This work was supported by Adelphi University faculty development grant and grant R15GM113156 from NIGMS awarded to EVC, grant R01GM067862 from NIGMS and grant R01AG027849 from NIA awarded to DMR.

1. ריאגנטים ופתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מזון זבוב ותקשורת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכיבים לטוס חום סוכר 11%, 2% שמרי autolyzed, קמח תירס 5.2%, אגר 0.79% w / v במים בפלטה חשמלית נקבעה על 90 מעלות צלזיוס. מערבבים באופן קבוע עד לקבלת תערובת הומוגנית מעט צפופה מתקבלת. הכן נפח סופי של 550 מיליליטר של אוכל לטוס לסך של 5 עם 100 בקבוקוני מ&quot;ל לטוס מזון בכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים ממקור החימום, מערבבים מדי פעם עד שהאוכל מתקרר עד 80 מעלות צלזיוס ומוסיף 0.2% tegosept-מתיל 4 hydroxybenzoate-מומס באתנול 95%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפצל את האוכל בשני כרכים שווים. להוסיף 1.1 מיליליטר של 50 מ&quot;מ Rapamycin מומס באתנול לכרך אחד ו1.1 מיליליטר של אתנול להיקף האחר. מערבבים את rapamycin ופתרוני אתנול למזון. הקפד שהטמפרטורה יורדת ל -50 מעלות צלזיוס לפני הוספת תרופות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד מאגר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 500 מיליליטר של בידוד הצפת [225 מ&quot;מ מניטול, 75 מ&quot;מ סוכרוז, 10 מ&quot;מ 3 (N &lt;/ Em&gt; -morpholino) חומצת propanesulfonic (מגבים) וחומצת 1 מ&quot;מ ethylenediaminetetraacetic (EDTA), 2.5 מ&quot;ג / מיליליטר אלבומין בסרום שור (BSA)] במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה- pH 7.2 באמצעות נתרן הידרוקסידי. PH הראשוני יהיה חומצי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בבקבוקי אחסון סינון סטרילי עם גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר לעקר פתרון ולאחסן אותו על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצפת לשטוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 500 מיליליטר של חיץ לשטוף [225 מ&quot;מ מניטול, 75 מ&quot;מ סוכרוז, 10 מ&quot;מ KCl, 10 מ&quot;מ טריס HCl ו -5 מ&quot;מ KH PO 2 4] במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה- pH 7.2 באמצעות נתרן הידרוקסידי. PH הראשוני יהיה חומצי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בבקבוקי אחסון סינון סטרילי עם גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר לעקר פתרון ולאחסן אותו על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol> 2. גידול של זני דרוזופילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשלוט בצפיפות זחל במהלך פיתוח, מקום 25 זוגות של הורים לבקבוק תרבות ולאפשר להם להטיל ביצים במשך 48 שעות. </li> &lt;li&gt; הסרת הורים לאחר 48 שעות להסדיר צפיפות ביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.1 ו -2.2 שימוש בצאצאי F1 מתעוררים, כך שני דורות של שליטה בצפיפות זו מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף מבוגרים, להרדים את הזבובים באמצעות פחמן דו חמצני (CO 2) ונפרדים לפי מין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ברגולטור שלב אחד לCO הטהור נמסר 2 מטנק גבוה בלחץ בזרימה רציפה של 5 psi. כדי למנוע חשמל סטטי, להשתמש צינורות פלסטיק לזרז CO 2 לסינון בקבוק 500 מיליליטר עם מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפקק גומי עם חור אחד לאטום את הבקבוק. השתמש בצינורות