Name: whole retinal explants from chicken embryos for electroporation and chemical reagent treatments
Uploaded: 2015-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments at JoVE.com

The work was supported by Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), &#246;gonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsn&#228;mnd f&#246;r synskadade, Synfr&#228;mjandets forskningsfond and St Eriks &#246;gonsjukhus forskningsstipendier.

פרוטוקול זה מתבצע בהתאם להמלצות ב&quot; המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של האגודה למחקר ברפואת עיניים וראייה &quot;. 1. טיפול בביצה וגביית עיניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן ביצי ליבורנו הלבנות ב12-14 מעלות צלזיוס למשך לא יותר משבוע 1. אם זמין, להשתמש במקרר יין קירור לאחסון הביצים המופרות. הערה: טמפרטורות גבוהות חנות להוביל להתפתחות לא תקינה של עוברים, ואילו טמפרטורות נמוכות מגבירה תמותה. זמן אחסון מורחב מגדיל שני תמותה והתפתחות לא תקינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על הביצים ב37.5 מעלות צלזיוס ו -60% חממת ביצת humidified עם הנדנדה עדינה בתדירות של 5 פעמים בשעה 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הביצים מודגרות מן חממת הביצה בגיל העוברי הרצוי. הערה: גיל העובר העוף נקבע כזמן של דגירה והוא כונה כימים עובריים (E) או כשלבים (רח &#39;), על פי הסדרה של שלבי התפתחות שתוארו על ידי המבורגר והמילטון 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הביצים שנבחרו בזרימה למינרית. נגב את קליפת הביצה עם 70% אתנול, כדי למנוע זיהום של העובר. הערה: ניהול כל ההליכים בתנאים אספטיים עם פתרונות סטרילי <url> https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory&quot;lutions </url> ומכשירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש בצד של הביצה בתקיפות כנגד משטח קשה לפיצוח פתוח הביצה. הנח את התוכן בצלחת פטרי 100 מ&quot;מ. השתמש בכפית קטנה להעביר את העובר לצלחת פטרי 35 מ&quot;מ המכילה מראש חימם (37 ° C) 1x PBS כדי למנוע את הרקמות מייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את 35 מ&quot;מ צלחת פטרי המכילה את הרקמה העוברית על מיקרוסקופ לנתח stereovision משקפת בזרימה למינרית. לערוף את העובר על ידי צובט את הצוואר עם מלקחיים עדינים וזורקים את הגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים בסדר לעשות חתך המחוספס הפה, הגחון לעין. החל באתר של חתך, קורע את הרקמות המקיפות את כל העין. לצבוט את עצב הראייה ולהסיר את העיניים בשלמות מארובת העין. לאסוף צד השמאל ועין ימין מאותו העובר לשימוש כמו גם השליטה או עין שטופלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכפית קטנה להעביר את העיניים לצלחת חדשה 35 מ&quot;מ פטרי המכילה מראש חימם (37 ° C) 1x PBS. </li></ol> 2. הכנת Explants הרשתית השלמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים עדינים כדי להסיר את כל הרקמה סביב העין כולל Anlage scleral. הערה: רקמת תנתק בקלות עוזבת את הרשתית על הגוף ועדשת הזגוגית עם אפיתל הפיגמנט (1A-B איור) ללא פגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים עדינים לצבוט חתך קטן לאפיתל הפיגמנט בחלק הגב של העין ללא פגיעה ברשתית העצבית (איור 1 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחי קנס לקרוע בעדינות לפתוח את starti אפיתל הפיגמנטng באתר של חתך, ומשאירה את העדשה ואת כל הרשתית מחוברת לגוף הזגוגי (1D איור). שמור את העין בחם (37 מעלות צלזיוס) 1x PBS כדי להקל על הסרת האפיתל פיגמנט. הערה: אפיתל הפיגמנט עלול להיות קשה להסרת, בפרט לאורך גוף הריסים סביב התלמיד, באזור הקדמי של העין, ולאורך הבקע דמית העין. לכן, חלק מאפיתל הפיגמנט ניתן להשאיר על הרשתית העצבית (איור 1E-F). </li></ol> 3. טיפול בExplants הרשתית השלמה <ol start="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electroporation של explants רשתית השלם הערה: Electroporation של explants רשתית השלם יכול להתבצע מייד לאחר שלב 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום תרבות המכיל 1: 1 DMEM: תערובת מזון F12, 10% FBS, 10 U / ml פניצילין סטרפטומיצין, 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, וL- גלוטמין 2 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את קובט פלסטיק חד פעמי של 1.5 מיליליטר (מ&quot;מ 12.5 מ&quot;מ x 12.5 x 45 מ &#39;מ &#39;) (או כל מיכל קטן מסוגל להחזיק פתרון 300-400 μl) כ 8 מ&quot;מ מהתחתית בעזרת מסור בסדר להב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את פלסמיד דנ&quot;א של בחירה ב1xDPBS לריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם / μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעילו את הפרמטרים electroporator וסט 15 V לST20 - ST25 רשתית (E3-E4) ו -20 V לst26 - st27 רשתית (E5). הגדר את הדופק חוזר ל5 פולסים של 50 דופק באורך msec עם 1 מרווחי שניות. השתמש במחולל פעימות שיכולות להיות נשלט על ידי רגל דוושה על הרצפה כתהיינה צורך בשתי הידיים כדי להחזיק את האלקטרודות במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר (קוטר שטוח, עגול. 4 מ&quot;מ) שתי ההנעה בצורת אלקטרודות פלטינה (איור 2 א) לשקע הפלט על מחולל את הדופק. הערה: אלקטרודות הפלטינה שימוש בפרוטוקול זה נעשו על ידי סדנת האוניברסיטה. אלקטרודות נעשו מ&quot; rondelles &quot;(כיתה פלטינה: 950 Pt / 5 