+membrane+protein+segregation.">Lipid directed intrinsic membrane protein segregation.</a> J. Am. Chem. Soc. 135, 17294-17297 (2013).</li><li>Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Micrometer-Sized+Free-Standing+Membranes.">Preparation of Micrometer-Sized Free-Standing Membranes.</a> ChemPhysChem. 12, 2568-2571 (2011).</li><li>Lazzara, T. D., Carnarius, C., Kocun, M., Janshoff, A., Steinem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+attoliter-sized+compartments+using+fluid+pore-spanning+lipid+bilayers.">Separating attoliter-sized compartments using fluid pore-spanning lipid bilayers.</a> ACS nano. 5, 6935-6944 (2011).</li><li>Winterhalter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Black+lipid+membranes.">Black lipid membranes.</a> Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 5, 250-255 (2000).</li><li>Ko&#231;er, A., Walko, M., Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+utilization+of+reversible+and+irreversible+light-activated+nanovalves+derived+from+the+channel+protein+MscL.">Synthesis and utilization of reversible and irreversible light-activated nanovalves derived from the channel protein MscL.</a> Nat. Protoc. 2, 1426-1437 (2007).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

הטכניקה המוצגת כאן מאפשרת בדיקה מקבילה מאוד תחבורת חלבון הממברנה. מערכות חלבון הממברנה מחדש ניתן ליישם ישירות biochip, מה שהופך את ההתאמה של תיאורטית כל טרנספורטר קרום או ערוץ אפשרי. ניתוח תחבורה מוגבל רק על ידי הקמת מערכת לקריאה החוצה פלורסנט, בין אם באמצעות שינוי קרינה ישיר (טרנסלוקציה של fluorophores או מצעים שכותרתו fluorescently) או שינוי קרינה עקיף (צבעים-רגיש pH, תגובות אנזימטיות משניות). השני, לעומת זאת עדיין לא נקבע, הוקמה. אפיון פונקציונלי של ערוצי קרום או מובילים על רמת החלבון היחידה הוא המוקד העיקרי של טכניקה זו. בשילוב עם מיקרוסקופ אוטומטי, הקמת יישומי הקרנה עבור effectors חלבון היא גם אפשרית. ההתקנה assay מאפשר הקלטה במקביל ועד 8 שבבי, עם נקודות assay מרובות על כל שבב. בגלל הפרדה מוחלטת של שבבי, שהוא מקביל באמת, המאפשר חזרות הניסוי מרובים לרבות בקרות בטווח אחת ניסיוני, ברגע שהתנאים הוקמו. צעדים קריטיים במהלך בהגדרת ניסוי הם ההכנה של שלפוחית ​​unilamellar באמת, הכינון מחדש הפעיל של החלבון של בחירה, הפצת יעילות של proteoliposomes על פני השבב ואת יכולת השמירה של bilayer השומנים המושעים כלפי המצעים בשימוש assay. בעוד הכנת שלפוחית ​​unilamellar היא בעלת חשיבות בסיסית עבור assay זה כדי למנוע את הקמתה של גליונות קרום multilamellar על פני השבב במהלך היווצרות bilayer השומנים מושעה, זה די קל להבטיח unilamellarity של שלפוחית ​​באמצעות sonicating ליפוזומים במהלך ההכנה. היישום הישיר של proteoliposomes הוא הקידום הגדול של presente השיטהד. בניגוד לגישות קודמות יותר מורכבים ורלוונטיים רפואי חלבונים יכולים עכשיו להיות ממוקדים, מחייב כמובן ההקמה מראש של פרוטוקול כינון מחדש מניב חלבון פונקציונלי בחירה חביבה. בנוסף, חלבונים בממברנה בעל תחומים חוץ-קרום גדולים להקטין את היווצרות SSMS נכונה. כך זה צריך להיות מותאם עבור כל חלבון חדש, למשל על ידי שינוי הריכוז 2 CaCl. יחס הכינון מחדש של החלבון של עניין צריך להיות שנבחר בקפידה. ניתוח אירועי חלבון יחידים הוא רצוי ואת מטרות משנה באמצעות הטכניקה הציגה כאן. כמות החלבון מחדש ולכן צריכה לא תעלה על 1-2 יחידות חלבון פונקציונליות לכל תיקון קרום פורש הנקבובי בהנחת כינון מחדש אידיאלי וכי חלבון הממברנה מופץ stochastically ברחבי bilayer. בנוסף את הכיווניות של חלבון לאחר הכינון מחדש צריך גם לזכור, שכן יש not להיות שווה בין שניהם directionalities. לבסוף פעם כל הנושאים הללו נבדקים בקפידה אופטימיזציה, אף אחד המצעים בשימוש עשוי להציג שום חדירות הממברנה נוקבות של הקרום פורש הנקבובי. fluorophores בעלי מטען חשמלי חיובי, כמו רוב הצבעים מבוססים rhodamine במשטר ספקטרלי אדום נוטה להתגבר על מחסום הקרום במהירות. אינטראקציות הידרופוביות חזקות יכולות גם להוביל קובץ מצורף נוקב כדי bilayer השומנים. שני המאפיינים אינם רצויים. המחקר של תעלות יונים באופן איכותי הוא גם להעלות על הדעת. הקרנה עבור effectors ערוץ באמצעות בינארי כן / לא readout יכול להיחשב באמצעות צבעי יון רגיש. המכשול הגדול ביותר כאן יהיה ההקמה חלקית לפחות bilayer שומנים השומרים על יון. זה עשוי להיות בר השגה רק באמצעות שינוי פני שטח של שבב nanopore.

