We thank members of the UNC Zebrafish Aquaculture facility for maintenance of the zebrafish. We would also like to thank Diagnosys, LLC for assistance with the setup of the ERG apparatus. Additional thanks go to Dr. Portia McCoy and the laboratory of Dr. Ben Philpot for assistance with electrophysiological methods. We also wish to thank Lizzy Griffiths for her illustration of a larval zebrafish. This work was supported by National Institutes of Health awards F32 EY022279 (to J.D.C) and R21 EY019758 (to E.R.W).

אחזקת בעלי חיים ופרוטוקולי ניסוי אושרו על ידי ועדות הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של אוניברסיטת צפון קרוליינה בצ&#39;אפל היל, ולעמוד בכל הדרישות של משרד NIH של בעלי חיים במעבדת רווחה והאגודה להערכה והסמכה של מעבדה טיפול בבעלי חיים בינלאומיים. הערה: פרוטוקולים כדי להשיג זחלים לניתוח ERG, שפורסם לגידול דג הזברה סטנדרטי ותחזוקה הועסקו 18. זחלים שהושגו באמצעות רבייה טבעית, ושוכנו בשעה 14 מחזור אור / חושך 10 שעות. פרוטוקול זה כבר מותאם לזחלים ב5-7 ימים לאחר הפריה (DPF), אבל יכול להתבצע באופן אידיאלי על דגים מבוגרים עם שינויים קטנים להליך. כאן, להשתמש בלחץ TL של זחלי דג הזברה wild-type בשעה 5 DPF. 1. Micropipette הפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך כמה micropipettes באמצעות 1.5 x 0.86 מ&quot;מ (קוטר חיצוני על ידי קוטר פנימי) נימי זכוכית בורוסיליקט אש מלוטשת עםחוט להט (טמפרטורת התכה, 821 ° C) וFlaming / בראון micropipette פולר P-97 מצויד בנימת חום תיבה. השתמש בתכנית לעיצוב micropipettes המתואר בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק כל micropipette תחת מיקרוסקופ עם שליט graticule מתאים כדי להבטיח שטיפים הם 10-15 מיקרומטר בקוטר ויש לו טיפ פתיחה חלקה (כלומר, ללא קצוות משוננים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחסן בזהירות micropipettes כדי למנוע נזק קצה וחשיפה לאבק. אפשרויות אחסון כוללות צלחות פטרי עם מעבדה קלטת, קופסות מרופדות קצף, או מיכלי אחסון micropipette זמין מסחרי. ניתן להשתמש בנימי מושכי micropipette אחרים וזכוכית ארוכות כמו הקוטר הנכון של micropipette וקצה באיכות גבוהה מושגת: הערה. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> לחץ </td><td> חום </td><td> משוך </td><td> Velocity </tד&gt; <td> זמן </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 560 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 450 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 410 </td><td> 55 </td><td> 40 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> טבלת 1: תכנית לייצור micropipettes באמצעות / micropipette פולר חום P-97 Flaming המצויד בנימת חום תיבת Micropipettes מבוצעים באמצעות 1.5 x 1.0 מ&quot;מ 2 (קוטר חיצוני על ידי קוטר פנימי) נימי זכוכית בורוסיליקט אש מלוטשת עם נימה. (טמפרטורת היתוך, C 821 °). 2. הצפת הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מסונן, המאגר של רינגר דג זהב מחומצן 19 בנימי microelectrode וכדי להרוות את ספוג אלכוהול פוליוויניל (PVA) על שהזחלים ממוקמים לניסויים. לחלופין, השתמש ב- E3<html> תקשורת עובר או תמיסת מלח מאוזנת של האנק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 10x רינגר דג זהב כפי שמתואר בטבלה 2. התאימו לpH 7.8, ולעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן את המניה 10x על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור פתרון עבודה ביום של הניסוי על ידי דילול הפתרון של רינגר 10x ל1X עם מים ללא יונים, מזוקקים. לסנן באמצעות מערכת סינון 0.22 מיקרומטר. חמצן על ידי מבעבע עם 95% O גז 2 CO 2/5% במשך 10 דקות. כובע בחוזקה לאחר מכן על מנת להבטיח שהפתרון נותר מחומצן. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> NaCl </td><td> 1.25 M </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 26 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 25 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 10 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> 100 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 100 מ&quot;מ </td></tr></tbody></table>jove_content &quot;&gt; טבלה 2: הכנת פתרון 10x רינגר דג זהב. 3. electroretinogram פלטפורמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניסויי ERG על שולחן נגד רעידות בתוך כלוב פאראדיי כדי לשפר את יחס האות לרעש. צרף פלטפורמת פלדה מותאמת אישית לשולחן נגד הרעידות באמצעות אגוזי משושה. הנח פלטפורמת פלסטיק מטלטלין עם תחתית viscoelastic פולימר urethane הלם קליטה על השולחן מתחת למקור האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את המצלמה עם מעמד ממוגנט, שמטרה למטה בפלטפורמת פלסטיק מטלטלין. מקם את micromanipulator (אשר יחזיק microelectrode ההקלטה) עם מעמד ממוגנט שני מהימין לפלטפורמת פלסטיק מטלטלין. ודא שהמצלמה וmicromanipulator לא יופרעו על ידי התנועה של ציוד אחר ושהם לא לחסום תאורה ממקור האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את המצלמה לצג וידאו ולמקם אותו כדי להציג את עינו שלזחל להצבת אלקטרודה במיקום הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שההגדרה היא מוארקת כראוי עם חוטי נחושת. כדי לבדוק את הרעש, למקם את האלקטרודה התייחסות וקצה microelectrode ההקלטה בגודל 35 מ&quot;מ צלחת פטרי מלא עם הפתרון של רינגר. בדוק את רמות הרעש החשמלית של ההתקנה עם אוסצילוסקופ או תכונה מובנית של מנגנון ERG. רמות רעש צריכה להיות לא יותר מ ± 10 μV מנקודת ההתחלה. </li></ol> 4. ספוג הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך מלבן קטן של ספוג PVA היבש שיתאים בנוחות בצלחת פטרי 35 מ&quot;מ. העובי של הספוג לא צריך להיות גדול יותר מהעומק של המנה. השתמש בסכין יפני בסכין גילוח נקי לחיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך קיצוץ נוסף לתוך הספוג כדי להתאים את האלקטרודה ההתייחסות (או לחתוך רדוד לאורך בחלק התחתון של הספוג או פרפר לחתוך אנכי דרך אחד הקצוות הקטנים יותר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סמן עמיד כימיכדי לסמן נקודה קטנה על ספוג (שבו הזחל יוצב) שיכול לשמש למיצוב המצלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את ספוג PVA בפתרון של רינגר עד רווי. הסר ולמחוק במהירות על מגבת נייר 2-3 פעמים. מניחים את הספוג בצלחת פטרי 35 מ&quot;מ נקייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את צלחת פטרי המכילה את הספוג על פלטפורמת הפלסטיק כך שהסימן יכול להיות דמיין ידי המצלמה. </li></ol> 5. אלקטרודה הכנה הערה: התקנת דג הזברה מורכבת אלקטרודה התייחסות במגע עם ספוג רינגר-רווי פתרון PVA והאלקטרודה הקלטה במגע עם הקרנית. האלקטרודה ההתייחסות מורכבת מגלולת Ag / AgCl. האלקטרודה ההקלטה היא micropipette זכוכית משך מלא בפתרון של רינגר ומוחזק על ידי בעל microelectrode מכיל חוט Ag. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלוריד אלקטרודות ידי טבילתם ב6-9 hypochlorite נתרן% (אקונומיקה) במשך 5 דקות (MICR ההקלטהחוט oelectrode) או 15 דקות (האלקטרודה ההתייחסות). אוויר יבש על Kimwipe במשך 5 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לסגנון של חתך שנעשה בשלב 4.2, למקם את כדור Ag / AgCl של האלקטרודה ההתייחסות ל( לקיצוץ הפרפר האנכי) או מתחת (לחתך הרדוד לאורך בתחתית) את הספוג. צרף להוביל אלקטרודה התייחסות למערכת ההקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, אם יש לו את התקנת ERG אילוצי שטח או שיש חפצי פוטו חזקים במיוחד מן האלקטרודה Ag / AgCl, לחבר את האלקטרודה ההתייחסות לספוג באמצעות גשר מלח אגר להעביר את האלקטרודה מנתיב האור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף ~ 40 סנטימטרים של צינורות בגודל המתאים ל5 מיליליטר מזרק מנעול שאינו Luer. מלא את המזרק עם הפתרון של רינגר. בעלי microelectrode בעל יציאות לחץ בדרך כלל ספינה עם מתאמים כדי להתאים צינורות בקטרים ​​פנימיים של 1/16 &quot;, 3/32&quot;, 1/8 &quot;או 5/32&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא שאינו Luer מזרק 1 מיליליטר מנעול עםהפתרון של רינגר ו, באמצעות מיקרו-fil, למלא בקפידה את בעל microelectrode. למנוע היווצרות של בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את מזרק 5 מיליליטר ליציאת הלחץ של בעל microelectrode עם צינורות ולהשתמש בו כדי להבטיח כי בעל microelectrode מלא של הפתרון של רינגר. השימוש במייקרו-fil ומזרק 1 מ&quot;ל מלא הפתרון של רינגר, למלא את כוס micropipette מהקצה ולהבטיח כי אין בועות נמצאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף micropipette הזכוכית לבעל microelectrode, להיות זהיר, כדי לשמור על ישר חוט האלקטרודה. ברגע שהשיג, להשתמש במזרק 5 מיליליטר לכפות זהירות הפתרון של רינגר דרך microelectrode עד כמות זעירה של פתרון נראית לעין בקצה. יישום מזדמן של לחץ למזרק (כאשר לא חל על קרנית) ימנע היווצרות של בועות אוויר, כמו גם חסימות בשל אבק או הצטברות מלח, בקצה micropipette. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הפתרון יוצא כזרם, להחליף את gmicropipette ילדה, כפתיחת טיפ גדולה מדי או פגומה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות במקום microelectrode ההקלטה בmicromanipulator ולצרף את יתרון מערכת ההקלטה. </li></ol> 6. ניתוח electroretinogram הערה: עקב הדומיננטיות חרוט של רשתית הזחל, ניתן להשיג תוצאות ERG באיכות גבוהה כאשר הכנות להקלטה מתבצעות תחת רמות נמוכות של אור לבן עקיף (&lt;סוויטה דה לוקס 1) או לתקופות קצרות (&lt;1 דקות) בעוצמה גבוהה יותר ( ≤250 אור סוויטה דה לוקס) עובד. תקופה קצרה של הסתגלות כהה עדיין נדרשת לפני ההקלטה (ראה שלב 6.7). עם זאת, ניתן לבצע ניסויים באור אדום או באינפרא האדום עמום באמצעות מצלמת אינפרא אדום רגישה. כל הניסויים בוצעו במי מערכת עיקור מסנן (0.22 מיקרומטר) ממתקן UNC דג הזברה חקלאות המים אך יכול לשמש אמצעי תקשורת חלופי עובר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריבועי נייר מגבת לחתוך מדידה כ 12 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מדידת פוטנציאל קולט המוני קונוס מבודד, דגירה 3-5 זחלים במי מערכת עם 500 מיקרומטר (±) -2--4-phosphonobutyric חומצת אמינו (APB) במשך 5 דקות. הערה: בעוד APB הוא תערובת של רצמית הפעיל (L) וצורות לא פעילים (R) של AP4, זה יעיל כמו L-AP4 ופחות יקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי 3-5 זחלים במי מערכת עם 0.02% (w / v) Tricaine עד, כ 1-2 דקות להגיב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במשאבת פיפטה ופיפטה פסטר להעביר בזהירות זחלים בודדים על ריבועי נייר מגבת תחת stereoscope לנתח באמצעות תאורה מינימאלית (≤250 סוויטה דה לוקס ל&lt; 1 דקות). בדוק את המיקום של כל זחל ולבחור מועמד שהוא למעלה בצד גב עם עין unoccluded. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקלטות ארוכות (&gt; 30 דקות), לשמור את הזחל לח על ידי זיגוג הגוף עד, אבל לא כולל את הראש עם methylcellulose 3% בעזרת מברשת משיער הגמל בסדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להעביר את squar מגבת ניירדואר עם הזחל לספוג PVA הלח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקלטות ארוכות (&gt; 30 דקות), יחול זרם רציף של O 100% רוויי מים 2 גז על הזחל ידי מבעבע הגז דרך airstone בבקבוק בצד זרוע המכיל מים מזוקקים. מקם את צינור יציאה בצד זרוע הבקבוק שמעביר את חמצן humidified ליד ראשו של הזחל. הערה: שלב 6.4.1 וצעד 6.5.1 יהיה להאריך את החיים של הדגים 16. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת תאורה מינימאלית, להשתמש micromanipulator ומצלמה לעמדת קצה microelectrode בנקודת האמצע בין האף וקצות הזנב של העין ולחץ בעדינות על גבול הגב של הקרנית. הערה: מיקום שגוי של קצה האלקטרודה לאזורים הרחוק הדיסטלי של הקרנית יכול לגרום לגל ERG של קוטביות הפוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר זחל אל dark-להסתגל למשך 5-10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא תגובות הבזק מבחן לאור הניתן ממקור אור LED או ממריץ אופטי באמצעות avaiציוד גירוי והקלטת lable. להתאים את הפרמטרים פרוטוקול כגון עוצמת הבזק, אורך הבזק, הבזק צבע, עוצמת רקע והגדרות צבע ומסנן כדי להתאים את הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר סיימו עם הניסוי, להרדים זחלים על פי הנחיות AVMA / IACUC. </li></ol>