פלסטיק כדי לחבר את הצמצם לרוחב של הבקבוק לכרית CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הזבובים בפנקס ללא יותר מ 10-15 דקות. לאפשר להתאושש מהרדמה למשך 24 שעות לפני הצבתם בתנאי ניסוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור מספיק מטבוליטים לשברים מועשר במיטוכונדריה, להשתמש 300 זבובים לדגימה. הנה, להשתמש נקבות, אבל עדיןr עשוי להיות שונה בניסויים אחרים. העבר את 150 זבובים לכלוב דמוגרפיה 1 ליטר תוצרת בית. לאפשר גישה ל5 מיליליטר של אוכל לטוס בבקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 150 הזבובים שנותר לעוד כלוב 1 ליטר. אל overpopulate כלובים עם יותר מ -150 זבובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשש דגימות לשכפל לתנאי ניסוי. מאז תמציות בעלי חיים שלמות להניב יותר מטבוליטים, כדי ליצור מדגם 1 של כל בעלי החיים מבודד, להעביר 50 נקבה עפה לכלוב אחד. באשר למבודד במיטוכונדריה, להשתמש שש דגימות לשכפל לתנאי ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלובי מקום במהירות של 25 מעלות צלזיוס עם מחזור של 12 שעות אור וחושך 12 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק מזון טרי כל 2 או 3 ימים בבקבוקון עם 5 מיליליטר של מזון כדי לשמור על איכות מזון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על זבובים על מזון במשך 10 ימים. צעד זה נחוץ לטיפול rapamycin 7. טיפולים או מצבים אחרים יהיו שונים. </li></ol> 3. בידוד של שברי מיטוכונדריאלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזבלה עפה מכלוב אחד (150 זבובים) לhomogenizer dounce זכוכית טפלון מלא 1 מיליליטר של חיץ בידוד מצונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize ידי הזזת העלי למעלה ולמטה במשך 15 משיכות. שמור מרגמה על קרח כדי לשמור על שלמות מיטוכונדריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההעברה homogenate לצינור 1.5 מיליליטר ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את supernatant ו צנטריפוגות ב6,000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להעשיר למיטוכונדריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כsupernatant מכיל חלק cytosolic, לבטל את supernatant או להשתמש בו לניסויים חלופיים. Resuspend גלולה ב300 μl של חיץ לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1-3.5 לכלוב השני. מערבבים את כדורי resuspended של שני הכלובים בצינור microcentrifuge קריוגני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 6000 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ופלאש להקפיא את גלולה בחנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את השברים המועשר המיטוכונדריה ב -80 ° C או בטמפרטורה נמוכה יותר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לבעלי חיים שלפני כלparation, למקם את המבוגרים בצינור microcentrifuge קריוגני. פלאש-להקפיא את הבקבוקון במבוגרים חנקן נוזלים חנות ב -80 ° C או בטמפרטורה נמוכה יותר. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Scheffler, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondria (Scheffler, Mitochondria). , 484 (2007).</li><li>Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria--a+nexus+for+aging,+calorie+restriction,+and+sirtuins.">Mitochondria--a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins.</a> Cell. 132 (2), 171-176 (2008).