We thank Barbara Windschiegl for her help in establishing SOPs; Dennis Remme for his work on the NanoCalcFX software and Alina Kollmannsperger, Markus Braner and Milan Gerovac for helpful suggestions on the manuscript. The German-Israeli Project Cooperation (DIP) provided by the DFG and the Federal Ministry of Education and Research to R.T., as well as the Federal Ministry of Economics and Technology (ZIM R&amp;D Project) to R.T. and Nanospot GmbH supported this work.

<ol>
	<li>Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-target+network.">Drug-target network.</a> Nat Biotechnol. 25, 1119 (2007).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li><li>Osaki, T., Suzuki, H., Le Pioufle, B., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multichannel+simultaneous+measurements+of+single-molecule+translocation+in+&#945;-hemolysin+nanopore+array.">Multichannel simultaneous measurements of single-molecule translocation in &#945;-hemolysin nanopore array.</a> Anal. Chem. 81, 9866-9870 (2009).</li><li>Carrillo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+membrane+capacitance+measurements+for+studying+endocytosis+and+exocytosis+in+yeast.">High-resolution membrane capacitance measurements for studying endocytosis and exocytosis in yeast.</a> Traffic. , (2015).</li><li>Giacomini, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+transporters+in+drug+development.">Membrane transporters in drug development.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 9, 215-236 (2010).</li><li>Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+membrane+protein+inhibition+by+optical+ion+flux+in+a+droplet+interface+bilayer+array.">Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51, 3134-3138 (2012).</li><li>Zollmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+liposome+analysis+of+peptide+translocation+by+the+ABC+transporter+TAPL.">Single liposome analysis of peptide translocation by the ABC transporter TAPL.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 2046-2051 (2015).</li><li>Tamm, L. K., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+phospholipid+bilayers.">Supported phospholipid bilayers.</a> Biophys. J. 47, 105-113 (1985).</li><li>Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+membranes:+scientific+and+practical+applications.">Supported membranes: scientific and practical applications.</a> Science. 271, 43-48 (1996).</li><li>Castellana, E. T., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+supported+lipid+bilayers:+From+biophysical+studies+to+sensor+design.">Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design.</a> Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).</li><li>Wagner, M. L., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+polymer-supported+planar+lipid+bilayers+for+reconstitution+of+integral+membrane+proteins:+silane-polyethyleneglycol-lipid+as+a+cushion+and+covalent+linker.">Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker.</a> Biophys. J. 79, 1400-1414 (2000).</li><li>Naumann, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+polymer-supported+phospholipid+bilayer:+tethering+as+a+new+approach+to+substrate-membrane+stabilization.">The polymer-supported phospholipid bilayer: tethering as a new approach to substrate-membrane stabilization.</a> Biomacromolecules. 3, 27-35 (2002).</li><li>Weiskopf, D., Schmitt, E. K., Kl&#252;hr, M. H., Dertinger, S. K., Steinem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-BLMs+on+highly+ordered+porous+silicon+substrates:+Rupture+process+and+lateral+mobility.">Micro-BLMs on highly ordered porous silicon substrates: Rupture process and lateral mobility.</a> Langmuir. 23, 9134-9139 (2007).</li><li>Watanabe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrayed+lipid+bilayer+chambers+allow+single-molecule+analysis+of+membrane+transporter+activity.">Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity.</a> Nat. Commun. 5, (2014).</li><li>Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembled+Microarrays+of+Attoliter+Molecular+Vessels.">Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 115, 5738-5741 (2003).</li><li>Lohr, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Liposomes+Used+to+Study+the+Activity+of+Individual+Transporters.">Single Liposomes Used to Study the Activity of Individual Transporters.</a> Biophysical Journal. 106, 229a (2014).</li><li>Dunlop, J., Bowlby, M., Peri, R., Vasilyev, D., Arias, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+electrophysiology:+an+emerging+paradigm+for+ion-channel+screening+and+physiology.">High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and physiology.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 358-368 (2008).</li><li>Milligan, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robotic+multiwell+planar+patch-clamp+for+native+and+primary+mammalian+cells.">Robotic multiwell planar patch-clamp for native and primary mammalian cells.</a> Nat. Protoc. 4, 244-255 (2009).</li><li>Soga, N., Watanabe, R., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attolitre-sized+lipid+bilayer+chamber+array+for+rapid+detection+of+single+transporters.">Attolitre-sized lipid bilayer chamber array for rapid detection of single transporters.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li><li>Kleefen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+parallel+single+transport+recordings+on+nanopore+arrays.">Multiplexed parallel single transport recordings on nanopore arrays.</a> Nano Lett. 10, 5080-5087 (2010).</li><li>Wei, R., Gatterdam, V., Wieneke, R., Tamp&#233;, R., Rant, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+sensing+of+proteins+with+receptor-modified+solid-state+nanopores.">Stochastic sensing of proteins with receptor-modified solid-state nanopores.</a> Nat. Nanotechnol. 7, 257-263 (2012).</li><li>Urban, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+transport+recordings+on+a+membrane-on-nanopore+chip+at+single+molecule+resolution.">Highly parallel transport recordings on a membrane-on-nanopore chip at single molecule resolution.</a> Nano Lett. 14, 1674-1680 (2014).</li><li>Kusters, I., Van Oijen, A. M., Driessen, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-on-a-Chip:+Microstructured+Silicon/Silicon-Dioxide+Chips+for+High-Throughput+Screening+of+Membrane+Transport+and+Viral+Membrane+Fusion.">Membrane-on-a-Chip: Microstructured Silicon/Silicon-Dioxide Chips for High-Throughput Screening of Membrane Transport and Viral Membrane Fusion.</a> ACS Nano. 8, 3380-3392 (2014).</li><li>Hansen, J. S., Thompson, J. R., He&#769;lix-Nielsen, C., Malmstadt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+directed+intrinsic+membrane+protein+segregation.">Lipid directed intrinsic membrane protein segregation.</a> J. Am. Chem. Soc. 135, 17294-17297 (2013).</li><li>Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Micrometer-Sized+Free-Standing+Membranes.">Preparation of Micrometer-Sized Free-Standing Membranes.</a> ChemPhysChem. 12, 2568-2571 (2011).</li><li>Lazzara, T. D., Carnarius, C., Kocun, M., Janshoff, A., Steinem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+attoliter-sized+compartments+using+fluid+pore-spanning+lipid+bilayers.">Separating attoliter-sized compartments using fluid pore-spanning lipid bilayers.</a> ACS nano. 5, 6935-6944 (2011).</li><li>Winterhalter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Black+lipid+membranes.">Black lipid membranes.</a> Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 5, 250-255 (2000).</li><li>Ko&#231;er, A., Walko, M., Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+utilization+of+reversible+and+irreversible+light-activated+nanovalves+derived+from+the+channel+protein+MscL.">Synthesis and utilization of reversible and irreversible light-activated nanovalves derived from the channel protein MscL.</a> Nat. Protoc. 2, 1426-1437 (2007).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