<ol>
	<li>Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The retina: an approachable part of the brain. , (1987).</li><li>Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inexpensive+device+for+non-invasive+electroretinography+in+small+aquatic+vertebrates.">An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates.</a> J Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).</li><li>Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+responses+of+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium.</a> J Neurophysiol. 91, 1134-1142 (2004).</li><li>Heckenlively, J. R., Arden, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , (2006).</li><li>Perlman, I., Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).</li><li>Fadool, J. M., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+a+model+system+for+the+study+of+eye+genetics.">Zebrafish: a model system for the study of eye genetics.</a> ProgRetin. Eye Res. 27, 89-110 (2008).</li><li>Doerre, G., Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+photoreceptor+cell+development+in+the+zebrafish+retina.">Genetic analysis of photoreceptor cell development in the zebrafish retina.</a> Mech. Dev. 110, 125-138 (2002).</li><li>Brockerhoff, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+stimulates+a+transducin-independent+increase+of+cytoplasmic+Ca2++and+suppression+of+current+in+cones+from+the+zebrafish+mutant+nof.">Light stimulates a transducin-independent increase of cytoplasmic Ca2+ and suppression of current in cones from the zebrafish mutant nof.</a> J Neurosci. 23, 470-480 (2003).</li><li>Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+cone-specific+kinase+GRK7+in+larval+zebrafish+leads+to+impaired+cone+response+recovery+and+delayed+dark+adaptation.">Knockdown of cone-specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone response recovery and delayed dark adaptation.</a> Neuron. 47, 231-242 (2005).</li><li>Harada, T., Harada, C., Parada, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+visual+system+development:+more+than+meets+the+eye.">Molecular regulation of visual system development: more than meets the eye.</a> Genes Dev. 21, 367-378 (2007).</li><li>Branchek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+photoreceptors+in+the+zebrafish,+brachydaniorerio.+II.+Function.">The development of photoreceptors in the zebrafish, brachydaniorerio. II. Function.</a> J Comp Neurol. 224, 116-122 (1984).</li><li>Schmitt, E. A., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+development+in+the+zebrafish,+Daniorerio:+light+and+electron+microscopic+analyses.">Early retinal development in the zebrafish, Daniorerio: light and electron microscopic analyses.</a> J Comp Neurol. 404, 515-536 (1999).</li><li>Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod+contributions+to+the+electroretinogram+of+the+dark-adapted+developing+zebrafish.">Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish.</a> Dev Dyn. 222, 564-570 (2001).</li><li>Wong, K. Y., Adolph, A. R., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+bipolar+cell+input+mechanisms+in+giant+danio.">Retinal bipolar cell input mechanisms in giant danio.</a> I. Electroretinographic analysis. J Neurophysiol. 93, 84-93 (2005).</li><li>Nelson, R. F., Singla, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spectral+model+for+signal+elements+isolated+from+zebrafish+photopicelectroretinogram.">A spectral model for signal elements isolated from zebrafish photopicelectroretinogram.</a> Vis Neurosci. 26, 349-363 (2009).</li><li>Korenbrot, J. I., Mehta, M., Tserentsoodol, N., Postlethwait, J. H., Rebrik, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EML1+(CNG-modulin)+controls+light+sensitivity+in+darkness+and+under+continuous+illumination+in+zebrafish+retinal+cone+photoreceptors.">EML1 (CNG-modulin) controls light sensitivity in darkness and under continuous illumination in zebrafish retinal cone photoreceptors.</a> J Neurosci. 33, 17763-17776 (2013).</li><li>Gurevich, L., Slaughter, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+waveforms+of+the+ON+bipolar+neuron+and+the+b-wave+of+the+electroretinogram.">Comparison of the waveforms of the ON bipolar neuron and the b-wave of the electroretinogram.</a> Vision Res. 33, 2431-2435 (1993).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Daniorerio). , (2007).</li><li>Kim, D. Y., Jung, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction+contributions+to+the+goldfish+electroretinogram+at+the+photopic+illumination+level.">Gap junction contributions to the goldfish electroretinogram at the photopic illumination level.</a> Korean J PhysiolPharmacol. 16, 219-224 (2012).</li><li>Brockerhoff, S. E., Dowling, J. E., Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+retinal+mutants.">Zebrafish retinal mutants.</a> Vision Res. 38, 1335-1339 (1998).</li><li>Naka, K. I., Rushton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-potentials+from+colour+units+in+the+retina+of+fish+(Cyprinidae).">S-potentials from colour units in the retina of fish (Cyprinidae).</a> J Physiol. 185, 536-555 (1966).</li><li>Naka, K. I., Rushton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-potentials+from+luminosity+units+in+the+retina+of+fish+(Cyprinidae).">S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae).</a> J Physiol. 185, 587-599 (1966).</li><li>Shao, X. M., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-agar+salt+bridge+in+patch-clamp+electrode+holder+stabilizes+electrode+potentials.">Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials.</a> J Neurosci. Methods. 159, 108-115 (2007).</li><li>Brockerhoff, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+behavioral+screen+for+isolating+zebrafish+mutants+with+visual+system+defects.">A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects.</a> ProcNatlAcadSci. U S A. 92, 10545-10549 (1995).</li><li>Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroretinogram+(ERG)+Measurements+in+Larval+Zebrafish.">Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish.</a> CSH protocols. , (2008).</li><li>Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ganzfeld+ERG+in+zebrafish+larvae.">Ganzfeld ERG in zebrafish larvae.</a> Doc Ophthalmol. 104, 57-68 (2002).</li><li>Kainz, P. M., Adolph, A. R., Wong, K. Y., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lazy+eyes+zebrafish+mutation+affects+M&#252;ller+glial+cells,+compromising+photoreceptor+function+and+causing+partial+blindness.">Lazy eyes zebrafish mutation affects M&#252;ller glial cells, compromising photoreceptor function and causing partial blindness.</a> J Comp Neurol. 463, 265-280 (2003).</li><li>Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celsr3+is+required+for+normal+development+of+GABA+circuits+in+the+inner+retina.">Celsr3 is required for normal development of GABA circuits in the inner retina.</a> PLoS. genetics. 7, e1002239 (2011).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