הניתוח של חלבונים בממברנה הפך של הגדלת ריבית למחקר בסיס תרופות ב -20 השנים האחרונות. פיתוח תרופות חדישות תלוי בזיהוי ואפיון מפורט של מטרות חדשות, כיום להיות אחד הגורמים המגבילים. העובדה כי כ -60% מכלל מטרות התרופה הם חלבונים בממברנה 1, הופכת את הפיתוח של טכניקות על מנת להבהיר את תפקידם החשוב ביותר. בעבר, טכניקות לחקר ערוצי מובילי electrogenic פותחו שפע 2 - 4. מצעים ללא electrogenic בניגוד להציג משימה מאתגרת יותר. הם לעומת זאת עניין מיוחד, שכן מטרות תרופת ממשלה, כפי שהם שולטים השטף של מומסים וחומרים מזינים על פני קרום התא ותפקוד כקולטנים מפתח איתות מפלים 5. מאמץ ניכר כבר הכניסו לתוך הפיתוח של techniques ללמוד את תפקודם של חלבונים תחבורה הממברנה 6, 7. מערכות המשתמשות ממברנות מוצקות נתמך צמחו ככלים מבטיחים ביותר בתחום זה 8 - 10, כולל bilayers שומנים המוצק נתמך, bilayers הקשור 11, 12, ממברנות שומנים בדם microblack 13, 14 ו מערכי שלפוחית ​​יליד 15, 16 עד כמה שם. חלקם אפילו זמינים כמו setups המסחרי 17, 18. כמה דוגמאות פורסמו שילוב היכולת ללמוד חלבונים בממברנה יחידים באופן מקביל מאוד 14, 19, תנאים הכרחי עבור יישומי הקרנה. עם זאת, שיטות אלו לעתים נדירות לגשר בין מחקר בסיסי כדי הסביבה התעשייתית. הקשיים בדרך כלל לשכב היכולת של המערכת להיות automatable, ייצור אינטנסיבי בעלות ו / או הכנה מפרכת. גישה o<html> vercoming כל המכשולים הנ&quot;ל הוא המטרה הסופית. הטכניקה המוצגת כאן פותחה ללמוד ערוצי קרום מובילים במבחנה בסביבה מבוקרת על רמת החלבון היחידה 20 - 22. כינון של חלבונים בממברנה מטוהר אל חביבי מוקם יותר הרבה יותר מאשר גישות דומות עבור GUVs 23 - 26 או שומנים שחורים ממברנות 27. הם יכולים להיות מיושמים ישירות אל פני שטח השבב, שם היווצרות bilayer מתקיימת באמצעות תהליך הרכבה עצמית. עיצוב הזכוכית התחתונה של שבב nanoporous (איור. 1) מאפשר מיקרוסקופיה אוויר, המאפשרת האוטומציה הפשוטה של המערכת. בשילוב עם במה ממונעת שבבי מרובים ניתן למדוד בו זמנית, עם כל שדה הראייה המכילה אלף חללים אטומים לניתוח. = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53373/53373fig1.jpg" /> איור 1. עיצוב של biochips nanopore המרובב. א) סיליקון על מבודד (SOI) רקיק בנוי על ידי תחריט תגובתי-יון. כ 1,150 צ &#39;יפס פרט מיוצר מ כל רקיק עם מאפיינים זהים ואיכות. B) כל שבב מורכב 250,000 microcavities פרט עם פתחי ננו. סרגל קנה מידה:. 200 מיקרומטר C) חלל כל למיעון דרך-אאוט לקרוא קרינה רבה-ספקטרלי. בלוקי שכבה העליונים intransparent אותות הניאון ממאגר החיץ, מה שהופכים את biochip תואם מיקרוסקופי פלואורסצנטי הפוכים. D) במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הדמיה חושפת מסודר באופן שווה פתחים נקבוביים וחספוס פני שטח של שכבת תחמוצת סיליקון של 3.6 ננומטר (n = 40) אופטימלי איחוי שלפוחית. סרגל קנה מידה:. 5 מיקרומטר E) מיקרופון אלקטרונים סורקroscopy (SEM) התמונה מראה חתך דרך nanopore המאפשר גישה החללים femtoliter בתוך שבב סיליקון. נתון זה נעשה שימוש חוזר באישור 21. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53373/53373fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> כל ניתוח הנתונים מתבצע באמצעות תוכנה חופשית על מנת להבטיח גישה חופשית עבור משתמשי קצה. סדרת זמן מנותחת באמצעות תוכנת עיבוד תמונה חינם תוכנת ניתוח עקום לבנות מותאם אישית עיבוד יצווה המאפשר וקורלציה פשוטה של ​​מערכי נתונים גדולים עם ערוצים ואלף פלורסנט מרובים של עקומות. חלבון המודל להשתמש בפרוטוקול זה הוא ערוץ mechanosensitive של מוליכות גדולות (MscL) ערוץ חלבון נגזר E. coli. הוא מתפקד כשסתום לשחרור הלם אוסמוטי בטבע, אך הוא היה שונה בצורה כזאת כי תוכננה באופן רציונלי syntפונקציות hetic ניתן לחבר קוולנטית לצד התכווצות ערוצים. ויה-הדחייה ממונית על המפעיל המחויב קוולנטית (MTSET) בערוץ מופעל לפתוח, יצירה-שסתום ננו. מולקולות קטנות כמו יונים, מים, חלבונים קטנים, אך גם fluorophores הקטן יכולות לחלחל דרך הערוץ. הנה, החלבון משמש כמודל כדי להדגים את היכולת של המערכת לזהות טרנסלוקציה חלבון בתיווך.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[2-(Trimethylammonium)ethyl]&lt;br/&gt; methanethiosulfonate</td><td>Toronto Research Chemicals Inc.</td><td>T792900</td><td>MTSET; hydrolized by water. Keep as dry pouder aliquot at -80 &amp;deg;C. Use immediately (30 minutes) after solubilization in buffer.