Cu) צלחת פלטינה 0.1 מ&quot;מ. Wi חיבור 0.8 מ&quot;ממחדש היה מבודד באמצעות צינורות פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את כל explant הרשתית מצעד 2.3 לקובט (או מיכל קטן שווה ערך) בעזרת פיפטה פסטר פוליאתילן עם הקצה מנותק לרכוש את גודל טיפ-פתיחה הנכונה עבור explant הרשתית. הימנע משימוש בטיפי פיפטה כמו הרשתית נוטה לצרף לפלסטיק ולקרוע לגזרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה 100 μl כדי להסיר בעדינות את כל 1x PBS המקיף את טיפול explant לוקח רשתית שלא לגעת ברשתית כדי למנוע את הקריעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף פתרון פלסמיד 100 μl לקובט כדי לכסות את כל explant הרשתית. דחף בעדינות את explant הרשתית עם מלקחיים אם זה צף למעלה. שימוש במלקחיים או אלקטרודות למצב העדשה להתמודד עם כל צד אחד של קובט ועצב הראייה לחלק התחתון של קובט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את האלקטרודה החיובית מול העדשה והאלקטרודה השלילית מאחורי הרשתית (איור 2 א), בלי לגעת ברקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">החל הנוכחי על ידי לחיצה הרגל על ​​הדוושה. בדקו בועות באלקטרודות המצביעות על שחרור מוצלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה 100 μl כדי להסיר את כל תערובת פלסמיד מקובט ללא פגיעה ברשתית. תערובת פלסמיד ניתן לעשות שימוש חוזר שלושה עד חמש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את קובט עם מחומם מראש (37 ° C) 1x PBS. שימוש במלקחיים כדי לנתק עדינות explant הרשתית מהקיר של קובט. לאחר electroporation הרשתית לעתים מכוסות בבועות, מה שהופך את לדבוק בקיר של קובט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפיפטה פסטר פוליאתילן להעביר את כל explant הרשתית לצלחת 24-המכילה גם (37 מעלות צלזיוס) מדיום תרבות 1 מיליליטר מחומם מראש לכל טוב. דגירה explant רשתית אחד בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה explant הרשתית על 37 מעלות צלזיוס על שייקר הכתף, עם מהירות קבועה של 50 סל&quot;ד, בתוך תא חממה עם 5% CO 2 למשך 24 שעות. הסיבוב הוא להבטיח חשיפה המרבית לבינונית ולpreveהידבקות NT של הרשתית לחלק התחתון של צלחת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לשלב 4. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול בexplants רשתית השלם עם ריאגנטים כימיים הערה: טיפול הכימי של explants רשתית השלם יכול להתבצע מייד לאחר שלב 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום תרבות המכיל 1: 1 DMEM: תערובת מזון F12, 10% FBS, 10 U / ml פניצילין סטרפטומיצין, 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, וL- גלוטמין 2 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכפית קטנה להעביר explant הרשתית מצעד 2.3 לתוך צלחת 24 גם המכילה 1 מיליליטר מראש חימם בינונית (37 מעלות צלזיוס) תרבות לכל טוב. דגירה explant רשתית אחד בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה explant רשתית כל במשך 60 דקות על 37 מעלות צלזיוס על שייקר הכתף, עם מהירות קבועה של 50 סל&quot;ד, בתוך תא חממה עם 5% CO 2 לפני הוספת מגיב כימי או רכב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון הכימי, למשל Cdk1 / 2 מעכב III, מעכב התקדמות M-שלב 13, בגמרריכוז של 30 מיקרומטר בDMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת 24 גם, המכיל את כל explant הרשתית, מן חממת התא. הוסף 10 μl של המגיב הכימי או הרכב (DMSO) ישירות למדיום הרשתית, וכתוצאה מכך ריכוז סופי של 300 ננומטר Cdk1 / 2 מעכב שלישי ב0.01% DMSO. באופן ידני לסובב את צלחת 24 גם כדי לאפשר חלוקה שווה של המגיב הכימי או רכב בפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה explants הרשתית על 37 מעלות צלזיוס על שייקר הכתף, עם מהירות קבועה של 50 סל&quot;ד, בתוך חממה עם 5% CO 2 לזמן הרצוי (עד 24 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לשלב 4. </li></ol></li></ol> 4. קיבוע והקפאה של כל הפריטים הרשתית Eexplants <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת 24 היטב המכילה את explant רשתית כל מטופלים מן חממת התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכפית קטנה להעביר explant הרשתית לצלחת 24 גם המכילה 1 מיליליטר / גם קר כקרח paraformaldehyde 4% ב1xPBS. אינקובטוריםטה על קרח במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכפית קטנה להעביר את כל explant הרשתית לצלחת 24 גם המכילה 1 מיליליטר / גם 1xPBS הקרח הקר לשטוף את הרשתית. דגירה על קרח למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכפית קטנה להעביר את כל explant הרשתית לצלחת 24 גם המכילה 1 מיליליטר / גם סוכרוז 30% קרים כקרח ב1xPBS. לדגור על קרח במשך 1-3 שעות, בהתאם ליום העוברי של הרשתית. לST20 - ST25 רשתית (E3), דגירה עבור שעה 1, רשתית מבוגרת זקוק לזמן דגירה ארוך יותר בסוכרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכפית קטנה להעביר את כל explant הרשתית על סרט פרפין המכיל הרכבה בינונית כ -500 הקפאת cryostat μl. הסר ככל סוכרוז ככל האפשר על ידי בעדינות להזיז את explant הרשתית במדיום ההקפאה באמצעות הכפית הקטנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את explant הרשתית לעובש הטבעה מכיל מדיום הקפאה. מקם את העיניים כדי להקל על חתך בעתיד. שים עובש ההטבעה מכיל את כל explant הרשתית על ד&quot;רקרח y עד הבינוני קפוא מוצק. חנות ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol>

