The authors would like to gratefully thank Steffen Lippert, Khalid Aliyev, Korinna J&#246;hrens and Katharina Struecker for their help during this project.

בעלי חיים הוחזקו במתקן לרפואה ניסויית (FEM, Charité, ברלין, גרמניה), ואת כל פרוטוקולי הניסוי היו נבדקו ואושרו על ידי משרד המדינה לענייני בריאות ומקומי (LAGeSo, ברלין, גרמניה;. רג O מס &#39;0365 / 11). קציר 1. כבד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה טרום ניתוחית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בצלחת פקק לקיבעון. שים וילון רפואי על הצלחת. באמצעות ארבע מחטים, לתקן מסכת משאיפת על צלחת הפקק להרדמת משאיפת במהלך ניתוח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סידור מכוון של פורטל ורידי הצינורית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר צנתר ורידים היקפי (G-20) לברזלי שלוש-דרך. צנתר הוורידים יש לחתוך באלכסון, באורך של כ. 1.5 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דה-אוויר למערכת באמצעות מזרק 10 מיליליטר מלא פתרון רינגר. זה מאוד חשוב לזהירות דה-האוויר כי תסחיף גז עלול להשפיע לרעה על decellularization זלוף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סידור מכווןשל צינורית העורקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש צינורית פרפר ולחתוך את המחט לאורך של 5 מ&quot;מ. להתאים צינור 5 סנטימטר (ID 0.58 מ&quot;מ; OD 0.96 מ&quot;מ) למחט 5 מ&quot;מ ולתקן את זה עם דבק מגע. הכנס צינור 2 ס&quot;מ ארוך (ID 0.28 מ&quot;מ; 0.61 מ&quot;מ OD) לתוך הצינור הגדול ולתקן את זה עם דבק מגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליק צינור אחר על בנייה זו כבסיס גשר ולתקן את זה עם דבק מגע. דה-אוויר צינורית העורקים עם מזרק 5 מיליליטר מלא פתרון רינגר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדמה ושיכוך כאבים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום להרדמה של החולדה בחדר האינדוקציה ההרדמה על ידי isoflurane 3.5% בחמצן בקצב זרימה של 1.5 ליטר / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח שיכוך כאבים בטוחים במהלך המבצע, להזריק metamizol (100 מ&quot;ג / קילוגרם מסת גוף) וקטמין במינון נמוך / medetomidine (10 מ&quot;ג / 0.1 מ&quot;ג לכל קילוגרם מסת גוף) intraperitoneally. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק isoflurane 1.5% בחמצן / דקה 1 ליטר באמצעות מסכת משאיפת לתחזוקה הבאה של הרדמה כירורגית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסדרים לפני ניתוח &lt;ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את הבטן בנדיבות עם מכונה גז חשמלית. להרטיב את אתר החתך המגולח בבטן עם אתנול 70% לחיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה במצב שכיבה על הצלחת מוכנה, להכניס את הראש לתוך מסכת משאיפת ולתקן את הגפיים עם קלטת רפואית וסיכות. הסר אתנול ופרווה עודפים עם תחבושות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת הרדמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את עומק ההרדמה על ידי צפייה בקצב הנשימה. כאשר ההרדמה נראית עמוקה מספיק (40-60 נשימות / דקה), לבדוק אם כאבים די בניסיון לעורר את רפלקס קמצוץ הבוהן באמצעות מלקחיים כירורגיים לצבוט את העור בין האצבעות של שני גפיים האחוריות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גישת בטן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך החציוני בקיר בטן הזנב מעל שלפוחית ​​השתן. לחתוך מנקודה זו לשתי קשתות costal הרוחב באופן בצורת V. יש להיזהר שלא לחתוך לסרעפת. משוך את דופן הבטן לחתוך מעל החזה. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את xiphoid עם מהדק אוברהולט, למשוך אותו cranially ולתקן את זה עם גומייה. השתמש צמר גפן רטוב לפנות את המעי. לעטוף את המעי בתחבושת גזה רטובה. יתר על כן, לכסות את כל השוליים הבטן עם תחבושות רטובות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבד הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את רצועת falciform. השתמש בתחבושת גזה רטובה כדי להחזיק את האונה של הכבד המדיאלי ועזבה cranially מתחת לכיפה של הסרעפת. לחשוף את רצועת hepatoduodenal ואונת כבד omental העליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשני microforceps ומספריים באביב כדי לנתח בזהירות את הרצועה הצמודה לאונה העליונה omental עד האונה היא ניידת. הזז את האונה באמצעות צמר גפן רטוב מתחת לתחבושות, מחזיק אונות המדיאלי והשאירו במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הגיוס של אונת כבד omental העליונה, להעביר את הבטן בצד השמאל. תקן את הבטן עם מהדק ולנתח את omentum הקטין עם microforceps והמספריים באביב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגייס את omenta הנמוךl אונת כבד עד שהוא נייד ולאחר מכן להעביר את האונה אחורית לתוך החלל שלה. השתמש מהדק בקהאוס כדי לשמר את תריסריון. הזז את תריסריון לשמאל כדי למתוח ולחשוף את רצועת hepatoduodenal. להותיר את צינור מרה המשותף ברצועת hepatoduodenal המתוחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את צינור המרה מהשומן ורקמת לבלב. חותך את צינור המרה של 1.5 סנטימטר מהסתעפות צינור מרה. לנתח את וריד השער מרקמת השומן שמסביב. לחשוף את וריד gastroduodenal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשור את וריד gastroduodenal פעמיים עם משי 6-0 ולחלק את הווריד בין 2 חיבורי האותיות. לנתח את תא מטען צליאק ועורק כבד הנפוץ מן הרקמה הסובבת עד שכל רמי העורקים מתגלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחרר את עורק gastroduodenal מן הרקמה הסובבת. לקשור את עורק gastroduodenal פעמיים עם משי 6-0, עם הקשרים רחוקים אחד מהשני. לנתח את עורק gastroduodenal בין 2 חיבורי האותיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחרר את עורק הטחולמהרקמה הסובבת. לקשור את עורק הטחול פעמיים עם משי 6-0, עם הקשרים רחוקים אחד מהשני. לנתח את עורק הטחול בין 2 חיבורי האותיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחרר את עורק הקיבה שמאל מהרקמה הסובבת. לקשור את עורק הקיבה שמאל פעמיים עם משי 6-0, עם הקשרים רחוקים אחד מהשני. לנתח את העורק בין 2 חיבורי האותיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להותיר