Name: 3d hydrogel scaffolds for articular chondrocyte culture and cartilage generation
Uploaded: 2015-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation at JoVE.com

The authors would like to acknowledge Stanford Department of Orthopaedic Surgery and Stanford Coulter Translational Seed Grant for funding. J.H.L. would like to thank National Science Foundation Graduate Fellowship and DARE Doctoral Fellowship for support.

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות של נבדקי סטנפורד אדם האוניברסיטה ואישרו פרוטוקול Institutional Review Board. 1. בידוד Articular הכונדרוציטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג סחוס מהרקמה שהושלכה במהלך החלפת מפרק הברך ולנתח כפי שתואר לעיל 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחינה ויזואלית לבחור condyles הירך המדיאלי או לרוחב של דגימות סחוס למשטחים חלקים ולעשות חתך על פני השטח של הסחוס באמצעות אזמל כדי להסיר 4-5 ביופסיות סחוס מ&quot;מ מבלי להשפיע על עצם subchondral. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד כונדרוציטים מהמטריצה ​​תאית על ידי ניתוק האנזימטית של הרקמה עם O טיפול / N עם collagenase המטוהר. השתמש 1: 1 יחס של Collagenase השני (125 U / ml) וCollagenase IV (160 U / ml) בתקשורת צמיחה הכונדרוציטים על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לסנן את הרקמה מתעכל המכיל את התאים ניתקו דרך 70מ&quot;מ נקבובית רשת ניילון גודל. לשטוף פעמיים עם 20 מיליליטר של DMEM / F12 וצנטריפוגות ב 600 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט כונדרוציטים המבודדים בצפיפות של צלחת תרבות 1 x 10 6 תאים / 60 מ&quot;מ הבא מחדש השעיה בDMEM / F12 בתוספת 10% העוברי בסרום שור (FBS), 25 מיקרוגרם / מיליליטר ascorbate, L-גלוטמין 2 מ&quot;מ, אנטיביוטיקה (100 U / פניצילין מיליליטר, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, ו 0.25 מיקרוגרם / fungizone מיליליטר). שמור את הצלחות על 37 מעלות צלזיוס ולשמור על התרבויות הכונדרוציטים העיקריות כmonolayer צפיפות גבוהה לפני אנקפסולציה בהידרוג&#39;ל biomimetic. </li></ol> ייצור 2. Biomimetic Hydrogel הערה: שיטה זו מאפשרת את הסינתזה של הידרוג&#39;ל biomimetic המכיל פולי (diacrylate אתילן גליקול) (PEGDA, גרם MW 5000 / שומה), סולפט-methacrylate כונדרואיטין (CS-MA) בDPBS. התוספת של photoinitiator מאפשרת crosslinking photoactivated. הרכב הידרוג&#39;ל הסופי מכיל 7% לשקולt / נפח (w / v) של PEGDA, 3% w / v של CS-MA, ושל 0.05% w / v של photoinitiator. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנתז CS-MA ידי functionalizing פולימר CS עם קבוצות methacrylate. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון שנאגרו של 50 מ&quot;מ חומצה 2-morpholinoethanesulfonic (MES) ו0.5 M נתרן כלורי (NaCl) על ידי המסת 1.952 גרם של MES ו5.84 גרם של NaCl ב200 מיליליטר של מים ללא יונים (DiH 2 O). לפזר 5 גרם של מלח נתרן כונדרואיטין סולפט בפתרון שנאגרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף .532 גרם (4.62 mmol) N-hydroxysuccinimide (NHS) ו1.771 גרם (9.24 mmol) 1-אתיל-3 (3-dimethylaminopropyl) hydrochloride -carbodiimide (EDC) (יחס טוחנת של NHS: EDC = 1: 2) ל הפתרון ומערבבים במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף .765 גרם (4.62 mmol) methacrylate 2-aminoethyl (AEMA) (יחס טוחנת של NHS: EDC: AEMA = 1: 2: 1) לפתרון ולשמור על התגובה ב RT למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את התערובת על ידי דיאליזה נגד מים ללא יונים (diH 2 O) במשך 4 ימים באמצעות צינורות דיאליזה (12-14 kDa MWCO). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את pפתרון urified דרך מסנן 0.22 מיקרומטר ולמקם את הצינורות הפתוחים המכילים את הפתרון בO הייבוש והוואקום / N. ודא שכל הצינורות מוגנים מפני אור. אחסן את הפולימר המומס ב -20 ° C המוגנים מפני אור ולחות. </li></ol></li></ol> Encapsulation 3. הסלולרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי מוטות סרט וגלילי PCR (על חבטות את הידרוג 3D תא-לאדן) ולעקר את תבנית ג&#39;ל הגלילית מחוייט על ידי טבילה ב0.2 מיקרומטר אתנול 70% מסוננים במכסת מנוע בתרבית רקמה תחת אור UV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את תחתית תבנית ג&#39;ל עם סרט PCR autoclaved ללא בועות אוויר או פערים כדי למנוע הדלפות. שמור את זה בצלחת 150 מ&quot;מ סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום לפני אנקפסולציה התא בהידרוג&#39;ל biomimetic, לנתק את monolayer הכונדרוציטים בצפיפות גבוהה עם O טיפול / N בCollagenase השני ופתרון Collagenase IV. השתמש 125 U / ml לCollagenase השני ו -160 U / ml לCollagenase VI כל בצמיחה הכונדרוציטים תקשורתעל 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח צינור 50 מ&quot;ל ולהוסיף 5% במשקל / נפח (w / v) (diacrylate אתילן גליקול) פולי (PEGDA, MW = g 5000 / שומה), 3% w / סולפט-methacrylate נ &#39;כונדרואיטין (CS-MA), ו 0.05% w / v photoinitiator בDPBS. מערבולת הצינור לערבב את הפתרון ולשמור אותו בצד. להגן על הצינור מהאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התאים ניתקו בצינור פלקון 50 מיליליטר, ולספור צנטריפוגות ב 460 XG במשך 5 דקות. לשאוב את כל התקשורת מצינור התאים ולהוסיף חומר ג&#39;ל המעורב לעיל כדי מחדש להשעות תאים בצפיפות של 15 × 10 6 תאים / מיליליטר. מערבבים אותו 30 פעמים ביסודיות, תוך הימנעות היווצרות בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 