</li><li>Raimundo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+pathology:+stress+signals+from+the+energy+factory.">Mitochondrial pathology: stress signals from the energy factory.</a> Trends in molecular medicine. 20 (5), 282-292 (2014).</li><li>Embley, T. M., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+evolution,+changes+and+challenges.">Eukaryotic evolution, changes and challenges.</a> Nature. 440 (7084), 623-630 (2006).</li><li>Lane, N., , <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the Meaning of Life. 368, (2006).</li><li>Montooth, K. L., Meiklejohn, C. D., Abt, D. N., Rand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial-nuclear+epistasis+affects+fitness+within+species+but+does+not+contribute+to+fixed+incompatibilities+between+species+of+Drosophila.">Mitochondrial-nuclear epistasis affects fitness within species but does not contribute to fixed incompatibilities between species of Drosophila.</a> Evolution; international journal of organic evolution. 64 (12), 3364-3379 (2010).</li><li>Villa-Cuesta, E., Holmbeck, M. A., Rand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapamycin+increases+mitochondrial+efficiency+by+mtDNA-dependent+reprogramming+of+mitochondrial+metabolism+in+Drosophila.">Rapamycin increases mitochondrial efficiency by mtDNA-dependent reprogramming of mitochondrial metabolism in Drosophila.</a> Journal of cell science. 127 (Pt 10), 2282-2290 (2014).</li><li>Zhu, C. -. T., Ingelmo, P., Rand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&#215;G&#215;E+for+Lifespan+in+Drosophila:+Mitochondrial,+Nuclear,+and+Dietary+Interactions+that+Modify+Longevity.">G&#215;G&#215;E for Lifespan in Drosophila: Mitochondrial, Nuclear, and Dietary Interactions that Modify Longevity.</a> PLoS genetics. 10 (5), e1004354 (2014).</li><li>Madala, N. E., Piater, L. A., Steenkamp, P. A., Dubery, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivariate+statistical+models+of+metabolomic+data+reveals+different+metabolite+distribution+patterns+in+isonitrosoacetophenone-elicited+Nicotiana+tabacum+and+Sorghum+bicolor+cells.">Multivariate statistical models of metabolomic data reveals different metabolite distribution patterns in isonitrosoacetophenone-elicited Nicotiana tabacum and Sorghum bicolor cells.</a> SpringerPlus. 3, 254 (2014).</li><li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+Studies+Of+Mammalian+Tissues+I+.+Isolation+Of+Intact+Mitochondria+From+Rat+Liver+Some+Biochemical+Properties+Of+Mitochondria+And+Submicroscopic+Particulate+Material.">Cytochemical Studies Of Mammalian Tissues I . Isolation Of Intact Mitochondria From Rat Liver Some Biochemical Properties Of Mitochondria And Submicroscopic Particulate Material.</a> Journal of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).</li><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+isolation:+functional+mitochondria+from+mouse+liver,+muscle+and+cultured+fibroblasts.">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nature protocols. 2 (2), 287-295 (2007).