בפרוטוקול זה הליך פשוט להקלטות ERG של דג הזברה זחל מפורט. הליך זה מאפשר לassay מהיר והמקיף של function.There החזותי מספר שלבים קריטיים בכל ההליך שצריך להיות כל הזמן בראש. זחלי דג הזברה צריכים להיות בריאים לפני הניסוי למניעת מוות בטיפולים תרופתיים פוטנציאליים ולהבטיח פרנסה ממושכת במהלך הקלטות ERG. בנוסף, חשוב שהזחלים מנוצלים בניסויים הם באופן הדוק באותו גיל. זאת בשל ההתפתחות המהירה של הרשתית (כלומר, פיתוח ההפרש של תת קונוס) וגם המורפולוגיה והפיסיולוגיה הכוללות של הזחלים. לדוגמא, לאחר 7 DPF את היעילות של דיות אפיתל ירידות ולכן קשה יותר כדי לשמור את הדגים בחיים. גורם חשוב נוסף הוא האיכות של אלקטרודות ההקלטה והתייחסות. יש לנקוט בזהירות בעת משיכת נימי זכוכית כדי למנוע t המחוספסשב&quot;ס. Microforge micropipette יכול להיות מועסק על מנת אש-פולני משך אלקטרודות ועזרה כדי לשפר את רכישת אות. בנוסף, שמירה על איכות אלקטרודות Ag / AgCl היא מאוד חשובה. לאחר שימוש, הם חייבים לשטוף עם מים מזוקקים ואוויר היבש באופן מיידי. בעוד מחשיך של פני השטח החיצוניים של אלקטרודות יכול להתרחש עם זמן ולא משפיע על ביצועים, הכתים (צהוב לאדום כהה) או יש להימנע אלקטרודות מגולענים. הימנע אלקטרודות טיפול בידיים חשופות, כמו זיהום חלבון יכול להשפיע לרעה על התנהגות אלקטרודה. לבסוף, יש לציין כי אלקטרודות Ag / AgCl הן רגישים ויכולות להוביל חפצי הבזק אם לא מוגן. עם זאת, מצאנו ממצאים אלה כדי להיות מינימאליים (ראו אגדות לאיורי 1 ו -2) ולא להפריע למדידות של תגובות דג הזברה הזחל להבהב גירויים שלנו. לחלופין, גשר מלח יכול לשמש לחיבור האלקטרודה Ag / AgCl לספוג באמצעות sa אגרגשר lt להעביר את האלקטרודה מנתיב האור. למרות שגשר מלח משמש בהקלטות ישירות הנוכחיות (DC) כדי לייצב את האלקטרודה 23 פוטנציאליים, הקלטת ERG מנצלת זרם חילופין (AC). לכן המטרה היחידה של גשר מלח במערכת זו תהיה אם יש הגדרה המסוימת אילוצי שטח או חפצי פוטו חזקים במיוחד. יש ERG מספר יתרונות על פני שיטות אחרות למדידת תפקוד ראייה. היתרון העיקרי הוא שזה הקלטת in vivo. החסרון הוא שהפעילות של תאים ספציפיים יש להסיק מצורת הגל ולא נמדדו באופן ישיר, כפי שניתן היה במקרה של הקלטות האלקטרודה יניקה או מהדק תיקון של קולטני אור ותאים אחרים ברשתית. בדרך כלל, יש לי ERGs הקלטות האלקטרודה יניקה, הקלטות מהדק תיקון ורשתית כל היתרון שסוכנים תרופתיים יכולים בקלות להיות מוצגות לתאים כדי להגדיר את המרכיבים המולקולרייםשל התגובה, ואילו זה יותר קשה in vivo תוך שימוש במודלים של יונקים. החדירות של זחלי דג הזברה לסוכנים כגון מתגברת על חסרון זה. ניתוח של זחלים כהים מותאמת בהעדר סוכנים תרופתיים מייצר צורת גל ERG נשלט על ידי b-הגל, תוצאה שנצפתה על ידי מספר קבוצות אחרות 2, 9,24 -26. אנחנו מדגימים את היכולת לבודד את פוטנציאל קולט ההמוני החרוט על ידי ניצול של היכולת של סוכנים תרופתיים לחדור דג הזברה זחל. זחלים שטופלו בAPB להציג ביטול ב-הגל, המאפשר &quot;גל&quot; להיות דמיין 14-17. גל עם אות מצוינת ליחסי רעש התקבל על ידי ממוצע 3 מטאטא. לפעמים שינוי בגל התגובה יצוין, אבל Makhankov et al. 2 דיווחו כי השונות במדידות חוזרות ונשנות של אותו בעל חיים הוא פחותמזה ראה בין אנשים. לכן, את השונות עלולות להיות התוצאה של וריאציה ביולוגית ולא שונות בטכניקה. כמו כן, אנו מנוצלים ניתוח ERG לבחון התאוששות קונוס in vivo באמצעות פרדיגמה הבזק כפולה, בדומה לתוצאות שפורסמו בנוכחות והיעדר תאורת רקע 9, 16. הדבר זה הושג על ידי מדידת היכולת של רשתית הזחל להגיב להבזקים רצופים של משתנה ISI. כאשר משתמש בשילוב עם סוכנים תרופתיים או אסטרטגיות הנדסת הגנום כגון TALENs כדי לדפוק את מטרות מסלול, דג הזברה היא מערכת רבת עוצמה למחקר in vivo של המכניקה המולקולרית של הסתגלות והתאוששות קונוס חזותית. ההליך ואת הציוד שלנו יכולים בקלות להיות מותאם לבחון עיניים מבודדות זחל, דג הזברה מבוגרת או בעלי חוליות אחרות 27, 28. למעשה, מערכת הגירוי והקלטת ERGכי אנו מעסיקים היו בעיקר מיועדים לשימוש בסביבה קלינית ולאחר מכן שונה לניסויים בעכברים. התאמת הפלטפורמה לזחלי דג הזברה הייתה פשוטה ויכול היה בקלות להיות משוכפלת במעבדות אחרות עבור עלות נמוכה. הגדרות דומות בהיקף של ציוד אלקטרו הקלאסי יכולות להיות בנויות לבעלות מינימאלית, וכבר הוכיחו לספק תוצאות אמינות 16. בסך הכל, טכניקה זו היא יתרון גדול של חוקרי חקר המנגנונים של תפקוד ראייה.