</td></tr><tr><td>1 ml gas-tight syringe</td><td>Hamilton</td><td>#1001</td><td></td></tr><tr><td>10 ml round flask</td><td>Schott Duran</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.7 mm glas beads</td><td>Roth</td><td>N032.1</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanole</td><td>Roth</td><td>9866.5</td><td></td></tr><tr><td>30 cm Luer-Lock Extension Tube</td><td>Sarstedt</td><td>744304</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Roth</td><td>5025.5</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2 Adsorbent</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td>need to be activated before first use</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;Dihydrat</td><td>Roth</td><td>HN04.3</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma</td><td>C0875</td><td>store dark at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Chloroform reagent grade</td><td>VWR Chemicals</td><td>22711324</td><td></td></tr><tr><td>DOPE&lt;sup&gt;ATTO390&lt;/sup&gt;</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 390-165</td><td>store dark at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Ethanol absolute</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205</td><td></td></tr><tr><td>Injekt Single-use syringe</td><td>Braun</td><td>460 60 51V</td><td></td></tr><tr><td>Injekt-F single-use syringe</td><td>Braun</td><td>91 66 017V</td><td></td></tr><tr><td>Keck clips</td><td>Schott</td><td>KC29</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-Phosphatidylcholine, 20% (Soy)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>5416016</td><td>store under inert gas at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>NaCl 99.5% p.a.</td><td>Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>Nanopore E100 wafer/chips</td><td>Micromotive (Mainz/Germany)</td><td></td><td>available on request</td></tr><tr><td>Nucleopore Track-Etch Membrane 0.4 &amp;micro;m</td><td>Whatman</td><td>800282</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green Dextran 488 (70 kDa)</td><td>life Technologies</td><td>D-7173</td><td>store dark at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Oy647</td><td>Luminartis (M&amp;uuml;nster/Germany)</td><td>OY-647-T-1mg</td><td>store dark at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Rotilabo-syringe filtration, unsterile, pore-size 0.22 &amp;micro;m</td><td>Roth</td><td>P 818.1</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5080</td><td>column material for size exclusion chromatography</td></tr><tr><td>Silastic MDX4-4210</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>curing agent for chip fixation onto cover glass support</td></tr><tr><td>sticky-Slide 8-well</td><td>ibidi</td><td>80828</td><td>multi-well chamber for the mounting onto glass slides (chip holder)</td></tr><tr><td>Three-way stopcock blue</td><td>Sarstedt</td><td>744410001</td><td></td></tr><tr><td>Tris Pufferan 99.9% Ultra Quality</td><td>Roth</td><td>5429.2</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Roth</td><td>6683.1</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 0.2 &amp;micro;m cellulose nitrate membrane filter</td><td>Roth</td><td>NH69.1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&amp;uuml;chi 461 water bath</td><td>B&amp;uuml;chi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&amp;uuml;chi Rotavapor RE 111</td><td>B&amp;uuml;chi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cary Eclipse Fluorescence Spectrophtometer&amp;nbsp;</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiposoFast Mini Extruder</td><td>Avestin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrane pump&amp;nbsp;</td><td>Vaccubrand</td><td>15430</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight Nanoparticle Tracking Microscope</td><td>Malvern / Nanosight</td><td>LM 14C</td><td></td></tr><tr><td>NyONE microscope</td><td>Synentec</td><td></td><td>available on request</td></tr><tr><td>Pump control</td><td>Vaccubrand</td><td>CVC 2II</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator bath Sonorex RK100H</td><td>Brandelin electronic</td><td>31200001107477</td><td></td></tr><tr><td>Vaccum pump RC5</td><td>Vaccubrand</td><td>1805400204</td><td></td></tr><tr><td>Water bath W13</td><td>Haake</td><td>002-9910</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Cleaner PDC-37G</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-37G</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Open Source</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td>scientific image processing software</td></tr><tr><td>NanoCalcFX</td><td>Freeware</td><td>http://sourceforge.net/projects/nanocalc/</td><td>data analysis/evaluation software for massive transport kinetic datasets</td></tr><tr><td>NTA 2.3 Analytical Software</td><td>Nanosight</td><td></td><td>data acquisition and analysis software for nanoparticle tracking microscope</td></tr><tr><td>NTA 2.3 Temperature Comms</td><td>Nanosight</td><td></td><td>temperature controle software for nanoparticle tracking microscope</td></tr></tbody></table>