</li><li>Corcelli, A., Saponetti, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+isolated+in+nearly+isotonic+KCl+buffer:+focus+on+cardiolipin+and+organelle+morphology.">Mitochondria isolated in nearly isotonic KCl buffer: focus on cardiolipin and organelle morphology.</a> Biochimica et biophysica acta. 1798 (3), 681-687 (2010).</li><li>Roede, J. R., Park, Y., Li, S., Strobel, F. H., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+mitochondrial+phenotyping+by+high+resolution+metabolomics.">Detailed mitochondrial phenotyping by high resolution metabolomics.</a> PloS one. 7 (3), e33020 (2012).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה הם: 1) גידול מספיק זבובים בחלל בשפע. זה מאוד חשוב שלא לגרום להתפוצצות אוכלוסין כלובי דמוגרפיה עם יותר מ -150 זבובים כל אחד; 2) שינוי המזון של הכלובים לעתים קרובות כדי למנוע תחרות מזון ומתח תזונתי; ו 3) שמירה על כל הדגימות ב 4 ° C כדי להבטיח את השלמות בבידוד של חלק המיטוכונדריה. מומלץ גם לצנן את חיץ הבידוד, לשטוף חיץ, וhomogenizer dounce זכוכית הטפלון לפני השימוש. כדי להפחית את זיהום cytosolic של פלגי המיטוכונדריה המועשר, גלולה המיטוכונדריה מצעד 3.5 יכולה לשטוף עם חיץ לשטוף. החילוץ של מטבוליטים משברי המיטוכונדריה מועשרות דורש מספר גבוה של דגימות לשכפל (6 חזרות / תנאי ניסוי). בסך הכל, 24 כלובים המשמשים לאיורים 1 ו -2. אנו ממליצים על ביצוע החילוץ של כל יםamples באותו היום כדי להקטין השתנות ניסיונית. למרות שאפשרי, פרוטוקול זה כרוך בתכנון והכנה של חומרים הדרושים מבעוד מועד זהירים. יש צורך בתיוג של הצינורות לפני הזמן, ועיצוב תכנית להבטיחה עקביות של זמני המתנה בין הדגימות לשמר את איכות דגימה וכדי להקטין את השונות בין משכפל. המאגרים משמשים בדרך כלל כדי לחלץ המיטוכונדריה מכילים סוכרים 10,11; ומכאן, הניתוח של מטבוליטים סוכר מסוימים עשוי להיות מושפע משיטת החילוץ. למרות שאנו לא השתמשנו בהם בניתוח שלנו, מאגרי חילוץ KCl עשויים להיות אלטרנטיבה למאגרי בידוד המיטוכונדריה המכילים סוכרים 12. בשל אופי homeostatic של רשתות מטבוליות ומערכת מורכבת של אותות סלולריים שמתווכים את התגובה הזאת, שינויים בחילוף חומרים של המיטוכונדריה יכולים להיות מזוהים על ידי משמרות בבריכות המטבוליט תא כולו. במקרה של mitochondרגולציה ריאל של מערכות כאלה, משמרות המטבוליט עדינות עשויות להתעכב, אלא אם כן מספיק מטבוליטים מופקים משברים מועשרות במיטוכונדריה. במערכות מודל שבו שפע של המיטוכונדריה יכול להיות מבודדת מהרקמה, metabolomics רזולוציה הגבוה זיהה בהצלחה שינויים בפנוטיפים המיטוכונדריה 13. עם זאת, בmelanogaster דרוזופילה, מחסה מספיק מטבוליטים איכות להרכב טוב של מדגם עשויה להציג אתגר. שימוש בפרוטוקול זה השגנו כמות גבוהה, איכות ומגוון רחב של מטבוליטים על מנת להוכיח כי פרוטוקולי חילוץ שונים לחשוף משמרות המטבוליט שונות לשברי המיטוכונדריה כל-לטוס לעומת. למרות הכתם המערבי של חלבונים במיטוכונדריה וcytosolic מרמז זיהום קטן של חלבונים בשני שברים, כדי לאשר מדידות כמותיות מפורטות של מטבוליטים של המיטוכונדריה, צעדים נוספים להגבלת זיהום של מטבוליטים cytosolic בשבריר המיטוכונדריה יכולה להיות Applמטען. מדידה של מטבוליטים לפני הקפאת המדגם והשוואה של מטבוליטים אלה לאלה שהושגו לאחר הצעד / הפשרה ההקפאה עשויה לספק כימות מדויק יותר של מטבוליטים מסוימים של המיטוכונדריה. עם זאת, במודל זה שבו אנו לשנות את הגנום המיטוכונדריאלי, הנהלים שמשמשים להכנת דגימות במיוחד אינפורמטיבי ועשויות להצביע על מסלולי רומן של תכנות מחדש חילוף חומרים בתיווך דרך המיטוכונדריה.