Electroretinogram (ERG) הוא שיטה לא פולשנית אלקטרו שכבר נעשה שימוש נרחב במרפאת לקביעת התפקוד של הרשתית בבני אדם. הפעילות החשמלית בתגובה לגירוי אור נמדדת על ידי הנחת אלקטרודות הקלטה על פני השטח החיצוניים של הקרנית. המאפיינים של הפרדיגמה הגירוי וצורת גל התגובה להגדיר את תאי העצב ברשתית תורמים לתגובה. שיטה זו הותאמה לשימוש עם מספר המודלים של בעלי חיים, כולל עכברים ודג זברה. יש תגובת ERG חוליות הטיפוסית ארבעה מרכיבים עיקריים: א-גל, שהוא פוטנציאל קרנית-שלילית הנגזר מפעילות תאי קולטי אור; ב-הגל, פוטנציאל קרנית-חיובית הנגזר מON תאים דו קוטביים; ד-הגל, פוטנציאל קרנית-חיובית להתפרש כפעילות של התאים דו קוטביים OFF; וג-הגל, אשר מתרחש כמה שניות לאחר b-הגל ומשקף פעילות בגליה מולר והמילאפיתל הפיגמנט INAL 1-4. אזכור נוסף להבנת ההיסטוריה והעקרונות של ניתוח ERG בבני אדם ובעלי חיים מודל הוא ספר הלימוד המקוון, Webvision, מאוניברסיטת יוטה וטקסטים כגון עקרונות ותרגול של אלקטרופיזיולוגיה הקלינית של 4 Vision, 5. rerio Danio (דג הזברה) כבר העדיף ארוך כמודל לפיתוח חוליות, בשל ההבשלה המהירה שלה ושקיפות, אשר מאפשרת ניתוח לא חודרני המורפולוגי של מערכות איברים, מבחני התנהגות והן קדימה לאחור מסכי גנטיים (לסקירה, ראה Fadool ו דאולינג 6). זחלי דג הזברה הם נוחים מאוד למניפולציה גנטית ותרופתית, אשר, כאשר יחד עם הפוריות הגבוהה שלהם, לגרום להם מודל חיה מצוין לניתוחים ביולוגיים תפוקה גבוהה. היחס גבוה יותר של קונוסים למוטות בדג הזברה זחל - בערך 1: 1 בהשוואה לעכברים (~ קונוס 3%ים) - להפוך אותם שימושי במיוחד ללימוד הפונקציה חרוט 7-9. ברשתית החוליות, קונוסים לפתח לפני מוטות 10. מעניין, קונוסים דג הזברה הם אופרטיביים מוקדם ככל 4 DPF, המאפשרים ניתוח אלקטרו סלקטיבית של קונוסים בשלב זה 6, 11,12. בניגוד לכך, תגובות ERG במוטות מופיעות בין 11 ל 21 DPF 13. לכן, זחלי דג הזברה ב4-7 DPF לשרת תפקודי כרשתית כל-קונוס. עם זאת, תגובת ERG photopic יליד 4-7 זחלי DPF נשלט על ידי b-הגל. יישום של סוכנים תרופתיים, כגון L - (+) - 2-אמינו-4-phosphono-butyric חומצה (L-AP4), אגוניסט לגלוטמט metabotropic קולט (mGluR6) בא לידי ביטוי בON תאים דו קוטביים, חוסם ביעילות את הדור של ב-הגל ומגלה את הפוטנציאל המבודד ההמוני קונוס קולט, (&quot;גל&quot;) 14-17. כאן אנו מתארים פשוטים וreliablשיטת דואר לניתוח ERG באמצעות ציוד ERG זמין מסחרי מיועד לשימוש עם עכברים שהותאמו לשימוש עם זחלי דג הזברה. מערכת זו יכולה להיות מנוצלת על זחלי דג הזברה של משתנה רקע גנטי, כמו גם אלו שטופלו בסוכנים תרופתיים, כדי לסייע לחוקרים בזיהוי של מסלולי איתות שתורמים לרגישות חזותית והסתגלות אור 16. הפרוצדורות מפורטות בפרוטוקול זה תדריך את החוקרים בשימוש בניתוח ERG כדי לענות על מגוון של שאלות ביולוגיות הנוגעות לראייה, ומדגימות את הבנייה של התקנת ERG גמישה.

