We thank the MDI Biological Laboratory animal core service facility for zebrafish maintenance. Research reported in this publication was supported by Institutional Development Awards (IDeA) from the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under grant numbers P20GM104318 (for COBRE) and P20GM103423 (INBRE) and Department of Defense &#8211; USAMRAA (W81XWH-BAA-1) grant.

<ol>
	<li>San Miguel-Ruiz, J. E., Garc&#237;a-Arrar&#225;s, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+cellular+events+occur+during+wound+healing+and+organ+regeneration+in+the+sea+cucumber+Holothuria+glaberrima.">Common cellular events occur during wound healing and organ regeneration in the sea cucumber Holothuria glaberrima.</a> BMC Dev Biol. 7, 115 (2007).</li><li>Poss, K. D., Keating, M. T., Nechiporuk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tales+of+regeneration+in+zebrafish.">Tales of regeneration in zebrafish.</a> Dev Dyn. 226, 202-210 (2003).</li><li>Akimenko, M. A., Mar&#237;-Beffa, M., Becerra, J., Old G&#233;raudie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Old+questions,+new+tools,+and+some+answers+to+the+mystery+of+fin+regeneration.">Old questions, new tools, and some answers to the mystery of fin regeneration.</a> Dev Dyn. 226, 190-201 (2003).</li><li>Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+research+today.">Regeneration research today.</a> Dev Dyn. 226, 162-166 (2003).</li><li>Seifert, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+shedding+and+tissue+regeneration+in+African+spiny+mice+(Acomys).">Skin shedding and tissue regeneration in African spiny mice (Acomys).</a> Nature. 489, 561-565 (2012).</li><li>Goss, R. J., Grimes, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+downgrowths+in+regenerating+rabbit+ear+holes.">Epidermal downgrowths in regenerating rabbit ear holes.</a> J Morphol. 146, 533-542 (1975).</li><li>Williams-Boyce, P. K., Daniel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ear+tissue+regeneration+in+mammals.">Comparison of ear tissue regeneration in mammals.</a> J Anat. 149, 55-63 (1986).</li><li>Allan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+response+and+Msx1+expression+after+human+fetal+digit+tip+amputation+in+vitro.">Tissue response and Msx1 expression after human fetal digit tip amputation in vitro.</a> Wound Repair Regen. 14, 398-404 (2006).</li><li>Borgens, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+regrow+the+tips+of+their+foretoes.">Mice regrow the tips of their foretoes.</a> Science. 217, 747-750 (1982).</li><li>Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+regeneration+of+the+neonatal+digit+tip+in+mice.">Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice.</a> Dev Biol. 315, 125-135 (2008).</li><li>Muneoka, K., Allan, C. H., Yang, X., Lee, J., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+regeneration+and+regenerative+medicine.">Mammalian regeneration and regenerative medicine.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 84, 265-280 (2008).</li><li>Takeo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+in+nail+epithelium+couples+nail+growth+to+digit+regeneration.">Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration.</a> Nature. 499, 228-232 (2013).</li><li>Akimenko, M. A., Johnson, S. L., Westerfield, M., Ekker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+induction+of+four+msx+homeobox+genes+during+fin+development+and+regeneration+in+zebrafish.">Differential induction of four msx homeobox genes during fin development and regeneration in zebrafish.</a> Development. 121, 347-357 (1995).</li><li>Reginelli, A. D., Wang, Y. Q., Sassoon, D., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digit+tip+regeneration+correlates+with+regions+of+Msx1+(Hox+7)+expression+in+fetal+and+newborn+mice.">Digit tip regeneration correlates with regions of Msx1 (Hox 7) expression in fetal and newborn mice.</a> Development. 121, 1065-1076 (1995).