membrane transport processes analyzed by a highly parallel nanopore chip system at single protein resolution

תחבורת חלבון ממברנה על רמת החלבון היחידה עדיין מתחמקת ניתוח מפורט, אם המצע translocated הוא בלתי electrogenic. מאמצים רבים נעשו בתחום זה, אך טכניקות המאפשרות ניתוח תחבורת תפוקה גבוהה אוטומטי בשילוב עם טכניקות bilayer שומנים ממסות ללא נדרשו לניתוח של מובילי הממברנה הן נדירות. מחלקה זו של מובילי אולם הוא מכריע הומאוסטזיס התא ולכן יעד מרכזי בפיתוח תרופות ומתודולוגיות כדי לקבל תובנות חדשות זקוקה נואשות. כתב היד המוצג כאן מתארת ​​את ההקמה וטיפול של biochip רומן לניתוח תהליכי הובלה בתיווך חלבון הממברנה ברזולוציה טרנספורטר יחידה. Biochip מורכב microcavities המוקפת nanopores כי הוא מקביל מאוד בעיצובו יכול להיות יוצר כיתה תעשייתית וכמות. ליפוזומים-מחסה חלבון ניתן ליישם ישירותפני שטח השבב להרכיב bilayers שומנים נקבובי פורש עצמי התאסף באמצעות SSM-טכניקות (נתמכים מוצק ממברנות שומנים בדם). נקבובי פורש חלקים של הממברנה הם בודדים, מתן הממשק עבור טרנסלוקציה מצע לתוך או מתוך שטח החלל, אשר יכול להיות מלווה הודעת פלורסנט רב-ספקטרלי בזמן אמת. הקמת נהלי עבודה סטנדרטיות (SOPs) מאפשרת הקמה הפשוטה של ​​bilayers שומנים מחסה חלבון על פני השבב של כמעט כל חלבון הממברנה כי יינתן מחדש מבחינה תפקודית. תנאי היחיד הוא הקמת מערכת לקריאה החוצה פלורסנט מצעי תחבורה שאינו electrogenic. ביצועי תוכן יישומי הקרנה הם מטרות משנים על ידי שימוש מיקרוסקופי פלואורסצנטי הפוכים אוטומטיים הקלטה שבבית מרובה במקביל. ערכות נתונים גדולות ניתן לנתח באמצעות תוכנת ניתוח האישית מעוצב הזמינה באופן חופשי. שלושה צבעים ניאון ספקטרלי רבלקריאה החוצה יתר על כן מאפשרת אפלית נתונים משוחדת למעמדות אירוע אחרות, ביטול תוצאות חיוביות כוזבות. טכנולוגית השבב מבוססת כיום על משטחי SiO 2, אבל functionalization נוסף באמצעות משטחי שבב מצופה זהב הוא גם אפשרי.