<table><tbody><tr><td>Faraday cage</td><td>80/20 Inc</td><td>custom</td><td>Custom designed aluminum &quot;Industrial Erector Set&quot; for Cage framework</td></tr><tr><td>PVA sponge</td><td>Amazon</td><td>B000ZOWG1C</td><td>Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae</td></tr><tr><td>150 ml Sterile Filter systems</td><td>Corning</td><td>431154</td><td>Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes</td></tr><tr><td>Espion E2</td><td>Diagnosys, LLC</td><td>contact</td><td>Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com</td></tr><tr><td>Colordome</td><td>Diagnosys, LLC</td><td>contact</td><td>Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Drummond</td><td>3-000-024-R</td><td>Holding and positioning the recording microelectrode</td></tr><tr><td>Magnetic ring stand</td><td>Drummond</td><td>3-000-025-MB</td><td>Holding and positioning of the camera and refrence electrode</td></tr><tr><td>Lead extensions</td><td>Grass Technologies</td><td>F-LX</td><td>Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes</td></tr><tr><td>Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor</td><td>Grass Technologies</td><td>DF-215/10</td><td>Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins</td></tr><tr><td>Window screen frame (metal) and spline</td><td>Lowes or Home Depot</td><td>various</td><td>For attaching copper mesh to Faraday cage framework</td></tr><tr><td>Steriflip 50 ml filters</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes</td></tr><tr><td>BNC adaptor</td><td>Monoprice</td><td>4127</td><td>Connecting camera to BNC cable</td></tr><tr><td>BNC cable</td><td>Monoprice</td><td>626</td><td>Connecting camera to video adaptor</td></tr><tr><td>Camera lens</td><td>Navitar</td><td>1582232</td><td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td></tr><tr><td>Camera coupler</td><td>Navitar</td><td>1501149</td><td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td></tr><tr><td>Luna BNC to VGA + HDMI Converter</td><td>Sewell</td><td>SW-29297-PRO</td><td>BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor</td></tr><tr><td>APB</td><td>Sigma</td><td>A1910</td><td>mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential</td></tr><tr><td>Borosilicate glass</td><td>Sutter</td><td>BF-150-86-10</td><td>Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821&amp;deg;C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>P97 Flaming/Brown puller</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td>For pulling glass micropipettes</td></tr><tr><td>Sorbothane sheet</td><td>Thorlabs</td><td>SB12A</td><td>Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size</td></tr><tr><td>Breadboard</td><td>Thorlabs</td><td>B2436F</td><td>Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen</td></tr><tr><td>Passive Isolation Mounts</td><td>Thorlabs</td><td>PWA074</td><td>Provides vibration isolation to breadboard</td></tr><tr><td>Copper mesh</td><td>TWP</td><td>022X022C0150W36T</td><td>To line Faraday Cage</td></tr><tr><td>Pipette pump</td><td>VWR</td><td>53502-233</td><td>Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae</td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td>Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Watec</td><td>WAT-902B</td><td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td></tr><tr><td>Tricaine (MS-222)</td><td>Western Chemical</td><td>Tricaine-S</td><td>Pharmaceutical-grade anesthetic,</td></tr><tr><td>Micro-fil</td><td>WPI</td><td>MF28G-5</td><td>Filling microelectrode holder and microelectrode glass</td></tr><tr><td>Microelectrode holder</td><td>WPI</td><td>MEH2SW15</td><td>Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment</td></tr><tr><td>Reference Electrode</td><td>WPI</td><td>DRIREF-5SH</td><td>Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode</td></tr><tr><td>Reference Electrode (alternative)</td><td>WPI</td><td>EP1</td><td>Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead</td></tr><tr><td>Low-noise cable for Microelectrode holder</td><td>WPI</td><td>13620</td><td>Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard</td></tr></tbody></table>

electroretinogram analysis of the visual response in zebrafish larvae

Electroretinogram (ERG) הוא שיטה לא פולשנית אלקטרו לקביעת תפקוד רשתית. באמצעות המיקום של האלקטרודה על פני השטח של הקרנית, פעילות חשמלית שנוצרה בתגובה לאור ניתן למדוד ומשמש להערכת הפעילות של תאים ברשתית in vivo. כתב יד זה מתאר את השימוש של ERG למדוד תפקוד ראייה של דג הזברה. דג הזברה ארוכה כבר נוצל כמודל לפיתוח חוליות בשל הקלות של דיכוי גן על ידי oligonucleotides morpholino ומניפולציה תרופתית. ב5-10 DPF, רק קונוסים הם פונקציונליים ברשתית הזחל. לכן, דג הזברה, בניגוד לבעלי חיים אחרים, היא מערכת מודל עוצמה לחקר תפקוד הראייה קונוס in vivo. פרוטוקול זה משתמש הרדמה סטנדרטית, מיקרומניפולציה ופרוטוקולי stereomicroscopy כי הם נפוצים במעבדות המבצעות מחקר דג הזברה. שיטות שתוארו לעשות שימוש בEQ אלקטרופיזיולוגיה הסטנדרטיuipment ומצלמה אור נמוך כדי להנחות את המיקום של microelectrode ההקלטה על גבי קרנית הזחל. לבסוף, אנו מדגימים כיצד ממריץ / מקליט ERG זמין מסחרי שנועד במקור לשימוש עם עכברים יכול בקלות להיות מותאם לשימוש עם דג הזברה. ERG של דג הזברה זחל מספק שיטה מצוינת שלו מנסה לאמוד פונקציה חזותית חרוט בבעלי חיים ששונו על ידי הזרקת oligonucleotide morpholino כמו גם בשיטות של הנדסה גנטית חדשות יותר כגון אצבע nucleases (ZFNs) האבץ, תמלול Activator-כמו מפעיל nucleases (TALENs), ו חזרות התקבצו באופן קבוע Interspaced הקצר Palindromic (CRISPR) / Cas9, אשר כולם בצורה ניכרת את היעילות והיעילות של גן המיקוד בדג זברה. בנוסף, אנו מנצלים את היכולת של סוכנים תרופתיים לחדור זחלי דג הזברה להעריך את המרכיבים המולקולריים התורמים לphotoresponse. פרוטוקול זה מתאר התקנה שיכולה להיות משונית ושימוש על ידי חוקריםעם מטרות ניסוי שונות.