המטרה של הליך זה היא לפתח שברים המיטוכונדריה מועשרות שיניבו מספיק מטבוליטים המיטוכונדריה ללימודי metabolomics באמצעות melanogaster תסיסנית. מניסיוננו, metabolomics ניתוח תוך שימוש בשיטות מיצוי סלולארי כל אינם מסוגלים לזהות שינויי המטבוליט המיטוכונדריה עדינים בדרוזופילה. עם זאת, fractioning המיטוכונדריה לפני ניתוח metabolomics מגביר את הרגישות לזהות משמרות המטבוליט המיטוכונדריה. המיטוכונדריה הם אברונים תאיים אחראים על מתן 90% מהאנרגיה שתאים צריכים לתפקוד נורמלי 1. בשנים האחרונות זה כבר הכיר בכך שהמיטוכונדריה לשחק הרבה יותר דינמי תפקיד בתפקוד תאי והאורגניזם מאשר רק ייצור אדנוזין טריפוספט (ATP), וכעת הם מוכרים כרכזות להסדרת 2,3 הומאוסטזיס חילוף חומרים. המיטוכונדריה הוא התוצאה של תהליך שבו endosymbiotic דיסשושלות חיידקי tinct התמזגו ~ לפני 1.5 מיליארדים שנים 4. כמיטוכונדריה התפתחה לאברונים אמיתיים, גנים מאנדוסימביוזה שולבו בגנום הגרעיני המתפתח. בבעלי חיים היום, כ -1,500 חלבוני המיטוכונדריה הם בקידוד גרעיניים תוך 37 גנים להישאר בmtDNA, 13 מהם לקודד חלבוני המיטוכונדריה שהם תת-יחידות של מתחמי האנזים של זרחון חמצוני 5. יש צורך בתיאום בין המיטוכונדריה ותאים גרעיניים כדי לשמור על תפקוד המיטוכונדריה נכון. שימוש בשיטות שתוארו כאן היינו מסוגל לזהות שינויים מטבוליים המיטוכונדריה בתסיסנית הנובעים ממניפולציה של התיאום בין הגנום המיטוכונדריאלי והגרעיני. אנחנו השתמשנו בזן של דרוזופילה בי mtDNA ממיני אחותה ד simulans הונח על ד בודד melanogaster רקע גרעיני 6. mitonuclear &#39;שיבש&#39; זהגנוטיפ הושווה לגנוטיפ mitonuclear &#39;הילידים&#39;, או-התפתח שיתוף של ד melanogaster נושא את אותו הגנום גרעיני עם ד המקורי שלו melanogaster mtDNA. ד melanogaster וד &#39; simulans mtDNAs שונה על ידי ~ 100 חומצות אמינו ו&gt; 500 החלפות נרדפים המשפיעות 7,8 תקשורת mitonuclear. אנחנו שנוצרנו תמציות לטוס כל ותמציות מועשרות המיטוכונדריה ללמוד משמרות המטבוליט בתגובה ללחץ תרופתי. כאן אנו מראים כי בעת שימוש שבברי המיטוכונדריה המועשרת לזהות שינויים בולטים במטבוליטים המיטוכונדריה בין גנוטיפ נשא ד הילידים, התפתח-שיתוף mtDNAs melanogaster וגנוטיפ שיבש נשא ד simulans mtDNA. לעומת זאת, שינויי המטבוליט בין שני גנוטיפים אלה הם עדינים תוך שימוש בשיטות רגילות לנצל תמצית לטוס כולה. לכן, שיטה זו סיפקה דרך להבין כיצד mtDNAs לתווך שינויי המיטוכונדריה בתגובה לתרופות שונות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2% tegosept -methyl 4-hydroxybenzoate&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAA14289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>792799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>38057&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCL&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RES3098T-B7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1551139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 pads to anesthetize flies</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>MINJ-DROS-FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 liter cage&#160;</td>
			<td>Web Restaurant Store</td>
			<td>999RD32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 liter cage lid&#160;</td>
			<td>Web Restaurant Store</td>
			<td>999LRD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a glass-teflon dounce homogenizer&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9661231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rapamycin&#160;</td>
			<td>LC Laboratories&#160;</td>
			<td>R-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-porin</td>
			<td>MitoSciences</td>
			<td>MSA03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-alpha tubulin</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>12G10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#8482; BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 pad</td>
			<td>Tritech Research, Inc</td>
			<td>MINJ-DROS-FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter flask</td>
			<td>enasco</td>
			<td>SB08184M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber stopper</td>
			<td>enasco</td>
			<td>S08512M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of mitochondrial enriched fractions for metabolic analysis in drosophila