72 μl של ההשעיה התא-הידרוג&#39;ל או הידרוג&#39;ל לבד לתוך תבנית ג&#39;ל הגלילי מחוייט ולהשרות gelation באמצעות חשיפה לאור UV (365 ננומטר אורך גל) בשעה 3 mW / m 2 למשך 5 דקות. הכן כמה פתרון הידרוג&#39;ל ללא תוכן סלולארי. השתמש במבנים אלה כפקדים שליליים לבדיקה ביוכימית ומכאנית העתיד. Measuמחדש את עוצמת אור UV עם מד עוצמת קרינת UV. כדי להתאים את עוצמת, לשנות את המרחק בין מקור אור UV ופיגום הידרוג&#39;ל במהלך gelation. הערה: מאחר הידרוג&#39;ל מכיל CS, תרומת acellular יורדת מתוכן GAG ביוכימיים של הידרוג&#39;ל התא-לאדן לייצג GAG הסלולרי בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באזמל כדי לחתוך את הסרט לקליפה קלה והסר אותו בזהירות. בעזרת המוטות גליליות, לדחוף את הג&#39;ל לתוך צלחת גם 6 עם 5 מיליליטר של DPBS סטרילי כדי לשטוף את הג&#39;ל unpolymerized ותאים רופפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות הידרוג התא-לאדן ב -24 צלחות גם מכילות 1.5 מיליליטר של תקשורת צמיחה הכונדרוציטים לכל אחד. השתמש במרית חד פעמית להעביר את הידרוג שטף לתוך הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את כדאיויות תא על ידי צביעת 24 הודעה אנקפסולציה-שעות מתות החי באמצעות ערכת הכדאיות / cytotoxity. תרבות הידרוג התא-לאדן והידרוג הריק במשך 3-6 שבועות משתנה לGro הכונדרוציטים הטריwth תקשורת כל 2 ימים לפני קציר לניתוחים. </li></ol> 4. ניתוח ביטוי RNA חילוץ וג&#39;ין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב התקשורת ולשים סטרילי PBS 1X בתא-לאדן, כמו גם את הידרוג השליטה הריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מרית סטרילי, להעביר את כל הידרוג&#39;ל לצינור Eppendorf נקי 1.5 מיליליטר ולהוסיף 250 μl של Tri-מגיב על צינור אחד. עקוב אחר ההוראות של היצרן לבודד RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בידוד RNA וכימות שימוש 1 מיקרוגרם שלו מכל מדגם ולבצע שעתוק הפוך לcDNA באמצעות הקיבולת גבוהה cDNA הפוך תמלול ערכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לPCR כמו להשתמש מערכי ביטוי גני TaqMan לבחינת הביטוי של גני עניין שלך. לנרמל את רמות ביטוי גנים פנימיים לGAPDH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתנאי PCR כולל דגירה 2 דקות ב 50 מעלות צלזיוס כדי להשבית amplicons הקודמת עם glycosylase אורציל-דנ&quot;א, ואחריו 1060; דקות דגירה על 95 מעלות צלזיוס כדי להפעיל את פולימראז תקי. ואז לבצע מחזורים ארבעים של PCR, בהיקף של 15 שניות על 95 מעלות צלזיוס, ודקות 1 ב 60 ° C. </li></ol> 5. ניתוח ביוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל מבני תא-הידרוג&#39;ל לכמת DNA וייצור glycosaminoglycan הגופריתי (sGAG) כדלקמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב התקשורת ולשים סטרילי PBS 1X בתא-לאדן, כמו גם את הידרוג השליטה הריק. לשקול צינור ריק ולשים בתוך הידרוג&#39;ל לאחר סופג את זה על נייר ולרשום את המשקל או המשקל רטוב של הידרוג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא כל הידרוג&#39;ל ב -20 ° C בצינור 1.5 מיליליטר נפרד eppendorf לעיכול אנזימטי ולאחר מכן להשתמש aliquot של המוצר מתעכל לרוץ assay PicoGreen (לDNA) וassay הכחול דימתיל-מתילן (לGAG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון papainase לעיכול אנזימטי של הידרוג&#39;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשון להכין את חיץ PBE על ידי שקילה מתוך 7.1 גרם של נתרן phosphatdibasic דואר (Na 2 4 HPO) ו -1.6 גרם של מלח disodium חומצת Ethylenediaminetetraacetic (EDTA-Na 2). ממיסים בכ -500 מיליליטר של DH 2 O, להתאים את ה- pH 6.5 ולסנן את הפתרון המטוהר דרך מסנן 0.22 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 0.035 גרם של L-ציסטאין ב 20 מיליליטר של חיץ PBE. סנן את הפתרון ושל אנזים פפאין סטרילי 100 μl. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מוכן לבצע את מבחני, לקחת את הצינורות מ-20 ° C ולהוסיף 300 μl של פתרון פפאין מוכן הידרוג הקפוא. למחוץ את הג&#39;ל עם מכתש ועלי ולערבב אותו היטב עם העלי המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביא את הנפח 500 μl עם פתרון פפאין נוסף. בצע את אותו ההליך לג&#39;לי השליטה. לדגור על 60 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות 3,9. התמיסה המכילה הידרוג&#39;ל מתעכל ולכן יכולה לשמש לדנ&quot;א וכימות GAG. מדוד את תוכן ה- DNA באמצעות assay PicoGreen עם DNA הפאג מבדה כסטנדרט הבא יחסי הציבור של היצרןotocol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את התוכן הגופריתי-GAG באמצעות כחול 1.9-dimethylmethylene (DMMB) assay מחייב צבע עם כונדרואיטין סולפט הכריש כמו 10 סטנדרטיים. לקבוע את תוכן GAG על ידי חלוקת הסך של GAG למשקל הרטוב המקביל. </li></ol> 6. מכאני בדיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע בדיקות דחיסת unconfined באמצעות מערכת בדיקת Instron 5944 מצוידות בתא מטען 10 N. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הימים הרצויים של תרבות במבחנה, לבצע את בדיקת הדחיסה על פיגום התא-הידרוג&#39;ל והידרוג שליטת acellular. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את הדגימות באמבט PBS ב RT ולדחוס בשיעור של 1% מתח / sec למתח מרבי של 15% מאז 11,12 המתח הפיזיולוגי חווה ברקמת סחוס בתנאי טעינה כבר דיווח להיות 10-20% 13,14. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור מתח לעומת עקומות מתח וכושר עקום באמצעות משוואת פולינום סדר שלישי. לקבוע comprמודול משיק essive ממשוואת הכושר העקום בערכי מתח של 15%. </li></ol>