את וריד caval הנחות בין הכליה הימנית ואונת כבד לרוחב הנכונה. לנתח את הווריד מהחלל retroperitoneal. לחשוף את אב העורקים על ידי הבא לתא מטען צליאק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את רקמת שומן retroperitoneal. הזרק 1,000 הפרין IE מלוחים 1 מיליליטר לווריד הנבוב הנחות. לחזור הצינורית ולסגור את החתך עם צמר גפן. חכה 1-2 דקות להשפעה המערכתית של הפרין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להותיר את אב העורקים עם מלקחיים. לנתח את אב העורקים ולגרום לדימום מחודש החולדה. יתר על כן, לנתח את נחות הווריד הנבוב distally מהכליות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורטל הוורידים Cannulation (השתמש בצינורית מוכנה בסעיף 1.2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך דגים-פה בוריד שער דיסטלי. פתח את החתך עם מלקחיים וcannulate וריד השער. לשטוף את הכבד עם 20 מיליליטר פתרון רינגר עד decolorizes הכבד ולתקן את הצינורית עם חיבורי אותיות (משי 6-0). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העורקים Cannulation (השתמש בצינורית מוכנה בסעיף 1.3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את אב העורקים מעל תא מטען צליאק. לשחרר את קטע אב העורקים מהחלל retroperitoneal. חותך את קטע אב העורקים longitudinally ליצור תיקון אב העורקים. הכנס את הצינורית העצמית בנויות לבעל סטטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 2 מלקחיים כדי להחליק את תיקון אב העורקים על הצינורית. ולקשור את העורק הכבד עם משי 6-0 על הצינורית ולתקן את התיקון בירכה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Explantation כבד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הסרעפת, לעשות חתך עגול ולנתח את הכבד מהמבנים הסמוכים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סטהמחדש את הכבד במכל 500 מיליליטר סטרילי המלא 350 מיליליטר פתרון רינגר עד לשימוש. </li></ol></li></ol> 2. פתרונות דטרגנט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10% מניות פתרון Triton X-100 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו בקבוק 1,000 מיליליטר עם dest אקווה 900 מיליליטר. ולהוסיף 100 מיליליטר Triton X-100 (99,9%). השתמש בוחש לפזר את טריטון X-100. מלא את הבקבוק עם dest אקווה. עד נפח כולל של 1,000 מיליליטר הוא הגיע. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1% Triton X-100 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף את פתרון המניות 100 מיליליטר (10%) לבקבוק 1,000 מיליליטר. להוסיף 900 ​​dest אקווה מיליליטר. ולנער את הבקבוק פעמיים. סנן 1% דרך פילטר סטרילי פתרון Triton X-100. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10% SDS פתרון במלאי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו בקבוק 1,000 מיליליטר עם dest אקווה 900 מיליליטר. ולהוסיף SDS 66.99 גרם (99.9%, צפיפות 0.67). השתמש בוחש לפזר את SDS. מלא את הבקבוק עם dest אקווה. עד נפח כולל של 1,000 מיליליטר הוא הגיע. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1% SDS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף את פתרון המניות 100 מיליליטר (10%) לבוט 1,000 מיליליטרייתכנו. להוסיף 900 ​​dest אקווה מיליליטר. ולנער את הבקבוק פעמיים. סנן 1% SDS הפתרון דרך פילטר סטרילי. </li></ol></li></ol> 3. Decellularization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרה של התקן זלוף <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig1.jpg" /></li></ol> איור 1:. תכנית של התקן זלוף לסלקטיבי עורקים וורידי הפורטל זלוף של כבדי עכברוש ארבעה תחת תנאי לחץ נדנוד (. שונה מן et al Struecker 14) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קישור לטמיון לברזלי שלוש-דרך והארכת Heidelberger להסדיר את רמת מילוי וממלא את הכור עם 500 מיליליטר 0,9% NaCl. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig2.jpg" /></li></ol> איור 2:. תכנית של הגדרת זלוף קישור תא זלוף (1,400 סנטימטר 3) (1) לקצה הדיסטלי (4) למלכודת הבועה (5) דרך גישת ורידי הפורטל (2) או באמצעות AC העורקיםסס (3). מלכודת הבועה (5) צריכה להיות מצוידת בחֲסִימָה (4) בקצה הדיסטלי ואוורור (6). חבר את מלכודת הבועה (5) להארכת Heidelberger (7). קישור הארכת Heidelberger למגזר המשאבה (8). יתר על כן, לחבר את קטע המשאבה (8) לעוד ארכה Heidelberger (9). הכנס את ההארכה האחרונה Heidelberger (9) לבקבוק של תמיסת ניקוי (10). חבר את הנשמה (11) לתא זלוף (או למפיץ הלחץ במקרה של זילופים מרובים). כדי לנקז את נוזלי הכור, לחבר את יצוא לבקבוק פסולת (12). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את קטע המשאבה למשאבה. התחל המשאבה כדי למלא את המחזור עם PBS, לסגור את הקצה הדיסטלי של מלכודת הבועה ולפתוח את פתח האוורור. כאשר החלק התחתון של הבועה מכוסה היטב עם PBS (2-3 סנטימטר), לסגור את פתח האוורור ולפתוח את הקצה הדיסטלי של מלכודת הבועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנה כבד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קישור הסתום המשולש של צינורית וריד שער לגישת כור בנושא. גonnect צינורית העורקים לגישת העורקים. להיות זהיר כדי להבטיח שאף אוויר נכנס למערכות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישום של תנאי לחץ נדנוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש הנשמה בתדירות של 15 פעימות לדקה ומשרעת של 26 mbar (דקות. 4 mbar, מקסימום. 30 mbar). חבר את מכשיר ההנשמה לתא לחץ ההפצה ולחבר את התא לכור. התחל יישום לחץ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול decellularization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים זלוף עם קצב זרימה של 5 מיליליטר / דקה. התחל decellularization עם טפטוף של הכבד עם 1% Triton X-100 למשך 90 דקות. לאפשר הזרמת שפכים באמצעות יצוא של מכשיר זלוף ולהשאיר את הנוזל בתוך מתמיד תא זלוף ומעל כבד perfused. לאחר 90 דקות, לשנות את חומר הניקוי ל1% SDS. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig3.jpg" /> <img alt="טבלת 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029table1.jpg" /></li></ol></li></ol> &lt;p&gt; איור 3: זלוף פרוטוקול לכל קבוצות הניסוי.

