ברצוננו להודות לד&quot;ר Claycomb למתן תאי HL-1 ופרוטוקול תחזוקה מפורט. כמו כן, אנו רוצים להודות לגב &#39;אלנה קאריו וד&quot;ר סת Robia על סיועם ביצירת סרט התא ומר פיט קארון לעזרתו בהכנה כמה אבזרים למערכת הערוץ הכפולה שלנו מיפוי אופטי. עבודה זו נתמכה על ידי איגוד לב האמריקאי (10GRNT3770030 &amp; 12GRNT12050478 לXA), המכונים הלאומי לבריאות (HL113640 לXA), וויולה אוניברסיטת מחקר קרן לפיתוח (לXA).

1. פתרון הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוראפינפרין פתרון (NP) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר 40 מ&quot;ג של NP ל -25 מיליליטר של 30 מ&quot;מ חומצה אסקורבית (חומצה אסקורבית .1475 g ב -25 מיליליטר מים מטוהרים מילי- Q (MQ). הימנע מחשיפה לאור ישירה במהלך הכנת פתרון זה בגלל נוראפינפרין (NP) הוא רגיש לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את פתרון NP עם מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. Aliquot הפתרון לmicrotubes סטרילי 1 מ&quot;ל ולאחסן ב -20 ° C. ברגע שהוקפא, NP יציב למשך חודש אחד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת בתוספת לשטוף וסופי Claycomb <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל עם 43.5 מיליליטר של מדיום Claycomb ולהשלים עם 5 מיליליטר של סרום שור העוברי (FBS), 0.5 מיליליטר של פניצילין / סטרפטומיצין, 0.5 מיליליטר של NP ו -1: 100 בדילול מלא L-גלוטמין לעשות 50 מיליליטר של מדיום Claycomb בתוספת סופי. הימנע מחשיפה לאור ישירה במהלך הכנת פתרון זה בגלל בינוני Claycomb הוא רגיש לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדיום לשטוף Claycomb משתמש באותו המתכון כמו supבינוני ליישמם Claycomb מלבד להוסיף 5% FBS ולהשמיט את NP ורכיבי L-גלוטמין. הערה: התקשורת הסופית ולשטוף Claycomb תוספת טובה לשבועיים, כאשר הם מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס ללא חשיפה לאור ישירה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון מעכב טריפסין סויה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר 25 מ&quot;ג של מעכבי טריפסין סויה לתוך של פוספט Ca-חופשי וMg-חופשי של Dulbecco שנאגרו 100 מיליליטר (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את הפתרון באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. הערה: הפתרון מעוקר הוא יציב למשך חודש אחד, כאשר הם מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג&#39;לטין / פתרון ציפוי צלחת פיברונקטין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 0.1 גרם של ג&#39;לטין לתוך 500 מיליליטר של מים MQ לעשות ג&#39;לטין 0.02%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי, ואז לדלל 1 מיליליטר של פיברונקטין לתוך 199 מיליליטר של ג&#39;לטין 0.02% ומערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 6 מיליליטר של תמיסת הג&#39;לטין לתוך צינורות נפרדים ולאחסן ב -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון מלח &#39;הנקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מערבביםצלחת, לפזר את מלחי הבאים במי MQ (mmol / L), NaCl (136.9), KCl (5.366), KH 2 PO 4 (.4409), Nah 2 PO 4 (.4000), MgSO 4 (.8142), D-Glc (5.051), NaHCO 3 (4.162), HEPES (סך של 5.042), CaCl 2 (1.261). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צבע רגיש סידן פתרון (Rhod2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 1 מ&quot;ג של אבקה יבשה Rhod2 ב400 μl של 20% pluronic F-127 בDMSO לעשות Rhod2 לצבוע פתרון מניות ולאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הפתרון הזה מניית 1: 1,000 בפתרון מלח &#39;הנקס לעשות פתרון סופי עובד לפני תחילת הניסוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צבע רגיש מתח פתרון (Rh237) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 5 מ&quot;ג של Rh237 עם 2 מיליליטר של DMSO לעשות פתרון מניות ולאחסן ב -20 ° C. לדלל את מניות הפתרון 1: 1,000 בפתרון מלח &#39;הנקס לעשות פתרון סופי עובד לפני תחילת הניסוי. </li></ol></li></ol> &amp; #160; הערה: 1-4 פתרונות מבוסס על פרוטוקול תרבית תאי Claycomb HL-1 עם שינוי קל. 2. Passaging וCulturing HL-1 myocytes פרוזדורים על Coverslips הערה: ניתן להשיג תאי HL-1 מד&quot;ר Claycomb (אוניברסיטת מדינת לואיזיאנה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול HL-1 תאים בצלוחיות T25 ולהאכיל עם 5 מיליליטר של Claycomb בינוני בתוספת יומית. מעבר התאים בT25 צנצנות בחמישה ימים על פי פרוטוקול Claycomb HL-1 תרבית תאים (שיפורט להלן) 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips המקום העגול (קוטר 20 מ&quot;מ) לתוך צלחות תרבות 12 גם 24 שעות לפני תאי בקבוק T25 הם מחוברות באופן מלא ומוכן לpassaged, ולאחר מכן לכסות את coverslips עם ג&#39;לטין / פיברונקטין הלילה בשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום, לשאוב והבא זורק את הג&#39;לטין / פיברונקטין מצלחות התרבות ולהחליף גם 1.5 מיליליטר של מדיום הסופי Claycomb תוספת בכל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול תאים מcultur T25בקבוק דואר לאחר שהגיע למפגש מלא ביום 5. לשאוב בינוני מהבקבוק T25 המכיל את התרבות ומחוברות ולשטוף את התרבות קצרה עם PBS על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PBS ולהוסיף 3 מיליליטר של 0.05% טריפסין / EDTA על 37 מעלות צלזיוס ידי pipetting טריפסין / EDTA על החלק התחתון של בקבוק T25 כדי למנוע מגע ישיר עם התאים. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר טריפסין / EDTA על ידי שאיפה ולהוסיף עוד 1.3 מיליליטר של טריפסין / EDTA לכל בקבוק T25. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 1 דקה. בדוק תחת מיקרוסקופ ואם תאים עדיין מחוברים לבקבוק, הקש כדי לסלק באופן מלא תאים הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1.3 מיליליטר של מעכבי טריפסין הסויה לתאים ותאי העברה מהבקבוק לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. יש לשטוף את הבקבוק הריק עם 5 מיליליטר של מדיום לשטוף Claycomb. להוסיף את לשטוף את התאים בצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant ועדינות מחדש להשעות את התא גלולהב 6 מיליליטר של מדיום הסופי Claycomb בתוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים היטב בכל צלחת 12 גם עם 0.5 מיליליטר של השעיה תא מתאי passaging. להאכיל את התאים עם מדיום הסופי Claycomb טרי בתוספת יומית. הערה: באופן קרוב לפקח על הצמיחה של התאים, בדרך כלל monolayers התא להגיע למעמד ומחוברות ביום 4 והפעילויות הספונטניות יישארו גלויות. לאחר מכן, monolayer התרבותי יהיה מוכן למיפוי אופטי ביום 4-5. </li></ol> 3. סידן טעינה ומתח צבעים רגישים לתאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללימודי מיפוי אופטיים, להסיר בעדינות את coverslip מצלחת תרבית תאי 12 גם ולשטוף עם תמיסת מלח &#39;הנקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכתים תאים עם הצבע רגיש Ca Rhod2, דגירה monolayer התא על coverslip עם 3 מיליליטר של חומץ (מבעבע עם 5% CO גז O 2 2/95%) פתרון Rhod2 עובד על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך 30 דקות . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכתים את התאים עם צבע רגיש מ &#39;VRh237, לטבול את monolayer התא הטעון Rhod2 ל 3 מיליליטר של תמיסת חומץ Rh237 עובדת על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 15 דקות נוספות. </li></ol> מיפוי 4. ערוץ כפול האופטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את monolayer התא, שהוא כפול מוכתם במ &#39;V וצבעים Ca, לחדר מחזור במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. השתמש במערכת דם מחוממת כדי לשמור על הטמפרטורה של החדר בתא C ° 35 ± 1. לשלוט בזהירות את הטמפרטורה של perfusate על ידי התאמת מהירות הזרימה במחזור דרך החדר כדי להימנע משיפוע של יותר מ -0.3 מעלות צלזיוס פני התא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההקלטה מ &#39;V / אותות Ca, לשטוף את monolayer התא עם פתרון הנקס טרי לכ 5 דקות כדי להסיר את הצבע שנותר ממדרגות הצביעה הקודמות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> monolayers תא בריא קצב באמצעות אלקטרודה דו קוטבית המורכבת מפיפטה זכוכית מלאה בתמיסת מלח &#39;הנקס וsilvאה החוט הכרוך סביב קצה פיפטה כמו בעבר תאר 12,17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> monolayers קצב הבריא של תאים באורך מחזור של 200-500 רוחב msec ודופק של 2 אלפיות שניים, מצפה לסף צעדה בכ 1 mV. הערה: לכל אצווה של monolayers התרבותי, יש להשתמש בלפחות שני monolayers שאינם מטופלים על מנת לבחון את מצבו של התא אצווה. monolayers שליטה הבריא צריך להיות מסוגל להיות שנתפס על ידי קיצוב חשמל באורכי מחזור של 200-500 אלפיות שני. אם monolayers השליטה לא מצליח להיות בקצב חשמלי, זה מצביע על כך שכל התא אצווה עשוי שלא להיות מתאים לניסויי מיפוי אופטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעורר את שני מ &#39;V וצבעים רגישים Ca, שימוש במקור אור LED (520 ננומטר אורך גל) בשילוב עם מסנן עירור (510 ננומטר / 40) ומראה dichroic (561 ננומטר). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את אותות ניאון הנפלטים על ידי התאים באמצעות אובייקטיבי 40X ופיצול עם מראה dichroic (594 ננומטר) לרכיב מ &#39;V ומרכיב Ca.סנן את האור הנפלט בערוץ מ &#39;V עם מסנן ארוך לעבור (700 ננומטר) והאור הנפלט בערוץ Ca עם מסנן לעבור להקה (585/40 ננומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את אור הניאון המסונן באמצעות שתי מצלמות CCD (80 x 80 פיקסלים, 1,000 תמונות בשניה; חולצה אדומה הדמיה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להימנע photobleaching צבע, לבצע הקלטות בפחות מ 2 שניות על כל שדה הראייה להגביל את הזמן של חשיפה לאור. כאן, בדרך כלל תמונה ארבעה תחומים שונים לכל שכבה. </li></ol></li></ol> 5. עיבוד נתונים של m V או הקלטות Ca <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשניהם מ &#39;V ואותות Ca (80 x 80 פיקסלים), ממוצע ערכי העצמה של עשרים וחמש (5 x 5) פיקסלים שכנים לערך עוצמה אחד בנקודות זמן הקלטה שונות כדי להפחית את רעש רקע. הערה: לאחר מיצוע הנתונים, כל נקודת זמן הקלטה של ​​פוטנציאל פעולה בודד או חולף Ca מניבה מטריצת נתונים המכילה 16 x 16 בממוצע ערכי עוצמה (בממוצעערוצי נתונים) עם רזולוציה מרחבית של 50 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר זמן הפעלה (AT) של מטר V מוקלט או אותות Ca. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיר זמן הפעלה (AT) של פוטנציאל פעולה בודד או חולף Ca, לקבוע את הזמן של 50% משיא של משרעת מ &#39;V או אותות Ca באמצעות אלגוריתם המבוסס על MATLAB מחוייט כפי שתואר לעיל. 12 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידני להגיה ATS ניתח לחסל את כל שגיאות שעלולות להתרחש במהלך ניתוח התכנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות המוגדר במטריקס (16 x 16 בממוצע נתוני ערוצים) של פוטנציאל פעולה נרשם וחולף סידן, בהתאמה, בתוכנה בשימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב פוטנציאל פעולה או וקטורי סידן חולפים מהירות הולכה (CV) במטריצת AT תוך שימוש בשיטת ניתוח שדה וקטורים כפי שתואר לעיל עם שינויים קלים 12,18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את וקטור קורות החיים של ערוץ נתונים ביחס לסביבתו בנקודות נתונים (5 ×; 5 שכנים בממוצע ערוצי נתונים) כדי לדמות משטח חלק פולינום פעמים הפעלה (על פני שטח) באמצעות אלגוריתם לפחות מרובע בתכנית MATLAB 12,18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב וקטור הולכה תוך שימוש בנוסחות שלהלן פורמולה 1: <img alt="משוואת 1" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52542/52542eq1.jpg" /> פורמולה 2: θ = arctan [(dy / DT) / (DX / DT)] הערה: Ve היא וקטור קורות חיים המוקרנים בקואורדינטות x ו- y צירים; dx / dt היא ההשלכה של וקטור קורות החיים בציר X; dy / dT הוא ההשלכה של וקטור קורות החיים בציר y. T הוא משטח AT; x, y מתייחס ל2-D מרכז; T x = ∂T / ∂x הוא נגזר החלקית של T ביחס לx; y T = ∂T / ∂y הוא נגזר החלקית של T ביחס לy; θ הוא הכיוון הסופי של וקטור קורות חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבוצה כל הווקטורים של מטריצת AT ל -36 מסלולים, כל אחד מהם מכסים מגזר עשר מעלות במצפן. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את המסלול המכיל את האוכלוסייה הגדולה ביותר של וקטורי קורות החיים בין מסלולי ההולכה 36. לחשב את קורות החיים הממוצע של מסלול זה לייצג את קורות החיים של השכבה. </li></ol></li></ol> 6. ויזואליזציה של התפשטות גלים הפתוחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את עוצמת האות של פוטנציאל אישי פעולה או חולף Ca בנקודות זמן הקלטה שונות ביחס לשווי השיא שלה באמצעות תוכנת MATLAB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן זמני לאחסן את נתוני עוצמת המנורמל של כל נקודת זמן שנרשם למטריצת עוצמה 16 x 16 בתוכנת MATLAB בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות מפת עוצמה בצבעים ממטריצת העצמה מאוחסנת של כל נקודת זמן הקלטה באמצעות פונקצית surf.m. הערה: במפת העצמה, אדום מייצגת בעוצמה גבוהה של מטר V או אותות Ca, וכחולה משקפת בעצימות נמוכות של אותות הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור קובץ .avi באמצעות פונקצית avifile.m. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את כל iמפות ntensity בנקודות זמן הקלטה שונות של פוטנציאל הפעולה או חולף Ca באמצעות פונקצית addframe.m. הערה: בשלב זה, שני קבצי avi נפרדים של m V והתפשטות Ca יופקו. </li></ol>