<ol>
	<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).</li><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation.">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Method. 24, 43-48 (2001).</li><li>Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+patterns+and+targets+of+dA1+interneurons+in+the+chick+hindbrain.">Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain.</a> J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).</li><li>Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+in+embryonic+chick+retina.">In ovo electroporation in embryonic chick retina.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+commitment+and+differentiation+in+explants+of+embryonic+rat+neural+retina.+Comparison+with+the+developmental+potential+of+dissociated+retina.">Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina.</a> Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).</li><li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+hairy+and+Enhancer+of+split+homolog+1+regulates+differentiation+of+retinal+neurons+and+is+essential+for+eye+morphogenesis.">Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis.</a> Neuro. 16, 723-734 (1996).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).</li><li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures.">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).</li><li>Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+explant+culture+of+the+embryonic+chicken+retina+with+long-term+preservation+of+photoreceptors.">Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors.</a> Exp eye re. 93, 556-564 (2011).</li><li>Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heterogenic+final+cell+cycle+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+regulated+by+the+DNA+damage+response+pathway.">The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway.</a> Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).</li><li>Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+terminal+basal+mitosis+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+sensitive+to+cisplatin-induced+cell+cycle+arrest.">The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest.</a> Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 49-92 (1951).</li><li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+cyclin+B1-Cdk1+synchronizes+events+in+the+nucleus+and+the+cytoplasm+at+mitosis.">Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.</a> J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).</li><li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+in+the+neural+tube.">Mitosis in the neural tube.</a> J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).</li><li>Baye, L. M., Link, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interkinetic+nuclear+migration+and+the+selection+of+neurogenic+cell+divisions+during+vertebrate+retinogenesis.">Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis.</a> J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

בעבודה זו בפרוטוקול מפורט לנתיחה, electroporation או טיפול כימי, וculturing של explants רשתית השלם מעוברי עוף מוצג. פרוטוקול זה הוא קל, מהיר ומאפשר לשניהם שיעור הצלחה גבוה ושחזור תוצאות. Electroporation של explants רשתית השלם מייצר שטחים גדולים של תאים המבטאים את מבנה הגן של עניין. זה קל למצב בצורה נכונה את האלקטרודות ולחשוף חלק מסוים של הרשתית לריכוז פלסמיד דנ&quot;א מוגדר. גישה זו מאפשרת לשיטה אמינה לבדיקת תפקוד גן ברשתית עם שיעור הצלחה בדרך כלל גבוה יותר בהשוואה לelectroporations באוב. explant הרשתית השלם גם מאפשר לחשוף את הרשתית למדיום המכיל ריכוז מוגדר של מגיב כימי נותן התפלגות אחידה של המגיב ברשתית העצבית. הפרוטוקול מאפשר לשילובטיפולים בי הרשתית electroporated ראשונה ולאחר מכן טופל בחומרים. ההשפעה של שונות בין עוברי אדם עשויה להיות ממוזערת, שכן הן עין טופלה ושליטה יכולה להיות שנאספו מאותו העובר ותטופל באופן עצמאי. עוברי הפרוטוקול כבר מותאם לexplants רשתית שלם מST20 (E3) לst27 (E5) לelectroporation וST20 (E3) לst31 עוברים (E7) לטיפול בחומר כימי. בשלבים צעירים הרשתית / כוס אופטית קטנה מדי ושביר לטפל ביעילות ובאוב electroporation הוא הכי יעיל יותר סביר. Electroporations על explants רשתית שלם לא בוצע על במות יותר מאשר st27 (E5). סביר להניח ניתן להתאים את הפרוטוקול לexplants מעוברים מבוגר. שיכלול cuvettes קבלת גדולה יותר, בארות גדולות יותר לדגירה וגידול בהיקף בינוני תרבות רשתית. עם זאת, על ידי E12-14 אפיתל הפיגמנט והקטע החיצוני שלתאי קולטי האור נקשרו באופן הדוק, וההסרה של אפיתל הפיגמנט עלולה לגרום נזק לרשתית. הרשתית צריכה להיות שלמה במהלך ההליך כולו והדגירה הניסיוניים. עם זה לנתיחה ופרוטוקול culturing, השלמות המבנית של ארכיטקטורת הרשתית נותרה בשלמותה במהלך 24 שעות, המבוסס על הביטוי של סמני סוג תא מסוימים. כאמור, יש לנו למדנו התקדמות מחזור התא בexplants והתהליך של הגירה גרעינית interkinetic של תאי רשתית נראה נורמלי. אם הפרוטוקול מבוצע במהירות יש רק השפעה קטנה על ההתקדמות התפתחותית בexplant. עם זאת, הפיתוח עשוי להיות האטה מעט וexplant כי כבר בתרבית למשך 24 שעות עשוי להפגין גיל התפתחותי שהוא 1-2 שעות צעירות ממקבילו הרגיל. מומלץ להשוות את explant לרשתית רגילה באותו גיל ומומלץ להשתמש בעין הנגדית כExpl ניסיונישליטת נמלה. יש לציין כי הסרת האפיתל הפיגמנט ברשתית עלולה להשפיע על ההתפתחות של מגזרי קולטי האור החיצוניים. צריך גם לציין שרשתית explant מייצגת רשתית פגועה עם תאי הגנגליון ברשתית axotomized. פרוטוקול זה הוא פשוט, ולכן מפחית את השגיאות ניסיוניות אבל לשעבר אוב המצב דורש כמה בקרות ניסיוניות. תהליך התפתחותי ספציפי שהוא נושא להיחקר באמצעות לשעבר זה אובו הפרוטוקול יכול להיות גם למד במקביל ולהיות בהשוואה לנורמלית במצב אוב. הבקרות הניסיוניות המתאימות חייבות תמיד להיות כלולות, כגון כלי רכב משומשים לsolubilize חומרים. בעת שימוש בחוסמי נתיב אות, להשתמש בכמה מעכבים שונים לאותו תהליך או להשתמש מעכבים שונים המתמקדים באנזימים יותר מרמה של המסלול הספציפי שלמד. לelectroporation, פלסמיד דנ&quot;א להביע GFP הוא שימושיביקורת חיובית SA. אם פלסמיד כזה אינו מייצר שום ביטוי גן כתב, זה ככל הנראה בשל שהאנודה (+) והקתודה (-) ממוקמות בצורה לא נכונה. אז פלסמיד דנ&quot;א יהגר מהרשתית. כאשר בודקים פלסמידים DNA רומן לכן מומלץ לכלול פלסמיד דנ&quot;א שמבטא חלבון ניאון שונה כמו שליטת electroporation פנימית. הפרמטרים electroporation שתוארו בפרוטוקול זה כבר מותאם לייצור מספר גבוה של גן הכתב לבטא בתאים. הפחתת המתח או מספר הפעימות מפחיתה את מספר תאי transfected, אשר עשוי להניב תוצאות שליליות כוזבות. עם זאת, הגדלת המתח או מספר הפעימות עלולה להביא לפגיעה של הרקמות ומוות של תאי גידול. שלושה סטים של אלקטרודות פלטינה מותאמות אישית שנעשה כבר בשימוש לכל electroporations במהלך יותר משנתיים בלי להראות שום יכולת מופחתת. אלקטרודות יש לנקות היטב וsurfac אלקטרודהלהיות מלוטש דואר. אלקטרודות ההנעה 4 מ&quot;מ מסחריות זמינות. פרוטוקול זה מתמקד בelectroporation של פלסמידים DNA וטיפול כימי של explants רשתית כולה. אפשר להרחיב עוד יותר את הפרוטוקול זה לכלול הפרוצדורות אחרות, כגון דפיקה למטה של ​​ביטוי גנים עם שימוש oligomers morpholino. הליך explant הרשתית השלם פותח את האפשרות לביצוע ניסויים לטווח קצר בצורה קלה, מהירה ומאוד לשחזור. זה מפחית את עלויות, זמן, ואת מספר בעלי החיים הדרושים לכל ניסוי והכי חשוב זה מגדיל את האפשרות לקבל נתונים מוצקים.