<ol>
	<li>Struecker, B., Raschzok, N., Sauer, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+support+strategies:+cutting-edge+technologies.">Liver support strategies: cutting-edge technologies.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, 166-176 (2014).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+liver+scaffolds+effectively+support+the+proliferation+and+differentiation+of+mouse+fetal+hepatic+progenitors.">Decellularized liver scaffolds effectively support the proliferation and differentiation of mouse fetal hepatic progenitors.</a> J Biomed Mater Res A. , (2013).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat Med. 16, 814-820 (2010).</li><li>Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+decellularization+of+intact+rat+liver.">Method for the decellularization of intact rat liver.</a> Organogenesis. 6, 134-136 (2010).</li><li>Bao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+portal+implantable+functional+tissue-engineered+liver+using+perfusion-decellularized+matrix+and+hepatocytes+in+rats.">Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats.</a> Cell transplantation. 20, 753-766 (2011).</li><li>Baptista, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+whole+organ+decellularization+for+the+generation+of+a+vascularized+liver+organoid.">The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid.</a> Hepatology. 53, 604-617 (2011).</li><li>Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+whole-organ+assembly:+moving+toward+transplantation+on+demand.">Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand.</a> J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).</li><li>Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole-organ+regenerative+medicine+approach+for+liver+replacement.">A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. 17, 677-686 (2011).</li><li>De Kock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+quick+method+for+whole-liver+decellularization:+a+novel+in+vitro+three-dimensional+bioengineering+tool.">Simple and quick method for whole-liver decellularization: a novel in vitro three-dimensional bioengineering tool.</a> Archives of toxicology. 85, 607-612 (2011).</li><li>Park, K. M., Woo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+decellularization+for+multi-organ+scaffolds+in+rats.">Systemic decellularization for multi-organ scaffolds in rats.</a> Transplantation proceedings. 44, 1151-1154 (2012).</li><li>Shirakigawa, N., Ijima, H., Takei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+liver+as+a+practical+scaffold+with+a+vascular+network+template+for+liver+tissue+engineering.">Decellularized liver as a practical scaffold with a vascular network template for liver tissue engineering.</a> J Biosci Bioeng. , (2012).</li><li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two+decellularization+methods+in+the+development+of+a+whole-organ+decellularized+rat+liver+scaffold.">Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold.</a> Liver Int. 33, 448-458 (2013).</li><li>Struecker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+rat+liver+decellularization+by+arterial+perfusion+under+oscillating+pressure+conditions.">Improved rat liver decellularization by arterial perfusion under oscillating pressure conditions.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2014).</li><li>Struecker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+Liver+Decellularization+Under+Oscillating+Pressure+Conditions:+A+Technical+Refinement+to+Improve+the+Homogeneity+of+the+Decellularization+Process.">Porcine Liver Decellularization Under Oscillating Pressure Conditions: A Technical Refinement to Improve the Homogeneity of the Decellularization Process.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