</li><li>Brien, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinate+development+of+skin+cells+and+cutaneous+sensory+axons+in+zebrafish.">Coordinate development of skin cells and cutaneous sensory axons in zebrafish.</a> Journal of Comparative Neurology. 520, 816-831 (2012).</li><li>Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+fin+primordia+of+zebrafish+larvae+regenerate+by+a+similar+growth+control+mechanism+with+adult+regeneration.">Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration.</a> Dev Dyn. 231, 693-699 (2004).</li><li>Yoshinari, N., Ishida, T., Kudo, A., Kawakami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+and+functional+analysis+of+zebrafish+larval+fin+fold+regeneration.">Gene expression and functional analysis of zebrafish larval fin fold regeneration.</a> Dev Biol. 325, 71-81 (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish:+Cellular+and+Developmental+Biology,+part+A.+Preface.">The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, part A. Preface.</a> Methods Cell Biol. 100 (13), (2010).</li><li>Dahm, N. -. V. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: A Practical Approach, Issue 975. , 303 (2002).</li><li>Detrich, H., Westerfield, M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: 2nd Edition Genetics, Genomics and Informatics. , (2005).</li><li>Concha, M. L., Adams, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+cell+divisions+and+cellular+morphogenesis+in+the+zebrafish+gastrula+and+neurula:+a+time-lapse+analysis.">Oriented cell divisions and cellular morphogenesis in the zebrafish gastrula and neurula: a time-lapse analysis.</a> Development. 125, 983-994 (1998).</li><li>Distel, M., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-lapse+imaging+of+zebrafish+embryonic+development.">In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li><li>Kulesa, P. M., Kasemeier-Kulesa, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+Heated+Incubation+Chamber+around+a+Microscope+Stage+for+Time-Lapse+Imaging.">Construction of a Heated Incubation Chamber around a Microscope Stage for Time-Lapse Imaging.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bitplane.">Bitplane.</a> Imaris V 6.1.0 Reference Manual. , (2008).</li><li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Image Processing with ImageJ. , 36-42 (2004).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Mateus, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cell+and+tissue+dynamics+underlying+zebrafish+fin+fold+regeneration.">In vivo cell and tissue dynamics underlying zebrafish fin fold regeneration.</a> PLoS One. 7, e51766 (2012).</li><li>Jones, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Dynamic+in+vivo+imaging+of+postimplantation+mammalian+embryos+using+whole+embryo+culture.">et al.Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture.</a> Genesis. 34, 228-235 (2002).</li><li>Rieger, S., Senghaas, N., Walch, A., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-2+controls+directional+chain+migration+of+cerebellar+granule+neurons.">Cadherin-2 controls directional chain migration of cerebellar granule neurons.</a> PLoS Biol. 7, e1000240 (2009).</li><li>Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+brain+development+and+organogenesis+in+zebrafish+using+immobilized+embryonic+explants.">Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants.</a> Dev Dyn. 228, 464-474 (2003).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139, 3242-3247 (2012).</li><li>Tadrous, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+PSF+generation+for+3D+brightfield+deconvolution.">A method of PSF generation for 3D brightfield deconvolution.</a> J Microsc. 237, 192-199 (2010).</li><li>Distel, M., Babaryka, A., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+in+vivo+time-lapse+imaging+at+cellular+resolution+by+stereomicroscopy.">Multicolor in vivo time-lapse imaging at cellular resolution by stereomicroscopy.</a> Dev Dyn. 235, 1100-1106 (2006).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