ממברנות נקבוביות פורש ניתן ליצור בקלות על פני שבב nanostructured באופן עצמי התאסף. אולם תהליך הבסיסית היא עדיין עדין המושפע מפרמטרים רבים כמו גודל liposome, monodispersity של האוכלוסייה liposome, lamellarity, lipid- ומלח-הריכוז ועל התכונות הכימיות השטח. רוב הפרמטרים אלו מתאפיינים בזהירות טופלה בפרוטוקול לעיל. פרמטרים אחרים אולם צריך להיבדק במהלך כל הכנות חדשות, על מנת להבטיח בניסוי מוצלח. אלו הם התפלגות גודל liposome והאוכלוסייה dispersity (איור. 2 א). עבור היווצרות קרום פורש נקבובית אופטימלית כדי למנוע חדירת liposome לתוך בגדלי liposome שטח החלל הרבה מעל הקוטר הנקבובי הם הכרח. יתר על כן, ההכנות ליפוזום monodisperse הוכחו להניב את התוצאות הטובות ביותר בקרום מתפשט Fusiעַל. עוד צעד קריטי כי יש להיבדק על כל הכנה הוא פעילות חלבון לאחר כינון מחדש. באמצעות assay dequenching-הקרינה עבור ליפוזומים מחדש עם MscL G 22 C, פתיחת ערוץ יכול להיות פיקוח באמצעות ספקטרוסקופיית הקרינה, מתן יחס של ליפוזומים מחסה MscL G 22 C חלבון פעיל (איור. 2 B). לאחר להתפשט אל פני השטח שבב, טרנסלוקציה המומס של יעד פלורסנט ידי MscL G 22 C באקטיבציה ליגנד ניתן בעקבות (איור. 3 ב). MscL G 22 C ערוצי מהונדסים סגורים במצב ברירת המחדל שלהם, כולא מולקולות ניאון קטנות בתוך שטח החלל. על ידי תוספת של MTSET אפנן כימיים מטענים חיוביים מתוודעים באזור ההתכווצות שלהנקבובית C MscL G 22, דוחף אותה פתוחה באמצעות דחייה אלקטרוסטטית. Fluorophore בפח לפני מתחמק שטח החלל כדי להשיג שיווי משקל דיפוזיה. הירידה הבאה של קרינה בתוך שטח החלל יכולה להיות פיקוח. תהליך זה הוא מאוד לשחזור, וכתוצאה מכך אוכלוסייה הומוגנית של אירועים בזרימה (האיור. 3 ג). עקומות בזרימת וכתוצאה אשכול בשתי אוכלוסיות נפרדות, הוכחת היכולת של assay להפלות בין אירועים טרנסלוקציה יחיד ו רב (איור. 3 D). יתר על כן המערכת מסוגלת לעקוב עד שלושה צבעים ספקטרלית מופרדים היטב במקביל בזמן אמת, מה שמאפשר להקליט הקרנות גבוהה תוכן ולהפלות בדיוק ואובייקטיבי בין חיובית, תוצאות חיוביות ושליליות שווא. במחקר זה 9.046 חללים אטומים נותחו, מתוכם 8% מוצג efflהתנהגות UX. פריסת הערוצים לקריאה החוצה ניאון השונה, אירועים יכולים להיות מופלים לתוך אירועי monoexponential בזרימה, קינטיקה מורכב, חדירות שומנים וקרעי קרום (איור. 3 E). רק אירועים המציגים אותות יציבים המומס המלא לצבוע קרום נחשבים לניתוח סופי. קינטיקה קומפלקס מייצגי אירועים בזרימה עם אותות בקרה יציבים ולכן מושמטים. חדירות ליפידים וקרעים הממברנה הם אירועים חפצים מיסודם המתרחשים באמצעות מערכות bilayer שומנים פורשים נקבוביות. הם יכולים להיות מושלך באמצעות אותות צבע מלאה כאמור לעיל (איור. 4). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53373/53373fig2.jpg" /> איור 2. גודל חלוקת proteoliposomes ו MscL הפונקציה. א) שלפוחית ​​היו analyz<html> אד על ידי ניתוח מעקב ננו-חלקיקים. דגימות LUV נבדקו לפני (זכר שחור) ואחרי הכינון מחדש של MscL G 22 C (זכר אדום). לאחר הכנת LUV, גודל חלקיקים ממוצע של 214 ± 70 ננומטר מושג. הגודל הוא ירד במהלך כינון מחדש, וכתוצאה מכך proteoliposomes של 158 ± 60 ננומטר בגודל. ב) פעילות MscL קבל תוקף לאחר כינון מחדש על ידי assay בזרימה. 28 calcein עצמי רווה משתחררת proteoliposomes דרך פתח בתיווך MTSET של ערוץ MscL, מוביל dequenching של fluorophore (אדום) ואת גידול מהיר של עוצמת הקרינה. ליפוזומים בלי חלבונים מראה בזרימה כזה, אפילו לאחר תוספת MTSET חזר (שחורה). solubilization דטרגנט הציג לאחר (TX-100) של מהדורות ליפוזומים כל כמוס בעבר לצבוע. נתון זה נעשה שימוש חוזר באישור 21.et = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53373/53373fig3.jpg" /> איור 3. ליגנד מגודרת טרנסלוקציה המומס על ידי MscL ברמה מולקולה בודדת. א) Engineered MscL G 22 ערוצי C סגורות במצב ברירת המחדל שלהם. מומסים קטנים כגון fluorophore מצליחים לעבור לא דרך הערוץ ולא bilayer השומנים. עם התוספת של MTSET, גידול ציסטאין יחיד מהונדס של כל protomer MscL G 22 C מקבל שונה, מציג מטענים חיוביים מרובים בצד ההתכווצות של מתחם ערוץ pentameric. ערוץ MscL G 22 C נדחף פתוח על ידי דחיית תשלום לצבוע בפח יכול לפזר מתוך החלל, מה שמוביל לירידה בעוצמת קרינה. B) Tiלי עקבות של פתיחת MscL G 22 C על תוספת של MTSET. Proteoliposomes המכיל מחדש מבחינה תפקודית MscL G 22 C פוזרו על פני השבב. Oy647 (אדום) היה לכוד בתוך החללים כמו מצע טרנסלוקציה. OregonGreen Dextran (70 kDa, ירוק) נוסף כמו מצע שליטה בלתי חדירה ערוץ לפקח על סגוליות המצע של אירוע ההעברה וכן את שלמות הממברנה במהלך הניסוי. חביבים נוספו עם DOPE ATTO 390 (0.1% mol; סגולים) כדי לבדוק זיהום שומנים בתוך חללים. תוספת של MTSET (3 מ&quot;מ סופי) בזמן t = 0 שניות פותחת את הערוץ, מה שמוביל בזרימת Oy647 מהנקבובית, הוקלטה באמצעות לקריאה החוצה קרינה. C) אקראי הרי MscL G 22 עקומות בזרימת C להפגין אירועים בזרימה טיפוסיים. D) שיעור קבועים לאירועי טרנסלוקציה (n = 242) אשכול לשתי אוכלוסייה גאוסהים, הוכחה כי אירועי תחבורה יחידים ו מרובי ערוצים עלולים להיות מופלים. E) גבוהה הקרנת תוכן וניתוח סטטיסטי של 9046 חללי שבב אטומים עם תצוגה משולש בזמן אמת צבע. 8% מכלל חללי השבב נתחו להראות אירועים בזרימת מעריכים. בשל פענוח ספקטרלי (אדום: מומס translocated; ירוקה: המומס שליטה; סגול: שומנים בדם), אירועים בזרימה, קינטיקה מורכב, חדירות שומנים, וקרעים הממברנה יכול להיות מופלה, ובכך ביטול תוצאות חיוביות שגוי. נתון זה נעשה שימוש חוזר באישור 21. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53373/53373fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53373/53373fig4.jpg" /> איור 4. כיתות אירוע מכובד על ידי זיהוי שלושה צבעים. מומס translocated (אדום), לניהול עבודותמומס l (ירוק) לבין צבע שומנים (סגול) יכולים להיות מופלה ספקטרלית המאפשרים מבחר נתונים משוחד. א) חללים אטומים מחסה לא חלבון קרום להראות נקבעו אירועי שטף תחת תנאי הניסוי המתואר עבור ערוץ MscL הקלטה (ראה איור. 3A) . את הודעת הניאון היא יציבה עבור כל הערוצים. B) מעורפלת bilayers שומנים מושעים הם סקרניים החלל. ג) תוצאות הקרע בממברנה bilayer שומנים הרציפים פורשו את סדקי nanopore. ובכך, שטח החלל לא מופרד יותר מתא החיץ. צבעים בפח (אדום) להתחמק החלל במורד מפל הריכוזים. המומס המלא (הירוק), בעבר מסוגל לעבור דרך הממברנה, נכנס החלל. D) הדוגמא לאירוע חדירת שומנים. בעוד אות הניאון עבור לצבוע שומנים (הסגול) מגדילה בשל הקרום פולש בחלל החלל, מומס טרנסלוקציה הוא pusheד מתוך החלל (אדום), אשר הביאו לקיטון ב אות ניאון. Nanopore על חסום על ידי bilayer השומנים בדם, מניעת המעבר של המצע המלא (הירוקה). E) במהלך קרע בקרום, מומס התחבורה הסגורה מתחמק במהירות המחלל (אדום), ואילו המומס המלא מפזר ב (ירוק). נתון זה נעשה שימוש חוזר באישור 21. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53373/53373fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution at JoVE.com