בדרך כלל, ERGs נרשמים מזחלי דג הזברה בשעה 5 DPF, מאז מספר מחקרים שפורסמו הקלטות ERG בשלב זה 9, 16,20. תגובות הזחל נמדדו בתנאים כהים מותאם ללא תאורת רקע באמצעות גירוי msec 20 אור LED הלבן. אנו מנוצלים מערכת זמינה מסחרי בהיקף של ERG ממריץ Ganzfeld אור ובקר / צורב במחשב. ממריץ משתמש אפנון רוחב מערכת פיקוח הדוק דופק קניינית (PWM) כדי לשלוט בעוצמת ההארה של שני הרקע ופלאש גירוי. תגובות נרשמו באמצעות מגבר ההפרש במלואו קניינית עם מסנן אנטי-aliasing חומרת נהיגה אנלוגי 16-bit ממיר דיגיטלי (ADC) ל. הקלטות גירוי והתגובה היו נשלטו על ידי תוכנת קניינית כלולה בציוד על פי הפרוטוקול של היצרן. הציוד שלנו היה מתוכנת לנצל קצב דגימה של kHz 1 CASC, דיגיטלי בסלמסנני ADE מוגדרים bandpass של בין .312 הרץ ו -300 הרץ, ומסנן חריץ 60 הרץ להסרת רעש עודף. בזחל הכהה מותאם העליות ב-גל במשרעת עם הגדלת עוצמות אור (איור 1). הגל מוסתר בדרך כלל על ידי b-הגל ולא ניתן לאתר באופן אמין. ב-הגל יכול להיחסם על ידי דוגרים הזחלים עם אגוניסט קולטן גלוטמט metabotropic (mGluR6), חומצת 4 phosphono-butyric (APB). זה מאפשר לפוטנציאל קולט ההמוני קונוס (או &quot;גל&quot;) כדי להתגלות. זה עולה &quot;גל&quot; תגובה במשרעת עם עוצמות גוברים של אור (איור 2). יכולות להיות מנוצלת פרדיגמות נוספות כדי לבדוק את הפרמטרים חזותיים מעבר תפקוד ראייה בסיסי ורגישות. באמצעות השימוש בפרדיגמה הבזק כפולה, אחד יכול למדוד את היכולת של photoresponse קונוס להתאושש מהגירוי הראשוני (איור 3 א). כמרווח interstimulus(ISI) מגבירה, המשרעת של עליות התגובה השניה, המצביעה על התאוששות מהגירוי הראשוני (איור 3). העקבות מבודדת-APB &quot;גל&quot; שהוצגו הן ממוצעת של שלושה מטאטא ותואמות את הדיווחים שפורסמו בERGs זחל דג הזברה ניצול פרדיגמות דומות גירוי 2, 9,16. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52662/52662fig1.jpg" /> איור 1: הקלטת ERG אופיינית ב5 DPF דג הזברה זחל. סדרת עוצמת הושגה בתנאים כהים מותאמת. הדגים חשופים לאור LED הלבן למשך תקופה של 20 אלפיות שניים עם עוצמות שווה 1, 10, 25, 50 125, 250, 500, 1,250, 2,500 ו -5,000 cd / m 2. תחילתו של גירוי אור הוא כונה על ידי הקו האנכי המקווקו. גל השלילי אפשרי (חץ אנכי) קשה להבחין, ואילו החיוביב-גל פוטנציאלי (חץ זווית) הוא השיא הדומיננטי של צורת הגל. חפץ פוטו קטן ניתן לראות כסטייה חיובית קטין לפני תחילת הגל. הבלעה, בממוצע אמפליטודות תגובה ב-גל עם הגדלת עוצמות אור שכבר יתאים באמצעות משוואת Naka-ראשטון 21, 22. ברים שגיאה מייצגים SEM. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52662/52662fig2.jpg" /> איור 2: פוטנציאל קולט המוני קונוס מבודד-APB נרשם מסדרת עצמת דג הזברה זחל שהושגה בתנאים כהים מותאם בשעה 5 DPF.. הגירוי הוא אור לבן 20 msec LED עם עוצמות שווה 1, 10, 25, 50 125, 250, 500, 1250, 2500 ו- CD 5000 / m 2. תחילתו של גירוי אור הוא כונה על ידי הקו האנכי המקווקו. קולט המבודד ההמוני קונוס הפוטנציאלי (&quot;גל&quot;) הוא האלמנט הדומיננטי של צורת הגל (חץ). קטןחפץ פוטו ניתן לצפות כסטייה חיובית קטין לפני תחילתה של תגובת קונוס. הבלעה, בממוצע אמפליטודות תגובה עם הגדלת עוצמות אור שכבר יתאים באמצעות משוואת Naka-ראשטון. ברים שגיאה מייצגים SEM. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52662/52662fig3.jpg" /> איור 3:.. הקלטת פוטנציאל קולט ההמוני Cone ניצול הפרדיגמה הבזק כפול 5 DPF זחל שטופל APB היה נתון לשני הבזקים 20 אלפיות שניים של אור הלבן (מקור LED), כל אחד עם עוצמה של 1,000 cd / m 2 (א) התגובה להבזקים 2 רצופים עם מרווח interstimulus (ISI) שווה ל 2 שניות. חשיפות אור מסומנות על ידי קווים אנכיים מקווקו. האמפליטודה של התגובה השנייה היא נמוכה מזה של התגובה הראשונה, המצביעה על התאוששות תגובה שלמה. (ב) היחס אין סופי קולט ההמוני קונוס המבודד המרביTiAl תגובה של הגירוי השני לזה של הגירוי הראשוני לכל ISI. ניתוח רגרסיה שאינה ליניארי מיטבית יושם. ככל שעולה ISI, התגובה לגירוי השנייה העליות במשרעת ביחס לתגובה לגירוי הראשוני המצביע על התאוששות הדרגתית של רגישות קולטי אור. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52662/52662fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

ניתוח electroretinogram של התגובה החזותית בדג הזברה זחלים

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

electroretinogram-analysis-of-the-visual-response-in-zebrafish-larvae

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.5K Views.  University of North Carolina at Chapel Hill. We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Video: Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Assay ההתנהגות כדי למדוד את התגובה של דג הזברה לשינויים לעוצמות אור

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Biology

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, robust, and simple to manipulate. A suitable model has been found in the optokinetic response (OKR), a reflexive behavior present in all vertebrates due to its high selection value. The OKR involves slow stimulus-following movements of eyes alternated with rapid resetting saccades. The measurement of this behavior is easily carried out in zebrafish larvae, due to its early and stable onset (fully developed after 96 hours post fertilization (hpf)), and benefitting from the thorough knowledge about zebrafish genetics, for decades one of the favored model organisms in this field. Meanwhile the analysis of similar mechanisms in adult fish has gained importance, particularly for pharmacological and toxicological applications.
Here we describe VisioTracker, a fully automated, high-throughput system for quantitative analysis of visual performance. The system is based on research carried out in the group of Prof. Stephan Neuhauss and was re-designed by TSE Systems. It consists of an immobilizing device for small fish monitored by a high-quality video camera equipped with a high-resolution zoom lens. The fish container is surrounded by a drum screen, upon which computer-generated stimulus patterns can be projected. Eye movements are recorded and automatically analyzed by the VisioTracker software package in real time.
Data analysis enables immediate recognition of parameters such as slow and fast phase duration, movement cycle frequency, slow-phase gain, visual acuity, and contrast sensitivity.
Typical results allow for example the rapid identification of visual system mutants that show no apparent alteration in wild type morphology, or the determination of quantitative effects of pharmacological or toxic and mutagenic agents on visual system performance.