<ol>
	<li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+the+heart.">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).</li><li>Salama, G., Hwang, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+optical+mapping+of+intracellular+free+calcium+and+action+potentials+from+Langendorff+perfused+hearts.">Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts.</a> Current protocols in cytometry / editorial board, J. Paul Robinson, managing editor ... [et al.]. 12 (Unit 12 17), (2009).</li><li>Laurita, K. R., Singal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+action+potentials+and+calcium+transients+simultaneously+from+the+intact+heart.">Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280 (5), H2053-H2060 (2001).</li><li>Fast, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+optical+imaging+of+membrane+potential+and+intracellular+calcium.">Simultaneous optical imaging of membrane potential and intracellular calcium.</a> J Electrocardiol. 38 (4 Suppl), 107-112 (2005).</li><li>Sowell, B., Fast, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+mechanism+of+shock-induced+arrhythmias:+role+of+intracellular+calcium.">Ionic mechanism of shock-induced arrhythmias: role of intracellular calcium.</a> Heart Rhythm. 9 (1), 96-104 (2012).</li><li>Fast, V. G., Kleber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+conduction+in+cultured+strands+of+neonatal+rat+heart+cells+measured+with+voltage-sensitive+dyes.">Microscopic conduction in cultured strands of neonatal rat heart cells measured with voltage-sensitive dyes.</a> Circ Res. 73 (5), 914-925 (1993).</li><li>Hou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+role+for+HERG+in+determining+frequency+of+reentry+in+neonatal+rat+ventricular+myocyte+monolayer.">A major role for HERG in determining frequency of reentry in neonatal rat ventricular myocyte monolayer.</a> Circ Res. 107 (12), 1503-1511 (2010).</li><li>Beauchamp, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+contributions+of+connexins+40+and+43+to+atrial+impulse+propagation+in+synthetic+strands+of+neonatal+and+fetal+murine+cardiomyocytes.">Relative contributions of connexins 40 and 43 to atrial impulse propagation in synthetic strands of neonatal and fetal murine cardiomyocytes.</a> Circ Res. 99 (11), 1216-1224 (2006).</li><li>Xia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+L-+and+T-type+Ca2++channels+in+murine+HL-1+cells.">Functional expression of L- and T-type Ca2+ channels in murine HL-1 cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 36 (1), 111-119 (2004).</li><li>Claycomb, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HL-1+cells:+a+cardiac+muscle+cell+line+that+contracts+and+retains+phenotypic+characteristics+of+the+adult+cardiomyocyte.">HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).</li><li>Fahrenbach, J. P., Ai, X., Banach, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+intercellular+coupling+improves+the+function+of+cardiac+pacemakers+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Decreased intercellular coupling improves the function of cardiac pacemakers derived from mouse embryonic stem cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 45 (5), 642-649 (2008).</li><li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Jun+N-terminal+kinase+activation+contributes+to+reduced+connexin43+and+development+of+atrial+arrhythmias.">c-Jun N-terminal kinase activation contributes to reduced connexin43 and development of atrial arrhythmias.</a> Cardiovasc Res. 97 (3), 589-597 (2013).</li><li>White, S. M., Constantin, P. E., Claycomb, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+physiology+at+the+cellular+level:+use+of+cultured+HL-1+cardiomyocytes+for+studies+of+cardiac+muscle+cell+structure+and+function.">Cardiac physiology at the cellular level: use of cultured HL-1 cardiomyocytes for studies of cardiac muscle cell structure and function.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H823-H829 (2004).</li><li>Yang, Z., Shen, W., Rottman, J. N., Wikswo, J. P., Murray, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+stimulation+causes+electrical+remodeling+in+cultured+atrial+myocytes.">Rapid stimulation causes electrical remodeling in cultured atrial myocytes.</a> J Mol Cell Cardiol. 38 (2), 299-308 (2005).</li><li>Brundel, B. J., Kampinga, H. H., Henning, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calpain+inhibition+prevents+pacing-induced+cellular+remodeling+in+a+HL-1+myocyte+model+for+atrial+fibrillation.">Calpain inhibition prevents pacing-induced cellular remodeling in a HL-1 myocyte model for atrial fibrillation.</a> Cardiovasc Res. 62 (3), 521-528 (2004).</li><li>Umapathy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrogram+fractionation+in+murine+HL-1+atrial+monolayer+model.">Electrogram fractionation in murine HL-1 atrial monolayer model.</a> Heart Rhythm. 5 (7), 1029-1035 (2008).</li><li>Fast, V. G., Cheek, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+arrhythmias+induced+by+strong+electrical+shocks+in+myocyte+cultures.">Optical mapping of arrhythmias induced by strong electrical shocks in myocyte cultures.</a> Circ Res. 90 (6), 664-670 (2002).</li><li>Bayly, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+conduction+velocity+vector+fields+from+epicardial+mapping+data.">Estimation of conduction velocity vector fields from epicardial mapping data.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 45 (5), 563-571 (1998).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

