אנו מודים למר רוג&#39;ר אקרויד, מר אנדרו ויימן ומר כריס Stoddard, יועץ מנתחים בשפילד הוראת בתי החולים NHS Foundation Trust, לעזרתם ברכישת דגימות רקמת הוושט ותמיכתם של העבודה שלנו. אנו מודים Ashraful Haque על עזרתו בשילוב שורות תאי גידול למודל. הכרת תודה אנו מודים תמיכה כספית למחקר זה על ידי מענקים מBardhan המחקר והחינוך בנאמנות (ברנדה) וחקר סרטן יורקשייר (YCR).

<ol>
	<li>Pera, M., Manterola, C., Vidal, O., Grande, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+esophageal+adenocarcinoma.">Epidemiology of esophageal adenocarcinoma.</a> J. Surg. Oncol. 92 (3), 151-159 (2005).</li><li>Manea, G. S., Lupusoru, C., Caruntu, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+study+on+the+effect+of+bile,+and+bile+and+hydrochloric+acid+mixture+on+the+esophageal+mucosa.">Experimental study on the effect of bile, and bile and hydrochloric acid mixture on the esophageal mucosa.</a> Rom. J. Morphol. Embryol. 50 (1), 61-66 (2009).</li><li>Andl, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+mediates+increased+cell+proliferation,+migration,+and+aggregation+in+esophageal+keratinocytes+in+vitro+and+in+vivo.">Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo.</a> J. Biol. Chem. 278 (3), 1824-1830 (2003).</li><li>Underwood, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+primary+oesophageal+squamous+epithelial+cells+with+HET-1A+in+organotypic+culture.">A comparison of primary oesophageal squamous epithelial cells with HET-1A in organotypic culture.</a> Biol. Cell. 102 (12), 635-644 (2010).</li><li>Nystrom, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture.">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> J. Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).</li><li>Okawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+interplay+between+EGFR+overexpression,+hTERT+activation,+and+p53+mutation+in+esophageal+epithelial+cells+with+activation+of+stromal+fibroblasts+induces+tumor+development,+invasion,+and+differentiation.">The functional interplay between EGFR overexpression, hTERT activation, and p53 mutation in esophageal epithelial cells with activation of stromal fibroblasts induces tumor development, invasion, and differentiation.</a> Genes &amp; Development. 21 (21), 2788-2803 (2007).</li><li>Green, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+characterization+of+an+organotypic+tissue-engineered+human+esophageal+mucosal+model.">The development and characterization of an organotypic tissue-engineered human esophageal mucosal model.</a> Tissue Eng Part A. 16 (3), 1053-1064 (2010).</li><li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+induces+immortalization+of+human+esophageal+keratinocytes+without+p16INK4a+inactivation.">Telomerase induces immortalization of human esophageal keratinocytes without p16INK4a inactivation.</a> Mol. Cancer Res. 1 (10), 729-738 (2003).</li><li>Bhargava, S., Chapple, C. R., Bullock, A. J., Layton, C., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+buccal+mucosa+for+substitution+urethroplasty.">Tissue-engineered buccal mucosa for substitution urethroplasty.</a> BJU. Int. 93 (6), 807-811 (2004).</li><li>Ralston, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocytes+contract+human+dermal+extracellular+matrix+and+reduce+soluble+fibronectin+production+by+fibroblasts+in+a+skin+composite+model.">Keratinocytes contract human dermal extracellular matrix and reduce soluble fibronectin production by fibroblasts in a skin composite model.</a> Br. J. Plast. Surg. 50 (6), 408-415 (1997).</li><li>Green, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsatile+exposure+to+simulated+reflux+leads+to+changes+in+gene+expression+in+a+3D+model+of+oesophageal+mucosa.">Pulsatile exposure to simulated reflux leads to changes in gene expression in a 3D model of oesophageal mucosa.</a> Int. J. Exp. Pathol. 95 (3), 216-228 (2014).</li><li>Wang, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+culture+of+epithelial+cells+from+primary+breast+carcinomas+using+irradiated+3T3+cells+as+feeder+layer.">Selective culture of epithelial cells from primary breast carcinomas using irradiated 3T3 cells as feeder layer.</a> Pathol. Res. Pract. 197 (3), 175-181 (2001).</li><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsinizing+and+subculturing+mammalian+cells.">Trypsinizing and subculturing mammalian cells.</a> J. Vis. Exp. (16), e755 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+Hemacytometer+to+Count+Cells.">Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2014).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> N. Am. J. Med. Sci. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues.">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nat. Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).</li><li>Morgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometric+bead+array:+a+multiplexed+assay+platform+with+applications+in+various+areas+of+biology.">Cytometric bead array: a multiplexed assay platform with applications in various areas of biology.</a> Clin. Immunol. 110 (3), 252-266 (2004).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+abnormal+expression+of+retinoic+acid+receptor-beta,+p+53+and+Ki67+protein+in+normal,+premalignant+and+malignant+esophageal+tissues.">The abnormal expression of retinoic acid receptor-beta, p 53 and Ki67 protein in normal, premalignant and malignant esophageal tissues.</a> World J. Gastroenterol. 8 (2), 200-202 (2002).</li><li>Moll, R., Divo, M., Langbein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+keratins:+biology+and+pathology.">The human keratins: biology and pathology.</a> Histochem. Cell Biol. 129 (6), 705-733 (2008).</li><li>Rice, R. H., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+in+human+epidermal+cells+of+a+soluble+protein+precursor+of+the+cross-linked+envelope:+activation+of+the+cross-linking+by+calcium+ions.">Presence in human epidermal cells of a soluble protein precursor of the cross-linked envelope: activation of the cross-linking by calcium ions.</a> Cell. 18 (3), 681-694 (1979).</li><li>Eves, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+invasion+in+reconstructed+human+skin+is+influenced+by+skin+cells+-+investigation+of+the+role+of+proteolytic+enzymes.">Melanoma invasion in reconstructed human skin is influenced by skin cells - investigation of the role of proteolytic enzymes.</a> Clin. Exp. Metastasis. 20 (8), 685-700 (2003).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