למרות שהטכניקה שהוצגה לקציר כבד החולדה וdecellularization היא לשחזור בקלות, ישנם צעדים קריטיים מסוימים לשקול: במהלך הכנה לקציר כבד, חשוב להימנע מדימום חמור משום שהיא תפעיל קרישת דם ועלולה לגרום להיווצרות קריש דם בתוך הכבד. לדעתנו, זה יתרון לחתוך אב העורקים בבטן ישירות לפני cannulation של וריד השער, כדי למנוע זרימת דם דרך העורק הכבד במהלך זלוף דרך וריד הפורטל. ברגע שהכבד cannulated וperfused ברור, היווצרות קריש דם היא כבר לא בעיה. לאחר קצירת כבד ותחבורה למכשיר זלוף, החיבור של כבדים למכשיר זלוף הוא צעד קריטי במיוחד בגלל הכניסה של בועות גז לתוך מעגל זלוף יש להימנע כדי למנוע תסחיף גז. זה שימושי ללמלא מראש את השסתום המשולש, שבו אניs מחובר לצינורית הכבד, עם PBS באמצעות מזרק וצינורית דקה ישירות לפני חיבור השסתום למערכת זלוף. לאחר זלוף הוא הוקם, אם כל המחברים הצינור, שלוש דרך שסתומים וצינורות מחוברים בצורה מושלמת צריכה להיות מחדש נבדק. אם כבדים הם perfused במשך תקופות ארוכות (למשל., O / N), אפילו שגיאה קטנה בחיבור יכול להוביל לאוויר שאיבה למערכת זלוף, ובכך מוביל לתוצאות זלוף קטלניות. הנתונים שהוצגו מוגבלים על ידי העובדה שהלחץ והתדירות האופטימלי של שינויים בלחץ נדנוד לתוצאות הטובות ביותר decellularization עדיין אינם ברורים. יתר על כן, זלוף-מבוקר לחץ עלול להוביל לתוצאות טובות יותר ויציבים יותר מזלוף-מבוקר זרימה עושה. זלוף-מבוקר לחץ מאפשר היישום של פרוטוקול זלוף אחד לכבדים של גדלים ומשקלים שונים, עם אותה התוצאה, כי הזרימה באופן אוטומטי בדואר מותאם. העורק הכבד ווריד שער שונה באופן משמעותי במונחים של גודל וספיקות פיזיולוגיות. לפיכך, שיעור קבוע זלוף (5 מיליליטר / דקה) בהחלט לגרום ללחצי זלוף שונים בתוך שתי מערכות כלי דם. כמו כן, לחץ זלוף קבוע יגרום לשיעורי זלוף שונים. שיטה אחת כדי להשוות את יעילות decellularization באמצעות שני מסלולי זלוף תהיה לבצע זלוף בלחצים פיסיולוגיים זלוף או שיעורי זלוף באמצעות שני המסלולים. עם זאת, על מנת להפוך את התוצאות דומות במחקר הנוכחי, בחרנו שיעור זלוף קבוע לשני המסלולים. למרבה הצער, שימוש במכשיר שלנו, אנחנו לא היו מסוגלים למדוד את לחץ זלוף בתוך כבד perfused. מכשירי זלוף הדור הבא שלנו יהיו קטנים יותר כדי למזער את הכמות של תקשורת זלוף ההכרחית. יתר על כן, מכשירי משאבה יאפשר זלוף-מבוקר לחץ. הטכניקת דואר הציג מופיעה מאוד שימושית עבור decellularization לשחזור, הומוגנית כבד חולדה. בין אם הטכניקה המוצגת הינה מתאימה לrecellularization והתבגרות איבר במבחנה יש להתייחס נוסף. בין אם יש להם תנאי לחץ נדנוד השפעה על תאים אוכלסו מחדש תהיה נושא של ניסויים נוספים. הטכניקה המוצגת הינה מתוחכמת יותר ממכשירי זלוף כבד חולדה אחרים ומציגה מספר יתרונות ברורים: 1) decellularization הומוגנית הוא לשחזור, עם תוצאות טובות כאשר תנאי לחץ נדנוד מיושמים. 2) מכשיר זלוף אטום ומאפשר decellularization סטרילי, שהוא תנאי הכרחי לאכלוס מטריצה ​​וזלוף לטווח ארוך. 3) הפרוטוקול המוצג הנו קצר יותר מפרוטוקולים שפורסמו אחרים אבל עדיין יעיל מאוד. 4) זלוף סלקטיבי של וריד השער והעורק הכבד הופך אכלוס תא בררני באמצעות מערכות שונות אפשרי,אשר עשוי להיות כלי חשוב. מכשיר זלוף ייושם בניסויי decellularization נוספים כדי לחדד ולייעל decellularization כבד חולדה. ההשפעה של זלוף-מבוקר לחץ תוערך באופן ניסיוני ולעומת זלוף-מבוקר זרימה. התוספת של אלמנטים נוספים (למשל., &quot;יחידת דיאליזה&quot;, מחליף חום, oxygenator) לניסויי אכלוס, תרבות והתבגרות מופיעה אפשרית וסביר לפתח המכשיר שהוצג עוד.