تقنية المعروضة هنا يسمح للتحليل مواز للغاية من النقل بروتين الغشاء. ويمكن مباشرة أنظمة بروتين الغشاء أعيد تطبيقها على بيوشيب، مما يجعل التكيف من الناحية النظرية كل نقل غشاء أو توجيه ممكن. تحليل النقل يقتصر فقط عن طريق إنشاء نظام تلا الفلورسنت، إما عن طريق تغيير مباشر مضان (النبات من fluorophores أو ركائز fluorescently المسمى) أو التغيير غير المباشرة مضان (الأصباغ الحساسة للدرجة الحموضة، والتفاعلات الأنزيمية الثانوية). هذا الأخير، ولكن لم يتم بعد تأسيسها. التوصيف الوظيفي للقنوات الغشاء أو النقل على مستوى بروتين واحد هو المحور الرئيسي لهذه التقنية. في تركيبة مع المجهر الآلي، وإنشاء تطبيقات الكشف عن المؤثرات البروتين هو ممكن أيضا. إعداد مقايسة يسمح بتقييد مواز لمدة تصل إلى 8 رقائق، مع نقاط فحص متعددة على كل رقاقة. بسبب الفصل التام من رقائق، فمن مواز حقا، والسماح لعدة يكرر التجريبية بما في ذلك التحكم في تشغيل تجريبي واحد، بعد أن تستتب الأوضاع. خطوات حاسمة خلال إنشاء تجربة هي إعداد الحويصلات unilamellar حقا، وإعادة نشطة من البروتين في الاختيار، ونشر كفاءة proteoliposomes على سطح رقاقة والقدرة الإبقاء على طبقة ثنائية الدهون علقت نحو ركائز المستخدمة في الفحص. في حين إعداد الحويصلات unilamellar له أهمية أساسية لهذا الاختبار لتجنب إنشاء صفائح الأغشية الصفاحات على سطح رقاقة خلال تشكيل الدهون طبقة ثنائية مع وقف التنفيذ، فمن السهل بدلا لضمان unilamellarity الحويصلات عبر sonicating في الجسيمات الشحمية أثناء التحضير. التطبيق المباشر لproteoliposomes هو النهوض كبير من PRESENTE طريقةد. وعلى النقيض من المناهج السابقة البروتينات أكثر تعقيدا وذات الصلة طبيا يمكن الآن المستهدفة، الأمر الذي يتطلب بطبيعة الحال إنشاء مسبق من بروتوكول إعادة العائد بروتين وظيفي الاختيار في LUVs. بالإضافة إلى ذلك، بروتينات غشاء حيازة مجالات كبيرة خارج الغشاء تقلل من تشكيل SSMS المناسبة. هذا يجب أن يكون الأمثل لكل بروتين جديد، على سبيل المثال من خلال تغيير تركيز CaCl 2. نسبة إعادة تشكيل البروتين من الفائدة يجب أن يتم اختياره بعناية. كان المطلوب تحليل الأحداث بروتين واحد وبارعة باستخدام تقنية يعرض هنا. ولذلك ينبغي أن كمية البروتين أعيد لا تتجاوز 1-2 وحدات من البروتين وظيفية لكل تغطي المسام غشاء التصحيح افتراض إعادة المثالية والتي وزعت على بروتين غشاء عشوائيا عبر طبقة ثنائية. بالإضافة إلى ذلك يكون الاتجاه من البروتين بعد إعادة ينبغي أيضا أن يوضع في الاعتبار، كما فعلت نبعد التمديد لتكون على قدم المساواة بين كل من directionalities. وأخيرا مرة واحدة ويتم فحص جميع هذه القضايا بعناية والأمثل، فإن أيا من ركائز المستخدمة قد عرض أي نفاذية غشاء غير محددة من الغشاء الذي يمتد المسام. fluorophores موجبة، مثل معظم الأصباغ القائمة على رودامين في النظام الطيفي الأحمر تميل إلى التغلب بسرعة على حاجز الغشاء. تفاعلات مسعور قوية يمكن أن يؤدي أيضا إلى مرفق غير محددة إلى طبقة ثنائية المادة الدهنية. لم يتم المطلوب على حد سواء الخصائص. دراسة القنوات الأيونية بطريقة النوعية هي أيضا يمكن تخيلها. الكشف عن المؤثرات قناة باستخدام ثنائي نعم / لا يمكن التفكير قراءات استخدام الأصباغ الحساسة للأيون. أكبر عقبة هنا سيكون إنشاء الدهون طبقة ثنائية على الأقل جزئيا-الاحتفاظ أيون. وهذا قد يكون فقط يمكن تحقيقه عبر تعديل سطح رقاقة ثقب النانو.

