This work was supported by grants from the Pharmaceutical Research and Manufacturers Association of America (PhRMA) Foundation (to B. Gulbransen), National Institutes of Health (Building Interdisciplinary Research Careers in Women&#8217;s Health) grant K12 HD065879 (B. Gulbransen) and start-up funds from Michigan State University (B. Gulbransen).

הערה: ההליכים הבאים הכרוכים ברקמה מחיות מעבדה עולים בקנה אחד עם הנחיות AVMA להמתת החסד של בעלי חיים 2013 ואושרו מראש על ידי IACUC אוניברסיטת מדינת מישיגן. 1. רקמות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים בעלי חיים מחקר בתא המכיל isoflurane 2.5% בחמצן או על ידי הצבת 3-5 מיליליטר של נוזל על isoflurane חומר סופג על הרצפה של החדר, על מנת להבטיח כי מכשול פיזי מונע מבעלי חיים מגע ישיר עם isoflurane. מבחן לעומק הרדמה על ידי צובט את השודד. הערה: עומק ההרדמה נחשב מתאים כאשר אין רפלקס נסיגה של הגפיים האחורי. ברגע שהרדים כראוי, להרדים את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה במצב שכיבה ולנקות את עור בטן עם אתנול 70%. שימוש במלקחיים לצבוט עור בטן בקו האמצע ולהשתמש במספריים כירורגית כדי להפוך את תקשורת 6 סנטימטרחתך l לאורך alba linea לחשוף איברי עיכול פנימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים בוטים לאתר ולחשוף את המעי בתוך הצפק. חותך את לפדר ileal / מעי גס עם מספריים ולהתחיל לפרום את המעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שאורכו של המעי נפרם כראוי, לחתוך את דיסטלי המעי אל הקיבה והפרוקסימלי לcecum להכנת מעי. להכנת מעי גסה, לחתוך את דיסטלי המעי הגס לcecum והפרוקסימלי לפי הטבעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר במהירות את קטע המעי ולמקם אותו בכוס עם תקשורת DMEM / F12 בתוספת hydrochloride nicardipine 3 מיקרומטר ו1 מיקרומטר hydrochloride scopolamine (המכונה &quot;תקשורת&quot; להלן) על קרח. התוספת של מעכבים אלו, מסייעת microdissection והדמיה לאחר מכן על ידי משתק את שריר החלק במעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קטע Cut של עניין (למשל, מעי ריק, מעי, מעי גס דיסטלי או הפרוקסימלי) המבוסס על סמנים אנטומיים הוקמו. בדרך כלל utilizרקמת דואר מהמעי הדיסטלי או המעי הגס דיסטלי. עם זאת, להשתמש באותו ההליך בסיסי לבודד, הנוירונים myenteric עומס ותמונה וגליה בכל האזורים במעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר קטע קטן (4-6 סנטימטר) של קטע מעי רצוי ומניחים בצלחת פטרי מצופה Sylgard מלאה תקשורת מצוננת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Secure הפרוקסימלי וקצוות מרוחקים של קטע המעי עם סיכות חרקים ולפתוח את צינור המעיים על ידי ביצוע ישר, חתך לאורכו לאורך גבול mesenteric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת פין שטוחה תחת מתח אור עם צד רירית וזהירות לנתח משם שכבה רירית באמצעות מלקחיים עדינים (מס &#39;5 ו# 5/45 עבודה הטובה ביותר) ומספריים באביב יפים מאוד. הערה: הסרת הרירית יכולה להיות די טראומטית עבור ENS אם לא נעשה כראוי. להכנות איכות, דואגים להגביל ההסרה פתאומית של הרירית על ידי קילוף או גירוד. התרגול הטוב ביותר הוא להסיר את הרירית ולחתוך עם מספריים מתחת קנס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הרקמה לתוך הכנה קטנהs (כ 0.5 סנטימטר 2) וסיכה לתוך מנות הדמיה (4 פינות עם שכבת שריר מעגלית כלפי מעלה) הניחה על קרח עם תקשורת טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לנתח את שריר מעגלי על ידי מתגרה בנפרד עם פינצטה בסדר לחשוף את מקלעת myenteric. הימנע ממתיחה מוגזמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת הדמיה חזרה על פתרון קרח ושינוי עם תקשורת טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין 2 מיליליטר של תערובת אנזים לכל צלחת [Dispase 1 U / ml (4.48 מ&quot;ג / 8 מיליליטר), Collagenase סוג II 150 U / ml (5.45 מ&quot;ג / 8 מיליליטר) בתקשורת]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מנות מהקרח ולהוסיף את תערובת האנזים מהצעד 1.13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה מנות ב RT למשך 15 דקות עם 5% CO 2/95% אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנות רקמות לשטוף עם תקשורת 3 פעמים ובפינות מחדש פינים. </li></ol> 2. טוען Fluo-4 Dye הערה: הימנע photobleaching ידי עבודה עם אור מוגבל בזמן טיפול צבעי ניאון ורקמה עמוס צבעי מחוון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 4 פתרון טעינת Fluo-4 מיקרומטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1.5 מיליליטר תקשורת ו -1.2 μl של מניית probenecid 250 מ&quot;מ לaliquot 1.5 μl של 4 מ&quot;מ מניית Fluo-4. 