Decellularization וrecellularization עשוי לאפשר את הדור של איברים פונקציונליים, השתלה במבחנה 1. על ידי תאי הסרת וחומר אנטיגני (למשל., DNA, epitopes אלפא-גל) מאיבר, ניתן להשיג את המטריצה ​​הלא פחות או-חיסונית תאית (ECM). מטריצה ​​זו חוסכת microanatomy תלת ממדי של איברים ויכולה לשמש כbiomatrix האידיאלי לאכלוס עם תאים ממוצא שונה, ואולי xenogeneic 2. כך, מטריצת כבד חולדה decellularized יכולה להיות אוכלס מחדש עם תאי כבד אנושיים. מיקרו-כבד אנושי זה יכול לשמש כמודל vivo לשעבר למחקר על מחלות (למשל., מחלות מטבוליות מולדות, מחלות ויראליות או ממאירות) או לבדיקת תרופות פרה 3. כמה פרוטוקולים שונים לdecellularization זלוף כבד חולדה כבר פורסמו 4-13. בכל הפרוטוקולים, decellularלמען האזרוח הושג על ידי טפטוף של חומרי ניקוי יוניים או שאינם יוניים בסיסיים דרך וריד פורטל cannulated. למיטב ידיעתנו, היינו הקבוצה הראשונה לדווח decellularization כבד חולדה על ידי זלוף סלקטיבית דרך וריד הפורטל ו / או עכברוש העורק כבד 14. מאפשר זלוף סלקטיבית של מערכות כלי דם השונות בכבד עשוי לאפשר תוצאות decellularization טובות יותר ו, יתר על כן, עשוי לשחק תפקיד חשוב באכלוס סלולארי. במחקר המפורט כאן, כבדים היו perfused במכשיר זלוף קניינית מותאם אישית, המאפשרים זלוף בתנאי לחץ נדנוד. תנאי לחץ אלה מחקים את זלוף נשימה תלויה הפיזיולוגי של הכבד: באתר, הכבד נתקע מתחת לאוגד של הסרעפת, תנועה שבנשימה יש השפעה ישירה על זלוף כבד. השראה במיוחד מובילה להורדת של הסרעפת ולסחוט של הכבד, אופטימיזציהיצוא hepato-ורידים, ואילו פקיעה מובילה להעלאה של הכבד והורדה של לחץ intraabdominal כדי לייעל יבוא פורטל-ורידים 15. המטרה שלנו הייתה להעריך אם יש להם תנאי לחץ נדנוד השפעה על ההומוגניות של decellularization זלוף כבד חולדה על ידי חיקוי תנאי intraabdominal vivo לשעבר. ההומוגניות של תהליך decellularization עשויה להיות גורם לזלזל בdecellularization זלוף. כל הסוכנים הידועים המשמשים לשינויי סיבת decellularization הכבד לECM. תאים באזורי perfused גרוע יישארו בECM, ואילו באזורים אחרים כבר decellularized לחלוטין. לפזר את התאים הנותרים, משך זלוף או לחץ חייב להיות מורם, גורם ליותר שינויים באזורי perfused היטב. לפיכך, חומרי ניקוי לdecellularization צריך להיות מופץ homogenously בתוך האיבר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Self built arterial cannula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Portex Non Sterile Polyethene Tubing</td>
			<td>SIMS Portex</td>
			<td>REF 800/110/100</td>
			<td>0,28mm ID 0,61mm OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Portex Non Sterile Polyethene Tubing</td>
			<td>SIMS Portex</td>
			<td>REF 800/110/200</td>
			<td>0,58mm ID 0,96m OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Venodrop Safe butterfly catheter</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>3275851</td>
			<td>21 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>portal vein cannula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periphereal Venous Catheter</td>
			<td>BD</td>
			<td>393224</td>
			<td>BD Venflon Pro 20G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>three-way stopcock</td>
			<td>smiths medical</td>
			<td>888-101RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Sticks</td>
			<td>Hecht-Assistent</td>
			<td>4302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Pads&#160;</td>
			<td>Shaoxing Zhengde Surgical dressing</td>
			<td>13H118-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Bandage</td>
			<td>Hubei Haige&#160; Medical Instruments</td>
			<td>14388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ringer Solution</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>13 HKP022</td>
			<td>1000ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td>10ml/ Luer Solo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606061V</td>
			<td>5ml /Luer Solo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture (Silk 6/0)</td>
			<td>Resorba</td>
			<td>H1F</td>
			<td>LOT 105001.81</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medical drape</td>
			<td>Shaoxing Zhengde Surgical dressing</td>
			<td>D0613011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle holder</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>17570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-forceps</td>
			<td>Inox-Electronic</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-scissors</td>
			<td>Martin</td>
			<td>11-740-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-forceps</td>
			<td>S&#38;T&#160;</td>
			<td>112314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamp</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>BH111R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors</td>
			<td>F S T&#160;</td>
			<td>14501-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical forceps</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>BD 557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Decellularisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Respirator</td>
			<td>Resmed</td>
			<td>14.24.11.0004</td>
			<td>SmartAIR ST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Device</td>
			<td>Charite, medical engineering laboratory</td>
			<td>custome-made device</td>
			<td>decellularisation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump ismatec reglo ICC</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>ISM4408&#160;</td>
			<td>4-channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heidelberger extension 75 cm&#160;</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>2873</td>
			<td>75 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS/CA pump-segment</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>IS 3510&#160;</td>
			<td>MS/CA/click&#39;n&#39;go/POM-C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CA 2-stopper tube</td>
			<td>Pharmed</td>
			<td>BPT NSF-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bubble trap&#160;</td>
			<td></td>
			<td>custome-made item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock hose connector</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>No. 02-1887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Detergents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS pellets</td>
			<td>Carl Roth&#160;</td>
			<td>CN30.4&#160;</td>
			<td>2,5 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth&#160;</td>
			<td>3051.1&#160;</td>
			<td>10l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin 1%</td>
			<td>Morphisto</td>
			<td>10177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer hematoxylin</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gomori staining</td>
			<td>Morphisto</td>
			<td>11104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlcainBlue-PAS staining</td>
			<td>Morphisto</td>
			<td>11388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct Red 80&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>365548</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