מאמר זה מתאר את ההיבטים המרכזיים של מיפוי אופטי בשכבת myocyte פרוזדורים תרבותית HL-1 מוכתמת בצבעי ניאון רגישים סידן ומתח. זה כולל culturing monolayer אופטימלי HL-1 תא, התקנה של ציוד המיפוי, מיפוי monolayer תרבותי, וניתוח נתונים. כדי למפות בהצלחה תאים בתרבית, המפתח הוא להכין monolayer תא מפוזר באופן אחיד. כאשר זריעת התאים לcoverslips, להיות בטוח כדי לפזר באופן שווה את התאים. תמיד מפת monolayers תא מלאה גדל ומחוברות לחלוטין, כמו אלה יגיבו הטובים ביותר לצעדה חשמלית. כמו כן, חשוב לשמור על התאים מחומצן בעת ​​טעינת הצבעים, אבל בועות החמצן לא צריכה לבוא במגע ישיר עם התאים כמו זה עלול להרוג או לסלק אותם מcoverslip. הפחתת ריכוז לצבוע והפחתת עוצמת אור יקטן גודל אות ולהפחית יחס אות לרעש, תוך הגדלת concentrati צבעובשיפור עוצמת אור יגדל עוצמת אות, אלא גם להגדיל את הרעש. לכן, איזון אופטימלי של ריכוז צבע ניאון וכוח אור העירור צריך להיקבע על מנת לשפר את יחס האות לרעש של אותות הקלטה. יתר על כן, בעת הקלטת מיפוי אופטית, להיות בטוח כדי למנוע חשיפה של monolayer התא לחשיפות של אור מרוכז כל עוד זה עלול לגרום לניזק לתאים פוטודינמי בתחום האור חשוף. לבסוף, מערכת מיפוי אופטית המספקת רזולוציה של זמן ומרחב גבוהה של אותות הקלטה נדרשת לקבלת נתונים באיכות גבוהה. בעוד מיפוי אופטי ערוץ כפול בלב שלם יש פוטנציאל גדול ללימוד electrophysiology לב בשל יכולתו לאותות מתח וסידן לאסוף בו-זמנית, מגבלה אחת היא שטכניקה זו אוספת מידע משטח 3-D כמפת הקרנת 2-D. הנתונים שהתקבלו 2-D מלב שלם עם מידע התעלם מcurvat 3-Dיור של הלב יכול לגרום לשגיאות נתונים בניתוחים, במיוחד בניתוח מהירות הולכה. עם היתרונות של שימוש HL-1 מודל 2-D בתרבית תאי, אנו מסוגלים לדמיין מקצבים קבועים וסדירים, להעריך חולף Ca וקינטיקה פוטנציאל פעולה, לקבוע מהירות הולכה ולאפיין Ca ודפוסי התפשטות פוטנציאל פעולה (אחיד או שאינה התפשטות אחידה) בלי להתערב ממבנה 3-D של לב שלם. לכן, מיפוי בהצלחה שני ארעיים סידן ופוטנציאל פעולה בשכבת myocyte פרוזדורים תרבותית HL-1 כגישה חינם יכול לשפר באופן משמעותי את ההבנה של מאפייני אלקטרו של myocytes פרוזדורים והמנגנונים של arrhythmogenesis פרוזדורים.