הרשתית היא חלק ממערכת העצבים המרכזית ואת זה הוא, בפשטותה היחסית ואדריכלות סלולרית מאופיינת היטב, דגם פופולרי לחקר התפתחות מערכת עצבים מרכזית. עינו של עובר העוף היא יחסית גדולות בהשוואה לשאר העובר. לכן נגיש בקלות באובו למניפולציות ניסיוניות, כגון זריקות או electroporation, ומשמש ככלי מצוין לצבור ידע על תאים ברשתית וביולוגיה התפתחותית בvivo. למרות יתרונות הגדולים אלה, הישרדות של העוברים יכולה להיות נמוכה כאשר ניסויים פולשניים כגון עם electroporations, זריקות חוזרות ונשנות, או מניפולציות ניסיוניות משולבות. Electroporation של פלסמידים DNA לעובר העוף באובו הוא טכניקה חשובה ומבוססת 1. היא מאפשרת תיוג של תאי עצב, התחקות של גורל תא, כמו גם שטחים עצביים בnerv המרכזימערכת היחידות הארגוניות והיא מאפשרת לביטוי גנים מחוץ לרחם לנתח תפקוד חלבון in vivo. הטכניקה נוצלה בעבר ללימודים של צינור עצבי 2, המוח האחורי 3, ורשתית 4. יש Electroporation של רשתית עוברית באוב כמה קשיים ניסיוניים הקשורים למצב in vivo. העמדה של העין, בשל קיפול הגולגולת של העובר, קרובה יחסית ללב. קרבה זו מגדילה את הסיכון של דום לב לאחר electroporation, והסיכון עולה עם גיל העובר. יתר על כן, כדי לגשת לעין, יש צורך לפתוח את הקרומים העובריים, ובכך להגדיל את הסיכון לדימום, מומים וכדאיות מופחתים שלאחר מכן. כאשר בודקים ואופטימיזציה פלסמיד דנ&quot;א חדש לעתים קרובות ללא תוצאה פנוטיפי ידועה, מגבלות אלה עשויות להקטין את היעילות וכוחה של השיטה אפילו בניסויים מנוסים. כפי שהוצג בפרוטוקול זה, התרבות של wexplant החור ברשתית, שהוגדר כרשתית עצבית השלמה עם אפיתל הפיגמנט הוסר, הוא שיטה יעילה המשלימה בגישת אוב. זריקות תוך עיניות של ריאגנטים כימיים קלות יחסית לביצוע באוב. עם זאת, הריכוז היעיל ומדויק של חומרים כימיים שהוחדרו בתוך הרשתית העצבית עלול להיות קשה לשלוט באופן מלא. הנפח המוזרק עשוי להשתנות עקב דליפה ואתר הזרקה המדויק עשוי להשפיע הן על חלוקת מגיב בתוך העין ודיפוזיה דרך הגוף הזגוגי. ההשתנות תהיה השלכות משמעותיות על הפרשנות של התוצאות כאשר כלומר, עקומת תגובה למינון מעכב אנזים נקבעה; במיוחד אם ההשפעה היא קטנה והחלון הזמני של ההשפעה הוא צר. יתר על כן, רק עין אחת יכולה לשמש מכל עובר בעת ביצוע ניסויים באובו בשל השפעות מערכתיות פוטנציאליות דרך זרם הדםעל העין הנגדית. התאמת גיל היא חשובה כאשר לומדים פיתוח והשתנות בודדות בין מטופלים ועוברים בקרה עשויה להוביל לשונות ניסיוניות נוספות. מסיבות אלה, לשעבר אוב שיטה המבוססת על explants רשתית מעוברי עוף פותח, שברשתית העצבית יכולה להיות חשופה למדים ובשליטת תנאי ניסוי במבחנה. הפרוטוקול הנוכחי פותח על בסיס פרוטוקולים קודמים 5-9. explants רשתית מבמה (רח &#39;) 20 (ימים עובריים [E] 3) לst31 (E7) עוברי עופות נותחו, תרבותי וelectroporated עם ריכוז פלסמיד דנ&quot;א מוגדר או שנחשפו למדיום המכיל ריכוז מוגדר של מגיב כימי. הפרוטוקול המובא כאן כבר מיושם בהצלחה בפרסומים האחרונים, באמצעות כמה ריאגנטים כימיים שונים, כולל רגולטורים של מסלול הנזק לדנ&quot;א, כגון KU55933, SB 218,078, ומועצה לביטחון לאומי 109,555 דיטוsylate, ומחזור התא, כגון Cdk1 / 2 מעכב שלישי 10,11.