<ol>
	<li>Roberts, S., Menage, J., Sandell, L. J., Evans, E. H., Richardson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+study+of+collagen+types+I+and+II+and+procollagen+IIA+in+human+cartilage+repair+tissue+following+autologous+chondrocyte+implantation.">Immunohistochemical study of collagen types I and II and procollagen IIA in human cartilage repair tissue following autologous chondrocyte implantation.</a> Knee. 16, 398-404 (2009).</li><li>Smeriglio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Potential+of+Juvenile+and+Adult+Human+Articular+Chondrocytes+for+Cartilage+Tissue+Formation+in+Three-Dimensional+Biomimetic+Hydrogels.">Comparative Potential of Juvenile and Adult Human Articular Chondrocytes for Cartilage Tissue Formation in Three-Dimensional Biomimetic Hydrogels.</a> Tissue engineering. Part A. , (2014).</li><li>Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+catalyze+cartilage+formation+by+neonatal+articular+chondrocytes+in+3D+biomimetic+hydrogels.">Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels.</a> Scientific reports. 3, 3553 (2013).</li><li>Taipale, J., Keski-Oja, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors+in+the+extracellular+matrix.">Growth factors in the extracellular matrix.</a> FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11, 51-59 (1997).</li><li>Varghese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+sulfate+based+niches+for+chondrogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Chondroitin sulfate based niches for chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Matrix Biol. 27, 12-21 (2008).</li><li>Park, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+matrix+stiffness+on+the+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+in+response+to+TGF-beta.">The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-beta.</a> Biomaterials. 32, 3921-3930 (2011).</li><li>Wang, T., Lai, J. H., Han, L. H., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+Differentiation+of+Adipose-Derived+Stromal+Cells+in+Combinatorial+Hydrogels+Containing+Cartilage+Matrix+Proteins+with+Decoupled+Mechanical+Stiffness.">Chondrogenic Differentiation of Adipose-Derived Stromal Cells in Combinatorial Hydrogels Containing Cartilage Matrix Proteins with Decoupled Mechanical Stiffness.</a> Tissue engineering. Part A. , (2014).</li><li>Smith, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+intermittent+hydrostatic+pressure+and+BMP-2+on+osteoarthritic+human+chondrocyte+metabolism+in+vitro.">Effects of intermittent hydrostatic pressure and BMP-2 on osteoarthritic human chondrocyte metabolism in vitro.</a> J Orthop Res. 29, 361-368 (2011).</li><li>Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Kimura, J. H., Hunziker, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocytes+in+agarose+culture+synthesize+a+mechanically+functional+extracellular+matrix.">Chondrocytes in agarose culture synthesize a mechanically functional extracellular matrix.</a> J Orthop Res. 10, 745-758 (1992).</li><li>Farndale, R. W., Buttle, D. J., Barrett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+quantitation+and+discrimination+of+sulphated+glycosaminoglycans+by+use+of+dimethylmethylene+blue.">Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue.</a> Biochim Biophys Acta. 883, 173-177 (1986).</li><li>Lai, J. H., Levenston, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meniscus+and+cartilage+exhibit+distinct+intra-tissue+strain+distributions+under+unconfined+compression.">Meniscus and cartilage exhibit distinct intra-tissue strain distributions under unconfined compression.</a> Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society. 18, 1291-1299 (2010).</li><li>Li, L. P., Buschmann, M. D., Shirazi-Adl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-rate+dependent+stiffness+of+articular+cartilage+in+unconfined+compression.">Strain-rate dependent stiffness of articular cartilage in unconfined compression.</a> Journal of biomechanical engineering. 125, 161-168 (2003).</li><li>Armstrong, C. G., Bahrani, A. S., Gardner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+measurement+of+articular+cartilage+deformations+in+the+intact+human+hip+joint+under+load.">In vitro measurement of articular cartilage deformations in the intact human hip joint under load.</a> The Journal of bone and joint surgery. American. 61, 744-755 (1979).</li><li>Macirowski, T., Tepic, S., Mann, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+stresses+in+the+human+hip+joint.">Cartilage stresses in the human hip joint.</a> Journal of biomechanical engineering. 116, 10-18 (1994).</li><li>Benya, P. D., Shaffer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiated+chondrocytes+reexpress+the+differentiated+collagen+phenotype+when+cultured+in+agarose+gels.">Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels.</a> Cell. 30, 215-224 (1982).</li><li>Buckwalter, J. A., Mankin, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Articular+cartilage:+tissue+design+and+chondrocyte-matrix+interactions.">Articular cartilage: tissue design and chondrocyte-matrix interactions.</a> Instructional course lectures. 47, 477-486 (1998).</li><li>Wang, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+chondroitin+sulphate+for+cartilage+tissue-biomaterial+integration.">Multifunctional chondroitin sulphate for cartilage tissue-biomaterial integration.</a> Nat Mater. 6, 385-392 (2007).</li><li>Simson, J. A., Strehin, I. A., Allen, B. W., Elisseeff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bonding+and+fusion+of+meniscus+fibrocartilage+using+a+novel+chondroitin+sulfate+bone+marrow+tissue+adhesive.">Bonding and fusion of meniscus fibrocartilage using a novel chondroitin sulfate bone marrow tissue adhesive.</a> Tissue engineering. Part A. 19, 1843-1851 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