סידן ייחודי (Ca) ומתח (מ &#39;V) טכניקת מיפוי אופטי ערוץ כפול 1-5 מתגלה ככלי יעיל כדי להקליט בו זמנית אותות מ&#39; V וCa בשני לבבות שלמים וmonolayers תאים בתרבית. טכניקה זו מאפשרת לקבל מידע רב עוצמה ביחס למערכת היחסים בין ארעיים סידן ופוטנציאל פעולה כדי להבין טוב יותר את מנגנוני אלקטרו הבסיסיים של הפרעות בקצב לב. monolayers תאים בתרבית הוכיח להיות מודל סלולארי שימושי ללמוד electrophysiology לב ואת המנגנון הבסיסי של הפרעות קצב. 4,6-8 HL-1 תאים קו תרבות myocyte פרוזדורים מאופיינים היטב. תאי HL-1 גם לשמור על גנוטיפ מובחן באופן ייחודי ופנוטיפ הכולל מורפולוגיים, אלקטרו, ומאפיינים תרופתיים של myocytes פרוזדורים המבוגר. תאים אלה מבטאים גני לב וחלבונים, כולל importaNT יון לב ערוצים (כלומר, L- וערוצי סידן T-סוג) 9 וisoforms הבוגר של חלבוני התכווצות sarcomeric בדרך כלל נמצא בmyocytes פרוזדורים מבוגר כמו אחרים ויש לנו שדווח בעבר. 10-13 בנוסף, HL-1 תאים יכולים להיות בתרבית כדי ליצור monolayer myocyte 2 ממדים (2-D). לפיכך, היתרונות של שימוש monolayers HL-1 התרבותי כוללים: 1) עלות וקלה יותר יחסית נמוכות כדי לשמור על קו תרבות myocyte מאשר הבידוד וculturing myocytes ילוד הראשוני; 2) monolayer ומחוברות של תאים מפחיתה את המורכבות המבניות הנובעות ממבנה 3-D של הלב; 3) monolayer תא יכול לחסל את ההפרעה של סיסטיק ביניים המתרחשת בלב שלם. זה יכול לשמש כדי לנתח פונקציות אלקטרו ספציפיות של קבוצה של myocytes ללא התערבות של fibroblasts ומטריצת ביניים; 4) הערכה של השלכות תפקודיות ממניפולציה תרופתית או גנטית ברחוב ללא מוצאmonolayers תא tured ניתן להשיג ביעילות. לכן, HL-1 תאים הפכו למודל סלולארי בשימוש נרחב ללימוד היבטים שונים של הפיסיולוגיה myocyte כמו גם פעילויות חשמליות חריגות מושרה צעדה. 13-16 monolayers תא בריא עם זאת, טיפול וטיפול מיוחד נדרש לתרבות המגיבים לחיצוני צעדה חשמלית ללימודי מיפוי אופטיים. בנוסף, הליך מכתים צבע ניאון כפול עשוי בקלות לגרום נזק לשלמות monolayers תא ומחוברות בתרבית. לפיכך, מ &#39;V ביצוע / מיפוי אופטי ערוץ כפול CA בmonolayers HL-1 בתרבית היה אתגר גדול. מטרתה של שיטה זו היא לספק את השלבים העיקריים לביצוע בהצלחה מיפוי אופטי ערוץ כפול בmonolayers HL-1 בתרבית. כאן יש לנו סיפקנו פרטים רבים על פרוטוקול מותאם להכנת monolayer HL-1 התא, מיפוי אופטי ערוץ כפול של monolayer תאים בתרבית, ועיבוד נתוני מיפוי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhod2 dry powder</td>
			<td style="width:103px;">&#160;AAT Bioquest</td>
			<td style="width:119px;">21062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pluronic</td>
			<td style="width:103px;">AAT Bioquest</td>
			<td style="width:119px;">20050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">DMSO</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rh237</td>
			<td style="width:103px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">&#160;S-1109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KH2PO4&#160;</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4&#160;</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPEs</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