כתב יד זה מתאר את הייצור ואפיון של מודל ברירית הוושט רלוונטי מבחינה ביולוגית אנושי מתאים לשימוש כפלטפורמה ניסיונית ללמוד את ההשפעה של חשיפה לגורמי לחץ סביבתי על אפיתל הוושט. השלבים הקריטיים ביותר לייצור המוצלח של מודל ברירית הוושט אדם: להבטיח כי הרוב המכריע של תאי האפיתל להישאר שגשוג ולא התחיל כבר להבדיל לפני זריעתם על הפיגום; שמירה על ממשק אוויר נוזלי למרוכבים כדי להבטיח הבשלה נכונה של האפיתל; שמירה על סטריליות בכל תקופת התרבות המורחבת. בשל הכמויות מוגבלות של רקמה אנושית הזמינות לבידוד תא זה הוא בדרך כלל לא ניתן להשיג מספיק תאים מדגימת רקמה אחת זרע תאים מבודדים טרי ישירות על גבי הפיגום וכתוצאה מכך ph הרחבת תאASE נדרש בו התאים גדלים בתנאי תרבית תאי 2D סטנדרטיים. חשוב לוודא שתאים יישארו שגשוג בתקופה זו. זו מושגת על ידי הבטחה שהתרבויות לא מורשות להגיע confluency מלא, תוך שימוש בתאים במודל רק עד למעבר 4 וניטור מורפולוגיה תא בזהירות. כך תאים צריכים לשמור המורפולוגיה שלהם ייחודי שגשוג מצולעים והאופייני ההדוק &quot;מרוצף&quot; כמו מדרכה-מראה של תאי האפיתל שגשוג ולא את המראה המפוזר יותר נצפה בתרבויות שהחלו להבחין. השלב הקריטי השני נשלט על ידי הבטחה כי מדיום תרבית תאים מכסה את פני השטח העליונים של רשתות נירוסטה משמשות להרים את התרבויות לממשק אוויר נוזלי אבל על פני השטח העליונים של המבנה עצמו אינו שקוע. הצעד השלישי תלוי בהקפדה על פרוטוקול העיקור הארוך כאשר ייצור דה-cellularizedפיגום חזירי ושימוש בטכניקה סטרילית טובה לאורך כל התהליך. התוצאות שלנו מראות כי תאי הוושט אנושיים ראשוניים נדרשים לייצר אפיתל נורמלי, בוגר, מרובד. אם נעשה שימוש בשורת תאים הנציחה, אם כי נגזר מאפיתל הוושט האנושי, התאים נשארו שגשוג ולא הצליחו להבחין בצורת אפיתל מרובדת בוגרת. האפיתל וכתוצאה מכך לא יכול לשמש כמודל מספק לאפיתל הנורמלי, הממחיש את אי-ההתאמה של הקו סלולארי הונצח Het-1A לשימוש במודל. עם זאת ניתן לשלב שורות תאים אחרות, כגון אלו המתקבלים מגידולים בושט או מטפלזיה של בארט למודל או במקום או בנוסף לתאי האפיתל העיקריים לייצר מודלים לחקר התקדמות גידול, פלישה והתגובה לסוכנים תרופתיים. ניתן לבצע ניסויים תוך שימוש במודל של הוושט ליםimulate החשיפה של הוושט לבדיד אירועים, pulsatile בבליעה או רפלוקס. זו מושגת על ידי השריית שוב ושוב המבנים במדיום תרבות המכיל התרכובת (ים) להיבדק ושטיפה בPBS לפני החזרת המבנה לממשק אוויר נוזלי. ניתן לשנות זמני החשיפה והתדירות כדי לשקף את התהליך שמדומה, להבטיח כי את שכבת האפיתל חשופה לגורם הסביבתי (ים) תוך מתן אפשרות לתרבות להמשיך בממשק אוויר נוזלי. שיטה זו נעשתה שימוש במעבדה שלנו כדי לחקור את ההשפעה של ריפלוקס באפיתל הוושט הרגיל, שבו המודל נחשף למרכיבי ריפלוקס גסטרו-הוושט ספציפיים במשך 10 דקות פעמיים ביום למשך 11 ימים 11. לחלופין יכול להיות חשופה לרמות בונה רציפות של גורמי לחץ סביבתיים על ידי כולל תרכובות אלה במדיום התרבות. עם זאת, מאז האפיתל חייב להיות חשוף לממשק אוויר נוזלי לepitheאיליום להתבגר ולבדל כראוי 7, לא ניתן לצלול ברציפות המבנים במדיום התרבות. כתוצאה מכך, חשיפה ללחץ תהיה רק ​​באמצעות משטח submucosal בניסויים אלה, שעלולים להגביל את הרלוונטיות של תוצאות שהתקבלו. הטכניקה היא יחסית עבודה אינטנסיבית וכתוצאה מכך הוא מתאים יותר להקרנת מספרים מצומצמים יחסית של תרכובות. כתוצאה מכך, בעת שימוש במודל כפלטפורמה ניסיונית, זה מתאים לראשון לבצע מחקרים ראשוניים תוך שימוש בטכניקות תרבות תא קונבנציונליות לזהות מספר מוגבל של תנאים מוקדמים לניתוח נוסף תוך שימוש במודל הוושט יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית שתואר כאן 11. בנוסף לניתוח immunohistochemical זה כבר ניתן גם לבחון שינויים בפרופיל ביטוי גני אפיתל בעקבות חשיפה לפגעי סביבה. זו הושגה על ידי הפשטה משם באופן ידני את הדוארpithelium, חילוץ RNA והפיכתו לcDNA כדי לבודד את הגנים לידי ביטוי וניתוח על ידי microarray לקבל ביטוי גני פרופילי 11. בדרך זו ניתן היה להגדיל את המידע זמין מהמודל כפלטפורמה ניסיונית. שינויים מוקדמים בפרופיל ביטוי גני אפיתל בעקבות חשיפה מדומה לריפלוקס גסטרו-הוושט הוצעו ומתוצאות אלה תחומים חדשים הוצעו לחקירה נוספת במניעת התפתחותו של בארט מטפלזיה, מבשר metaplastic 11 OAC. המודל יכול לשמש גם כדי ללמוד ביטוי חלבון בשיטות כגון ניתוח מערבי כתם 15 וביטוי גנים באמצעות ניתוח כתם צפון 16. מחקרי יתר על כן של מולקולות איתות תאית יכולים להתבצע על מדיום התרבות 17.