أصبح تحليل بروتينات الغشاء من الاهتمام المتزايد للبحوث الأساسية والأدوية في السنوات ال 20 الماضية. تطوير عقاقير جديدة تعتمد على تحديد وتوصيف مفصل للأهداف جديدة، ويجري حاليا واحدة من العوامل التي تحد. حقيقة أن حوالي 60٪ من جميع الأهداف المخدرات هي بروتينات غشاء 1، يجعل من تطوير تقنيات لتوضيح وظيفتها الأهم. في الماضي، وقد تم تطوير تقنيات لدراسة قنوات كهربي والنقل في العديد 2-4. ركائز غير كهربي في العكس تمثل مهمة أكثر صعوبة. ومع ذلك فهي تحظى باهتمام خاص كأهداف المخدرات الرئيسية، كما أنها تتحكم في تدفق المواد المذابة والمواد الغذائية عبر غشاء الخلية ووظيفتها باسم المستقبلات الرئيسية في الإشارة شلالات 5. وقد بذلت جهود كبيرة في تطوير رechniques لدراسة وظيفة البروتينات النقل غشاء 6 و 7. ظهرت النظم التي تستخدم الأغشية الصلبة المدعومة من الأدوات كما الواعدة في هذا المجال 8-10، بما في صلب طبقات ثنائية الدهون المعتمدة، طبقات ثنائية المربوطة 11، 12، الأغشية microblack الدهون 13 و 14 و الأم صفائف حويصلة 15 و 16 على سبيل المثال لا الحصر. تتوفر حتى مع الاجهزة التجارية 17، 18 بعضهم. وقد نشرت بعض الأمثلة التي تجمع بين القدرة على دراسة بروتينات الغشاء واحدة بطريقة موازية للغاية 14، 19، وهو شرط أساسي لتطبيقات الفحص. ومع ذلك، هذه الأساليب نادرا ما يسد من البحوث الأساسية إلى البيئة الصناعية. كثيرا ما تكمن الصعوبات في قدرة النظام أن يكون automatable، والإنتاج الكثيف من حيث التكلفة و / أو التحضير شاقة. نهج س<html> vercoming جميع العقبات المذكورة أعلاه هو الهدف النهائي. وقد تم تطوير تقنية المعروضة هنا لدراسة قنوات الغشاء والنقل في المختبر في بيئة تسيطر عليها على مستوى البروتين واحدة 20-22. وأكثر من ذلك بكثير إنشاء إعادة تشكيل بروتينات الغشاء النقاء في LUVs من نهج مماثلة لGUVs 23-26 أو الدهون السوداء الأغشية 27. يمكنهم مباشرة يتم تطبيقها على سطح رقاقة، حيث تشكيل طبقة ثنائية تجري من خلال عملية التجميع الذاتي. تصميم الزجاج السفلي من رقاقة nanoporous (الشكل 1) يسمح للفحص المجهري الهواء، مما يسمح للأتمتة واضحة للنظام. جنبا إلى جنب مع مرحلة الآلية يمكن قياس رقائق متعددة في نفس الوقت، مع كل مجال الرؤية التي تحتوي على الآلاف من تجاويف مختومة لتحليلها. = &quot;1&quot;&gt; <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/53373/53373fig1.jpg" /> الشكل 1. تصميم biochips ثقب النانو المضاعفة. أ) السيليكون على العازل (منظم أبناء العراق) رقاقة عن طريق النقش على رد الفعل ايون. هي ملفقة حوالي 1150 رقائق الفردية من كل رقاقة مع خصائص مماثلة والجودة. ب) ويضم كل رقاقة 250،000 microcavities الفردية مع فتحات نانو. شريط مقياس: 200 ميكرون C) كل تجويف هو عنونة عبر مضان متعددة الأطياف للقراءة خارج. وintransparent أعلى كتل طبقة الاشارات الفلورسنت من الخزان العازلة، مما يجعل بيوشيب متوافقة مع المجاهر مضان مقلوب. D) مجهر القوة الذرية (AFM) التصوير يكشف ترتيب بالتساوي فتحات المسام وخشونة سطح طبقة ثاني أكسيد السيليكون من 3.6 نانومتر (ن = 40) الأمثل لالانصهار الحويصلة. مقياس شريط: 5 ميكرون E) هيئة التصنيع العسكري الضوئي الإلكترونمعارض roscopy (SEM) صورة مقطع عرضي من خلال ثقب النانو مما يتيح الوصول إلى تجاويف فيمتولتر داخل رقاقة السيليكون. تم إعادة استخدام هذا الرقم بإذن من 21. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53373/53373fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> يتم تنفيذ جميع تحليل البيانات باستخدام مجانية لضمان الوصول غير المقيد للمستخدمين النهائيين. ويتم تحليل السلاسل الزمنية باستخدام برنامج معالجة الصور والعرف بناء منحنى برامج التحليل تمكين تجهيز دفعة والارتباط المباشر لمجموعات كبيرة من البيانات مع قنوات الفلورسنت متعددة وآلاف من المنحنيات. البروتين النموذج المستخدم في هذا البروتوكول هو قناة mechanosensitive من البروتين قناة (MscL) تصرف كبير المستمدة من E. القولونية. وهي بمثابة صمام للافراج عن صدمة التناضحي في الطبيعة، ولكن تم تعديلها في مثل هذه الطريقة التي صممت بعقلانية syntيمكن أن تساهمي ظائف hetic أن تعلق على جانب قنوات انقباض. عبر المسؤول عن النفور من المنشط ملزمة تساهميا (MTSET) يتم تشغيل القناة لفتح، وخلق نانو صمام. جزيئات صغيرة مثل أيونات، المياه، بروتينات صغيرة، ولكن أيضا fluorophores صغيرة يمكن أن تتخلل من خلال القناة. هنا، يتم استخدام البروتين كنموذج للتدليل على قدرة نظام للكشف عن النبات بوساطة البروتين.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[2-(Trimethylammonium)ethyl]&lt;br/&gt; methanethiosulfonate</td><td>Toronto Research Chemicals Inc.</td><td>T792900</td><td>MTSET; hydrolized by water. Keep as dry pouder aliquot at -80 &amp;deg;C. Use immediately (30 minutes) after solubilization in buffer.