<table><tbody><tr><td>1xPBS (tablet)</td><td>Life technologies</td><td>18912-014</td><td></td></tr><tr><td>10x DPBS</td><td>Life technologies</td><td>14080-048</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petri dish</td><td>VWR</td><td>734-0006</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;l pipette tips</td><td>VWR</td><td>613-0798</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml disposable plastic cuvette</td><td>Thomas Scientific</td><td>8495V01</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D7039</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri dish</td><td>VWR</td><td>391-1998</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>Solveco</td><td>1054</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/2 inhibitor III</td><td>217714</td><td>Calbiochem</td><td>300 nM in 0.01% DMSO</td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td>Thermo Forma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Electrodes</td><td></td><td></td><td>Platina, custom made</td></tr><tr><td>Electro square porator ECM 830</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F12 Nutrient mix</td><td>Life Technologies</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>AgnThos</td><td>0108-5-PS</td><td></td></tr><tr><td>Freezing medium NEG50</td><td>Cellab, Sweden</td><td>6502</td><td></td></tr><tr><td>GFP expressing DNA plasmid (pZGs)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humidified incubator</td><td>Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany</td><td>8204</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium ProLong Gold with DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin film</td><td>VWR</td><td>291-1214P</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16005-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way embedding mold&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6032</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PhosphoHistone 3 (PH3)&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>06-570</td><td>Dilution 1/4,000</td></tr><tr><td>Platinum electrodes (custom made from &quot;rondelles&quot;)</td><td>Sargenta</td><td>390-R (rondeller)</td><td>Dia: 4mm, 0.1 mm thickness</td></tr><tr><td>Platimun electrodes&amp;nbsp;</td><td>Sonidel</td><td>CUY700P4L</td><td>Dia: 4 mm</td></tr><tr><td>Polyethylene pasteur pipette</td><td>VWR</td><td>612-2853</td><td></td></tr><tr><td>Rotator shaker</td><td>VWR</td><td>444-2900</td><td></td></tr><tr><td>Small spoon</td><td>VWR</td><td>231-2151</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>VWR</td><td>443815S</td><td></td></tr><tr><td>White Leghorn eggs</td><td></td><td></td><td>Local supplier</td></tr><tr><td>Wine cooler</td><td>WineMaster 24, Caso, Berlin Germany</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

whole retinal explants from chicken embryos for electroporation and chemical reagent treatments

הרשתית היא מודל טוב למערכת העצבים המרכזית בפיתוח. הגודל הגדול של העין והכי חשוב הנגישות למניפולציות ניסוייות באובו / in vivo הופך את הרשתית העוברית עוף מודל ניסיוני רב-תכליתי ויעיל מאוד. למרות רשתית העוף קלה למקד באוב על ידי זריקות או electroporation התוך עיני, הריכוז היעיל ומדויק של חומרים כימיים בתוך הרשתית עלול להיות קשה לשליטה מלאה. זה יכול להיות בגלל וריאציות של האתר המדויק הזרקה, דליפה מהעין או דיפוזיה אחידה של החומרים. יתר על כן, בתדירות של מומים ותמותה לאחר מניפולציות פולשנית כגון electroporation היא גבוהה למדי. פרוטוקול זה מתאר לשעבר אובו הטכניקה לculturing explants רשתית שלם מעוברי עוף ומספק שיטה לחשיפה מבוקרת של הרשתית לחומרים כימיים. פרוטוcol מתאר כיצד לנתח, ניסוי לתפעל, וexplants רשתית תרבות שלם מעוברי תרנגולת. Explants יכול להיות מתורבת לכ 24 שעות ויהיה נתון למניפולציות שונות כגון electroporation. היתרונות העיקריים הם כי הניסוי אינו תלוי בהישרדות של העובר וכי הריכוז של המגיב הציג יכול להיות מגוון ומבוקר על מנת לקבוע ולייעל את הריכוז האפקטיבי. יתר על כן, הטכניקה היא מהירה, זולה ויחד עם השיעור הגבוה הניסיוני שלה להצלחה, הוא מבטיח לשחזור תוצאות. יודגש כי היא משמשת כמצוינת כדי להשלים את הניסויים שבוצעו באוב.