voltage and calcium dual channel optical mapping of cultured hl-1 atrial myocyte monolayer

מיפוי אופטי הוכיח להיות טכניקה יקרה כדי לזהות פעילות חשמלית של הלב על שני לבבות לשעבר שלם vivo ובmonolayers myocyte התרבותי. תאי HL-1 היו בשימוש נרחב כמודל סלולארי 2 ממדים ללימוד היבטים שונים של פיזיולוגיה של לב. עם זאת, זה כבר אתגר גדול לסידן המפה אופטי ארעיים (Ca) ופוטנציאל פעולה בו זמנית מאותו שדה הראייה בשכבת תא פרוזדורים תרבותית HL-1. סיבה לכך הוא טיפול וטיפול מיוחדים נדרש כדי להכין את התאים בריאים שיכול לנפול בפח חשמלי וממופים אופטי. לכן, פיתחנו פרוטוקול עבודה אופטימלי למיפוי אופטי ערוץ כפול. בכתב היד הזה, שתארנו בפירוט כיצד לבצע את ניסוי מיפוי אופטי ערוץ הכפול. פרוטוקול זה הוא כלי שימושי שנועד לשפר את ההבנה של התפשטות פוטנציאל פעולה וקינטיקה Ca בפיתוח הפרעות קצב.