השיטה המוצגת מאפשרת התבוננות ריפוי פצעים והתחדשות רקמות בחיים זחלי דג הזברה עם in vivo הדמיה הזמן לשגות בסטראו brightfield, באמצעות הגדרה פשוטה יחסית. הליך זה מחייב היבטים מסוימים חשובים שצריכים לבדוק, אשר יהיה לייעל את התוצאה: 1) ריכוזי agarose נמוכים (~ 0.5%) יהיה הפחתת חסמי צמיחה של דג הזברה הזחל גדל ללא הרף, 2) הסרת agarose סביב הסנפיר חשובה לא כדי לטשטש את תהליך הריפוי, 3) לכידת agarose ברשת פלסטיק שומרת לעצמה את agarose ובעלי חיים במצב יציב לאורך כל ההליך, ו- 4) שליטה בסביבת טמפרטורה נכונה, שהוא חיוני לקיום זחל. יש לנו להתאים מחומם חדר דגירה 23,24, אשר מנצל אריזת בועות שהודבקה על גבי קרטון, ודוד כיפת קווי לשלוט על הטמפרטורה וזרימת אוויר נאותה עם תנודות מינימליות במהלךהליך הדמיה. ניתן להכין חדר פשוט וחסכוני זה כדי להתאים לכל מיקרוסקופ. תא דגירה מחוממת דומה כבר מנוצל גם לעכברי הדמיה ופיתוח חומוס 24,29. אנו מציעים כי זחלים-קטוע מראש הם רכובים על תמונה שלפני קטיעה, demounted לקטיעה, ושב ורכב לזמן לשגות הדמיה. למרות שזה אפשרי על מנת לבצע את הפעולות הבאות בשלב אחד בחדר ההדמיה הסופי, בניסיון שלנו מצאנו כי קטיעת סנפיר הזנב על coverslip זכוכית אינה אופטימלית, כפי שהוא קורע את הרקמה ולא לגרום לחתך נקי. שיטת הקטיעה מבוססת agarose באמצעות מחט מזרק תוארה במקור על ידי Kawakami ועמיתיו (2004) 16, והוא גם, בניסיון שלנו, אידיאלי לבצע קטיעות. כך, הסדרה די המסובכת של צעדים שהצגנו היא גם מוצדקת ומבטיחה תוצאת התחדשות אופטימלית. הראינו larv שדג הזברה אל ב -2 DPF ניתן הדמיה עד 1.5 ימים בagarose ופתרון Tricaine. אנו משמשים פתרון מותאם pH Tricaine (pH7) מוכן עם מלח אוקיינוס ​​מיידי, שאינו מפריע לבריאותו של הדגימה לתקופה ההדמיה הוצגה. אנחנו בעבר אך גם הוכיחו כי באמצעות Tricaine במדיום Danieau מאפשר זמן לשגות הדמיה של 2.5 DPF דג הזברה זחל על מיקרוסקופ confocal לפחות 2 ימים 30. לפיכך, תנאי חיץ אופטימליים יכולים להאריך בריאות זחל והאורך של הדמיה. לחלופין, ריכוזים נמוכים Tricaine עשויים לשמש להרדמה, או 2-פנוקסיתנול, שבו מצאו נסבל היטב בשלבי זחל ומבוגרים בגיל 28 מעלות צלזיוס במשך לפחות 60 שעות. כדי להימנע מפגמים בהתחדשות סנפיר, ואנחנו פינינו את agarose מסנפיר הזנב לפני ההדמיה. הנתונים שלנו מראה כי בתוך 1.5 ימים הסנפיר כבר התאחה לכ -60%. קצב התחדשות זו עולה בקנה אחד עם מחקר קודם הגדרת 3 ימיםזה זמן ממוצע להתחדשות סנפיר זנב בדג זברה זחלים עד 6 DPF 16. שיטות אלטרנטיביות לagarose אולם יכולות להיות מנוצלת כדי לעלות את הדג להדמיה. לדוגמא, דקה פלזמה קרישי 31 או פרופילן אתילן פלואור (FEP) צינורות מצופים בmethylcellulose ומלא בריכוזים נמוכים מאוד agarose (0.1%) היה מומלץ למיקרוסקופיה גיליון אור 32 ועשויה להיות מתאים לשיטה שלנו שהוצגה. עם זאת, אנו לא ממליצים agarose methylcellulose ושל 0.1%, כפי שהם דורשים כי הדגימה הם רכובים