רירית הוושט כוללת אפיתל מרובדת, קשקש מעל שכבה של רקמת חיבור, propria lamina, והוא אחד מהאתרים הראשונים שנתקלים בגורמי לחץ סביבתיים בליעה. חשיפה לרעלים תזונתיים מעורבת בפיתוח של קרצינומה של קשקש הוושט, תוך ריפלוקס duodenogastro-הוושט הוא גורם קריטי בפתוגנזה שלו של בארט מטפלזיה, אשר מזוהה עם עלייה בסיכון להתקדמות לאדנוקרצינומה של הוושט. קרצינומה של הוושט היא הגידול הממאיר הנפוץ ביותר -8 בגברים בבריטניה ואדנוקרצינומה של הוושט גדל במהירות בעולם המערבי 1. יתר על כן, חל שיפור קטן בתחזית מחלה, עם שיעור הישרדות של 5 שנים כוללת של כ -15%. כתוצאה מכך יש צורך בפלטפורמות ניסוי כדי לחקור את ההשפעה של חשיפה לגורמי לחץ סביבתי על אפיתל הוושט זה ומעורבותם האפשרית בdevelopment של מטפלזיה או גידולים. למרות שורות תאים הונצחו או גידול לאפשר לחוקרים ללמוד את התגובה של תאי האפיתל ללחצים אלה במבחנה, הם נשארים שגשוג ולא מצליחים להתמיין אפיתל התאים הבוגרים שנמצאו בשכבות העליונות של רירית הוושט. יתר על כן, תאי קווים שכבר עברו tumorigenesis עשויים לספק מידע מוגבל בלבד לגבי התגובות הראשוניות של תאים נורמלים בתוך האפיתל לגורמים סביבתיים; וזה השלב שבו הפוטנציאל להתערבות טיפולית עשוי להיות הגבוה ביותר. לבסוף, מערכות תרבית תאים קונבנציונליות לא מצליחות ללכוד את האינטראקציות הפוטנציאליות חשובות בין תאי אפיתל mesenchymal ובין תאים אלה והמטריצה ​​סביב המתרחשים בתוך רקמות in vivo. מודלים של בעלי החיים לספק מייקרו-סביבה מציאותית יותר ללימוד התגובות של epitheli הוושטאממ ויכול לשלב האינדוקציה המלאכותית ריפלוקס גסטרו-הוושט 2. עם זאת זה יכול להיות מאתגר יותר כדי לתפעל את גורמי הלחץ הסביבתיים במודלים האלה והם לא יכולים לייצג את התגובה בתוך הוושט האנושי באופן מלא. מודלים הוושט אחרים ניסיוניים אנושיים פותחו לנצל תאים ראשוניים, תאים הונצחו או שורות תאי גידול בקולגן, או בשילוב fibroblasts קולגן / Matrigel, פיגום המכיל 3,4. זה פחות עבודה אינטנסיבית כדי ליצור פיגומים אלה מפיגום הוושט acellular המתואר בכתב היד הזה, ומודלי organotypic אלה מספקים כלי שימושי, במיוחד במחקר של פלישת גידול 5,6, שבו תאי גידול חדירות לג&#39;ל קולגן יכול להיות בקלות נצפה. עם זאת יש לי ג&#39;ל קולגן אלה תכונות מכאניות שאינם ילידי הארץ וחסרי תכונות מסוימות של הרקמה המקורית, כולל קרום במרתף ספציפי וappropriatטופוגרפיה משטח דואר. זה יכול להשפיע על התנהגותם של תאים וכתוצאה מכך, לדוגמא, הדבקה עניות בין האפיתל והפיגום בעת שימוש בפיגום ג&#39;ל קולגן 7. כתוצאה מכך פיגום הוושט חזירי acellular פותח, עם היתרון של להיות יותר מציאותי מבחינה ביולוגית פיגום ולכן יותר מתאים לשימוש כפלטפורמה ניסיונית. זה גם הוכח שעדיף לשלב תאים ראשוניים למבני הוושט מאשר קווים הנציחו הוושט אפיתל תאים, כגון Het-1A, מאז תאים אלה יוצרים אפיתל רב שכבתי, אבל לא מצליחים רבד או להבדיל 4,7,8 . כתוצאה מכך, פרוטוקול זה הותאם משיטה כבר בשימוש במעבדה מקניל להכנת עור רקמות מהונדסים ורירית פה 9,10 ומשלב פיגום הוושט חזירי דה-cellularized בשילוב עם תאים ראשוניים אדם הוושט אפיתל fibroblasts. תיפרוטוקול של מייצר האפיתל בוגר, מרובדת, דומה לזו של וושט האדם הנורמלי כפי שהודגם על ידי CK4, CK14, Ki67 וinvolucrin מכתים. מודל התוצאה מספק פלטפורמה ניסיונית ללמוד תגובות ללחצים סביבתיים, ונעשה בו שימוש בצורה יעילה כדי לחקור שינויים בביטוי גנים באפיתל הוושט בתגובה לrefluxate רכיבים 11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td align="right">215240</td>
			<td>Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilise. Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Labtech</td>
			<td>LM-D1112</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12</td>
			<td>Labtech</td>
			<td>LM-H1236</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Calf Serum</td>
			<td>Labtech</td>
			<td>FB-1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>R+D Systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>Prepare 200 &#181;g/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydorcortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0396</td>
			<td>Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2786</td>
			<td>Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2767</td>