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions. 
Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.

שימוש בפרוטוקול שהוסבר לעיל, ביצענו ניתוח metabolomic על שברים מועשרות המיטוכונדריה ותמציות בעלי חיים שלמות כדי לבדוק את ההשפעה של התרופה על Rapamycin mtDNAs מסתעף 7. אנו נמסרו 200 מיקרומטר של rapamycin ידי המסת התרופה במזון הזבוב. זבובים נחשפו לRapamycin במשך 10 ימים. מטבוליטים מתמציות לטוס כל ומתמציות המיטוכונדריה התקבלו על ידי שימוש בספקטרומטר מסת גז כרומטוגרפיה (GC / MS) וספקטרומטריית כרומטוגרפיה הנוזלית-טנדם מסה (LC / MS / MS) תוך שימוש בשיטות מיצוי ממס סטנדרטית. איור 1 מציג העשרת Porin חלבון תחבורת קרום כאינדיקציה להעשרת המיטוכונדריה שבברי המיטוכונדריה. חלבון Porin היה בלתי ניתן לגילוי שבברי cytosolic. לעומת זאת, חלבון טובולין לא זוהה בחלק המיטוכונדריה, suggesting זיהום קטן של חלבוני cytosolic. איור 2 ואיור 3 ניתוח מופע רכיבי עיקרון (PCA) של פרופילי המטבוליט מלאים מד &#39;הילידים&#39; זן melanogaster (OreR) והזן &quot;שיבש&quot; של זבובים מחסה mtDNA מד simulans וDNA הגרעיני מד זן melanogaster OreR (sm21). שני הזנים נחשפו לrapamycin הסמים. הנתונים מוצגים כדו-עלילה של רכיב עיקרון צירי 1 ו -2 כדי להמחיש את ההשפעה של טיפול וmtDNAs 7,9. מטבוליטים שהושגו באמצעות תמצית לטוס כל סטנדרטית מוצגים באיור 2 א. איור 2 מציג עלילת PCA דומה למטבוליטים בתמציות מועשרות במיטוכונדריה. לתמציות כל זבוב (איור 2 א), טיפול rapamycin sifts הדגימות לערכים נמוכים באופן משמעותי של PC2. עם זאת, שינויים במטבוליטים בשל mtDNA genotype הם עדינים, מאז mtDNAs OreR וsm21 נחשף לrapamycin או רכב שליטה צמוד צמוד או חפיפה בחלל PCA. עם זאת, בעת שימוש בתמציות המיטוכונדריה מועשרות, mtDNAs להראות השפעות rapamycin ברורות על פרופילי המטבוליט המיטוכונדריה. בפרט, יש rapamycin השפעה חזקה על פרופילי מטבוליט של מתח OreR, שמוצגים על ידי העקירה לאורך ציר PC1. אבל, בגנוטיפ &#39;שיבש&#39; sm21 mtDNA, פרופיל המטבוליט למצב שליטה מזון נעקר מזה של הזן המקומי OreR (מצולעים אדומים ושחורים, בהתאמה, באיור 2). כתוצאה מכך, טיפול rapamycin יש ניכר פחות השפעה על השינוי של נופי המטבוליט בגנוטיפ mtDNA שיבש, sm21 (השווה מצולעים אדומים והכחולים באיור 2). איור 3 מראה עמ PCAהמון מטבוליטים מעורבים בהומאוסטזיס אנרגיה (קבוצת משנה של כל המטבוליטים, מוגבל לקו-פקטורים, ויטמינים וחומרי ביניים מעגל קרבס), הממוקמים בדרך כלל בתוך המיטוכונדריה. הנה שוב, משמרות המטבוליט משברי המיטוכונדריה מועשרות להראות התנהגות שונה מאלה מתמציות של בעלי חיים שלמים. תוצאות אלו מדגימות כיצד חילוף חומרים מידע שהושג על ידי תמצית מועשרת המיטוכונדריה ותמציות של בעלי חיים שונים כל אבל משלים אחד את השני, עם התמצית המועשרת המיטוכונדריה להיות רגישה יותר לשינויים מטבוליים במיטוכונדריה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53149/53149fig1.jpg" /> 1. ניתוח איור מערבי כתם מראה הפרדה יעילה של המיטוכונדריה שבברי המיטוכונדריה. נוגדנים השתמשו היו נגד Porin (חלבון קרום חיצוני של המיטוכונדריה) וטובולין (חלבון cytosolic). חלבון<html> שפע של שברי המיטוכונדריה וcytosolic היה לכמת באמצעות חומצת bicinchoninic assay (BCA). 30 מיקרוגרם של חלבון כולל הועמס בכל מסלול. שתי עקירות עצמאיות בוצעו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53149/53149fig2.jpg" /> 2. ניתוח איור עיקרון רכיב (PCA) של מטבוליטים שהושגו באמצעות דגימות כל בעלי חיים לעומת תמציות מועשרות המיטוכונדריה על זבובים שנשאו OreR וsm21 haplotypes המיטוכונדריה. () PCA של 210 מטבוליטים שזוהו בדגימות בעלי חיים שלמות. PCA (B) של 230 מטבוליטים זוהו בתמציות של המיטוכונדריה. מצולעים המקיפים נקודות נועדו לסייע להדמיה של שש דגימות לשכפל לכל טיפול.k &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53149/53149fig3.jpg" /> איור 3. ניתוח עיקרי רכיב של מטבוליטים מעורבים בהומאוסטזיס אנרגיה על זבובים שנשאו OreR וhaplotypes המיטוכונדריה sm21. () PCA של 12 מטבוליטים אנרגיה מתמציות לטוס כל ו -13 מטבוליטים אנרגיה מתמציות של המיטוכונדריה. מצולעים (ב) המקיפים את הנקודות נועדו לסייע להדמיה של שש דגימות לשכפל לכל טיפול. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53149/53149fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila at JoVE.com