בחלק התחתון של התא בשל חוסר המיצוק של תקשורת אלה. ריכוזים גבוהים מאוד של methylcellulose יתר על כן יפיקו כיסי אוויר המבוססים על הניסיון שלנו, ואלה עלולים להפריע להליך ההדמיה. אם תקשורת אלה העדיפו בשימוש בתא התחתון, חשוב שמרחק עבודה מתאים בין העדשה האובייקטיבית והדגימה הוא הווה. יש לציין כי מ &#39;ethylcellulose כמדיום הרכבה מומלצת רק לתקופה של עד היום 1, כפי שהוא עלול להפריע לבריאות זחל 32. ההרכבה הדגימה במכסה עלולה לגרום לסחף כלפי מטה הכבידה איטי. לכן מומלץ לחלקים מרובים תמונה בכל נקודת זמן, אשר גם יכול להיות מוקרנת למטוס בודד או רק תמונות שנמצאות במישור המוקד ניתן חילוץ להרכבת הסרט הסופי. הדמיה הדגימה בתא התחתון יכולה להיות מתודולוגיה חלופית, כדי למנוע סחף כלפי מטה פוטנציאלי. קרישי פלזמה יכולים להיות שימושיים כדי למנוע סחף, כמו הפלזמה תדבק השכבה העוטפת החיצונית (EVL, periderm) 31, ולכן עשוי לייצב את הדגימה. אולם זה צריך להיבדק, כמו גם איך דג הזברה זחל ארוך יכול להישמר בקרישי פלזמה מבלי להפריע לבריאות זחל או התחדשות סנפיר. הסרט שלנו הורכב ניצול חלקים בודדים (26 מיקרומטר)של Z- מחסנית נרשמה, שכיסה את העובי המלא של הסנפיר (~ 10 מיקרומטר) ואשר היווה z-סחף פוטנציאלי של הסנפיר במהלך הליך ההדמיה. על מנת לשמור על מידע 3-D, אפשר גם להקרין Z- ערימות לתמונות בודדות. כי זה עלול לגרום לטשטוש של התמונה, deconvolution brightfield עשויה להיות רצויה. תוכנה, כגון Deconvolve או X3 Autoquant יכולה להיות מנוצלת למטרה זו. לחלופין, אלגוריתמים מתמטיים (שתוארו בTadrous 33) יכולים להיות מיושמים להשגת פונקצית נקודת התפשטות יחס גבוה אות לרעש (SNR). קבלת יחס אות לרעש גבוהה מייצגת את אחד המכשולים העיקריים בdeconvolution brightfield. למרות ששיטה זו דורשת ניגודיות גבוהה ועובי מדגם דק, זה יהיה מתאים להדמיה של סנפיר הזנב בשל הרוחב המוקטן שלה. יתרון ברור של שיטת ההדמיה שהוצגה הוא שזה במהירות להתאמה לכל סטראו מצויד במצלמת CCDתוכנת הזמן לשגות ד ומציעה אלטרנטיבה בעלות נמוכה למערכות הדמיה confocal יקרות יותר. בעוד ששיטה זו לא לנצל הקרינה לגילוי תאים, ניתן להאריכה ליישומים כאלה על ידי ניצול מערכת אוטומטית לשליטת תריס ותוכנת deconvolution הודעה הדמיה-34. זה יאפשר למשתמשים לצפות בתהליכי תיקון נוסף פצע והתחדשות עם תא בודד או רזולוציה subcellular על פני תקופות זמן ארוכות יותר. הבהירות האופטית והקלות בה עוברי ודג זברה זחל יכולה להיות מטופלים, ואת יכולת ההתאמה של שיטה זו לכל סטראו הופכת אותו מתאימה להוראת ביולוגיה חוליות בסיסית במסגרת כיתתית. בשיטה זו ניתן להקנות לתלמידי הבנה טובה יותר של התהליכים הביולוגיים הבסיסיים שבבסיס תיקון והתחדשות רקמות. תהליכים ביולוגיים אחרים שכבר נתפסו עם שיטה דומה הם פיתוח דג הזברה עוברי 23,34 ולבפונקציה (לא פורסם). שיטה זו מציעה גם את האפשרות לתיקון פצע ניטור והתחדשות בזחלים שכבר מניפולציות גנטית ופרמקולוגית.