			<td>Prepare 10 mg/ml solution in 0.01M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2036</td>
			<td>Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2752</td>
			<td>Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052</td>
			<td>Prepare stock solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>Brand name Fungizone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>BR0014</td>
			<td>Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilise</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">10103578001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine solution</td>
			<td>Ecolab</td>
			<td>10830E</td>
			<td>Brand name Videne</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">433209</td>
			<td>Prepare 1M solution and autoclave to sterilise before use (121 &#730;C for 15 min)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td>Autoclave to sterilise before use (121 &#730;C for 15 min)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn calf serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">26010074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8783</td>
			<td>Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9508</td>
			<td>Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td>Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-phosphorylethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0503</td>
			<td>Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS (insulin, transferrin, selenium)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-838Z</td>
			<td>Used for composite media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3924</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.02% solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 culture flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td align="right">11819650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml universal tube</td>
			<td>SLS</td>
			<td>SLS7504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>180 ml pot</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-2603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>SLS</td>
			<td align="right">150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stainless steel rings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Manufactured in house - medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>steel mesh grids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Manufactured in house - sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2cm (w) x2 cm (d) x 0.5 cm (h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ki67</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>KI67-MM1-L-CE</td>
			<td>Clone MM1 Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9004</td>
			<td>Clone 6B10 Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK14</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>LL002-L-CE</td>
			<td>Clone LL002 Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Involucrin</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>INV</td>
			<td>Clone&#160; SY5 Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OE21</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">96062201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OE33</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">96070808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Het-1A</td>
			<td>ATCC-LGC</td>
			<td>CRL-2692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse 3T3 fibroblasts</td>
			<td>ATCC-LGC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>previously growth arrested by irradiation (60 Gy)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, characterization and potential uses of a 3d tissue-engineered human esophageal mucosal model