כפי שדווח בפרוטוקול זה, הידרוג 3D הם מסוגלים לשמור על הפנוטיפ הכונדרוציטים בתרבות, הימנעות התהליך של dedifferentiation תא לתאי fibrocartilage נתקלו בדרך כלל בתרבויות monolayer 15. יתר על כן, תרבויות לטווח ארוך של מבנה הידרוג&#39;ל chondrocytes- חשפו סביבה נוחה השומרת על תכונות תא הפנימיות הקשורים לגיל ומחלה. השימוש בהידרוג&#39;ל biomimetic 3D יש מספר יתרונות. ראשית, הכללתו של כונדרואיטין סולפט (CS), מרכיב עיקרי שנמצא בסחוס במפרק, מאפשר לתאים לבזות את מטריצת הידרוג&#39;ל על ידי הפרשת chondroitinase ונשכב סחוס מסונתז חדש נוספת הסלולר מטריצה ​​5, 16. בנוסף, CS הוכח יש תכונות אנטי דלקתיות במפרק דלקת פרקים. גם הידרוג&#39;ל biomimetic עשוי לשמש כחומר פיגומים למסירת תא בתיקון סחוס, ועשוי להיות שינוי כימיכדי להקל 17,18 שילוב רקמות ביולוגי טוב יותר. השימוש בהידרוג PEG-CS מאפשר טווח ארוך תרבויות של כונדרוציטים וההערכה של נכסים ביוכימיים ומכאניים. כאן אנו מראים כיצד פלטפורמה זו יכולה להיות שימושית עבור הניתוחים ההשוואתיים של מקורות שונים של כונדרוציטים מובחנים כדי להגדיר את סוג התא האופטימלי להנדסת סחוס. מעניין לציין, כונדרוציטים במארז בהידרוג&#39;ל להישאר קיימא ולהתרבות על פי היכולות הפנימיות שלהם. תומך הרכב הידרוג&#39;ל, למעשה, הצמיחה של כונדרוציטים לנוער ומבוגרים בריאים, כפי שמוצגת באיור 2. הרכב והמבנה של הידרוג&#39;ל תאר גם מקדמים היווצרות רקמת סחוס כפי שצוין על ידי התצהיר של מטריקס תפקודי הוערך על ידי glycosaminoglycan (GAG כימות). יתרון נוסף הוא שהמבנים הכונדרוציטים-הידרוג&#39;לניתן להעריך לתכונות מכאניות של רקמת הסחוס החדש שנוצרה. שים לב שבדיקת דחיסת unconfined צריכה להתבצע על הידרוג&#39;ל acellular להשוואה. הידרוג&#39;ל, למעשה, יש לי נוקשות פנימיות בשל הקשיחות של moieties CS. זן unconfined דחיסה של 5-20% (בשיעור של 1% מתח / ים) יכול להיות מיושם לבדיקה המכנית של רקמת סחוס 11,12 מאז את המתח הפיזיולוגי חווה ברקמת סחוס בתנאי טעינה כבר דיווח להיות 10-20 % 13,14. התגובה של הידרוג&#39;ל שני התאים-לאדן וacellular לבדיקות מכאניות הוערכה בסוף נקודות התרבות. בדוגמא שתוארה לעיל צפינו קשיחות דומה של המבנים המכילים כונדרוציטים מבוגרים ונוער בניגוד לקשיחות הנמוכה של המבנים המכילים כונדרוציטים OA. תכונות מכאניות כזה של מבנה התא-הידרוג&#39;ל מאפשרות ההערכה של המאפיינים הפונקציונליים שלרקמה שנוצרה נותנת ניתוח מעמיק של יכולת התבגרות תא. לסיכום, השימוש בהידרוג&#39;ל biomimetic 3D כדי לחקור את הפוטנציאל של אוכלוסייה הכונדרוציטים שונה כדי ליצור רקמת סחוס יכול להיות מיושם באופן נרחב. מלבד המחקרים במבחנה המתוארים כאן, השתלת in vivo של מבני התא-לאדן יכולה להיות שחזתה ללמוד התבגרות תא ופוטנציאל התחדשות בהקשר הפיזיולוגי. שינויים נוספים של פלטפורמת הידרוג&#39;ל עם גורמי biomimetic נוספים יכולים להיות גם חזה כדי לייעל התפשטות הכונדרוציטים והתבגרות.