The ability of an organism to orchestrate tissue repair processes after injury is crucial for its survival 1. While all animals have the capacity to heal their wounds, the extent to which tissues regenerate differs greatly among species. Vertebrate species such as zebrafish, salamanders and frog tadpoles have the remarkable ability to regenerate lost tissues, including their appendages, portions of their eyes, heart, and central nervous system 2-4. Mammalian species, such as the African spiny mouse and rabbits, are capable of regenerating holes in their pinnae 5-7, and humans and mice regenerate portions of their liver as well as their digit tips during fetal and juvenile stages 8-12. Although it is not well understood yet why and how certain species regenerate tissues more effectively than others, the presence of similar genetic pathways suggests that these mechanisms may lie dormant in species without great regeneration potential 13,14. Thus elucidating tissue repair and regeneration mechanisms in species with satisfactory regeneration outcomes will benefit regeneration in humans.
We have chosen the larval zebrafish tail fin as a paradigm to demonstrate its regeneration with time-lapse brightfield stereomicroscopy. The zebrafish larval tail fin is anatomically simple as compared to the more complex adult structures, consisting of a two-layered, infolded epithelium with somatosensory axons innervating the skin that surrounds medially located mesenchymal cells 15. Despite the anatomical differences, larval tail fin regeneration is somewhat comparable to adult fin regeneration in terms of the molecular signatures and the outgrowth responses 16,17. As compared to the adult fin, imaging larval tail fin regeneration has however several advantages: 1) larval fin regeneration is completed within just 2-3 days 16, 2) larvae can be mounted in low-melt agarose, and 3) larvae do not require feeding until ~ 5 days post fertilization (dpf) due to the presence of the yolk sac. This makes zebrafish larvae ideal for observing tissue repair dynamics in vivo.
The presented method enables the capture of detailed dynamics underlying the early processes of fin regeneration. Many studies have utilized fluorescence-based confocal microscopy to study cellular and subcellular biological processes in embryonic and larval zebrafish. Sophisticated confocal imaging setups are however often not accessible to everyone and highly expensive as compared to other imaging techniques. In contrast, the presented methodology utilizes a Discovery V12 stereomicroscope equipped with Axiovision software and a time-lapse module, thus providing a more affordable alternative to expensive imaging equipment to examine tissue behaviors. We demonstrate that this method can be utilized for imaging tissue regeneration with high temporal resolution at a minimal cost. The implications for this method could extend beyond basic biology to advance mammalian regeneration studies using organ cultures, for therapeutic development through pharmacological and genetic screens, and it can serve as a teaching tool in a classroom setting.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullseye Agarose (MidSci, Cat. No. BE-GCA500)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melt agarose (Fisher BioReagents, Cat No. BP1360-100)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea [Alfa Aesar, Cat No. L06690]&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Ocean Aquarium Salt (Pet store)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue (0.1% solution) (Sigma, Cat. No. M9140)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Sigma-Aldrich, Cat. No. E10505)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phenoxyethanol (Sigma-Aldrich, Cat. No. 77699)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 35 x 15 mm (BD Falcon, Cat. No 351008)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 60 x 15 mm (BD Falcon, Cat. No 351007)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 100 x 25 mm (BD Falcon, Cat. No 351013)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.75 inch boroschillate glass pipets (Fisher)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Glass Top Glass Bottom Dish (MatTek Corporation, Cat No. D35-20-0-TOP) Glass: 0.085-0.115mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost/Plus microscope slides (Fisherbrand, Cat No. 12-550-15)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (Electron Microscopy Services, Cat No. 72191-75)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (Warner Instruments, Cat. No. CS-18R15)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phifer Phiferglass Insect Screen Charcoal - 48&#34; (Home Depot)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOW CORNING&#174; HIGH VACUUM GREASE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips 20 &#181;l (Eppendorf, Cat. No. 930001007)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharply Angled Up (Fine Science Tools, Cat. No. 14037-10)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Lok&#8482; disposable syringe&#160;(BD, Cat. No. 309657)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mL Luer-Lok&#8482; disposable syringe (BD, Cat. No. 309653)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23-gauge syringe needles (BD, Cat. No. 305145)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps (Fine Science Tools, Cat. No. 11295-00)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabDoctor Mini Dry Bath (MidSci)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Discovery.V12 compound microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Plan Apo S 3.5X objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioCam MRm&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovision software, Release 4.8.2SP1 (12-2011)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