הומוגניות ובכך את האפקטיביות של פרוטוקולי decellularization שונים הוערכו על ידי התבוננות מקרוסקופית, ניתוח היסטולוגית, וניתוח של תוכן ה- DNA שנותר בתוך מטריצות כבד decellularized. יתר על כן, ליהוק קורוזיה בוצע לדמיין microanatomy שלם של כבדים לאחר decellularization. Macroscopy במהלך decellularization, הכבדים הפכו לוסנט, המציינים את הסרת התוכן סלולארי. כבדי perfused דרך וריד הפורטל הראה הבהרת הומוגניות (ובכך decellularization), עם תאים הנותרים macroscopically גלויים במהלך ואחרי decellularization (חצים לבנים). כבדי perfused דרך העורק הכבד הראה כמובן decellularization הומוגנית יותר ולא תאים שנותרו גלויים. אם כבד היה perfused עם היישום של תנאי לחץ נדנוד, לא תאים הנותרים היו גלויים, ללא קשר למסלול זלוף. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig4.jpg" /> איור 4: תוצאות מקרוסקופית של העכברוש הכבד Decellularization בלי נדנוד תנאי לחץ. משמאל: כבד החולדה decellularized באמצעות העורק הכבד. הכבד מופיע לוסנט, ללא תאים הנותרים macroscopically גלויים. מימין: כבד perfused דרך וריד הפורטל. הכבד מופיע inhomogeneously decellularized, עם תאי macroscopically גלויים <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig5.jpg" /> איור 5: תוצאות מקרוסקופית של decellularization כבד חולדה בתנאי לחץ נדנוד. משמאל: כבד החולדה decellularized באמצעות העורק הכבד. מימין: כבד perfused דרך וריד הפורטל. שני הכבדים מופיעים לוסנט, ללא תאים הנותרים גלויים. הערכה היסטולוגית הערכה היסטולוגית של תמיכת מטריצות כבד decellularizedאד הממצאים מקרוסקופיים. כבדי perfused דרך העורק הכבד לא הראו תאים הנותרים, ללא כל קשר אם הם היו perfused בתנאי לחץ נדנוד. כבדי perfused דרך וריד הפורטל הראו אזורים של תאים הנותרים, גם אם הם היו perfused עם היישום של תנאי לחץ נדנוד. עם זאת, היישום של תנאי לחץ נדנוד הפחית את מסת תאים שנותר בכבד perfused דרך וריד הפורטל. ECM של הכבדים היה נשמרת, ללא הבדלים נראים לעין בכל הפרוטוקולים יושמו. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig6.jpg" /> איור 6: H / E הכתמה של מטריצות כבד decellularized. AP: מטריצה ​​כבד decellularized perfused דרך העורק הכבד בלי נדנוד תנאי לחץ. + P: מטריצה ​​כבד decellularized perfused דרך העורק הכבד בתנאי לחץ נדנוד. PA-P: decellularized matr כבדix perfused דרך וריד הפורטל ללא נדנוד תנאי לחץ. הרשות הפלסטינית + P: מטריצה ​​כבד decellularized perfused דרך וריד הפורטל בתנאי לחץ נדנוד. חיצים: נותרו צבירי תאים. תוכן DNA תוכן DNA למשקל יבש של מטריצת כבד ירד בכל קבוצות הניסוי בהשוואה לזה בכבד ילידים, אם כי ההבדלים היו משמעותי מבחינה סטטיסטית רק בקבוצות perfused בתנאי נדנוד לחץ (PV + P; + P). הסכום הנמוך ביותר של ה- DNA למשקל יבש נמצא בכבד perfused דרך העורק הכבד בתנאי לחץ נדנוד. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig7.jpg" /> איור 7: תוכן DNA למשקל יבש של הכבד מטריקס (שונה מStruecker et al 14.). כבדי decellularized באמצעות תכנית העורק הכבד פחות שנותרו DNA מ Perfuse אלהד באמצעות פורטל וריד לעשות. כבדי perfused בתנאי לחץ נדנוד להראות DNA פחות מאלה שנותר decellularized ללא תנאים אלה לעשות. לפיכך, כבדי perfused דרך העורק הכבד בתנאי לחץ נדנוד להראות את תוכן ה- DNA שנותר לפחות. יציקת קורוזיה ליהוק קורוזיה של מטריצות כבד decellularized אישר כי microanatomy של כבדים (כולל מסגרת החלבון של מערכת ורידי הפורטל, מערכת העורקים ומערכת המרה) נשמרת במהלך decellularization. <img alt="איור 8" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig8.jpg" /> איור 8: תצלום של יציקת קורוזיה של כבד מטריקס עכברוש decellularized (שונה מStruecker et al 14.). למרות ההסרה של כל התאים, microanatomy של האיבר, כוללים ורידי הפורטל (הכחולה) ועורקי מערכות (אדום), נשמר. הרמ&quot;אענפים עיקריים ining של מערכת המרה הם יציקה בצהוב. <img alt="טבלת 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029table1.jpg" /> טבלת 1: קבוצות ניסוי להערכת ההשפעה של תנאי לחץ נדנוד וכביש זלוף על העכברוש הכבד Decellularization.