השכיחות של שתי אדנוקרצינומה של הוושט ומבשרה, מטפלזיה של בארט, עולה במהירות בעולם המערבי. יתר על כן אדנוקרצינומה של הוושט בדרך כלל יש פרוגנוזה גרועה, עם שיפור קטן בשיעורי הישרדות בשנים האחרונות. אלה הם תנאים קשים ללמוד ויש כבר חוסר פלטפורמות ניסוי מתאימים לחקור הפרעות של רירית הוושט. מודל של רירית הוושט האנושית פותח במעבדה מקניל ש, בניגוד למערכות תרבית תאי 2D קונבנציונליות, משחזרת אינטראקציות תא-תא ותא-מטריצה ​​הנוכחיות in vivo ומייצר האפיתל בוגר, מרובד דומה לזה של האדם הנורמלי וושט. בקצרה, המודל מנצל תאים נורמלים fibroblasts הוושט האנושי הראשוני ואפיתל-שינה לא גדלו בתוך פיגום הוושט acellular נגזר חזירי. אפיון immunohistochemical של מודל זהעל ידי CK4, CK14, Ki67 וinvolucrin צביעה מדגימה שחזור מתאים של היסטולוגיה של רירית הוושט אדם הנורמלית. מודל זה מספק מודל חזק, רלוונטי מבחינה ביולוגית ניסיוני של רירית הוושט האנושית. זה יכול בקלות לטפל לחקור מספר שאלות מחקר כולל את האפקטיביות של סוכנים תרופתיים ואת ההשפעה של חשיפה לגורמים סביבתיים כגון אלכוהול, רעלים, טמפרטורה גבוהה או רכיבי refluxate גסטרו-הוושט. המודל מאפשר גם תקופות תרבות מורחבות לא השגה עם תרבות קונבנציונלית תא 2D, המאפשרת, בין היתר, המחקר על ההשפעה של חשיפה חוזרת ונשנית של האפיתל בוגר לסוכן של ריבית לעד 20 ימים. יתר על כן, מגוון רחב של שורות תאים, כגון אלה שמקורם בגידולים בושט או מטפלזיה של בארט, ניתן לשלב את המודל כדי לחקור תהליכים כגון פלישת גידול וresponsivene סמיםss ביותר מבחינה ביולוגית רלוונטי סביבה.