</td></tr><tr><td>1 ml gas-tight syringe</td><td>Hamilton</td><td>#1001</td><td></td></tr><tr><td>10 ml round flask</td><td>Schott Duran</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.7 mm glas beads</td><td>Roth</td><td>N032.1</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanole</td><td>Roth</td><td>9866.5</td><td></td></tr><tr><td>30 cm Luer-Lock Extension Tube</td><td>Sarstedt</td><td>744304</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Roth</td><td>5025.5</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2 Adsorbent</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td>need to be activated before first use</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;Dihydrat</td><td>Roth</td><td>HN04.3</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma</td><td>C0875</td><td>store dark at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Chloroform reagent grade</td><td>VWR Chemicals</td><td>22711324</td><td></td></tr><tr><td>DOPE&lt;sup&gt;ATTO390&lt;/sup&gt;</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 390-165</td><td>store dark at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Ethanol absolute</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205</td><td></td></tr><tr><td>Injekt Single-use syringe</td><td>Braun</td><td>460 60 51V</td><td></td></tr><tr><td>Injekt-F single-use syringe</td><td>Braun</td><td>91 66 017V</td><td></td></tr><tr><td>Keck clips</td><td>Schott</td><td>KC29</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-Phosphatidylcholine, 20% (Soy)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>5416016</td><td>store under inert gas at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>NaCl 99.5% p.a.</td><td>Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>Nanopore E100 wafer/chips</td><td>Micromotive (Mainz/Germany)</td><td></td><td>available on request</td></tr><tr><td>Nucleopore Track-Etch Membrane 0.4 &amp;micro;m</td><td>Whatman</td><td>800282</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green Dextran 488 (70 kDa)</td><td>life Technologies</td><td>D-7173</td><td>store dark at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Oy647</td><td>Luminartis (M&amp;uuml;nster/Germany)</td><td>OY-647-T-1mg</td><td>store dark at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Rotilabo-syringe filtration, unsterile, pore-size 0.22 &amp;micro;m</td><td>Roth</td><td>P 818.1</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5080</td><td>column material for size exclusion chromatography</td></tr><tr><td>Silastic MDX4-4210</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>curing agent for chip fixation onto cover glass support</td></tr><tr><td>sticky-Slide 8-well</td><td>ibidi</td><td>80828</td><td>multi-well chamber for the mounting onto glass slides (chip holder)</td></tr><tr><td>Three-way stopcock blue</td><td>Sarstedt</td><td>744410001</td><td></td></tr><tr><td>Tris Pufferan 99.9% Ultra Quality</td><td>Roth</td><td>5429.2</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Roth</td><td>6683.1</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 0.2 &amp;micro;m cellulose nitrate membrane filter</td><td>Roth</td><td>NH69.1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&amp;uuml;chi 461 water bath</td><td>B&amp;uuml;chi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&amp;uuml;chi Rotavapor RE 111</td><td>B&amp;uuml;chi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cary Eclipse Fluorescence Spectrophtometer&amp;nbsp;</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiposoFast Mini Extruder</td><td>Avestin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrane pump&amp;nbsp;</td><td>Vaccubrand</td><td>15430</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight Nanoparticle Tracking Microscope</td><td>Malvern / Nanosight</td><td>LM 14C</td><td></td></tr><tr><td>NyONE microscope</td><td>Synentec</td><td></td><td>available on request</td></tr><tr><td>Pump control</td><td>Vaccubrand</td><td>CVC 2II</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator bath Sonorex RK100H</td><td>Brandelin electronic</td><td>31200001107477</td><td></td></tr><tr><td>Vaccum pump RC5</td><td>Vaccubrand</td><td>1805400204</td><td></td></tr><tr><td>Water bath W13</td><td>Haake</td><td>002-9910</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Cleaner PDC-37G</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-37G</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Open Source</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td>scientific image processing software</td></tr><tr><td>NanoCalcFX</td><td>Freeware</td><td>http://sourceforge.net/projects/nanocalc/</td><td>data analysis/evaluation software for massive transport kinetic datasets</td></tr><tr><td>NTA 2.3 Analytical Software</td><td>Nanosight</td><td></td><td>data acquisition and analysis software for nanoparticle tracking microscope</td></tr><tr><td>NTA 2.3 Temperature Comms</td><td>Nanosight</td><td></td><td>temperature controle software for nanoparticle tracking microscope</td></tr></tbody></table>