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

The presented protocol describes the analysis of membrane protein mediated transport on the single transporter level using pore-spanning solvent-free lipid bilayers. This is achieved by the creation of bulk produced nanopore array chips, combined with highly parallel data acquisition and analysis, enabling the future establishment of membrane protein effector screenings.

תחבורת ממברנה תהליכים נותחה על ידי מערכת שבב nanopore מקבילה מאוד ברזולוצית חלבון יחידה

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

membrane-transport-processes-analyzed-highly-parallel-nanopore-chip

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K Views.  Goethe University Frankfurt. The presented protocol describes the analysis of membrane protein mediated transport on the single transporter level using pore-spanning solvent-free lipid bilayers. This is achieved by the creation of bulk produced nanopore array chips, combined with highly parallel data acquisition and analysis, enabling the future establishment of membrane protein effector screenings.

Video: Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Biochemistry

Fine-tuning the Size and Minimizing the Noise of Solid-state Nanopores

Solid-state nanopores have emerged as a versatile tool for the characterization of single biomolecules such as nucleic acids and proteins1. However, the creation of a nanopore in a thin insulating membrane remains challenging. Fabrication methods involving specialized focused electron beam systems can produce well-defined nanopores, but yield of reliable and low-noise nanopores in commercially available membranes remains low2,3 and size control is nontrivial4,5. Here, the application of high electric fields to fine-tune the size of the nanopore while ensuring optimal low-noise performance is demonstrated. These short pulses of high electric field are used to produce a pristine electrical signal and allow for enlarging of nanopores with subnanometer precision upon prolonged exposure. This method is performed in situ in an aqueous environment using standard laboratory equipment, improving the yield and reproducibility of solid-state nanopore fabrication.