<html> Monolayer ומחוברות תרבותית מציגה קצב פנימי רגיל, כפי שהודגמה בסרט 1. לאחר מכן, אנו מבוצעים מ &#39;V מיפוי אופטי ערוץ כפול / Ca בשכבה HL-1 ומחוברות באופן מלא. איור 1 א מציג עקבות דוגמא מ&#39; V ואותות Ca מנרשם בודד הכה. מפות isochronal נציג מ &#39;V מופץ באופן אחיד ואותות Ca באמצעות מערכת המיפוי אופטי ערוץ הכפולה מוצגות ב1B דמויות ו1C. תמונות כרונולוגי נציג של פוטנציאל פעולה מופץ באופן אחיד וארעיים Ca התקבלו מאותה התרבות monolayer HL-1. לבסוף, סרטים 2 ו -3 לספק דוגמאות אנימציה של פוטנציאל מופץ באופן אחיד פעולה (סרט 2) וסידן חולף (סרט 3) בשכבה ומחוברות HL-1. <html> -page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52542/52542fig1highres.jpg" /> איור 1: () עקבות דוגמה למ &#39;V (כחול) וCa (אדום) מפעימה חשמלית בקצב באורך מחזור (CL) של 500 אלפיות שניים. (ב) תמונה של מערכת המיפוי האופטית שלנו לHL-1 monolayers. מפת isochronal של התפשטות פוטנציאל פעולה מאותו הפעימה בקצב לאורך כל שדה הראייה (C). מפת isochronal של התפשטות חולפת Ca מאותה הפעימה בקצב לאורך כל שדה הראייה (D). בשתי מפות isochronal, זמן לשגות מיוצג עם צבעים, מתחיל בכחול כהה ייזום ואדום כהה ב 50 אלפיות שניים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52542/52542fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> /52542/52542fig2highres.jpg &quot;/&gt; איור 2: (א) בסדרת מפות של הפצה מ &#39;V של 60, 80, 140, ו -200 אלפיות שני לאחר תחילת ההקלטה. (ב) מפות של הפצת Ca ב 60, 80, 140, ו -200 אלפיות שני לאחר תחילת ההקלטה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52542/looped HL-1 7-20-14.avi">סרט 1:</a> סרט נציג נרשם ממחוברות monolayer HL-1 ביום תרבות חמש, תחת מיקרוסקופ אור עם מטרת 40X. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52542/vm 07_21_14 jy.avi">סרט 2:</a> סרט מייצג של פוטנציאל פעולה מופץ מפעימה בקצב בCL של 500 אלפיות שניים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52542/ca 07_21_14 jy.avi">סרט 3:</a> סרט מייצג של חולף Ca מופץ מpaced הכה בCL של 500 אלפיות שניים.

Watch this Scientific Journal Video about Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer at JoVE.com

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

מתח וסידן ערוץ כפול אופטי מיפוי של תרבית HL-1 פרוזדורים Myocyte חד שכבתי

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

voltage-calcium-dual-channel-optical-mapping-cultured-hl-1-atrial

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K Views.  Loyola University Chicago. This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Video: Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

טיפול ניקוי נאות של המיקרוסקופ

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

שלב ניגודיות הפרעות דיפרנציאלי ניגודיות (DIC) מיקרוסקופית

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

מיפוי אופטי של Langendorff-perfused לבבות עכברוש

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Optical Recording of Electrical Activity in Guinea-pig Enteric Networks using Voltage-sensitive Dyes