הטכניקה המוצגת הינה מתאימה על מנת להבהיר את דינמיקת תיקון רקמות בתגובה לקטיעה. הסרט מוכיח כי קטיעת הסנפיר תחילה מפעילה השפעת ארנק מיתרים, מאופיינת בהתכווצויות באמצעות כבלים יקטינו שרירן שנמצאים בסנפיר פי 28 (איור 5, B). במקביל, תאים נמתחים מהפצע (ראה סרט). ההתכווצות ייתכן אפוא שאמצעי לגרש תאים שסביר להניח שנועדו לעבור מוות של תאים. התוצאות שלנו מראות עוד כי הצמיחה ההתפתחותי של הזחל מתרחשת באופן עצמאי של התחדשות (סרט), ואילו התחדשות סנפיר אינה יוזמת עד שלאחר קטיעה כ -14 שעות, כפי שנמדדה על ידי אורך סנפיר ואזור במהלך 36 שעות הזמן הבא קטיעה (איור 5 ג , D). צמיחת סנפיר משובי הכוללת לאחר 1.5 ימים הייתה כ -60% מאורך הסנפיר המקורי (איור 5E). יחדיו, תוצאות אלה ממחישות כי tr הקטיעה<html> iggers התכווצות סנפיר, שחול של תאים מהפצע, ותגובת משובי מתעכבים באופן זמני. בעוד תאי extruded הם צפויים עתידים לעבור מוות של תאים, הטבע של תאים אלה צריך להיות מובהרים נוספים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig1.jpg" /> קאמרי הרכבה טבעת 1. הדמיה איור () מוצג הינה טבעת פלסטיק שמחוברת לcoverslip עם גריז סיליקון. רשת פלסטיק מצורף לחלק הפנימי של החדר עם ארבע נקודות קטנות של שומן סיליקון. (ב) התא המכיל את הזחל רכוב מלא בפתרון Tricaine ושקופיות זכוכית מחוברת לחלק העליון. (C) רכוב זחל בן יומו 2 (חץ) מוצג בהגדלה גבוהה יותר כדי לתאר את גודלו ביחס לרשת.&quot;_blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig2.jpg" /> איור 2. קאמרי הדמיה עשה הרכבה מצלחות פטרי. () מוצג הינה צלחת זכוכית מסחרית זכוכית העליונה תחתונה פטרי עם רשת פלסטיק המצורפת לcoverslip הזכוכית. (ב) המוצג הנו קאמרי צלחת פטרי בהקמה עצמית עם חור שנקדח לתוך המכסה וcoverslip המצורף מבחוץ עם גריז סיליקון. הרשת והזחל הם רכובים בתוך החדר המכיל פתרון Tricaine. לאטום את החדר, גריז סיליקון מוחל על השפה העליונה, החיצונית של התא התחתון והמכסה העליון המצורף. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52654/52654fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <i<html> alt מ&quot;ג = &quot;איור 3&quot; src = &quot;/ קבצים / ftp_upload / 52,654 / 52654fig3.jpg&quot; /&gt; איור 3. תכנית של קטיעה והרכבה של זחל להדמיה. (א) לקטיעה, למקם את הזחל הרדים על צלחת פטרי מצופה agarose ולקטוע סנפיר הזנב עם מחט מזרק. (ב) להרכבה, להעביר את הזחל עם טפטפת העברה לתוך צינור 1.5 מיליליטר מלא 42 ° C agarose הנוזלי ופיפטה ירידה המכילה את הזחל לחדר ההדמיה, כוון את הדגים ולכסות את הקרושה agarose עם מדיום עובר. (C) תגרד את agarose מסנפיר הזנב באמצעות קצה תרי microloader פיפטה או כלי דומה ולהחליף בינוני עובר עם מדיום חדש. תמונה (D) סנפיר הזנב תחת סטראו. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52654/52654fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> ithin-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig4.jpg" /> איור 4. תא דגירה מחומם נבנה עצמית. (AC) המוצג הנו תא דגירה מחומם מקרטון, פלסטיק הבועות וסקוטש. דוד קווי כיפה (שנועד במקור לדגירת עוף) מחובר לתא באמצעות קלטת אלומיניום. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52654/52654fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig5.jpg" /> איור 5. דינמיקת התחדשות Fin. () תכנית של שיטת assay הקטיעה וכימות סנפיר זנב מנוצל כדי לקבוע את אורך הסנפיר (חץ אדום) ואזור (קווי המתאר אדומים של הסנפיר). קטיעת סנפיר זנב (ב) בתחילה מעוררת התכווצות של הסנפיר, ואחריו Regeתולדת רקמת nerative. הסנפיר גם עובר צמיחה התפתחותית, כפי שמעיד עליית גודל הרוחב. (C) המוצג הנו אורך הסנפיר כפונקציה של זמן, חושף התחלת צמיחת משובי ליניארי ב ~ 14 hPa. (ד) כימות של אזור הסנפיר חושפת לראשונה ירידה בגודל, שניתן לייחס להתכווצות של הסנפיר. אחרי ~ 14 שעות, מגדילה גודל הסנפיר בקצב ליניארי. (E) השוואה של אורך הסנפיר לפני הקטיעה ואחרי 36 שעות תערוכות ~ 60% לצמיחה מחודשת. בר סולם: 100 מיקרומטר קיצורים: קדם-מגבר, לפני קטיעה; שעות שלאחר קטיעה, hPa; regen, התחדשות; מגבר, קטיעה <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52654/52654fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52654/movie1.mp4">סרט.</a> התחדשות סנפיר במהלך 36 הזמןhr. מוצג הוא סנפיר זנב של זחל ישן 2.5 יום במהלך ההתחדשות. צמיחת משובי שלאחר קטיעת 30 דקות החל היא הדמיה ב -30 דקות במרווחים על סטראו באמצעות עדשה אובייקטיבית 3.5x.

Watch this Scientific Journal Video about Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy at JoVE.com

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

לכידת תיקון רקמות דג הזברה זחלים עם הזמן לשגות Brightfield stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

capturing-tissue-repair-zebrafish-larvae-with-time-lapse-brightfield

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.7K Views.  MDI Biological Laboratory. We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Video: Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

ניתוח<em&gt; In vivo</em&gt; נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Biosensing מוטורית נוירון פוטנציאל ממברנה עוברי דג הזברה חיים

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

פוטון רב זמן לשגות הדמיה כדי להמחיש את התפתחות בזמן אמת: ויזואליזציה של העברת תאי הרכס העצבי עוברי דג זברה

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

ניתוח של Actomyosin בסולמות הסלולר והרקמה המקומית באמצעות הזמן- סרטים פקיעה של מתורבת ביצת ביצה צ'יימברס

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

שיטת הרכבה שכבתית עבור מיקרוסקופ זמן מורחב מיקרוסקופיה של כל העוברים דגים

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

מדמיין את המוח המתפתח בחיים דגים באמצעות הברקשת וזמן-הדמיה קונמיקוד

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...