With its limited self-repair potential, human articular cartilage undergoes frequent irreversible damages. Extensive efforts are currently focused on the development of efficient cell-based approaches for treatment of articular cartilage injuries. The success of these cell-based therapies is highly dependent on the selection of an optimal cell source and the maintenance of its regenerative potential. Chondrocytes are a common cell source for cartilage repair, but they are limited in supply and can de-differentiate during in vitro expansion in 2D monolayer culture thereby limiting their generation of hyaline cartilage 1. 
The aim of this protocol is to establish a 3-dimensional hydrogel platform for an in vitro comparative study of human chondrocytes from different ages and disease state. Unlike conventional two-dimensional (2D) culture, three-dimensional (3D) hydrogels allow chondrocytes to maintain their morphology and phenotype and provides a physiologically relevant environment enabling chondrocytes to produce cartilage tissue 2,3. In addition to providing a 3D physical structure for chondrocyte culture, hydrogels mimic the function of native cartilage extracellular matrix (ECM). Specifically, the inclusion of chondroitin sulfate methacrylate provides a potential reservoir for secreted paracrine factors 4 and enables cell-mediated degradation and matrix turnover 5. Although many 3D hydrogel culture systems have been utilized widely in various studies including agarose and alginate gels, we have used a biomimetic 3D culture system that has some distinct advantages for chondrocyte culture. Chondroitin sulfate (CS) is an abundant component in articular cartilage and the PEG-CS hydrogels have been shown to maintain and even enhance chondrogenic phenotype and facilitate cell-mediated matrix degradation and turnover 2,5. In addition, the mechanical properties of the hydrogel scaffold can be easily modulated by changing concentration of PEG and hence can be utilized to further enhance the regeneration potential of chondrocytes or a related cell type 6,7. PEG/CSMA is also biocompatible and hence has the potential for a direct clinical application in cartilage defects for example. The limitation for this system is its complexity and the use of photopolymerization that can potentially affect cell viability as compared to simpler systems like agarose, however the advantages for the chondrocyte culture outweigh the potential limitations.
The 3D hydrogel culture is compatible with conventional assay for evaluation of cell phenotype (gene expression, protein immunostaining) and functional outcome (quantification of cartilage matrix production, mechanical testing). This favorable 3D environment was tested to compare the tissue regeneration potential of human chondrocytes from three different aged populations in long-term 3D cultures. 
The outcomes were evaluated via both phenotypic and functional assays. Juvenile, adult and OA chondrocytes showed differential responses in the 3D biomimetic hydrogel culture. After 3 and 6 weeks, chondrogenic gene expression was upregulated in juvenile and adult chondrocytes but was downregulated in OA chondrocytes. Deposition of cartilage tissue components including aggrecan, type II collagen, and glycosaminoglycan (GAG) was high for juvenile and adult chondrocytes but not for OA chondrocytes. The compressive moduli of the resulting cartilage constructs also exhibited similar trends. In conclusion, both juvenile and adult chondrocytes exhibited chondrogenic and cartilage matrix disposition up to 6 weeks of 3D culture in hydrogels. In contrast, osteoarthritic chondrocytes revealed a loss of cartilage phenotype and minimal ability to generate robust cartilage.

<table><tbody><tr><td>juvenile chondrocytes (Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System )</td><td>Lonza</td><td>CC-2550</td><td></td></tr><tr><td>adult chondrocytes (Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System)</td><td>Lonza</td><td>CC-2550</td><td></td></tr><tr><td>poly(ethylene glycol diacrylate)</td><td>Laysan Bio</td><td>ACRL-PEG-ACRL-1000-1g</td><td></td></tr><tr><td>2-morpholinoethanesulfonic acid</td><td>Sigma</td><td>M5287</td><td></td></tr><tr><td>photoinitiator</td><td>Irgacure&amp;nbsp;</td><td>2959</td><td></td></tr><tr><td>sodium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>chondroitin sulfate sodium salt&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C9819</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroxysuccinimide&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>130672</td><td></td></tr><tr><td>1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>E1769</td><td></td></tr><tr><td>2-aminoethyl methacrylate</td><td>Sigma</td><td>516155</td><td></td></tr><tr><td>dialysis tubing</td><td>Spectrum Laboratories&amp;nbsp;</td><td>132700</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase 2</td><td>Worthington Biochemical&amp;nbsp;</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase 4</td><td>Worthington Biochemical&amp;nbsp;</td><td>LS004189</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 media</td><td>HyClone, Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>SH3002301&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>live/dead assay</td><td>Life Technologies</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L3224&quot;&gt;L3224&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Tri reagent</td><td>Life Technologies</td><td>AM9738</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/P11496&quot;&gt;P11496&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma</td><td>C1276</td><td></td></tr><tr><td>1,9-dimethylmethylene blue&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>341088</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV light equipment - XX-15LW Bench Lamp, 365 nm</td><td>UVP</td><td>95-0042-07</td><td></td></tr><tr><td>Instron 5944 testing system&amp;nbsp;</td><td>Instron Corporation</td><td>E5940</td><td></td></tr></tbody></table>

3d hydrogel scaffolds for articular chondrocyte culture and cartilage generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer cartilage tissue offer a promising solution to repair articular cartilage. To select the optimal cell source for tissue repair, it is important to develop an appropriate culture platform to systematically examine the biological and biomechanical differences in the tissue-engineered cartilage by different cell sources. Here we applied a three-dimensional (3D) biomimetic hydrogel culture platform to systematically examine cartilage regeneration potential of juvenile, adult, and osteoarthritic (OA) chondrocytes. The 3D biomimetic hydrogel consisted of synthetic component poly(ethylene glycol) and bioactive component chondroitin sulfate, which provides a physiologically relevant microenvironment for in vitro culture of chondrocytes. In addition, the scaffold may be potentially used for cell delivery for cartilage repair in vivo. Cartilage tissue engineered in the scaffold can be evaluated using quantitative gene expression, immunofluorescence staining, biochemical assays, and mechanical testing. Utilizing these outcomes, we were able to characterize the differential regenerative potential of chondrocytes of varying age, both at the gene expression level and in the biochemical and biomechanical properties of the engineered cartilage tissue. The 3D culture model could be applied to investigate the molecular and functional differences among chondrocytes and progenitor cells from different stages of normal or aberrant development.