4 מ&quot;מ מניית Fluo-4 הוא הוכן על ידי הוספת 11.4 μl של F-127 pluronic (20% בDMSO; בתוספת 0.25% cremaphor-EL) 50 מיקרוגרם של Fluo-4, בבוקר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה preps בפתרון טעינת Fluo-4 במשך 45 דקות בחממה כהה על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מן החממה ולשטוף הכנות עם תקשורת 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת תמורת מדיה המכילה 200 מיקרומטר probenecid דגירה 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני ההדמיה. הערה: probenecid הוא תרופה מעכבת מובילי התנגדות multidrug בתאי עצב. תוספת של תרופה זו מעכבת את היכולת של תאי עצב כדי למתוח צבעים ומשפרת תיוג עצבי. תפזורת-טעינה של Ca 2 + צבעי מחוון בהעדר probenecid מייצרת טעינת תא בעיקר גליה. התוספת של probenecid מאפשרת הדמיה של תגובות עצביות וגליה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השתנה Kreמאגר BS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך חיץ קרבס שונה כך שהריכוזים הסופיים (מ&quot;מ) של הרכיבים הם אחריו כמו: 121 NaCl, 5.9 KCl, 2.5 CaCl 2, 1.2 MgCl 2, 1.2 לאא 2 PO 4, 10 HEPES, 21.2 NaHCO 3, pyruvic 1 חומצה ו -8 גלוקוז (pH מותאם ל7.4 עם NaOH). הוסף 3 nicardipine מיקרומטר וscopolamine 1 מיקרומטר לעכב התכווצויות שרירים במהלך Ca 2 + הדמיה וכל הר והניתוחים. </li></ol></li></ol> 3. הדמיה וניתוח הערה: השתמש לפחות מתקן הדמיה בסיסי עם מקור אור ניאון, מיקרוסקופ, מצלמת CCD באיכות ותוכנת רכישה מתאימה. להשתנות בתוספת רכיבים אחרים בהתאם למקור האור ויישום ספציפי. גלגל לסנן ותריס יש להשתמש במקור אור קשת קסנון מסורתי. עם זאת, מקורות אור LED ומערכות תאורה לא דורשים רכיבים אלה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את recOrding תא מתחת למיקרוסקופ ובאמצעות מערכת הזרימה זלוף הכבידה עם מאגרי מזרק מחוממים מרובים להקים שיעור זלוף רציף של 2-3 מיליליטר / דקה 37 ° C חיץ קרבס. ודא כדי למנוע היווצרות בועת אוויר בשתי שורת הקלט והיניקה מחוברת למלכודת ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא את המקלעת הרצויה אל מוקד תחת תאורה בשדה בהירה. הימנע overexposing רקמה, דבר שעלול להוביל להלבנת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את טעינת Fluo-4 בתוך הגרעינים ובחר הגרעינים בריאים הדמיה. הגרעינים לא בריאים / פגומים יפגינו מורפולוגיה autofluorescence או punctate ולא אמור לשמש להדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שגנגליון נבחר, להסיט את נתיב אור למצלמה ולקבל תמונת חיה עם תוכנת רכישת תמונה. ודא גנגליון שהוא בזמני מיקוד וקצב רכישת תמונה מוגדר וחשיפה. הערה: שיעורי רכישת תמונה וזמנים משתנים בהתאם לאירועי חוקרים רוצים להקליט. עבור רוב הניסויים, תמונותנרכשים באופן מסורתי ב0.5-1 הרץ לתאי גלייה ועד 2-10 הרץ לנוירונים כי Ca 2 + תגובות גליה אינן מהירות כמו Ca 2 + ארעיים בתאי עצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל בניסוי ולהקים פעילות בסיסית למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל תרופות מחוממות מראש של עניין, כגון אגוניסטים לקולטן ואת יריבים באמצעות מערכת זלוף זרימת כוח הכבידה בשיעור של 2-3 מיליליטר / דקה. עקוב יישום של אגוניסטים / יריבים על ידי חזרה לזלוף של חיץ רגיל ולאפשר תקופת לשטוף / התאוששות של לפחות 10 דקות. הערה: זמני יישום התרופה ישתנו בהתאם למתחם הפרט ותכנון ניסויים. באופן כללי, יישום 20-30 שניות של אגוניסט מספיק להפעלת הקולטנים בשילוב G-חלבון בתאי עצב ותאי גליה. עם זאת, תעלות יונים מגודרת ליגנד (כגון קולטני אצטילכולין ניקוטינית) דורשות פעמים יישום של לא יותר מ 5-10 שניות. חשיפות משך נוספות תגרום תעלות יונים יגנד מגודרות למהירות את אלהnsitize. יריבים צריכים להיות מיושמים על כ 3-15 דקות כדי להבטיח מצור של מסלולי קולט מלא. עם זאת, מדובר בהכללה גסה וחוקרים תמיד צריכים לייעל את כל תרופה ניסיונית בפרדיגמה המסוימת שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפסיק סרט הזמן לשגות הקלטה ותצוגה של הניסוי. אזורים נבחרים בקפידה של עניין (של ROI) באמצעות תוכנת ניתוח תמונה המתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בתוכנה כדי לנרמל ולהשוות עוצמת ניאון ROI נגד ערך ניאון בסיס הראשוני שלה. שינויים בקרינה מנורמלת הם ביחס ישר לשינויים ב[ Ca 2 +]. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשינוי של שיטה שתואר קודם לכן 26 באמצעות ΔF / F = ((F 1 - F 0) / F 0) ROI - ((F 1 - F 0) / F 0) רקע, שבו F1 הוא הקרינה בכל רגע נתון נקודה וF0 הוא הקרינה תחילת המחקר, כדי לשפר את דיוק ההערכה. עזרי שינוי זהבהפחתת רעש משינויי הקרינה בהכנות רקמה שמפגינים תנועה של שכבת שריר בסיס מקלעת myenteric. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Types+of+neurons+in+the+enteric+nervous+system.">Types of neurons in the enteric nervous system.</a> Journal of the Autonomic Nervous System. 81 (1-3), 87-96 (2000).</li><li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+the+autonomic+nervous+system:+peripheral+connections.">The organization of the autonomic nervous system: peripheral connections.</a> Neuroscience. 130 (1-2), 1-5 (2006).</li><li>Pham, T. D., Gershon, M. D., Rothman, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+of+origin+of+neurons+in+the+murine+enteric+nervous+system:+sequence+in+relation+to+phenotype.">Time of origin of neurons in the murine enteric nervous system: sequence in relation to phenotype.</a> Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 789-798 (1991).</li><li>Nasser, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+enteric+glia+in+intestinal+physiology:+effects+of+the+gliotoxin+fluorocitrate+on+motor+and+secretory+function.">Role of enteric glia in intestinal physiology: effects of the gliotoxin fluorocitrate on motor and secretory function.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291, G912-927 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+in+the+gut.">Glial cells in the gut.</a> Neurogastroenterology &amp; Motility. 17 (6), 777-790 (2005).</li><li>Broadhead, M. J., Bayguinov, P. O., Okamoto, T., Heredia, D. J., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++transients+in+myenteric+glial+cells+during+the+colonic+migrating+motor+complex+in+the+isolated+murine+large+intestine.">Ca2+ transients in myenteric glial cells during the colonic migrating motor complex in the isolated murine large intestine.</a> J. Physiol. 590, 335-350 (2012).</li><li>Gulbransen, B. D., Bains, J. S., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+targets+of+the+sympathetic+innervation+of+the+myenteric+plexus+in+the+guinea+pig+distal+colon.">Enteric glia are targets of the sympathetic innervation of the myenteric plexus in the guinea pig distal colon.</a> J. Neurosci. 30, 6801-6809 (2010).</li><li>McClain, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++Responses+in+Enteric+Glia+Are+Mediated+by+Connexin-43+Hemichannels+and+Modulate+Colonic+Transit+in+Mice.">Ca2+ Responses in Enteric Glia Are Mediated by Connexin-43 Hemichannels and Modulate Colonic Transit in Mice.</a> Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).</li><li>Chandrasekharan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonic+motor+dysfunction+in+human+diabetes+is+associated+with+enteric+neuronal+loss+and+increased+oxidative+stress.">Colonic motor dysfunction in human diabetes is associated with enteric neuronal loss and increased oxidative stress.</a> Neurogastroenterology &amp; Motility. 23 (2), e131-e126 (2011).