membrane transport processes analyzed by a highly parallel nanopore chip system at single protein resolution

نقل البروتين غشاء على مستوى بروتين واحد لا يزال يتهرب تحليل مفصل، إذا الركيزة translocated غير قابلة للكهربي. وقد بذلت جهود كبيرة في هذا المجال، ولكن تقنيات تمكين تحليل النقل عالية الإنتاجية الآلي في تركيبة مع تقنيات طبقة ثنائية المادة الدهنية الخالية من المذيبات المطلوبة للتحليل النقل غشاء نادرة. هذا النوع من النقل ولكن هو الحاسم في توازن الخلايا وبالتالي هدفا رئيسيا في تطوير العقاقير ومنهجيات للحصول على أفكار جديدة بحاجة ماسة. يصف المخطوطة هنا قدمت إنشاء والتعامل معها من بيوشيب رواية لتحليل البروتين بوساطة عمليات النقل غشاء على قرار نقل احد. يتكون بيوشيب من microcavities محاطة nanopores التي هي موازية للغاية في التصميم ويمكن أن تنتج في الصف الصناعي وكمية. ويمكن مباشرة الجسيمات الشحمية البروتين إيواء تطبيقها علىسطح رقاقة تشكيل طبقات ثنائية للدهون، والتي تمتد المسام الذاتي تجميعها باستخدام SSM-تقنيات (بدعم الصلبة الأغشية الدهنية). المسام التي تغطي أجزاء من الغشاء وقائما بذاته، وتوفير واجهة للالنبات الركيزة داخل أو خارج الفضاء تجويف، والتي يمكن أن تتبعها قراءات الفلورسنت متعددة الأطياف في الوقت الحقيقي. وضع إجراءات التشغيل القياسية (الأورام) يسمح بإنشاء واضحة من طبقات ثنائية الدهون-إيواء البروتين على سطح رقاقة من تقريبا كل بروتين الغشاء الذي يمكن تشكيلها وظيفيا. الشرط الوحيد هو إنشاء نظام تلا الفلورسنت لركائز النقل غير كهربي. تطبيقات فحص عالية المحتوى هي محقق عن طريق استخدام آلية المجهر الفلورسنت المقلوب تسجيل رقائق متعددة في نفس الوقت. ويمكن تحليل مجموعات البيانات الكبيرة باستخدام متاحة بحرية برامج التحليل مصمم خصيصا. ثلاثة ألوان متعددة الطيفية الفلوريةقراءة من علاوة على ذلك يسمح للتمييز البيانات غير منحازة إلى فئات الأحداث المختلفة، والقضاء على نتائج إيجابية كاذبة. وتعتمد هذه التقنية رقاقة حاليا على شافي 2 السطوح، ولكن المزيد من functionalization باستخدام أسطح رقاقة الذهب المطلي ممكن أيضا.