כתב יד זה מתאר את התהליך הנדרש, שמוצג בצורה סכמטית באיור 1, למודלי 3D תרבות של האפיתל הוושט האנושי בהצלחה. כדי לאשר את התאמתו של המודל כהיסטולוגית פלטפורמה ניסיונית ומחקרי immunohistochemical כבר התחייבו השוואת הרקמות התרבותית עם רירית הוושט קשקש אדם נורמלית. הערכה היסטולוגית של האפיתל המיוצר על ידי השיטה המתוארת תערוכות האפיתל בוגר, רב שכבתי, מרובד קשקש (איור 2) אשר ניתן להשוות לזה שנצפה בוושט (איור 2 א) האדם הנורמלי, אם כי (5 עד 10 שכבות דקות יותר של תאים לעומת 10 עד 20 לושט הרגיל), עם התאים הולכים ולהחמיא וסופו של הדבר anuclear כפי שהם נודדים לכיוון פני השטח. אפיון immunohistochemical של סמנים העיקריים של התפשטות ודיfferentiation להוכיח כי microanatomy של האפיתל המודל דומה לאפיתל הוושט האדם הנורמלי. ביטוי Ki67 דומה נצפה בשני וושט הילידים ואפיתל המודל, עם כתמים מוגבלים לקבוצת משנה של תאים בתוך הבסיס ושכבות מייד suprabasal (איורים 3 א ו 3 ב). זה דומה למחקרים שדיווחו כי פחות מ -10% מתאים בדרך כלל להראות ביטוי של סמן השגשוג, Ki67, באפיתל הוושט הרגיל 18. CK4 בדרך כלל לידי ביטוי בepithelia מרובדת ועמודים אך בדרך כלל נעדרים משכבות הבסיס תוך CK14 הוא חיובי רק בשכבת בסיס 19. בשני epithelia הוושט הנורמלי ומודל, CK14 הוא ציין בכל התאים בשכבת הבסיס (3D דמויות ו3E) תוך CK4 הוא ציין ברחבי אפיתל למעט שתי שכבות בסיסיות ביותר (איורים 3G ו <strong&gt; 3H). Involucrin ביטוי הוא סמן מוקדם של בידול, בא לידי ביטוי בשכבות suprabasal של האפיתל 20. שוב שתי הרקמות נורמליות אנושיות הוושט ומכתים את מופע אפיתל המודל המשקף (3J דמויות ו3K) זה. הניסיונות להחליף את תאי אפיתל הוושט העיקריים עם תאי אפיתל הונצחו בושט, כגון Het-1A, היו פחות מוצלחים ולא לייצר מודל תקף של אפיתל הוושט הרגיל. אפיתל רב שכבתי הוקם; עם זאת סמן שגשוג Ki67 זוהה לאורך אפיתל (איור 3 ג) ללא ביטוי המזוהה עבור כל סמנים של בידול (איורים 3F, 3I ו3L), מצביעים על כך שתאי Het-1A מיוצרים אפיתל hyperproliferative ללא עדות לריבוד או הרגילים התבגרות. עם זאת, המודל היהשינוי בהצלחה לשלב תאים סרטניים על ידי ההחלפה של תאי האפיתל עיקריים עם או אדנוקרצינומה של הוושט (OE33) או קרצינומה של תאי קשקש (OE21). זה מדגים את הגמישות של המודל, המאפשר את השימוש בו בחקירת מגוון של הפרעות בושט בשלבים שונים של התקדמות באמצעות ההכללה של מספר שורות תאים שונים. ניתן לראות כי יש הבדל ניכר בתגובות משתי שורות תאים אלה. קרצינומה של תאי קשקש OE21 מייצר אפיתל גלוי על המבנה כאזור צהוב מוגדר (איור 4 א) עם שסעים גדולים באפיתל (איור 4), עשויים לשקף מולקולות הידבקות תא מתפקדות. כולל תאי אדנוקרצינומה OE33 בתוך תוצאות המודל בכמות גדולה של השפלה פיגום, גלויה על ידי העין כדילול של הפיגום לאחר צמיחת 2 שבועות על ממשק אוויר / נוזל (איור 4C) ואישר בניתוח H + E כירידה ברורה בעובי של הפיגום באזור שמתחת לתאים (איור 4D). זה עשוי להיות תוצאה של אינטראקציה בין התאים הסרטניים ופיברובלסטים, מאז ניוון הפיגום לא נצפה בהעדר fibroblasts (4E דמויות ו4F). יש לנו נצפו השפעות דומות על פלישת גידול בנוכחות והיעדרות של fibroblasts במודלים מלנומה שווים 21. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52693/52693fig1.jpg" /> איור 1: תרשים סכמטי המציג את הייצור של מודל רירית הוושט הוושט fibroblasts אדם הם זורעים על פני השטח submucosal של הפיגום ותרבית למשך 7 ימים.. הפיגום הפוך, תאי אפיתל הוושט אדם הוסיפו ותרבותיים שקועים במשך 4 ימים. המבנה עולה לממשק אוויר נוזלי לבין 10 ל 20 daי&quot;ש. בסוף ניסוי המבנה יכול לעבור ניתוח נוסף כנדרש. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52693/52693fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52693/52693fig2.jpg" /> איור 2: השוואה של האפיתל המיוצר במודל הוושט עם נורמלי אפיתל הוושט אנושי ניתוח H + E של אפיתל הוושט אדם הנורמלי () ואפיתל הוושט (ב &#39;) הוקם במודל של רירית הוושט האדם.. בר סולם הוא 500 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52693/52693fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52693/52693fig3.jpg" /> <strאונג&gt; איור 3: אפיון immunohistochemical של האפיתל הוושט מיוצר במודל והשוואה עם וושט האדם הנורמלי. ניתוח IHC של וושט רגיל (טור 1) וושט הדגם מיוצר באמצעות תאים ראשוניים אדם הוושט אפיתל (עמודה 2) או תאי אפיתל הונצחו בושט (עמודה 3). אפיון היה ידי Ki67 (- C), CK14 (D, E), CK4 (G, H) וinvolucrin מכתים (J, K). בר סולם הוא 200 מיקרומטר. (נתון זה כבר שונה 7.) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52693/52693fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52693/52693fig4.jpg" /> איור 4: ההכללה של שורות תאי גידול בתוךמודל הוושט. תאי האפיתל העיקריים הוחלפו על ידי קו קשקש תא קרצינומה, OE21, או שורת תאי אדנוקרצינומה, OE33. תמונות מראות את המבנה עם תאי OE21 () או תאי OE33 או בשיתוף עם (ג) או בהעדר fibroblasts (E), לפני תיקון בתום תקופת התרבות. Epithelia כולל OE21 (ב) או תאי OE33 עם (ד) או בלי fibroblasts (F) הם דמיינו ידי צביעת H + E. בר סולם הוא 500 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52693/52693fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model at JoVE.com