</li><li>Abdo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glial+cells+protect+neurons+from+oxidative+stress+in+part+via+reduced+glutathione.">Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione.</a> FASEB J. 24, 1082-1092 (2010).</li><li>Aube, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+enteric+neurone+phenotype+and+intestinal+functions+in+a+transgenic+mouse+model+of+enteric+glia+disruption.">Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption.</a> Gut. 55, 630-637 (2006).</li><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nature Reviews Molecular cell biology. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Gulbransen, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+neuronal+P2X7+receptor-pannexin-1+mediates+death+of+enteric+neurons+during+colitis.">Activation of neuronal P2X7 receptor-pannexin-1 mediates death of enteric neurons during colitis.</a> Nat Med. 18, 600-604 (2012).</li><li>Bayguinov, P. O., Hennig, G. W., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+activity+in+different+classes+of+myenteric+neurons+underlying+the+migrating+motor+complex+in+the+murine+colon.">Calcium activity in different classes of myenteric neurons underlying the migrating motor complex in the murine colon.</a> J Physiol. 588, 399-421 (2010).</li><li>Okamoto, T., Bayguinov, P. O., Broadhead, M. J., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+transients+in+submucous+neurons+during+the+colonic+migrating+motor+complex+in+the+isolated+murine+large+intestine.">Ca(2+) transients in submucous neurons during the colonic migrating motor complex in the isolated murine large intestine.</a> Neurogastroenterol Motil. 24 (8), 769-778 (2012).</li><li>Kunze, W. A., Clerc, N., Furness, J. B., Gola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+soma+and+neurites+of+primary+afferent+neurons+in+the+guinea-pig+intestine+respond+differentially+to+deformation.">The soma and neurites of primary afferent neurons in the guinea-pig intestine respond differentially to deformation.</a> J Physiol. 526, 375-385 (2000).</li><li>Schemann, M., Michel, K., Peters, S., Bischoff, S. C., Neunlist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+the+gastrointestinal+tract:+mapping+the+human+enteric+nervous+system.">Imaging and the gastrointestinal tract: mapping the human enteric nervous system.</a> Am J Physiol. 282, G919-G925 (2002).</li><li>Hennig, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+spread+of+pacemaker+activity+in+through+ICC+in+guinea-pig+antrum.">Visualization of spread of pacemaker activity in through ICC in guinea-pig antrum.</a> Neurogastro Motil. 14, 575 (2001).</li><li>Stevens, R. J., Publicover, N. G., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+organization+of+Ca2++waves+by+enteric+neural+reflexes.">Induction and organization of Ca2+ waves by enteric neural reflexes.</a> Nature. 399, 62-66 (1999).</li><li>Stevens, R. J., Publicover, N. G., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+and+neural+regulation+of+calcium+waves+in+longitudinal+and+circular+muscle+layers+of+guinea-pig+small+intestine.">Propagation and neural regulation of calcium waves in longitudinal and circular muscle layers of guinea-pig small intestine.</a> Gastroenterology. 118, 982-984 (2000).</li><li>Jessen, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-like+glia+in+the+peripheral+nervous+system:+an+immunohistochemical+study+of+enteric+glia.">Astrocyte-like glia in the peripheral nervous system: an immunohistochemical study of enteric glia.</a> Journal of Neuroscience. 3 (11), 2206-2218 (1983).</li><li>Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+functional+roles+for+enteric+glia+in+the+gastrointestinal+tract.">Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 625-632 (2012).