הידרוג ביו המכיל PEG וmoieties CS (איור 1) מייצג פלטפורמה אידיאלית לתרבות והתבגרות של 2,3,5,7 כונדרוציטים במפרק אנושיים. כונדרוציטים מגילים שונים ומצבי מחלה יכולים להיות מתורבת בשיטה שתוארה ונותחו לפנוטיפ, ביטוי גנים שלהם ומאפיינים ביוכימיים ומכאניים של רקמת הסחוס שנוצרה. שלוש דגימות הכונדרוציטים, juvenile- 6 חודשים, למבוגר 34 שנים וosteoarthritic- 74 שנים, נקצרו לאחר 3 שבועות של התרבות בהידרוג&#39;ל biomimetic 3D. ביטוי גני מנתח של כונדרוציטים רגילים, שניהם צעירים ומבוגר, הראה עלייה בביטוי של גנים הכונדרוציטים Col2a1 וCol6a1. להיפך, כונדרוציטים חולים הראו ירידה דרמטית בCol2a1 תוך שמירה על הביטוי של Col6a1 (איור 2) מראה הפסד של פנוטיפ chondrogenic למרות היותו מתורבת בסביבת biomimetic חיובית. גם הידרוג CS-PEG לשמש כסביבה דינמית לכונדרוציטים להתרבות, לעכל את המטריצה ​​קיימת מראש של PEG וCS ולהפקיד מטריצת pericellular והתאית שלהם, המרכיבים העיקריים של רקמת הסחוס הבוגרת. בהתחשב ביכולות אלה, הרחבה הכונדרוציטים לאחר 3 שבועות של תרבות במבחנה יכולות להיות מוערכות על ידי כימות של ה- DNA עם צבע PicoGreen. ניתוח השוואתי של שלוש הקבוצות של תאים מראה כי צפיפות התאים של אוכלוסיות לנוער ומבוגרים הייתה ללא שינוי ואילו כונדרוציטים OA הציגו ירידה דרמטית בהשוואה ליום 1 של התרבות. אובדן תוכן DNA נצפה גם עבור OA אבל לא כונדרוציטים אחרים המצביעים על מוות של תאים אפשריים במהלך התרבות לטווח הארוך (איור 3). המטריצה ​​המופרשת הייתה לכמת כתוכן הגופריתי-GAG ידי assay מחייב צבע DMMB בשלב נקודת סיום לאחר 3 שבועות של תרבויות. תוכן GAG מנורמל על ידי המשקל הרטוב של הידרוג&#39;ל כrecorded לפני עיכול אנזימטי ותרומת acellular מופחת. כפי שניתן לראות באיור 4, כונדרוציטים הופקדו סכום משמעותי דומה של GAG במהלך 3 שבועות של התרבות בהידרוג 3D. נוכחותו של פיגום פיזי מאפשרת ההערכה של נכסים ביו-מכאניים של הדגימות באמצעות 2,3 בדיקות דחיסת unconfined. בעוד הידרוג acellular לעבור ירידה בmoduli הדחיסה, בונה תאים העמוסים נשמרה moduli הדחיסה לאחר 3 שבועות בתרבות (איור 4). פנוטיפי, ניתוחים ביוכימיים וביו-מכאניים שתוארו כאן הם אפוא שימושי להערכה והבנת הפוטנציאל של אוכלוסיות שונות להכונדרוציטים סחוס הנדסה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig1.jpg" /> איור 1. הידרוג biomimetic PEG-CS לרחוב ללא הכונדרוציטים 3Dture. כונדרוציטים הם resuspended בתערובת המכילה פולי (diacrylate אתילן גליקול) (PEGDA) וסולפט-methacrylate כונדרואיטין (CS-MA) ויציקה לתוך תבנית ג&#39;ל הגלילית מחוייט. לאחר חשיפה לקרינת UV, הגדילו את ג&#39;לי נאספים מהתבניות וכדאיויות תא מוערכת על ידי צביעה המתה חי פוסט-אנקפסולציה 24 שעות. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53085/53085fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig2.jpg" /> איור 2. ביטוי של גני chondrogenic בכונדרוציטים אנושיים בתרבית הידרוג biomimetic 3D. ביטוי גני כמותי של סמני סחוס Col2a1 וCol6a1 ידי כונדרוציטים לנוער, למבוגרים וOA לאחר 3 שבועות של התרבות בהידרוג&#39;ל biomimetic 3D. ערכים הם מנורמלים לרמת ביטוי גן ביום ב 1. שגיאהערס מייצג ממוצע ± SD. * P &lt;0.05, כפי שנקבע על ידי מבחן t סטודנטים שני זנב. שונה מSmeriglio et al. 2 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53085/53085fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig3.jpg" /> תוכן איור 3. DNA בכונדרוציטים אנושיים בתרבית הידרוג biomimetic 3D. כימות DNA על ידי assay PicoGreen בכונדרוציטים לנוער, למבוגרים וOA לאחר 3 שבועות של התרבות בהידרוג&#39;ל biomimetic 3D. ערכים הם מנורמלים לרמת ה- DNA ביום 1. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53085/53085fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig4.jpg" /> &lt;br /&gt; איור תוכן מדידת 4. GAG ובדיקת דחיסת unconfined של כונדרוציטים אנושיים ביום 1 ולאחר 3 שבועות של התרבות בהידרוג&#39;ל biomimetic 3D. () כימות GAG ידי assay DMMB בכונדרוציטים ביום 1 ולאחר 3 שבועות של תרבות ב הידרוג biomimetic 3D. ערכים הם מנורמלים להרטיב משקל (ww) והביעו כמיקרוגרם / g. (ב) מודולוס לחיצה (kPa) של הידרוג&#39;ל acellular ותא-לאדן ביום 1 ולאחר 3 שבועות של התרבות בהידרוג&#39;ל biomimetic 3D. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53085/53085fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about 3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation at JoVE.com

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes.

3D Hydrogel פיגומים למפרקים הכונדרוציטים תרבות וסחוס דור

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

3d-hydrogel-scaffolds-for-articular-chondrocyte-culture-cartilage

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

20.0K Views.  Stanford University. Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes. 

Video: 3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture

The protocol presents a facile, efficient, and versatile method to prepare chitosan-based hydrogels using dynamic imine chemistry. The hydrogel is prepared by mixing solutions of glycol chitosan with a synthesized benzaldehyde terminated polymer gelator, and hydrogels are efficiently obtained in several minutes at room temperature. By varying ratios between glycol chitosan, polymer gelator, and water contents, versatile hydrogels with different gelation times and stiffness are obtained. When damaged, the hydrogel can recover its appearances and modulus, due to the reversibility of the dynamic imine bonds as crosslinkages. This self-healable property enables the hydrogel to be injectable since it can be self-healed from squeezed pieces to an integral bulk hydrogel after the injection process. The hydrogel is also multi-responsive to many bio-active stimuli due to different equilibration statuses of the dynamic imine bonds. This hydrogel was confirmed as bio-compatible, and L929 mouse fibroblast cells were embedded following standard procedures and the cell proliferation was easily assessed by a 3D cell cultivation process. The hydrogel can offer an adjustable platform for different research where a physiological mimic of a 3D environment for cells is profited. Along with its multi-responsive, self-healable, and injectable properties, the hydrogels can potentially be applied as multiple carriers for drugs and cells in future bio-medical applications.