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

כתב יד זה מתאר את הייצור, אפיון ושימושים פוטנציאליים של רקמת מבנה הוושט 3D מהונדס הוכנה מפיברובלסטים נורמלים עיקריים אנושיים הוושט ותאי אפיתל קשקש זורעים בתוך פיגום חזירי דה-cellularized. התוצאות מראות ההיווצרות של האפיתל מרובדת בוגר דומה לושט האדם הנורמלי.

ייצור, אפיון ופוטנציאל שימושים של הוושט רירי דגם אדם מהונדס-רקמות 3D

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

production-characterization-potential-uses-3d-tissue-engineered-human

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.4K Views.  University of Sheffield.  כתב יד זה מתאר את הייצור, אפיון ושימושים פוטנציאליים של רקמת מבנה הוושט 3D מהונדס הוכנה מפיברובלסטים נורמלים עיקריים אנושיים הוושט ותאי אפיתל קשקש זורעים בתוך פיגום חזירי דה-cellularized. התוצאות מראות ההיווצרות של האפיתל מרובדת בוגר דומה לושט ה...

Video: Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of tri-leaflet polymer valve prostheses. However, identification of a protocol for initial assessment of polymer valve hydrodynamic functionality is paramount during the early stages of the design process. Traditional in vitro pulse duplicator systems are not configured to accommodate flexible tri-leaflet materials; in addition, assessment of polymer valve functionality needs to be made in a relative context to native and prosthetic heart valves under identical test conditions so that variability in measurements from different instruments can be avoided. Accordingly, we conducted hydrodynamic assessment of i) native (n = 4, mean diameter, D = 20 mm), ii) bi-leaflet mechanical (n= 2, D = 23 mm) and iii) polymer valves (n = 5, D = 22 mm) via the use of a commercially available pulse duplicator system (ViVitro Labs Inc, Victoria, BC) that was modified to accommodate tri-leaflet valve geometries. Tri-leaflet silicone valves developed at the University of Florida comprised the polymer valve group. A mixture in the ratio of 35:65 glycerin to water was used to mimic blood physical properties. Instantaneous flow rate was measured at the interface of the left ventricle and aortic units while pressure was recorded at the ventricular and aortic positions. Bi-leaflet and native valve data from the literature was used to validate flow and pressure readings. The following hydrodynamic metrics were reported: forward flow pressure drop, aortic root mean square forward flow rate, aortic closing, leakage&#160;and regurgitant volume, transaortic closing, leakage, and total energy losses. Representative results indicated that hydrodynamic metrics from the three valve groups could be successfully obtained by incorporating a custom-built assembly into a commercially available pulse duplicator system and subsequently, objectively compared to provide insights on functional aspects of polymer valve design.

There has been renewed interest in developing polymer valves. Here, the objectives are to demonstrate the feasibility of modifying a commercial pulse duplicator to accommodate tri-leaflet geometries and to define a protocol to present polymer valve hydrodynamic data in comparison to native and prosthetic valve data collected under near-identical conditions.

פרוטוקול להערכה הידרודינמית יחסית של הפולימר שסתום Tri-עלון

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

הנדסת רקמות של 3D אדם<em&gt; במבחנה</emמערכת מבחן גידול&gt;

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

דור והארכת כלי רקמות מהונדסות במודל עכבר

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is limited to cell proliferation and gene expression endpoints. However, in the organism, mammary morphogenesis occurs in a 3D environment. 3D culture systems help bridge the gap between monolayer cell culture (2D) and the complexity of the organism. Herein, we describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action. It uses the commercially available hormone-responsive human breast epithelial cell line, T47D, and rat tail collagen type 1 as a matrix. This 3D culture model responds to the main mammotropic hormones: estradiol, progestins and prolactin. The influence of these hormones on epithelial morphogenesis can be observed after 1- or 2-week treatment according to the endpoint. The 3D cultures can be harvested for analysis of epithelial morphogenesis, cell proliferation and gene expression.

We describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action.