</li><li>Gomes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-dependent+paracrine+communication+between+enteric+neurons+and+glia+in+a+primary+cell+culture+derived+from+embryonic+mice.">ATP-dependent paracrine communication between enteric neurons and glia in a primary cell culture derived from embryonic mice.</a> Neurogastroenterology &amp; Motility. 21 (8), e870-e862 (2009).</li><li>Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+neuron-to-glia+signaling+in+the+enteric+nervous+system.">Purinergic neuron-to-glia signaling in the enteric nervous system.</a> Gastroenterology. 136, 1349-1358 (2009).</li><li>Ren, J., Bertrand, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors+and+synaptic+transmission+in+enteric+neurons.">Purinergic receptors and synaptic transmission in enteric neurons.</a> Purinergic Signal. 4, 255-266 (2008).</li><li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+calcium.">Measurement of intracellular calcium.</a> Physiol Rev. 79, 1089-1125 (1999).</li><li>Dongcheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+regionalisation+for+enteric+nervous+system+formation:+implications+for+Hirschsprung's+disease+and+stem+cell+therapy.">Neural crest regionalisation for enteric nervous system formation: implications for Hirschsprung's disease and stem cell therapy.</a> Developmental Biology. 339 (2), 280-294 (2010).</li><li>Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behind+an+enteric+neuron+there+may+lie+a+glial+cell.">Behind an enteric neuron there may lie a glial cell.</a> J Clin Invest. 121, 3386-3389 (2011).</li><li>Boesmans, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuron-glia+interactions+in+the+enteric+nervous+system.">Imaging neuron-glia interactions in the enteric nervous system.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

The methodologies described in this manuscript provide a consistent approach to effectively study neurons and enteric glia in the ENS. Although imaging neurons and enteric glia in culture has yielded a wealth of insight into the function of individual cells, studying these cells in their native, multi-cellular environment is crucial for our understanding their physiology and pathophysiology. Fluorescence microscopy is a crucial technique for assessing multidirectional interactions of cells in the ENS. Loading cells of the ENS with selective fluorescent markers and image acquisition with high-resolution microscopy permits quantitative observations of cellular activity in the ENS. Imaging live tissue samples of the ENS is performed relatively quickly and generates large amounts of in-depth functional and spatial data. Mouse myenteric and submucosal plexus preparations used in these experiments allow for molecular and genetic manipulation approaches. Ca2+ imaging in whole-mount preparations provides a useful tool for the assessment of neuron-glia interactions.
In advanced experimental paradigms, several probes can be combined to obtain information about different events within the cells. Fluorescence microscopy can record images with enhanced contrast of specific molecules, if an appropriate fluorescent label is used. Fluo-4 was chosen because it possesses a large dynamic range. Sufficient incubation time is vital when using the AM dyes in ENS. Dye concentration and loading method may need to be adjusted to achieve best results. Ideal preparations should be loaded with sufficient dye to visualize changes in fluorescence but not so much so that the dye chelates the target ions and interferes with intracellular signaling. Exposure to fluorescent light should be limited to prevent phototoxicity in cells and photobleaching of dyes. 