A methodology for preparing solid-state nanopores in solution for biomolecular translocation experiments is presented. By applying short pulses of high electric fields, the nanopore diameter can be controllably enlarged with subnanometer precision and its electrical noise characteristics significantly improved. This procedure is performed in situ using standard laboratory equipment under experimental conditions.

כיוון עדין גודל ומזעור הרעש של מצב המוצק Nanopores

Solid-state nanopores have emerged as a versatile tool for the characterization of single biomolecules such as nucleic acids and proteins1. However, the ...

Engineering

Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores

Solid-state nanopores have been used to perform measurements at the single-molecule level to examine the local structure and flexibility of nucleic acids 1-6, the unfolding of proteins 7, and binding affinity of different ligands 8. By coupling these nanopores to the resistive-pulse technique 9-12, such measurements can be done under a wide variety of conditions and without the need for labeling 3. In the resistive-pulse technique, an ionic salt solution is introduced on both sides of the nanopore. Therefore, ions are driven from one side of the chamber to the other by an applied transmembrane potential, resulting in a steady current. The partitioning of an analyte into the nanopore causes a well-defined deflection in this current, which can be analyzed to extract single-molecule information. Using this technique, the adsorption of single proteins to the nanopore walls can be monitored under a wide range of conditions 13. Protein adsorption is growing in importance, because as microfluidic devices shrink in size, the interaction of these systems with single proteins becomes a concern. This protocol describes a rapid assay for protein binding to nitride films, which can readily be extended to other thin films amenable to nanopore drilling, or to functionalized nitride surfaces. A variety of proteins may be explored under a wide range of solutions and denaturing conditions. Additionally, this protocol may be used to explore more basic problems using nanopore spectroscopy.

A method of using solid-state nanopores to monitor the non-specific adsorption of proteins onto an inorganic surface is described. The method employs the resistive-pulse principle, allowing for the adsorption to be probed in real-time and at the single-molecule level. Because the process of single protein adsorption is far from equilibrium, we propose the employment of parallel arrays of synthetic nanopores, enabling for the quantitative determination of the apparent first-order reaction rate constant of protein adsorption as well as and the Langmuir adsorption constant.

חלבון ניטור ספיחה עם מצב מוצק nanopores

Solid-state nanopores have been used to perform measurements at the single-molecule level to examine the local structure and flexibility of nucleic acids ...

Bioengineering

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used for ATP production. The amphiphilic nature of membrane proteins requires particular attention to their handling, and reconstitution into the natural lipid environment is indispensable when studying membrane transport processes like proton translocation. Here, we detail a method that has been used for the investigation of the proton-pumping mechanism of membrane redox enzymes, taking cytochrome bo3 from Escherichia coli as an example. A combination of electrochemistry and fluorescence microscopy is used to control the redox state of the quinone pool and monitor pH changes in the lumen. Due to the spatial resolution of fluorescent microscopy, hundreds of liposomes can be measured simultaneously while the enzyme content can be scaled down to a single enzyme or transporter per liposome. The respective single enzyme analysis can reveal patterns in the enzyme functional dynamics that might be otherwise hidden by the behavior of the whole population. We include a description of a script for automated image analysis.

Here, we present a protocol to study the molecular mechanism of proton translocation across lipid membranes of single liposomes, using cytochrome bo3 as an example. Combining electrochemistry and fluorescence microscopy, pH changes in the lumen of single vesicles, containing single or multiple enzyme, can be detected and analyzed individually.

ליפוזום יחיד מדידות לצורך המחקר של משאבות פרוטונים אנזימים ממברנה בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי אלקטרוכימיה

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

High Resolution Physical Characterization of Single Metallic Nanoparticles

Individual molecules can be detected and characterized by measuring the degree by which they reduce the ionic current flowing through a single nanometer-scale pore. The signal is characteristic of the molecule&#39;s physicochemical properties and its interactions with the pore. We demonstrate that the nanopore formed by the bacterial protein exotoxin Staphylococcus aureus alpha hemolysin (&#945;HL) can detect polyoxometalates (POMs, anionic metal oxygen clusters), at the single molecule limit. Moreover, multiple degradation products of 12-phosphotungstic acid POM (PTA, H3PW12O40) in solution are simultaneously measured. The single molecule sensitivity of the nanopore method allows for POMs to be characterized at significantly lower concentrations than required for nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. This technique could serve as a new tool for chemists to study the molecular properties of polyoxometalates or other metallic clusters, to better understand POM synthetic processes, and possibly improve their yield. Hypothetically, the location of a given atom, or the rotation of a fragment in the molecule, and the metal oxidation state could be investigated with this method. In addition, this new technique has the advantage of allowing the real-time monitoring of molecules in solution.&#160;

Here, we present a protocol to detect discrete metal oxygen clusters, polyoxometalates (POMs), at the single molecule limit using a biological nanopore-based electronic platform. The method provides a complementary approach to traditional analytical chemistry tools used in the study of these molecules.

אפיון פיסי ברזולוציה גבוהה של חלקיקים מתכתיים בודדים

Individual molecules can be detected and characterized by measuring the degree by which they reduce the ionic current flowing through a single ...