מודל התרבות 3D-תגובת הורמון של האפיתל בלוטת חלב האדם

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific mutational background. The model is generated on a decellularized porcine scaffold that reproduces tissue-specific characteristics regarding extracellular matrix composition and architecture including the basement membrane. We standardized a protocol that allows artificial tumor tissue generation within 14 days including three days of drug treatment. Our article provides several detailed descriptions of 3D read-out screening techniques like the determination of the proliferation index Ki67 staining&#39;s, apoptosis from supernatants by M30-ELISA and assessment of epithelial to mesenchymal transition (EMT), which are helpful tools for evaluating the effectiveness of therapeutic compounds. We could show compared to 2D culture a reduction of proliferation in our 3D tumor model that is related to the clinical situation. Despite of this lower proliferation, the model predicted EGFR-targeted drug responses correctly according to the biomarker status as shown by comparison of the lung carcinoma cell lines HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) and A549 (EGFR wild-type, KRAS-mutated) treated with the tyrosine-kinase inhibitor (TKI) gefitinib. To investigate drug responses of more advanced tumor cells, we induced EMT by long-term treatment with TGF-beta-1 as assessed by vimentin/pan-cytokeratin immunofluorescence staining. A flow-bioreactor was employed to adjust culture to physiological conditions, which improved tissue generation. Furthermore, we show the integration of drug responses upon gefitinib treatment or TGF-beta-1 stimulation - apoptosis, proliferation index and EMT - into a Boolean in silico model. Additionally, we explain how drug responses of tumor cells with a specific mutational background and counterstrategies against resistance can be predicted. We are confident that our 3D in vitro approach especially with its in silico expansion provides an additional value for preclinical drug testing in more realistic conditions than in 2D cell culture.

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

רקמת 3D משולב תכנון הנדסי<em&gt; במבחנה</em&gt; /<em&gt; סיליקו</em&gt; דגם גידול ריאות לניבוי יעילות טיפול תרופתי רקעים מוטציוני ספציפיים

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

פיתוח תאיים תלת ממד Organotypic דגם של אדם המעיים הריריים Grown במיקרוגרבטיציה

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

הייצור של חלבון כמו אלסטין Hydrogels כימוס, Immunostaining של תאים ב- 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

זיהוי של אנדוטוקסין ניסוחים-Nano באמצעות מבחני Lysate (LAL) Amoebocyte Limulus

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional tissue. Tissue engineering holds great promise as a potential solution with its ability to integrate cells and signaling molecules into a 3-dimensional scaffold. Recent work with tissue engineered tracheal grafts (TETGs) has seen some success but their translation has been limited by graft stenosis, graft collapse, and delayed epithelialization. In order to investigate the mechanisms driving these issues, we have developed a mouse model for tissue engineered tracheal graft implantation. TETGs were constructed using electrospun polymers polyethylene terephthalate (PET) and polyurethane (PU) in a mixture of PET and PU (20:80 percent weight). Scaffolds were then seeded using bone marrow mononuclear cells isolated from 6-8 week-old C57BL/6 mice by gradient centrifugation. Ten million cells per graft were seeded onto the lumen of the scaffold and allowed to incubate overnight before implantation between the third and seventh tracheal rings. These grafts were able to recapitulate the findings of stenosis and delayed epithelialization as demonstrated by histological analysis and lack of Keratin 5 and Keratin 14 basal epithelial cells on immunofluorescence. This model will serve as a tool for investigating cellular and molecular mechanisms involved in host remodeling.

Graft stenosis poses a critical obstacle in tissue engineered airway replacement. To investigate cellular mechanisms underlying stenosis, we utilize a murine model of tissue engineered tracheal replacement with seeded bone marrow mononuclear cells (BM-MNC). Here, we detail our protocol, including scaffold manufacturing, BM-MNC isolation, graft seeding, and implantation.

Seeding, השרשת biosynthetic הוחלף נגזר רקמות מהונדסים בקנה הנשימה השתלה במודל של עכברים

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant technique with nutritional support. Recently, there have been many attempts at esophageal tissue engineering, but the success rate has been limited due to difficulty in early epithelization in the special environment of peristalsis. Here, we developed an artificial esophagus that can improve the regeneration of the esophageal mucosa and muscle layers through a two-layered tubular scaffold, a mesenchymal stem cell-based bioreactor system, and a bypass feeding technique with modified gastrostomy. The scaffold is made of polyurethane (PU) nanofibers in a cylindrical shape with a three-dimensional (3D) printed polycaprolactone strand wrapped around the outer wall. Prior to transplantation, human-derived mesenchymal stem cells were seeded into the lumen of the scaffold, and bioreactor cultivation was performed to enhance cellular reactivity. We improved the graft survival rate by applying surgical anastomosis and covering the implanted prosthesis with a thyroid gland flap, followed by temporary nonoral gastrostomy feeding. These grafts were able to recapitulate the findings of initial epithelialization and muscle regeneration around the implanted sites, as demonstrated by histological analysis. In addition, increased elastin fibers and neovascularization were observed in the periphery of the graft. Therefore, this model presents a potential new technique for circumferential esophageal reconstruction.

Esophageal reconstruction is a challenging procedure, and development of a tissue-engineered esophagus that enables regeneration of esophageal mucosa and muscle and that can be implanted as an artificial graft is necessary. Here, we present our protocol to generate an artificial esophagus, including scaffold manufacturing, bioreactor cultivation, and various surgical techniques.

רקמת הנדסה לשיקום שחזור הוושט בחולדות

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...