פרוטוקול זה מתאר את ההכנה (איור 1 א-ו) וculturing של explants רשתית השלם מעוברי תרנגולת. פרוטוקול זה שמש בהצלחה לכל explants רשתית מעוברים של ST20 (E3) לst31 (E7). Electroporation של פלסמידים DNA לתוך explants רשתית שלם מאפשר תיוג ומעקב של תאים ברשתית או ביטוי יתר של גן מוצרים שונים. לניסויי electroporation, אפיתל הפיגמנט הוסר בזהירות מעין enucleated של ST25 עובר (E4 ½). Explant הרשתית השלם היה אז הניח בקובט מכיל את פתרון ה- DNA פלסמיד, אלקטרודות היו שקועות (איור 2 א) ונוכחיות יושם. לאחר 24 שעות של culturing, תאי GFP חיוביים היו גלויים בחלק גדול של הרשתית שלמה (איור 2). לאחר חתך, GFP + תאים בודדים זוהו בקלות לאורך ציר apico-בסיס של הרשתית (אלחוטיתאיור 2 ג). Electroporation הביא באזור רשתית גדול תופס את פלסמיד ומבטא את גן הכתב. שיעור ההצלחה, נמדד במספר הרשתית עם אזור electroporated גדול יותר 1/5 של הרשתית הכוללת, היה 75% (62 מתוך 83 רשתית) לelectroporation explant רשתית כולה, בהשוואה ל -14% (37 מתוך 263 עיניים ) בelectroporation אובו. ניסויי electroporation על explants רשתית שלם בהצלחה בוצעו על ST20 (E3) לst27 עוברים (E5). Explants הרשתית השלם יכול להיות מתורבת לכ 24 שעות (איור 3 א &#39;וב&#39;). פעמים דגירה ארוכות יותר עשויות להוביל לעיכוב התפתחותי, מומים מורפולוגיים, אפופטוזיס וסופו של דבר התפוררות של הרשתית (איור 3 ג). כאשר culturing רשתית העוף ככל explants הארכיטקטורה של הרשתית נותרה בשלמותה. זה כולל הפצה של השלבים השונים של מחזור התא לאורך apico-basציר אל. במהלך התפתחות נורמלית התאים עוברים S-שלב בצד הבסיסי, ואחריו מיטוזה בצד הפסגה של 14,15 הרשתית. סעיף מexplant רשתית שלם, בתרבית במשך 24 שעות, היה immunostained עם 3 נוגדני phospho-היסטון (PH3), תיוג תאים בG2 מאוחר / M-שלב (איור 3D). התאים החיוביים PH3 נמצאו בצד הפסגה של הרשתית, עולה בקנה אחד עם פיתוח רשתית רגיל. מורכב cyclin B1-Cdk1 פעיל בגרעין ייזום מעבר M-שלב 13. חסימת פעילות Cdk1-קינאז ימנע אירועים במורד זרם, כי הם הכרחיים להתפשטות מחזור התא למיטוזה. שלב 29 explants רשתית השלם (E6) הודגרו עם Cdk1 / 2 מונעי III ל4 שעות וimmunoreactivity PH3 נותח. Cdk1 / 2 המעכב השלישי הפחית את מספר תאי PH3 החיוביים (איור 3E), המצביע על בלוק יעיל של מעבר G2 / M-שלב. ההפחתה של מספר mitoses לאחר treatmeNT עם מעכב Cdk1 / 2 וידא שהטיפול היה יעיל. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53202/53202fig1.jpg" /> איור 1. ההסרה של אפיתל הפיגמנט. העין 6 עוף (st29) יום עוברי הייתה גזור ומוכנה לculturing כexplant רשתית שלם. צפה () של העין הקדמית עם תלמיד ועדשה והסדק דמית העין כלפי מטה. אפיתל הפיגמנט הוא ללא פגע אבל Anlage scleral ורקמת חיבור המקיפה הוסר. צפה (ב) לחלק האחורי של העין. יציאת עצב הראייה והסדק דמית העין פונים כלפי מטה. חתך (ג) באפיתל הפיגמנט. (ד) רוב אפיתל הפיגמנט הוסר. (E) אפיתל הפיגמנט חלק נשאר בלאורך שפת הגוף והריסים ( F) הסדק דמית העין. LE: עדשה וגוף הריסים, CF:סדק דמית העין, ON: יציאת עצב ראייה. סרגל קנה מידה הוא 0.5 מ&quot;מ. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53202/53202fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53202/53202fig2.jpg" /> איור 2. Electroporation של explants רשתית כולה. () מצגת סכמטי של אלקטרודות הפלטינה ואיך הם ממוקמים משני צדי explant הרשתית השלם שהוא שקוע בפתרון פלסמיד דנ&quot;א בקובט הקטוע. (ב) explant רשתית שלם אחרי 24 שעות של culturing, ו- (ג) מחולק רשתית. ON: יציאת עצב ראייה. סרגל קנה מידה הוא (א) 4 מ&quot;מ, (ב) 0.5 מ&quot;מ, (ג) 50 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53202/53202fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה גדולה יותר ve</a><html> rsion של נתון זה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53202/53202fig3.jpg" /> 3. explants רשתית כל תרבית איור היה קבוע, קפוא, cryosectioned, ומסומן על ידי אימונוהיסטוכימיה. (א) explant רשתית כל st29 תרבית למשך 24 שעות. micrographs הקרינה של הכתמה גרעינית אחרי (ב) שעה 24 ו- (ג) שעות 48. (ד) נוגדן PH3 שימש לתאי תווית בG2 מאוחר / M-שלב. (E) הצפיפות היחסית (PH3 + תאים / מ&quot;מ 2, ממוצע ± SD) וקרינה micrographs של PH3 + תאים בst29 לאחר Cdk1 / 2 מעכב III טיפול במשך 4 שעות בהשוואה לרכב. רח &#39;: המבורגר ושלבי המילטון, מבחן t, ** p &lt;0.01, n ≥ 4 עיניים שטופלו, 4 חלקים לכל עין, שעות: שעות. סרגל קנה מידה הוא (א) 0.5 מ&quot;מ, (BE) 10 מיקרומטר.&quot;Target =&quot; _ jove.com/files/ftp_upload/53202/53202fig3large.jpg blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments at JoVE.com