Investigators must be careful with several steps of this experiment, especially solution and tissue preparation. Particular care has to be taken during processing and dissection of ENS tissue in order to maintain cellular functions. The GI tract contains several layers and tissue varieties, which pose challenges for dissection and imaging quality in these whole-mount preparations 27. Furthermore, the interconnecting fiber tracts of the MP are wider and ganglia are larger than those of the SMP 2. The neuronal density of the myenteric plexus is higher compared to that of the submucosal plexus 28. Slow and imprecise dissections will have detrimental effects on the quality of the plexus preparations and thus the overall success of the experiments. Therefore, clean/undamaged tools, practice and manual dexterity are critical to this procedure. 
In whole-mount tissue preparations, careful consideration should be taken when drawing the regions of interest (ROI) to correctly assess the kinetics and degree of observed change in fluorescence intensity of the desired cell type. As the ganglia are located on a contractile muscle layer, motion artifacts caused by gut motility are a primary concern during in situ imaging. Thus, suppressing these motion disturbances through re-pinning tissue preparations after incubation with enzymes and the addition of pharmacological inhibition (nicardipine/scopolamine) to buffers permits clear and reliable image acquisition. Aside from pharmacology and mechanical approaches to prevent tissue movement, recent studies illustrate the application of advanced software methodologies and cell type response characteristics to correct for residual tissue movement in the recordings and improve the accuracy of analysis 29. Barring these technical hurdles, this method provides physiologically relevant conditions to assess morphologic and quantitative characteristics of neurons and enteric glia in the ENS.

מערכת העצבים enteric (ENS) מאורגנת בשני plexuses ganglionated המוטבע בקיר של מערכת עיכול 1. מעגלים עצביים לשריר אלה, מקלעת myenteric (MP) ומקלעת submucosal (SMP), מורכבים מתאי עצב וגליה enteric (איור 1) 2. MP וSMP להסדיר עיכול פונקציות (GI) כגון תנועתיות מעיים וספיגת אפיתל והפרשה, בהתאמה 3. גליה מעיים נמצאות בסמיכות לתאי עצב בתוך הגרעינים אבל אוכלוסיות של גליה enteric גם קיימות בתוך מקשר קטעי סיבים וחלקים נוספים-ganglionic של קיר בטן 3,4. גליה מעיים האמינו במקור כדי לספק תמיכה תזונתית רק לתאי עצב. עם זאת, מחקרים שנערכו לאחרונה מצביעים על כך שנוירון, גליה אינטראקציות חיוניות לENS מתפקד 5,6. לדוגמא, הנתונים מראים כי גליה enteric &quot;להקשיב&quot; לפעילות עצבית 7ולווסת את המעגלים עצביים 6,8, להגן על תאי עצב enteric מלחץ חמצוני 9 והם מסוגלים לייצר תאי עצב חדשים enteric בתגובה לפציעה 10,11. הפרוטוקול המובא בסקירה טכנית זו מספק שיטה פשוטה וחזקה כדי לבחון את יחסי הגומלין המורכבים בין תאי עצב וגליה enteric באמצעות הדמיה Ca 2 + תאית אתרו. Ca 2 + הוא מולקולת איתות בכל מקום בתאים להתרגש וממלא תפקיד חיוני באירועי איתות הסינפטי במערכת העצבים 12. עירור של תאי עצב או גליה enteric מעורר העלאה בריכוז Ca 2 + cytoplasmic או על ידי זרם דרך Ca 2 + ערוצי -permeable או Ca 2 + שחרור מחנויות סידן תוך תאי. ההדמיה Ca 2 + ארעיים בתאי עצב וגליה עם צבעי ניאון הוא הוקם וטכניקה בשימוש נרחבת כדי ללמוד את הארגון ואת הדינמיקה של תפקודיים13-17 ENS. ההדמיה Ca 2 + הוכח להיות כלי חשוב בלימוד קטעי רקמה במערכת העיכול ללא פגע על מנת להבהיר את ההתפשטות של רגישות באמצעות רשתות ICC קוצב לב 18 ושריר חלק במעי 19,20. זה מאפשר לחוקרים לחקור מגוון רחב של פרמטרים פיסיולוגיים ומספק מידע על שתי הפריסה המרחבית שלהם ודינמיקה זמנית. תאים יכולים להיות מוכתמים ביעילות באופן פולשנית ידי שימוש באינדיקטורים ניאון קרום חדיר ופרוטוקולים מכתים מותאמים 21. זה מציע הזדמנות לעקוב אחר מספר גדול של תאי עצב וגליה enteric בהכנות השתמרו