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.

הכנת הברים מועשר מיטוכונדריאלי לניתוח חילוף חומרים ב<em&gt; דרוזופילה</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

preparation-mitochondrial-enriched-fractions-for-metabolic-analysis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

9.5K Views.  Adelphi University. Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster. 

Video: Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, organism development, and disease. It is often desirable to obtain PPI information using in vivo material, to gain the most natural and unbiased view of the interaction networks. The fruit fly Drosophila melanogaster is an excellent platform to study PPIs in vivo, and lends itself to straightforward approaches to isolating material for biochemical experiments. In particular, fruit fly embryos represent a convenient type of tissue to study PPIs, due to the ease of collecting animals at this developmental stage and the fact that the majority of proteins are expressed in embryogenesis, thus providing a relevant environment to reveal most PPIs. Here we present a protocol for collection of Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g), which is an ideal amount for a wide range of proteomic applications, including analysis of PPIs by affinity purification-mass spectrometry (AP-MS). We describe our designs for 1 L and 5 L cages for embryo collections that can be easily and inexpensively set up in any laboratory. We also provide a general protocol for embryo collection and protein extraction to generate lysates that can be directly used in downstream applications such as AP-MS. Our goal is to provide an accessible means for all researchers to carry out the analyses of PPIs in vivo.

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

The goal of this protocol is to provide a straightforward and inexpensive approach to collecting Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g) and preparing protein extracts that can be used in downstream proteomic applications, such as affinity purification-mass spectrometry (AP-MS).

הכנה בינונית של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברי תמציות עבור ניסויים פרוטאומיים

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy. The sub-diffraction limit resolution capabilities of super-resolution light microscopes allow improving the accuracy of the correlated data. Briefly, 110 nanometer thick cryo-sections are transferred to a silicon wafer and, after immunofluorescence staining, are imaged by super-resolution light microscopy. Subsequently, the sections are preserved in methylcellulose and platinum shadowed prior to imaging in a scanning electron microscope (SEM). The images from these two microscopy modalities are easily merged using tissue landmarks with open source software. Here we describe the adapted method for the larval zebrafish retina. However, this method is also applicable to other types of tissues and organisms. We demonstrate that the complementary information obtained by this correlation is able to resolve the expression of mitochondrial proteins in relation with the membranes and cristae of mitochondria as well as to other compartments of the cell.

This protocol describes the necessary steps to obtain subcellular protein localization results on zebrafish retina by correlating super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy images.

רזולוציה סופר correlative ואלקטרון לפתרון חלבון לוקליזציה ברשתית דג זברה

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and behavioral evolution. Drosophila olfactory tissues house the olfactory receptor neurons (ORNs) that detect volatile chemical cues in addition to hydro- and thermo-sensory neurons. In this protocol, we describe the dissection of developing peripheral olfactory tissue of the adult Drosophila species. We first describe how to stage and age Drosophila larvae, followed by the dissection of the antennal disc from early pupal stages, followed by the dissection of the antennae from mid-pupal stages and adults. We also show methods where preparations can be utilized in molecular techniques, such as the RNA extraction for qRT-PCR, RNAseq, or immunohistochemistry. These methods can also be applied to other Drosophila species after species-specific pupal development times are determined, and respective stages are calculated for appropriate aging.

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Here, we present a protocol to stage and dissect developing olfactory tissue from Drosophila species. The dissected tissue can later be used for molecular analyses, such as quantitative RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) or RNA sequencing (RNAseq), as well as in vivo analyses such as immunohistochemistry or in situ hybridization.

הכנת לפתח רקמות היקפיים חוש הריח עבור מולקולרית וניתוח Immunohistochemical ב דרוזופילה

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal metabolism. By combining the vast array of Drosophila genetic tools with the ability to survey large swaths of intermediary metabolism, a metabolomics approach can reveal complex interactions between diet, genotype, life-history events, and environmental cues. In addition, metabolomics studies can discover novel enzymatic mechanisms and uncover previously unknown connections between seemingly disparate metabolic pathways. In order to facilitate more widespread use of this technology among the Drosophila community, here we provide a detailed protocol that describes how to prepare Drosophila larval samples for gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)-based metabolomic analysis. Our protocol includes descriptions of larval sample collection, metabolite extraction, chemical derivatization, and GC-MS analysis. Successful completion of this protocol will allow users to measure the relative abundance of small polar metabolites, including amino acids, sugars, and organic acids involved in glycolysis and the TCA cycles.

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics

This protocol describes how to prepare Drosophila larvae for GC-MS-based metabolomic analysis.

הכנת דוגמאות זחל דרוזופילה עבור גז כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית (GC-MS)-מבוסס מטבולומיקס

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

דיסקציה של הרשתית הגולמי דרוזופילה אימונוהיסטוכימיה, ניתוח המערבי של RNA בידוד

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

הדמיה חיה וניתוח של התכווצויות שרירים בתוך העובר דרוזופילה

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

מפשיר Culturing, Cryopreserving שורות תאים דרוזופילה

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

הכנת מדרוזופילה זחל ופופל אשכים לניתוח חטיבת תאים בשידור חי, רקמה שלמה

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

הכנת הברים מועשר מיטוכונדריאלי לניתוח חילוף חומרים ב

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video