Watch this Scientific Journal Video about Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device at JoVE.com

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

נוהל Decellularization של כבדי עכברוש בהתקן זלוף נדנוד לחץ

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

procedure-for-decellularization-rat-livers-an-oscillating-pressure

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K Views.  Charité – Universitätsmedizin Berlin. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

Video: Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

Decellularization ו Recellularization של כבדים שלמים

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Perfusion-based whole organ decellularization has recently gained interest in the field of tissue engineering as a means to create site-specific extracellular matrix scaffolds, while largely preserving the native architecture of the scaffold. To date, this approach has been utilized in a variety of organ systems, including the heart, lung, and liver 1-5. Previous decellularization methods for tissues without an easily accessible vascular network have relied upon prolonged exposure of tissue to solutions of detergents, acids, or enzymatic treatments as a means to remove the cellular and nuclear components from the surrounding extracellular environment6-8. However, the effectiveness of these methods hinged upon the ability of the solutions to permeate the tissue via diffusion. In contrast, perfusion of organs through the natural vascular system effectively reduced the diffusion distance and facilitated transport of decellularization agents into the tissue and cellular components out of the tissue. Herein, we describe a method to fully decellularize an intact porcine heart through coronary retrograde perfusion. The protocol yielded a fully decellularized cardiac extracellular matrix (c-ECM) scaffold with the three-dimensional structure of the heart intact. Our method used a series of enzymes, detergents, and acids coupled with hypertonic and hypotonic rinses to aid in the lysis and removal of cells. The protocol used a Trypsin solution to detach cells from the matrix followed by Triton X-100 and sodium deoxycholate solutions to aid in removal of cellular material. The described protocol also uses perfusion speeds of greater than 2 L/min for extended periods of time. The high flow rate, coupled with solution changes allowed transport of agents to the tissue without contamination of cellular debris and ensured effective rinsing of the tissue. The described method removed all nuclear material from native porcine cardiac tissue, creating a site-specific cardiac ECM scaffold that can be used for a variety of applications.

A method to rapidly and completely remove cellular components from an intact porcine heart through retrograde perfusion is described. This method yields a site specific cardiac extracellular matrix scaffold which has the potential for use in multiple clinical applications.

נוהל Decellularization של לב חזירי ידי זלוף כלילית המדרדר

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

A detailed understanding of the complexity and relative variability within the human cardiac venous system is crucial for the development of cardiac devices that require access to these vessels. For example, cardiac venous anatomy is known to be one of the key limitations for the proper delivery of cardiac resynchronization therapy (CRT)1 Therefore, the development of a database of anatomical parameters for human cardiac venous systems can aid in the design of CRT delivery devices to overcome such a limitation. In this research project, the anatomical parameters were obtained from 3D reconstructions of the venous system using contrast-computed tomography (CT) imaging and modeling software (Materialise, Leuven, Belgium). The following parameters were assessed for each vein: arc length, tortuousity, branching angle, distance to the coronary sinus ostium, and vessel diameter.
	CRT is a potential treatment for patients with electromechanical dyssynchrony. Approximately 10-20% of heart failure patients may benefit from CRT2. Electromechanical dyssynchrony implies that parts of the myocardium activate and contract earlier or later than the normal conduction pathway of the heart. In CRT, dyssynchronous areas of the myocardium are treated with electrical stimulation. CRT pacing typically involves pacing leads that stimulate the right atrium (RA), right ventricle (RV), and left ventricle (LV) to produce more resynchronized rhythms. The LV lead is typically implanted within a cardiac vein, with the aim to overlay it within the site of latest myocardial activation. 
	We believe that the models obtained and the analyses thereof will promote the anatomical education for patients, students, clinicians, and medical device designers. The methodologies employed here can also be utilized to study other anatomical features of our human heart specimens, such as the coronary arteries. To further encourage the educational value of this research, we have shared the venous models on our free access website: <a href="http://www.vhlab.umn.edu/atlas" target="_blank">www.vhlab.umn.edu/atlas</a>.

The objective of this research is to recreate and then access the anatomy of the human cardiac venous system using 3D reconstructions generated from contrast-computed tomography scans.

שחזורים אנטומיים של מערכת ורידי לב האנושית באמצעות ניגודיות, טומוגרפיה ממוחשבת של דגימות זלוף-קבועות

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

An Ultrasonic Tool for Nerve Conduction Block in Diabetic Rat Models

Nerve conduction block with a high intensity-focused ultrasound (HIFU) transducer has been performed in normal and diabetic animal models recently. HIFU can reversibly block the conduction of peripheral nerves without damaging the nerves while using an appropriate ultrasonic parameter. Temporary and partial block of the action potentials of nerves shows that HIFU has the potential to be a useful clinical treatment for pain relief. This work demonstrates the procedures for suppressing the action potentials of neuropathic nerves in diabetic rats in vivo using an HIFU transducer. The first step is to generate adult male diabetic neuropathic rats by streptozotocin (STZ) injection. The second step is to evaluate the peripheral diabetic neuropathy in STZ-induced diabetic rats by an electronic von Frey probe and a hot plate. The final step is to record in vivo extracellular action potentials of the nerve exposed to HIFU sonication. The method showed here may benefit the study of ultrasound analgesic applications.

This work presents the methodology of applying high intensity-focused ultrasound to block the action potentials of diabetic neuropathic nerves.