תפקודי 14-16,22, כמו גם in vivo 23. הכנות רקמת הר-שלמות הן בתפזורת עמוסה Ca 2 + צבע מחוון גבוהה זיקה כגון Fluo-4, המגבירה הקרינה שלה כאשר חייב Ca 2 +. שינויים בקרינה נרשמים על ידי מצלמת CCD וanaדיגיטלי 6 lyzed. כניסתו של Ca 2 + סיפקה את ההזדמנות כדי לפקח על אינטראקציות תא עצב ותאי גליה, היענות לגירויים שונים, ומעורבותם של סוגי התאים בתהליכי עיכול בזמן אמת. באתר ההדמיה Ca 2 + הניבה תובנה גדולה לתוך מנגנוני האיתות של תאי עצב וגליה enteric ובעל כמה יתרונות ברורים על פני דגמי תרבית תאים 6,24. ראשית, באתר הכנות לשמור על סביבת מטריצת יליד נוירונים וגליה ולהשאיר את חלק הארי של הקשרים שלהם כדי למקד את הרקמה שלמה. שנית, הגנטיקה והמורפולוגיה של גליה enteric בתרבית באופן משמעותי בהשוואה לשינו in vivo 6,24. שלישית, אינטראקציות רבות heterotypic הולכים לאיבוד בתרבית תאים ראשוני וזה מגביל הערכת אינטראקציות תא-תא. למרות שתאים בתרבית מתאימים גם לחקירה של תכונות בסיסיות, usefulness לחקר אינטראקציות מורכבות בין גליה ונוירונים enteric מוגבל. גומלין נוירון, גליה חוקר באמצעות באתר גישה הוא יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית כמסלולים הסינפטי נותרו על כנן 25. בהשוואה לגישות תרבית תאים, בגישה באתר מציע תנאים משופרים לשיטתיים הבנת האינטראקציות המורכבות בין תאי עצב וגליה enteric. יתר על כן, הארגון מישוריים של מקלעת ganglionated בהכנות כל הר הוא אידיאלי עבור הדמיה ניאון של Ca 2 + ארעיים תאיים וטכניקה זו מספקת גישה פשוטה להערכת פעילות נוירון, גליה בENS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="764">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:391px;">Name</td>
			<td style="width:245px;">Company</td>
			<td style="width:128px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">BubbleStop Syringe Heater&#160;</td>
			<td style="width:245px;">AutoMate Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10-4-35-G</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">CaCl2</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">C3306</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Collagenase, Type II, powder</td>
			<td style="width:245px;">Gibco</td>
			<td style="width:128px;">17101-015</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Dispase</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">42613-33-2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Dissection tools</td>
			<td style="width:245px;">Roboz&#160;</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">DMSO</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">D5879</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Fixed-stage microscope</td>
			<td style="width:245px;">Olympus&#160;</td>
			<td style="width:128px;">BX51WI</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Fluo-4 AM dye</td>
			<td style="width:245px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:128px;">F-14201</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Glucose</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">G8270</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Insect pins</td>
			<td style="width:245px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:128px;">Minutien Pins</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">iQ Live Cell Imaging Software</td>
			<td style="width:245px;">Andor</td>
			<td style="width:128px;">Andor iQ3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">KCl</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">P3911</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">MgCl2</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">M9272</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">NaCl</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">S9888</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">S8282</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">S6014</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Neo sCMOS camera</td>