The enteric nervous system (ENS) is a self-contained network with identified functions, capable of performing complex behaviors in isolation. Its neurons (10 to 25 &mu;m in diameter) are arranged in plexuses that are confined to distinct planes of the gut wall 1; the myenteric plexus can be found between the longitudinal and circular muscle layers, and the submucous plexus between the circular muscle layer and the mucosa. Since the effector systems for these plexuses (transporting epithelium, endocrine cells, immune elements, blood vessels and smooth muscle) are also contained within the gut wall, semi-intact preparations can be dissected that preserve individual components of different reflex pathways. The behavior of the effector systems is controlled by the submucous and myenteric plexuses acting in concert. Therefore, detailed knowledge of synaptic interactions within and between ganglia, and of communication between the plexuses, is essential for understanding normal gastrointestinal function. The ENS, as an intact nervous system, is a unique experimental model in which one can correlate molecular and cellular events with the electrical behavior of the neuronal network and its physiological outputs. Because of the quasi-two-dimensional organization of its plexuses, the ENS is particularly well suited for the study of neural networks using multiple site optical recording techniques that employ voltage-sensitive dyes 2,7,8,9. We will illustrate here the use of a relatively new naphthylstyryl-pyridinium dye (di-4-ANEPPDHQ) 3 that offers multiple advantages over its predecessors, including very low phototoxicity, slow rate of internalization, and remarkable chemical stability. When used in conjunction with a camera that permits sub-millisecond time resolution, this dye allows us to monitor the electrical activity of all the neurons in the field of view with a maximal spatial resolution of ~ 2.5 &mu;m at 100X magnification. At lower magnification (10X or 20X), the sacrifice of single-cell resolution is compensated by a gain in perspective, revealing the intricacies of the inter-ganglionic circuitry.

This protocol illustrates how voltage-sensitive dyes enable optical recording of electrical activity from intact neural networks such as the plexuses of the guinea-pig enteric nervous system, with an adjustable resolution that ranges from single-cells to multi-ganglionic circuitry.

הקלטה אופטית של הפעילות החשמלית גינאה חזיר רשתות enteric באמצעות מתח רגיש צבעים

The enteric nervous system (ENS) is a self-contained network with identified functions, capable of performing complex behaviors in isolation. Its neurons ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of fluorescence can be changed by exposure to light of a specific wavelength. Optical highlighting allows noninvasive marking of a subpopulation of fluorescent molecules, and is therefore ideal for tracking single cells or organelles.
Critical parameters for efficient photoconversion are the intensity and the exposure time of the photoconversion light. If the intensity is too low, photoconversion will be slow or not occur at all. On the other hand, too much intensity or too long exposure can photobleach the protein and thereby reduce the efficiency of photoconversion.
This protocol describes a general approach how to set up a confocal laser scanning microscope for pc-FP photoconversion applications. First, we describe a procedure for preparing purified protein droplet samples. This sample format is very convenient for studying the photophysical behavior of fluorescent proteins under the microscope. Second, we will use the protein droplet sample to show how to configure the microscope for photoconversion. And finally, we will show how to perform optical highlighting in live cells, including dual-probe optical highlighting with mOrange2 and Dronpa.

This protocol describes a general approach to perform photoconversion of fluorescent proteins on a confocal laser scanning microscope. We describe procedures for the photoconversion of puried protein samples, as well as for dual-probe optical highlighting in live cells with mOrange2 and Dronpa.

Photoconversion של חלבונים מטוהרים פלורסנט ו Dual-בדיקה אופטי סימון בתאים חיים

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

בידוד והקלטות בערוץ KV בcardiomyocytes פרוזדורים וחדרית Murine

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

כינונה מחדש של חלבון טראנסממברנלי, יון ערוץ מתח מגודרת, KvAP, לענק Unilamellar שלפוחית ​​למיקרוסקופי וצמד תיקון ללימודים

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells in the pathogenesis of various renal diseases has been established since podocyte injury leads to proteinuria and foot process effacement. It was previously reported that various endogenous agents may cause a dramatic overload in intracellular Ca2+ concentration in podocytes, presumably leading to albuminuria, and this likely occurs via calcium-conducting ion channels. Therefore, it appeared important to study calcium handling in the podocytes both under normal conditions and in various pathological states. However, available experimental approaches have remained somewhat limited to cultured and transfected cells. Although they represent a good basic model for such studies, they are essentially extracted from the native environment of the glomerulus. Here we describe the methodology of studying podocytes as a part of the freshly isolated whole glomerulus. This preparation retains the functional potential of the podocytes, which are still attached to the capillaries; therefore, podocytes remain in the environment that conserves the major parts of the glomeruli filtration apparatus. The present manuscript elaborates on two experimental approaches that allow 1) real-time detection of calcium concentration changes with the help of ratiometric confocal fluorescence microscopy, and 2) the recording of the single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. These methodologies utilize the advantages of the native environment of the glomerulus that enable researchers to resolve acute changes in the intracellular calcium handling in response to applications of various agents, measure basal concentration of calcium within the cells (for instance, to evaluate disease progression), and assess and manipulate calcium conductance at the level of single ion channels.

Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli.

ערוץ יחיד הדמיה ניתוח וסידן בPodocytes של glomeruli מבודדת טרי

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

מיפוי אופטי של Intra-sarcoplasmic reticulum Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; ופוטנציאל הטרנסממברני בלב ארנב Langendorff-perfused

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...