Here we describe a facile preparation of chitosan-based injectable hydrogels using dynamic imine chemistry. Methods to adjust the hydrogel&#8217;s mechanical strength and its application in 3D cell culture are presented.

הכנת Hydrogels להזרקה מבוסס משקם ויישומה בתרבות תא תלת-ממד

The protocol presents a facile, efficient, and versatile method to prepare chitosan-based hydrogels using dynamic imine chemistry. The hydrogel is ...

Chemistry

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

ייצור רקמת סחוס אנושי באמצעות שלושה ממדי הזרקת דיו טכנולוגיית הדפסה

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

בונה אלגינט Layered: פלטפורמה עבור Co-תרבות של אוכלוסיות תאים הטרוגניות

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach recently explored for the development of autologous replacements involves the differentiation of stem cells into chondrocytes. To initiate this chondrogenesis, a degree of compaction of the stem cells is required; hence, we demonstrated the feasibility of magnetically condensing cells, both within thick scaffolds and scaffold-free, using miniaturized magnetic field sources as cell attractors. This magnetic approach was also used to guide aggregate fusion and to build scaffold-free, organized, three-dimensional (3D) tissues several millimeters in size. In addition to having an enhanced size, the tissue formed by magnetic-driven fusion presented a significant increase in the expression of collagen II, and a similar trend was observed for aggrecan expression. As the native cartilage was subjected to forces that influenced its 3D structure, dynamic maturation was also performed. A bioreactor that provides mechanical stimuli was used to culture the magnetically seeded scaffolds over a 21-day period. Bioreactor maturation largely improved chondrogenesis into the cellularized scaffolds; the extracellular matrix obtained under these conditions was rich in collagen II and aggrecan. This work outlines the innovative potential of magnetic condensation of labeled stem cells and dynamic maturation in a bioreactor for improved chondrogenic differentiation, both scaffold-free and within polysaccharide scaffolds.

Chondrogenesis from stem cells requires fine tuning the culture conditions. Here, we present a magnetic approach for condensing cells, an essential step to initiate chondrogenesis. In addition, we show that dynamic maturation in a bioreactor applies mechanical stimulation to the cellular constructs and enhances cartilaginous extracellular matrix production.

צבירת Cell מגנטי גזע 3D והתבגרות Bioreactor להתחדשות סחוס

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

Culturing בתרבית של תאים בפפטיד תלת מימדי פיגומים

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not regenerate very efficiently in vivo; and as a result, osteoarthritis leads to irreversible cartilage loss and is accompanied by chronic pain and immobility 1,2. Cartilage tissue engineering offers promising potential to regenerate and restore tissue function. This technology typically involves seeding chondrocytes into natural or synthetic scaffolds and culturing the resulting 3D construct in a balanced medium over a period of time with a goal of engineering a biochemically and biomechanically mature tissue that can be transplanted into a defect site in vivo 3-6. Achieving an optimal condition for chondrocyte growth and matrix deposition is essential for the success of cartilage tissue engineering. 
 In the native joint cavity, cartilage at the articular surface of the bone is bathed in synovial fluid. This clear and viscous fluid provides nutrients to the avascular articular cartilage and contains growth factors, cytokines and enzymes that are important for chondrocyte metabolism 7,8. Furthermore, synovial fluid facilitates low-friction movement between cartilaginous surfaces mainly through secreting two key components, hyaluronan and lubricin 9 10. In contrast, tissue engineered cartilage is most often cultured in artificial media. While these media are likely able to provide more defined conditions for studying chondrocyte metabolism, synovial fluid most accurately reflects the natural environment of which articular chondrocytes reside in.
 Indeed, synovial fluid has the advantage of being easy to obtain and store, and can often be regularly replenished by the body. Several groups have supplemented the culture medium with synovial fluid in growing human, bovine, rabbit and dog chondrocytes, but mostly used only low levels of synovial fluid (below 20&#37;) 11-25. While chicken, horse and human chondrocytes have been cultured in the medium with higher percentage of synovial fluid, these culture systems were two-dimensional 26-28. Here we present our method of culturing human articular chondrocytes in a 3D system with a high percentage of synovial fluid (up to 100&#37;) over a period of 21 days. In doing so, we overcame a major hurdle presented by the high viscosity of the synovial fluid. This system provides the possibility of studying human chondrocytes in synovial fluid in a 3D setting, which can be further combined with two other important factors (oxygen tension and mechanical loading) 29,30 that constitute the natural environment for cartilage to mimic the natural milieu for cartilage growth. Furthermore, This system may also be used for assaying synovial fluid activity on chondrocytes and provide a platform for developing cartilage regeneration technologies and therapeutic options for arthritis.

A 3D system of culturing human articular chondrocytes in high levels of synovial fluid is described. Synovial fluid reflects the most natural microenvironment for articular cartilage, and can be easily obtained and stored. This system thus can be used for studying cartilage regeneration and for screening therapeutics for treating arthritis.

מערכת 3D עבור chondrocytes culturing האדם במפרק של נוזל סינוביאלי

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

Biology

Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy this deficiency, several medical interventions have been developed. One such method is to resurface the damaged area with tissue-engineered cartilage; however, the engineered tissue typically lacks the biochemical properties and durability of native cartilage, questioning its long-term survivability. This limits the application of cartilage tissue engineering to the repair of small focal defects, relying on the surrounding tissue to protect the implanted material. To improve the properties of the developed tissue, mechanical stimulation is a popular method utilized to enhance the synthesis of cartilaginous extracellular matrix as well as the resultant mechanical properties of the engineered tissue. Mechanical stimulation applies forces to the tissue constructs analogous to those experienced in vivo. This is based on the premise that the mechanical environment, in part, regulates the development and maintenance of native tissue1,2. The most commonly applied form of mechanical stimulation in cartilage tissue engineering is dynamic compression at physiologic strains of approximately 5-20% at a frequency of 1 Hz1,3. Several studies have investigated the effects of dynamic compression and have shown it to have a positive effect on chondrocyte metabolism and biosynthesis, ultimately affecting the functional properties of the developed tissue4-8. In this paper, we illustrate the method to mechanically stimulate chondrocyte-agarose hydrogel constructs under dynamic compression and analyze changes in biosynthesis through biochemical and radioisotope assays. This method can also be readily modified to assess any potentially induced changes in cellular response as a result of mechanical stimuli.