يمكن بسهولة الأغشية التي تغطي المسام المراد إنشاؤها على سطح رقاقة ذات البنية النانومترية بطريقة الذاتي تجميعها. لكن العملية الأساسية لا تزال حساسة وتتأثر العديد من المعلمات مثل حجم الجسيمات الشحمية، monodispersity من السكان الحويصلية، lamellarity، lipid- والملح التركيز وسطح الكيميائية الخصائص. وقد اتسمت معظم هذه المعايير بدقة وموحدة في البروتوكول أعلاه. غيرها من المعالم ولكن يجب أن يتم التحقق خلال كل إعداد جديد، لضمان تجربة ناجحة. هذه هي توزيع حجم الجسيمات الشحمية والتبعثر السكان (الشكل 2 أ). لتشكيل غشاء تغطي المسام الأمثل وتجنب الحويصلية اقتحام أحجام تجويف الفضاء الحويصلية أعلى بكثير من قطر المسام هي ضرورة. وعلاوة على ذلك، وقد ثبت أن الاستعدادات الحويصلية monodisperse لانتاج أفضل النتائج في غشاء نشر ومغازيلعلى. خطوة حاسمة أخرى لابد من التحقق من كل إعداد لنشاط البروتين بعد إعادة. باستخدام مقايسة dequenching مضان لالجسيمات الشحمية تشكيلها مع MscL G 22 C، وفتح قناة يمكن رصدها عبر التحليل الطيفي مضان، وإعطاء نسبة من الجسيمات الشحمية إيواء نشط MscL G 22 C بروتين (الشكل 2 ب). مرة واحدة تنتشر على سطح رقاقة، المذاب النبات من هدف الفلورسنت التي كتبها MscL G 22 C على تفعيل يجند يمكن اتباعها (الشكل 3 B). لا تعمل المهندسة MscL G 22 قنوات C في حالتها الافتراضية، entrapping جزيئات الفلورسنت صغيرة داخل الفضاء تجويف. بإضافة المغير MTSET الكيميائية يتم إدخال الشحنات الموجبة إلى المنطقة انقباضوMscL G 22 C المسام، مما دفع مفتوحا عبر التنافر الكهربائي. وfluorophore شرك مسبق تهرب الفضاء تجويف لتحقيق التوازن نشر. يمكن رصد انخفاض لاحق من مضان داخل الفضاء تجويف. هذه العملية هي استنساخه للغاية، مما أدى إلى السكان متجانسة من الأحداث هروب رأس المال (الشكل 3 C). منحنيات هروب رأس المال الناتجة تتجمع في اثنين من السكان واضح، مما يدل على قدرة فحص للتمييز بين الأحداث النبات أحادية ومتعددة القنوات (الشكل 3 D). وعلاوة على ذلك فإن هذا النظام قادرا على متابعة ثلاثة الأصباغ طيفيا فصل جيدا بالتوازي وفي الوقت الحقيقي، مما يجعل من الممكن لتسجيل عروض عالية المحتوى والتمييز بدقة وموضوعية بين النتائج الإيجابية والسلبية الإيجابية، كاذبة. في هذه الدراسة تم تحليل 9.046 تجاويف مختومة، منها 8٪ عرض efflالسلوك UX. نشر فلوري مختلف القنوات تلا، يمكن التمييز الأحداث في أحداث monoexponential هروب رأس المال، حركية معقدة، والاقتحام الدهون وتمزق غشاء (الشكل 3 E). تعتبر الأحداث الوحيدة التي تعرض إشارات ثابتة للالمذاب التحكم وصبغ الغشاء عن التحليل النهائي. تمثل حركية معقدة أحداث هروب رأس المال مع اشارات التحكم متقلب وبالتالي تم حذفها. الاختراقات الدهون وتمزق غشاء هي أحداث القطع الأثرية التي تحدث في جوهرها باستخدام أنظمة طبقة ثنائية للدهون، والتي تمتد المسام. ويمكن التخلص منها باستخدام إشارات صبغ السيطرة على النحو المذكور أعلاه (الشكل 4). <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/53373/53373fig2.jpg" /> الرقم توزيع 2. حجم proteoliposomes وظيفة MscL. كانت أ) الحويصلات يحلل<html> إد عن طريق تحليل تتبع نانو الجسيمات. تم فحص عينات لوف قبل (تتبع الأسود) وبعد إعادة تشكيل MscL G 22 C (تتبع الأحمر). بعد إعداد LUV، ويتحقق حجم الجسيمات يعني من 214 ± 70 نانومتر. وانخفض حجم أثناء إعادة، مما أدى إلى proteoliposomes من 158 ± 60 نانومتر في النشاط الحجم. ب) MscL تم التحقق من صحة بعد إعادة كتبها مقايسة هروب رأس المال. إصدارها 28 calcein مروي الذاتية من proteoliposomes من خلال افتتاح بوساطة MTSET للقناة MscL، مما يؤدي إلى dequenching من fluorophore (الحمراء)، والزيادة السريعة في كثافة مضان. الجسيمات الشحمية دون البروتين تظهر لا يوجد مثل هذا هروب رأس المال، حتى بعد تكرار بالإضافة MTSET (أسود). لاحقا، قدم المنظفات الإذابة (TX-100) من النشرات الجسيمات الشحمية كل مغلفة سابقا صبغ. تم إعادة استخدام هذا الرقم بإذن من 21.وآخرون = &quot;_ فارغة&quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53373/53373fig3.jpg" /> الشكل (3). بوابات يجند المذاب النبات من قبل MscL في مستوى جزيء واحد. كما أنها أغلقت) المهندسة MscL G 22 قنوات C في حالتها الافتراضية. المواد المذابة الصغيرة مثل fluorophore غير قادرة على تمرير لا من خلال قناة أو طبقة ثنائية المادة الدهنية. على إضافة MTSET، وهي السيستين واحدة هندسيا من كل MscL G 22 C protomer يحصل تعديل، فرض رسوم إيجابية متعددة في الجانب انقباض في مجمع القناة pentameric. يتم الضغط على MscL G 22 قناة C مفتوحة من التنافر تهمة وصبغ شرك يمكن أن منتشر خارج تجويف، مما يؤدي إلى نقص في كثافة مضان. ب) تيلي يتتبع من MscL G 22 C فتح على إضافة MTSET. وانتشرت Proteoliposomes تحتوي على تشكيلها وظيفيا MscL G 22 C على سطح رقاقة. وقد شرك Oy647 (الأحمر) داخل تجاويف كما الركيزة النبات. وأضاف OregonGreen ديكستران (70 كيلو دالتون والأخضر)، والركيزة قناة التحكم غير منفذة للمراقبة خصوصية الركيزة لهذا الحدث النقل وكذلك سلامة غشاء أثناء التجربة. وتستكمل LUVs مع مخدر ATTO 390 (0.1 مول٪، الأرجواني) للتحقق من تلوث الدهون داخل تجاويف. إضافة MTSET (3 ملي النهائية) في ر = 0 ثانية تفتح القناة، مما يؤدي إلى Oy647 هروب رأس المال من تسوس الأسنان، سجلت عن طريق مضان قراءة المغادرة. C) اختار عشوائيا MscL G 22 منحنيات C هروب رأس المال أثبتت الأحداث هروب رأس المال نموذجية. D) معدل الثوابت للأحداث النبات (ن = 242) عنقودية على اثنين من سكان جاوسالصورة، مما يدل على أن الأحداث النقل أحادية ومتعددة القنوات يمكن التمييز. E) فحص عالية المحتوى والتحليل الإحصائي من 9046 تجاويف رقاقة مختومة من قبل الثلاثي اللون في الوقت الحقيقي قراءات. 8٪ من جميع التجاويف رقاقة تحليلها وتبين الأحداث هروب رأس المال الأسية. بسبب فك الطيفي (الأحمر: translocated المذاب، الأخضر: السيطرة المذاب، البنفسجي: الدهن)، والأحداث هروب رأس المال، حركية معقدة، والاقتحام الدهون، وتمزق الغشاء يمكن أن يكون هناك تمييز، وبالتالي القضاء على ايجابيات كاذبة. تم إعادة استخدام هذا الرقم بإذن من 21. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53373/53373fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/53373/53373fig4.jpg" /> الشكل (4). فئات الأحداث ميزت من خلال الكشف ثلاثة ألوان. المذاب Translocated (الحمراء)، كنترولل المذاب (الخضراء) وصبغة الدهون (البنفسجي) ويمكن التمييز طيفيا السماح لاختيار البيانات غير متحيزة. أ) تجاويف يختم إيواء أي بروتين الغشاء تظهر أي أحداث التمويه تحت ظروف تجريبية وصفها لقناة MscL تسجيل (انظر الشكل 3A) . قراءات الفلورسنت مستقرة لجميع القنوات. ب) تعريف سوء طبقات ثنائية الدهون علقت قادرة للتدخل في تجويف. النتائج C) غشاء تمزق في طبقة ثنائية المادة الدهنية متقطعة تمتد التصدع ثقب النانو. وبالتالي، لم يعد يفصل الفضاء تجويف من حجرة عازلة. الأصباغ شرك (الحمراء) تهرب من تجويف أسفل التدرج التركيز. المذاب التحكم (الأخضر)، وغير قادر سابقا لتمرير عبر الغشاء، يدخل D) مثال لحدث الدهون تدخل تجويف. بينما يزيد من إشارة الفلورسنت لصبغ الدهون (البنفسجي) بسبب غشاء غزو الفضاء تجويف، المذاب النبات هو pusheد من تجويف (الحمراء)، مما يؤدي إلى نقص في إشارة الفلورسنت. تم حظر ثقب النانو من قبل طبقة ثنائية المادة الدهنية، ومنع مرور الركيزة التحكم (الأخضر). E) أثناء تمزق الغشاء، المذاب النقل المغلقة تهرب بسرعة من تجويف (الحمراء)، في حين ينشر المذاب التحكم في (الخضراء). تم إعادة استخدام هذا الرقم بإذن من 21. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53373/53373fig4large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution at JoVE.com

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

The presented protocol describes the analysis of membrane protein mediated transport on the single transporter level using pore-spanning solvent-free lipid bilayers. This is achieved by the creation of bulk produced nanopore array chips, combined with highly parallel data acquisition and analysis, enabling the future establishment of membrane protein effector screenings.