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

פרוטוקול זה מתאר שיטה לנתח, ניסוי לתפעל וexplants רשתית תרבות שלם מעוברי תרנגולת. תרבויות explant הן שימושיות כאשר שיעור הצלחה גבוהה, יעילות ושחזור יש צורך לבדוק את ההשפעות של פלסמידים לelectroporation ו / או חומרים מגיב, כלומר, מעכבים האנזימטית.

Explants רשתית שלם מעוף עוברים לטיפולי Electroporation וכימיים מגיב

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

whole-retinal-explants-from-chicken-embryos-for-electroporation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.4K Views.  Uppsala University.  פרוטוקול זה מתאר שיטה לנתח, ניסוי לתפעל וexplants רשתית תרבות שלם מעוברי תרנגולת. תרבויות explant הן שימושיות כאשר שיעור הצלחה גבוהה, יעילות ושחזור יש צורך לבדוק את ההשפעות של פלסמידים לelectroporation ו / או חומרים מגיב, כלומר, מעכבים האנזימטית. 

Video: Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

העברה יעילה ג&#39;ין בצ&#39;יק הרשתיות לסלולריים יסודי לימודי תרבות:<em&gt; אקס-אוב</em&gt; גישת Electroporation

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

ב Electroporations אובו של HH 10 עוברים שלב עוף

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Biology

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Neuroscience

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

ב electroporation לג&#39;ימי של המוח התיכון צ&#39;יק לחקר תפקוד הגן בהתפתחות Neuron דופאמין

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell differentiation, axon guidance, retinotopic organization and synapse formation[1]. One drawback is the inability to efficiently and reliably manipulate gene expression in RGCs in vivo, especially in the otherwise accessible murine visual pathways. Transgenic mice can be used to manipulate gene expression, but this approach is often expensive, time consuming, and can produce unwanted side effects. In chick, in ovo electroporation is used to manipulate gene expression in RGCs for examining retina and RGC development. Although similar electroporation techniques have been developed in neonatal mouse pups[2], adult rats[3], and embryonic murine retinae in vitro[4], none of these strategies allow full characterization of RGC development and axon projections in vivo. To this end, we have developed two applications of electroporation, one in utero and the other ex vivo, to specifically target embryonic murine RGCs[5, 6]. 
With in utero retinal electroporation, we can misexpress or downregulate specific genes in RGCs and follow their axon projections through the visual pathways in vivo, allowing examination of guidance decisions at intermediate targets, such as the optic chiasm, or at target regions, such as the lateral geniculate nucleus. Perturbing gene expression in a subset of RGCs in an otherwise wild-type background facilitates an understanding of gene function throughout the retinal pathway. Additionally, we have developed a companion technique for analyzing RGC axon growth in vitro. We electroporate embryonic heads ex vivo, collect and incubate the whole retina, then prepare explants from these retinae several days later. Retinal explants can be used in a variety of in vitro assays in order to examine the response of electroporated RGC axons to guidance cues or other factors. In sum, this set of techniques enhances our ability to misexpress or downregulate genes in RGCs and should greatly aid studies examining RGC development and axon projections.

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Here we present two techniques for manipulating gene expression in murine retinal ganglion cells (RGCs) by in utero and ex vivo electroporation. These techniques enable one to examine how alterations in gene expression affect RGC development, axon guidance, and functional properties.

ב electroporation ברחם לשעבר vivo על ביטוי גנים בתאים עכבר גנגליון רשתית

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

ויזואליזציה של נדידת תאים העוסקות ב Tectum אופטיים לפתח הבחורה

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is comparatively very easy to manipulate the chick embryonic retina using recombinant DNA/RNA technology. Electroporation of DNA/RNA constructs into the embryonic retina have a great advantage to study gene regulation in retinal stem/progenitor cells during retinal development. Different type of assays such as reporter gene assay, gene over-expression, gene knock down (shRNA) etc. can be performed using the electroporation technique. This video demonstrates targeted retinal injection and in ovo electroporation into the embryonic chick retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). Here we show a rapid and convenient in ovo electroporation technique whereby a plasmid DNA that expresses green fluorescent protein (GFP) as a marker is directly delivered into the chick embryonic subretinal space and followed by electric pulses to facilitate DNA uptake by retinal stem/progenitor cells. The new method of retinal injection and electroporation at E4 allows the visualization of all retinal cell types, including the late-born neurons1, which has been difficult with the conventional method of injection and electroporation at E1.52.

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

The overall goal of this video is to show how to perform targeted retinal injection and in ovo electroporation of DNA/RNA constructs into the chick embryonic retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). This technique is very useful to study gene expression, gene regulation, and morphological change in developing chick retina.