The VisioTracker is an automated system for the quantitative analysis of visual performance of larval and small adult fish based on the recording of eye movements. It features full control over visual stimulus properties and real-time analysis, enabling high-throughput research in fields such as visual system development and function, pharmacology, neural circuit studies and sensorimotor integration.

VisioTracker, גישה אוטומטית חדשנית לניתוח oculomotor

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

The Optokinetic Response as a Quantitative Measure of Visual Acuity in Zebrafish

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple response. More recently adult visual behavior in zebrafish has become of interest, but methods to measure specific responses are new coming. To address this gap, we set out to develop a methodology to repeatedly and accurately utilize the optokinetic response (OKR) to measure visual acuity in adult zebrafish. Here we show that the adult zebrafish's visual acuity can be measured, including both binocular and monocular acuities. Because the fish is not harmed during the procedure, the visual acuity can be measured and compared over short or long periods of time. The visual acuity measurements described here can also be done quickly allowing for high throughput and for additional visual procedures if desired. This type of analysis is conducive to drug intervention studies or investigations of disease progression.

Zebrafish have been a valuable tool for many research areas. Here we demonstrate a method to elicit a visual response and calculate a functional visual acuity in the adult zebrafish.

תגובת Optokinetic כמדד כמותי של חדות ראייה בדג הזברה

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the  earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple  ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

תיוג מדרדר של תאים ברשתית גנגליון מבוגרים דג הזברה עם צבעי ניאון

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode

The zebrafish (Danio rerio) is commonly used as a vertebrate model in developmental studies and is particularly suitable for visual neuroscience. For functional measurements of visual performance, electroretinography (ERG) is an ideal non-invasive method, which has been well established in higher vertebrate species. This approach is increasingly being used for examining the visual function in zebrafish, including during the early developmental larval stages. However, the most commonly used recording electrode for larval zebrafish ERG to date is the glass micropipette electrode, which requires specialized equipment for its manufacture, presenting a challenge for laboratories with limited resources. Here, we present a larval zebrafish ERG protocol using a cone-shaped sponge-tip electrode. The novel electrode is easier to manufacture and handle, more economical, and less likely to damage the larval eye than the glass micropipette. Like previously published ERG methods, the current protocol can assess outer retinal function through photoreceptor and bipolar cell responses, the a- and b-wave, respectively. The protocol can clearly illustrate the refinement of visual function throughout the early development of zebrafish larvae, supporting the utility, sensitivity, and reliability of the novel electrode. The simplified electrode is particularly useful when establishing a new ERG system or modifying existing small-animal ERG apparatus for zebrafish measurement, aiding researchers in the visual neurosciences to use the zebrafish model organism.

Here, we present a protocol that simplifies the measurement of light evoked electroretinogram responses from larval zebrafish. A novel cone-shaped sponge-tip electrode can help to make the study of visual development in larval zebrafish using the electroretinogram ERG easier to achieve with reliable outcomes and lower cost.

הקלטת Electroretinogram דג זברה זחל באמצעות אלקטרודה ספוג-טיפ בצורת חרוט הרומן A

The zebrafish (Danio rerio) is commonly used as a vertebrate model in developmental studies and is particularly suitable for visual neuroscience. For ...

Developmental Biology

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

שימוש בתגובה optokinetic ללמוד לתפקד החזותי של דג הזברה

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis support continuous growth of the entire visual system, both in the eye and the brain. Coordinated growth between the retinae and the optic tectum ensures accurate retinotopic mapping as new neurons are added in the eyes and brain. To address whether retinal axons provide crucial information for regulating tectal stem and progenitor cell behaviors such as survival, proliferation, and/or differentiation, it is necessary to be able to compare innervated and denervated tectal lobes within the same animal and across animals. 
Surgical removal of one eye from living larval zebrafish followed by observation of the optic tectum achieves this goal. The accompanying video demonstrates how to anesthetize larvae, electrolytically sharpen tungsten needles, and use them to remove one eye. It next shows how to dissect brains from fixed zebrafish larvae. Finally, the video provides an overview of the protocol for immunohistochemistry and a demonstration of how to mount stained embryos in low-melting-point agarose for microscopy.

The article explains how to surgically remove eyes from living zebrafish larvae as the first step toward investigating how retinal input influences optic tectum growth and development. In addition, the article provides information about larval anesthetization, fixation, and brain dissection, followed by immunohistochemistry and confocal imaging.

הסרת עיניים בזחלי דגי זברה חיים לבחינת גדילה והתפתחות תלויי עצבנות של מערכת הראייה

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Photomotor Response Assay: A Method to Measure the Behavioral Response of Larval Zebrafish to a Sudden Change in Lighting Condition

Source: Steele, W. B., et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/57938/" target="_blank">Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine</a>.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2018).
This video describes the photomotor response assay of zebrafish and fathead minnow larvae using an automated tracking software. The protocol measures the behavioral response of the larval fish following a sudden change in lighting condition.

בדיקת תגובה פוטומוטורית: שיטה למדידת התגובה ההתנהגותית של דגי זברה זחלים לשינוי פתאומי במצב התאורה

Source: Steele, W. B., et al. Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Danio rerio (zebrafish)

Larva

Analyzing the Prey-Evoked Neuronal Activity in a Transgenic Zebrafish Larva

Source: Muto, A. et al.,&#160; <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/57485">Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates the method for studying visual prey detection in transgenic zebrafish larvae using calcium indicator-based fluoresce imaging with their neurons expressing fluorescent calcium indicator complexes.

ניתוח הפעילות העצבית המעוררת טרף בזחל דג זברה מהונדס

1. Ablation of a Subpopulation of Neurons Using a Two-photon Laser Microscope
NOTE: If users plan on performing Ca imaging following ablation, use the ...