النقل غشاء عمليات تحليلها بواسطة النظام ثقب النانو رقاقة الموازي عالية في قرار بروتين واحد

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

membrane-transport-processes-analyzed-highly-parallel-nanopore-chip

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K Views.  Goethe University Frankfurt. The presented protocol describes the analysis of membrane protein mediated transport on the single transporter level using pore-spanning solvent-free lipid bilayers. This is achieved by the creation of bulk produced nanopore array chips, combined with highly parallel data acquisition and analysis, enabling the future establishment of membrane protein effector screenings.

Video: Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

طريقة لتصور وتحليل غشاء متبادلة البروتينات التي نقل المجهر

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Biochemistry

Fine-tuning the Size and Minimizing the Noise of Solid-state Nanopores

Solid-state nanopores have emerged as a versatile tool for the characterization of single biomolecules such as nucleic acids and proteins1. However, the creation of a nanopore in a thin insulating membrane remains challenging. Fabrication methods involving specialized focused electron beam systems can produce well-defined nanopores, but yield of reliable and low-noise nanopores in commercially available membranes remains low2,3 and size control is nontrivial4,5. Here, the application of high electric fields to fine-tune the size of the nanopore while ensuring optimal low-noise performance is demonstrated. These short pulses of high electric field are used to produce a pristine electrical signal and allow for enlarging of nanopores with subnanometer precision upon prolonged exposure. This method is performed in situ in an aqueous environment using standard laboratory equipment, improving the yield and reproducibility of solid-state nanopore fabrication.

A methodology for preparing solid-state nanopores in solution for biomolecular translocation experiments is presented. By applying short pulses of high electric fields, the nanopore diameter can be controllably enlarged with subnanometer precision and its electrical noise characteristics significantly improved. This procedure is performed in situ using standard laboratory equipment under experimental conditions.

صقل الحجم والتقليل من الضوضاء من الحالة الصلبة ثقوب النانو

Solid-state nanopores have emerged as a versatile tool for the characterization of single biomolecules such as nucleic acids and proteins1. However, the ...

Engineering

Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores

Solid-state nanopores have been used to perform measurements at the single-molecule level to examine the local structure and flexibility of nucleic acids 1-6, the unfolding of proteins 7, and binding affinity of different ligands 8. By coupling these nanopores to the resistive-pulse technique 9-12, such measurements can be done under a wide variety of conditions and without the need for labeling 3. In the resistive-pulse technique, an ionic salt solution is introduced on both sides of the nanopore. Therefore, ions are driven from one side of the chamber to the other by an applied transmembrane potential, resulting in a steady current. The partitioning of an analyte into the nanopore causes a well-defined deflection in this current, which can be analyzed to extract single-molecule information. Using this technique, the adsorption of single proteins to the nanopore walls can be monitored under a wide range of conditions 13. Protein adsorption is growing in importance, because as microfluidic devices shrink in size, the interaction of these systems with single proteins becomes a concern. This protocol describes a rapid assay for protein binding to nitride films, which can readily be extended to other thin films amenable to nanopore drilling, or to functionalized nitride surfaces. A variety of proteins may be explored under a wide range of solutions and denaturing conditions. Additionally, this protocol may be used to explore more basic problems using nanopore spectroscopy.

A method of using solid-state nanopores to monitor the non-specific adsorption of proteins onto an inorganic surface is described. The method employs the resistive-pulse principle, allowing for the adsorption to be probed in real-time and at the single-molecule level. Because the process of single protein adsorption is far from equilibrium, we propose the employment of parallel arrays of synthetic nanopores, enabling for the quantitative determination of the apparent first-order reaction rate constant of protein adsorption as well as and the Langmuir adsorption constant.

رصد بروتين الامتزاز مع الحالة الصلبة Nanopores

Solid-state nanopores have been used to perform measurements at the single-molecule level to examine the local structure and flexibility of nucleic acids ...

Bioengineering

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used for ATP production. The amphiphilic nature of membrane proteins requires particular attention to their handling, and reconstitution into the natural lipid environment is indispensable when studying membrane transport processes like proton translocation. Here, we detail a method that has been used for the investigation of the proton-pumping mechanism of membrane redox enzymes, taking cytochrome bo3 from Escherichia coli as an example. A combination of electrochemistry and fluorescence microscopy is used to control the redox state of the quinone pool and monitor pH changes in the lumen. Due to the spatial resolution of fluorescent microscopy, hundreds of liposomes can be measured simultaneously while the enzyme content can be scaled down to a single enzyme or transporter per liposome. The respective single enzyme analysis can reveal patterns in the enzyme functional dynamics that might be otherwise hidden by the behavior of the whole population. We include a description of a script for automated image analysis.

Here, we present a protocol to study the molecular mechanism of proton translocation across lipid membranes of single liposomes, using cytochrome bo3 as an example. Combining electrochemistry and fluorescence microscopy, pH changes in the lumen of single vesicles, containing single or multiple enzyme, can be detected and analyzed individually.

قياسات الحويصلية واحد للدراسة لضخ البروتون غشاء الإنزيمات تستخدم كهربية ومجهر فلوري

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

High Resolution Physical Characterization of Single Metallic Nanoparticles

Individual molecules can be detected and characterized by measuring the degree by which they reduce the ionic current flowing through a single nanometer-scale pore. The signal is characteristic of the molecule&#39;s physicochemical properties and its interactions with the pore. We demonstrate that the nanopore formed by the bacterial protein exotoxin Staphylococcus aureus alpha hemolysin (&#945;HL) can detect polyoxometalates (POMs, anionic metal oxygen clusters), at the single molecule limit. Moreover, multiple degradation products of 12-phosphotungstic acid POM (PTA, H3PW12O40) in solution are simultaneously measured. The single molecule sensitivity of the nanopore method allows for POMs to be characterized at significantly lower concentrations than required for nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. This technique could serve as a new tool for chemists to study the molecular properties of polyoxometalates or other metallic clusters, to better understand POM synthetic processes, and possibly improve their yield. Hypothetically, the location of a given atom, or the rotation of a fragment in the molecule, and the metal oxidation state could be investigated with this method. In addition, this new technique has the advantage of allowing the real-time monitoring of molecules in solution.&#160;

Here, we present a protocol to detect discrete metal oxygen clusters, polyoxometalates (POMs), at the single molecule limit using a biological nanopore-based electronic platform. The method provides a complementary approach to traditional analytical chemistry tools used in the study of these molecules.