כלי אולטראסוניות גיאן לחסום במודלים עכברים סוכרתיים

Nerve conduction block with a high intensity-focused ultrasound (HIFU) transducer has been performed in normal and diabetic animal models recently. HIFU ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, significantly affecting the rate of human mortality and morbidity. Conventional methods for the detection of V. parahaemolyticus such as culture-based methods, immunological assays, and molecular-based methods require complicated sample handling and are time-consuming, tedious, and costly. Recently, biosensors have proven to be a promising and comprehensive detection method with the advantages of fast detection, cost-effectiveness, and practicality. This research focuses on developing a rapid method of detecting V. parahaemolyticus with high selectivity and sensitivity using the principles of DNA hybridization. In the work, characterization of synthesized polylactic acid-stabilized gold nanoparticles (PLA-AuNPs) was achieved using X-ray Diffraction (XRD), Ultraviolet-visible Spectroscopy (UV-Vis), Transmission Electron Microscopy (TEM), Field-emission Scanning Electron Microscopy (FESEM), and Cyclic Voltammetry (CV). We also carried out further testing of stability, sensitivity, and reproducibility of the PLA-AuNPs. We found that the PLA-AuNPs formed a sound structure of stabilized nanoparticles in aqueous solution. We also observed that the sensitivity improved as a result of the smaller charge transfer resistance (Rct) value and an increase of active surface area (0.41 cm2). The development of our DNA biosensor was based on modification of a screen-printed carbon electrode (SPCE) with PLA-AuNPs and using methylene blue (MB) as the redox indicator. We assessed the immobilization and hybridization events by differential pulse voltammetry (DPV). We found that complementary, non-complementary, and mismatched oligonucleotides were specifically distinguished by the fabricated biosensor. It also showed reliably sensitive detection in cross-reactivity studies against various food-borne pathogens and in the identification of V. parahaemolyticus in fresh cockles.

A protocol for the development of an electrochemical DNA biosensor comprising a polylactic acid-stabilized, gold nanoparticles-modified, screen-printed carbon electrode to detect Vibrio parahaemolyticus is presented.

התפתחות ביוסנסור אלקטרוכימי דנ א כדי לזהות חיידק והקאה

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

שתי שיטות Decellularization של רקמות הצמח ליישומים הנדסת רקמות

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and poor patency. Tissue engineering offers a novel solution to generate personalized grafts with a natural extracellular matrix containing the recipient&#39;s cells using the method of decellularization and recellularization. We show a detailed method for performing decellularization of the human saphenous vein and recellularization by perfusion of peripheral blood. The vein was decellularized by perfusing 1% Triton X-100, 1% tri-n-butyl-phosphate (TnBP) and 2,000 Kunitz units of deoxyribonuclease (DNase). Triton X-100 and TnBP were perfused at 35 mL/min for 4 h while DNase was perfused at 10 mL/min at 37 &#176;C for 4 h. The vein was washed in ultrapure water and PBS and then sterilized in 0.1% peracetic acid. It was washed again in PBS and preconditioned in endothelial medium. The vein was connected to a bioreactor and perfused with endothelial medium containing 50 IU/mL heparin for 1 h. Recellularization was performed by filling the bioreactor with fresh blood, diluted 1:1 in Steen solution, and adding endocrine gland-derived vascular endothelial growth factors (80 ng/mL), basic fibroblast growth factors (4 &#181;L/mL), and acetyl salicylic acid (5 &#181;g/mL). The bioreactor was then moved into an incubator and perfused for 48 h at 2 mL/min while maintaining glucose between 3 - 9 mmol/L. Later, the vein was washed with PBS, filled with endothelial medium and perfused for 96 h in the incubator. Treatment with Triton X-100, TnBP and DNase decellularized the saphenous vein in 5 cycles. The decellularized vein looked white in contrast to normal and recellularized veins (light red). The hematoxylin &#38; eosin (H&#38;E) staining showed the presence of nuclei only in normal but not in decellularized veins. In the recellularized vein, H&#38;E-staining showed the presence of cells on the luminal surface of the vein.

Here, we describe a protocol for the saphenous vein decellularization using detergents and recellularization by perfusion of the peripheral blood and the endothelial medium.

Decellularization ומתודולוגיה Recellularization עבור האדם הורידים saphenous גדולות

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

טכניקה כירורגית הרומן כבסיס In Vivo חלקי הכבד הנדסה בעכברוש

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ultimately rejection can occur. Creating a functional, autologous bio-artificial heart could solve these challenges. Biofabrication of a heart comprised of scaffold and cells is one option. A natural scaffold with tissue-specific composition as well as micro- and macro-architecture can be obtained by decellularizing hearts from humans or large animals such as pigs. Decellularization involves washing out cellular debris while preserving 3D extracellular matrix and vasculature and allowing &#34;cellularization&#34; at a later timepoint. Capitalizing on our novel finding that perfusion decellularization of complex organs is possible, we developed a more &#34;physiological&#34; method to decellularize non-transplantable human hearts by placing them inside a pressurized pouch, in an inverted orientation, under controlled pressure. The purpose of using a pressurized pouch is to create pressure gradients across the aortic valve to keep it closed and improve myocardial perfusion. Simultaneous assessment of flow dynamics and cellular debris removal during decellularization allowed us to monitor both fluid inflow and debris outflow, thereby generating a scaffold that can be used either for simple cardiac repair (e.g. as a patch or valve scaffold) or as a whole-organ scaffold.

This method enables decellularization of a complex solid organ using a simple protocol based on osmotic shock and perfusion of ionic detergent with minimal organ matrix disruption. It comprises a novel decellularization technique for human hearts inside a pressurized pouch with real-time monitoring of flow dynamics and cellular debris outflow.

Decellularization של הלב האנושי כולו בתוך נרתיק מווסת בכיוון הפוך

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

יצירת תנאי סביבה דינמיים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי בעל תפוקה גבוהה

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...