Chemistry

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

A Closed-Type Wireless Nanopore Electrode for Analyzing Single Nanoparticles

Measuring the intrinsic features of single nanoparticles by nanoelectrochemistry holds deep fundamental importance and has potential impacts in nanoscience. However, electrochemically analyzing single nanoparticles is challenging, as the sensing nanointerface is uncontrollable. To address this challenge, we describe here the fabrication and characterization of a closed-type wireless nanopore electrode (WNE) that exhibits a highly controllable morphology and outstanding reproducibility. The facile fabrication of WNE enables the preparation of well-defined nanoelectrodes in a general chemistry laboratory without the use of a clean room and expensive equipment. One application of a 30 nm closed-type WNE in analysis of single gold nanoparticles in the mixture is also highlighted, which shows a high current resolution of 0.6 pA and high temporal resolution of 0.01 ms. Accompanied by their excellent morphology and small diameters, more potential applications of closed-type WNEs can be expanded from nanoparticle characterization to single molecule/ion detection and single-cell probing.

Here, we present a protocol for fabrication of a closed-type wireless nanopore electrode and subsequent electrochemical measurement of single nanoparticle collisions.

אלקטרודה Nanopore אלחוטית מסוג סגור לניתוח חלקיקים יחיד

Measuring the intrinsic features of single nanoparticles by nanoelectrochemistry holds deep fundamental importance and has potential impacts in ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. This method combines expression of proteins tagged with the fluorescent non-canonical amino acid ANAP, and FRET between ANAP and fluorescent (trinitrophenyl) nucleotide derivatives. We present examples of nucleotide binding to ANAP-tagged KATP ion channels measured in unroofed plasma membranes and excised, inside-out membrane patches under voltage clamp. The latter allows for simultaneous measurements of ligand binding and channel current, a direct readout of protein function. Data treatment and analysis are discussed extensively, along with potential pitfalls and artefacts. This method provides rich mechanistic insights into the ligand-dependent gating of KATP channels and can readily be adapted to the study of other nucleotide-regulated proteins or any receptor for which a suitable fluorescent ligand can be identified.

This protocol presents a method for measuring adenine nucleotide binding to receptors in real time in a cellular environment. Binding is measured as F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between trinitrophenyl nucleotide derivatives and protein labeled with a non-canonical, fluorescent amino acid.

מדידת קשירת נוקלאוטידים לחלבוני ממברנה שלמים ומתפקדים בזמן אמת

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

High-Resolution Studies of Proteins in Natural Membranes by Solid-State NMR

Membrane proteins are vital for cell function and thus represent important drug targets. Solid-state Nuclear Magnetic Resonance (ssNMR) spectroscopy offers a unique access to probe the structure and dynamics of such proteins in biological membranes of increasing complexity. Here, we present modern solid-state NMR spectroscopy as a tool to study structure and dynamics of proteins in natural lipid membranes and at atomic scale. Such spectroscopic studies profit from the use of high-sensitivity ssNMR methods, i.e., proton-(1H)-detected ssNMR and DNP (Dynamic Nuclear Polarization) supported ssNMR. Using bacterial outer membrane beta-barrel protein BamA and the ion channel KcsA, we present methods to prepare isotope-labeled membrane proteins and to derive structural and motional information by ssNMR.

This work details robust basic routines on how to prepare isotope-labeled membrane protein samples and analyze them at high-resolution with modern solid-state NMR spectroscopy methods.

Membrane proteins are vital for cell function and thus represent important drug targets. Solid-state Nuclear Magnetic Resonance (ssNMR) spectroscopy ...

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take place, are inherently difficult to assess with standard biophysical methods. The introduction of mass-sensitive particle tracking (MSPT) constitutes an important step toward a thorough quantitative characterization of such processes. Technically, this was made possible through the advent of interferometric scattering microscopy (iSCAT)-based mass photometry (MP). When the background removal strategy is optimized to reveal the two-dimensional motion of membrane-associated particles, this technique allows the real-time analysis of both diffusion and molecular mass of unlabeled macromolecules on biological membranes. Here, a detailed protocol to perform and analyze mass-sensitive particle tracking of membrane-associated systems is described. Measurements performed on a commercial mass photometer achieve time resolution in the millisecond regime and, depending on the MP system, a mass detection limit down to 50 kDa. To showcase the potential of MSPT for the in-depth analysis of membrane-catalyzed macromolecule dynamics in general, results obtained for exemplary protein systems such as the native membrane interactor annexin V are presented.

This protocol describes an iSCAT-based image processing and single-particle tracking approach that enables the simultaneous investigation of the molecular mass and the diffusive behavior of macromolecules interacting with lipid membranes. Step-by-step instructions for sample preparation, mass-to-contrast conversion, movie acquisition, and post-processing are provided alongside directions to prevent potential pitfalls.

מעקב אחר חלקיקים רגישים למסה לאפיון דינמיקת מקרומולקולות הקשורות לממברנה

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...