التوصيف الفيزيائي عالي الاستبانة للجسيمات النانوية المعدنية المفردة

Individual molecules can be detected and characterized by measuring the degree by which they reduce the ionic current flowing through a single ...

Chemistry

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

غشاء الخلية الأصلية نظام الجسيمات النانوية لتحليل التفاعل البروتينية الغشاء

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

A Closed-Type Wireless Nanopore Electrode for Analyzing Single Nanoparticles

Measuring the intrinsic features of single nanoparticles by nanoelectrochemistry holds deep fundamental importance and has potential impacts in nanoscience. However, electrochemically analyzing single nanoparticles is challenging, as the sensing nanointerface is uncontrollable. To address this challenge, we describe here the fabrication and characterization of a closed-type wireless nanopore electrode (WNE) that exhibits a highly controllable morphology and outstanding reproducibility. The facile fabrication of WNE enables the preparation of well-defined nanoelectrodes in a general chemistry laboratory without the use of a clean room and expensive equipment. One application of a 30 nm closed-type WNE in analysis of single gold nanoparticles in the mixture is also highlighted, which shows a high current resolution of 0.6 pA and high temporal resolution of 0.01 ms. Accompanied by their excellent morphology and small diameters, more potential applications of closed-type WNEs can be expanded from nanoparticle characterization to single molecule/ion detection and single-cell probing.

Here, we present a protocol for fabrication of a closed-type wireless nanopore electrode and subsequent electrochemical measurement of single nanoparticle collisions.

قطب نانوبوري لاسلكية مغلقة لتحليل واحد جسيمات نانوية

Measuring the intrinsic features of single nanoparticles by nanoelectrochemistry holds deep fundamental importance and has potential impacts in ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. This method combines expression of proteins tagged with the fluorescent non-canonical amino acid ANAP, and FRET between ANAP and fluorescent (trinitrophenyl) nucleotide derivatives. We present examples of nucleotide binding to ANAP-tagged KATP ion channels measured in unroofed plasma membranes and excised, inside-out membrane patches under voltage clamp. The latter allows for simultaneous measurements of ligand binding and channel current, a direct readout of protein function. Data treatment and analysis are discussed extensively, along with potential pitfalls and artefacts. This method provides rich mechanistic insights into the ligand-dependent gating of KATP channels and can readily be adapted to the study of other nucleotide-regulated proteins or any receptor for which a suitable fluorescent ligand can be identified.

This protocol presents a method for measuring adenine nucleotide binding to receptors in real time in a cellular environment. Binding is measured as F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between trinitrophenyl nucleotide derivatives and protein labeled with a non-canonical, fluorescent amino acid.

قياس ارتباط النوكليوتيدات ببروتينات الغشاء الوظيفية السليمة في الوقت الفعلي

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

High-Resolution Studies of Proteins in Natural Membranes by Solid-State NMR

Membrane proteins are vital for cell function and thus represent important drug targets. Solid-state Nuclear Magnetic Resonance (ssNMR) spectroscopy offers a unique access to probe the structure and dynamics of such proteins in biological membranes of increasing complexity. Here, we present modern solid-state NMR spectroscopy as a tool to study structure and dynamics of proteins in natural lipid membranes and at atomic scale. Such spectroscopic studies profit from the use of high-sensitivity ssNMR methods, i.e., proton-(1H)-detected ssNMR and DNP (Dynamic Nuclear Polarization) supported ssNMR. Using bacterial outer membrane beta-barrel protein BamA and the ion channel KcsA, we present methods to prepare isotope-labeled membrane proteins and to derive structural and motional information by ssNMR.

This work details robust basic routines on how to prepare isotope-labeled membrane protein samples and analyze them at high-resolution with modern solid-state NMR spectroscopy methods.

Membrane proteins are vital for cell function and thus represent important drug targets. Solid-state Nuclear Magnetic Resonance (ssNMR) spectroscopy ...

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take place, are inherently difficult to assess with standard biophysical methods. The introduction of mass-sensitive particle tracking (MSPT) constitutes an important step toward a thorough quantitative characterization of such processes. Technically, this was made possible through the advent of interferometric scattering microscopy (iSCAT)-based mass photometry (MP). When the background removal strategy is optimized to reveal the two-dimensional motion of membrane-associated particles, this technique allows the real-time analysis of both diffusion and molecular mass of unlabeled macromolecules on biological membranes. Here, a detailed protocol to perform and analyze mass-sensitive particle tracking of membrane-associated systems is described. Measurements performed on a commercial mass photometer achieve time resolution in the millisecond regime and, depending on the MP system, a mass detection limit down to 50 kDa. To showcase the potential of MSPT for the in-depth analysis of membrane-catalyzed macromolecule dynamics in general, results obtained for exemplary protein systems such as the native membrane interactor annexin V are presented.

This protocol describes an iSCAT-based image processing and single-particle tracking approach that enables the simultaneous investigation of the molecular mass and the diffusive behavior of macromolecules interacting with lipid membranes. Step-by-step instructions for sample preparation, mass-to-contrast conversion, movie acquisition, and post-processing are provided alongside directions to prevent potential pitfalls.

تتبع الجسيمات الحساسة للكتلة لتوصيف ديناميكيات الجزيئات الكبيرة المرتبطة بالغشاء

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...