The biosynthesis of cartilaginous extracellular matrix by chondrocytes can be affected by application of mechanical stimuli. This method describes the technique of applying dynamic compressive strains to chondrocytes encapsulated in 3D constructs and the evaluation of induced changes in chondrocyte metabolism.

גירוי מכאני של הידרוג Chondrocyte-agarose

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy ...

Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target joint disorders are mostly palliative. The unmet need for effective disease-modifying OA drugs (DMOADs) has been primarily caused by the absence of appropriate models for studying the disease mechanisms and testing potential DMOADs. Herein, we describe the establishment of a miniature synovial joint-mimicking microphysiological system (miniJoint) comprising adipose, fibrous, and osteochondral tissue components derived from human mesenchymal stem cells (MSCs). To obtain the three-dimensional (3D) microtissues, MSCs were encapsulated in photocrosslinkable methacrylated gelatin before or following differentiation. The cell-laden tissue constructs were then integrated into a 3D-printed bioreactor, forming the miniJoint. Separate flows of osteogenic, fibrogenic, and adipogenic media were introduced to maintain the respective tissue phenotypes. A commonly shared stream was perfused through the cartilage, synovial, and adipose tissues to enable tissue crosstalk. This flow pattern allows the induction of perturbations in one or more of the tissue components for mechanistic studies. Furthermore, potential DMOADs can be tested via either &#34;systemic administration&#34; through all the medium streams or &#34;intraarticular administration&#34; by adding the drugs to only the shared &#34;synovial fluid&#34;-simulating flow. Thus, the miniJoint can serve as a versatile in vitro platform for efficiently studying disease mechanisms and testing drugs in personalized medicine.

We provide detailed methods for generating four types of tissues from human mesenchymal stem cells, which are used to recapitulate the cartilage, bone, fat pad, and synovium in the human knee joint. These four tissues are integrated into a customized bioreactor and connected through microfluidics, thus generating a knee joint-on-a-chip.

יצירת מפרק ברך על שבב למידול מחלות מפרקים ובדיקת תרופות

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...

Synthesis of Decellularized Cartilage Extracellular Matrix Hydrogels

Decellularized cartilage extracellular matrix (DC-ECM) hydrogels are promising biomaterials for tissue engineering and regenerative medicine due to their biocompatibility and ability to mimic natural tissue properties. This protocol aims to produce DC-ECM hydrogels that closely mimic the native ECM of cartilage tissue. The protocol involves a combination of physical and chemical disruption and enzymatic digestion to remove the cellular material while preserving the structure and composition of the ECM. The DC-ECM is cross-linked using a chemical agent to form a stable and biologically active hydrogel. The DC-ECM hydrogel has excellent biological activity, spatial structure, and biological induction function, as well as low immunogenicity. These characteristics are beneficial in promoting cell adhesion, proliferation, differentiation, and migration and for creating a superior microenvironment for cell growth. This protocol provides a valuable resource for researchers and clinicians in the field of tissue engineering. Biomimetic hydrogels can potentially enhance the development of effective tissue engineering strategies for cartilage repair and regeneration.

This paper introduces a new method for the synthesis of decellularized cartilage extracellular matrix (DC-ECM) hydrogels. DC-ECM hydrogels have excellent biocompatibility and provide a superior microenvironment for cell growth. Therefore, they can be ideal cell scaffolds and biological delivery systems.

סינתזה של הידרוג'לים מטריצה חוץ-תאית סחוס דה-תאי

Decellularized cartilage extracellular matrix (DC-ECM) hydrogels are promising biomaterials for tissue engineering and regenerative medicine due to their ...

Generating Spheroids from Various Chondrocytes using Low-Adhesive Conditions under Gravity and Homemade Mini-Bioreactors

Cartilage repair in chronic joint diseases demands advanced cell-based therapies to regenerate damaged tissues effectively. This protocol provides a step-by-step method for differentiating induced pluripotent stem cells (iPSCs) into chondrocyte-based spheroids, supporting tissue engineering and cell therapy applications. The differentiation process is carefully structured to promote chondrogenic lineage commitment, beginning with iPSCs cultured in specific media that sequentially guide cells through critical stages of differentiation. Initially, iPSCs are expanded to reach optimal confluency before induction toward chondrogenic lineage using a series of defined media changes. By day 10, cells are transitioned to a chondrogenesis-promoting medium that enhances the formation of chondrocyte-like cells expressing key markers of mature chondrocytes. Further aggregation in 96-well agarose-coated plates leads to the formation of three-dimensional spheroids, which are then cultured in custom mini-bioreactors designed to simulate a microenvironment that encourages extracellular matrix (ECM) deposition. By enabling scalable production of chondrocyte spheroids that mimic native cartilage characteristics, this approach offers a promising, reproducible solution for developing cell-based treatments for cartilage defects, providing broad utility for clinical and research applications in musculoskeletal regenerative medicine.

This study describes a method for producing chondrocytic spheroids by aggregating cells into spheroids under low-adhesion conditions using gravity, followed by culturing the resulting spheroids in mini-bioreactors.

יצירת ספרואידים מכונדרוציטים שונים בתנאי הדבקה נמוכה תחת כוח הכבידה ומיני ביוריאקטורים תוצרת בית

Cartilage repair in chronic joint diseases demands advanced cell-based therapies to regenerate damaged tissues effectively. This protocol provides a ...