ב electroporation לג&#39;ימי ברשתית צ&#39;יק עובריים

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

The chicken embryo provides an excellent model system for studying gene function and regulation during embryonic development. In ovo electroporation is a powerful method to over-express exogenous genes or down-regulate endogenous genes in vivo in chicken embryos1. Different structures such as DNA plasmids encoding genes2-4, small interfering RNA (siRNA) plasmids5, small synthetic RNA oligos6, and morpholino antisense oligonucleotides7 can be easily transfected into chicken embryos by electroporation. However, the application of in ovo electroporation is limited to embryos at early incubation stages (younger than stage HH20 - according to Hamburg and Hamilton)8 and there are some disadvantages for its application in embryos at later stages (older than stage HH22 - approximately 3.5 days of development). For example, the vitelline membrane at later stages is usually stuck to the shall membrane and opening a window in the shell causes rupture of the vessels, resulting in death of the embryos; older embryos are covered by vitelline and allantoic vessels, where it is difficult to access and manipulate the embryos; older embryos move vigorously and is difficult to control the orientation through a relatively small window in the shell.
In this protocol we demonstrate an ex ovo electroporation method for gene transfer into chicken embryos at late stages (older than stage HH22). For ex ovo electroporation, embryos are cultured in Petri dishes9 and the vitelline and allantoic vessels are widely spread. Under these conditions, the older chicken embryos are easily accessed and manipulated. Therefore, this method overcomes the disadvantages of in ovo electroporation applied to the older chicken embryos. Using this method, plasmids can be easily transfected into different parts of the older chicken embryos10-12.

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

A method of gene transfer into chicken embryos at later incubation stages (older than Hamburger and Hamilton stage (HH) 22) is described. This method overcomes disadvantages of in ovo electroporation applied to older chicken embryos and is a useful technique to study gene function and regulation at older developmental stages.

ין העברת לעוברי עוף מבוגרים יותר על ידי<em&gt; לג&#39;ימי לשעבר</em&gt; Electroporation

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...

Cone-Enriched Cultures from the Retina of Chicken Embryos to Study Rod to Cone Cellular Interactions

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form of inherited retinal degeneration, retinitis pigmentosa, lose night vision because of mutation driven loss of rod photoreceptors, a phenomenon followed by a progressive loss of function and death of cones leading to blindness. Geneticists have identified many genes with mutations causing this disease, but the first mutations identified questioned the mechanisms of secondary cone degeneration and how a dominant mutation in the rhodopsin gene encoding for the visual pigment expressed exclusively in rods can trigger cone degeneration.
This result of transplantations in a genetic model of the disease led to the concept of cell interactions between rods and cones and of non-cell autonomous degeneration of cones in all genetic forms of retinitis pigmentosa.
Cones comprise 5% of all photoreceptors in humans and only 3% in the mouse, so their study is difficult in these species, but cones outnumber rods in bird species. We have adapted 96-well plates to culture retinal precursors from the retina of chicken embryos at stage 29 of their development. In these primary cultures, cones represent 80% of the cells after in vitro differentiation. The cells degenerate over a period of one week in the absence of serum. Here, we describe the methods and its standardization.
This cone-enriched culture system was used to identify the epithelium-derived cone viability factor (EdCVF) by high content screening of a rat retinal pigmented epithelium normalized cDNA library. Recombinant EdCVF prevents the degeneration of the cones.

We describe a method to obtain primary cultures of cone photoreceptors from the retina of chicken embryos and its use for high content screening.

תרבויות מועשרות חרוט מן הרשתית של עוברי עוף ללמוד מוט כדי חרוט אינטראקציות הסלולר

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form ...

Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs

The chick retina has long been an important model system in developmental neurobiology, with advantages including its large size, rapid development, and accessibility for visualization and experimental manipulations. However, its major technical limitation had been the lack of robust loss-of-function approaches for gene function analyses. This protocol describes a methodology of gene silencing in the developing chick retina that involves transgenic expression of artificial microRNAs (miRNAs) by using the Tol2 transposon system. In this approach, a Tol2 transposon plasmid that contains an expression cassette for the EmGFP (emerald green fluorescent protein) marker and artificial pre-miRNA sequences against a target gene is introduced into the embryonic chick retina with a Tol2 transposase expression construct by in ovo electroporation. In the transfected retinal cells, the transposase catalyzes the excision of the expression cassette from the transposon vector and its integration into host chromosomes, leading to the stable expression of miRNAs and the EmGFP protein. In our previous study, we have demonstrated that the expression of Nel, a glycoprotein that exerts multiple functions in neural development, can be significantly suppressed in the developing chick retina by using this technique. Our results indicate that this methodology induces a stable and robust suppression of gene expression and thus provides an efficient loss-of-function approach for studies of retinal development.

We have developed a novel loss-of-function approach that involves the introduction and genomic integration of artificial micro-RNA sequences into chick embryos by using in ovo electroporation and the Tol2 transposon system. This technique provides a robust and stable gene knockdown methodology for studies of gene function during development.

גישת אובדן תפקוד ברשתית הגוזל העוברי באמצעות ביטוי טרנסגני בתיווך Tol2 של מיקרו-רנ"א מלאכותי

The chick retina has long been an important model system in developmental neurobiology, with advantages including its large size, rapid development, and ...

Explants רשתית שלם מעוף עוברים לטיפולי Electroporation וכימיים מגיב

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

העברה יעילה ג'ין בצ'יק הרשתיות לסלולריים יסודי לימודי תרבות:

ב Electroporations אובו של HH 10 עוברים שלב עוף

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

ב electroporation לג'ימי של המוח התיכון צ'יק לחקר תפקוד הגן בהתפתחות Neuron דופאמין

ב electroporation ברחם לשעבר vivo על ביטוי גנים בתאים עכבר גנגליון רשתית

ויזואליזציה של נדידת תאים העוסקות ב Tectum אופטיים לפתח הבחורה

ב electroporation לג'ימי ברשתית צ'יק עובריים

ין העברת לעוברי עוף מבוגרים יותר על ידי

תרבויות מועשרות חרוט מן הרשתית של עוברי עוף ללמוד מוט כדי חרוט אינטראקציות הסלולר

גישת אובדן תפקוד ברשתית הגוזל העוברי באמצעות ביטוי טרנסגני בתיווך Tol2 של מיקרו-רנ"א מלאכותי