			<td style="width:245px;">Andor</td>
			<td style="width:128px;">Neo 5.5 sCMOS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Nicardipine</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">N7510</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Perfusion chamber</td>
			<td style="width:245px;">Custom</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:245px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:128px;">Model 720</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Pluronic F-127&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:128px;">P3000MP</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Probenecid</td>
			<td style="width:245px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:128px;">P36400</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Scopolamine</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">S1013&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Sutter Lambda DG-4</td>
			<td style="width:245px;">Sutter</td>
			<td style="width:128px;">DG-4</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Sylgard&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:128px;">184</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Temperature Controller</td>
			<td style="width:245px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:128px;">TC-344C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ ca2+ imaging of the enteric nervous system

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

שימוש נכון בטכניקה זו מאפשרת לחוקרים למדוד במדויק Ca 2 + i תאית ארעיים [Ca 2 +] בנוירונים enteric וגליה בכל הר הכנות רקמות. דוגמא מייצגת של 2 + תגובות Ca העורר אגוניסט בגליה בתוך הגנגליון myenteric מהמעי גס העכבר מוצגת בוידאו 1. התוצאות הבאות נועדו כדי להמחיש כמה תוצאות נציג השגנו בשיטה זו. ראשית, איור 2 מדגים את התוצאות של ניסוי מדידת גליה enteric [Ca 2 +] i שינויים בתגובה לגירוי על ידי ATP בהכנות שפן ניסיונות הגס מקלעת שריר myenteric אורכית (LMMP). באופן ספציפי, נתון זה מראה את השיטה לניתוח נכון של פרוטוקול הניסוי המפורט לעיל כולל את קווי המתאר של גנגליון myenteric ניתח וכוכביות מציין את המיקום של נוירונים enteric. תוצאות אלו גם illustrate המינון האופטימלי של ה- ATP מאה מייקרו על הגיוס של חזיר ים אני בגליה myenteric [Ca 2 +]. תגובה זו יכולה לשמש כדי לכייל את גירוי גליה enteric ולנרמל את התגובות לגירויים לבדוק. בשלב הבא, איור 3 מבהיר כיצד לבחור כראוי אזורים של העניין (ROIs) המקיף את תאי גליה, מוצג עם סובבי עיגולים צהובים. תוצאות אלו מראות גם הרצויות שינויי הקרינה בתנאים בסיסיים ובתגובה לגירויים תרופתיים. לבסוף, איור 4 מדגים את השיקולים מרחביים לבחירת גליה ונוירונים enteric לi תגובות [2 + Ca] בהכנות כל הר. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig1highres.jpg" /> איור 1. ארגון של ENS. ENS מכיל שני plexuses ganglionated גדול. מקלעת myenteric ממוקמת בין lשכבות שרירים ongitudinal ומעגליות. מקלעת submucosal ממוקמת בין הרירית ושכבת השריר המעגלית. ENS מורכב אך ורק של תאי עצב וגליה enteric. שטחי סיבי עצב להתחבר הגרעינים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52506/52506fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig2highres.jpg" /> איור 2. גליה מעיים במגיבים מקלעת myenteric המעי הגס שפן הניסיונות לATP באתר. Fluo-4 הקרינה בגנגליון myenteric (א) (שתואר על ידי קו מקווקו) בתנאים בסיסיים. חיצים מצביעים על קטעי סיבי interganglionic עבים. (ב) על הגירוי עם ATP / L 100 μmol, תאי גלייה, אבל לא תאי עצב, להגדיל במהירות Fluo-4 הקרינה המצביעה על עלייה ב[ Ca 2 +] <sUB&gt; i. שים לב שתאים מגיבים הם קטנים ומקיפים את הנוירונים גדולים בהרבה (חללים אפלים שסומנו על ידי כוכביות). גליה מעיים (C) להגיב לATP באופן תלוי-מינון עם mmol 1 / L לעורר תגובות מקסימליים 24. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52506/52506fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig3highres.jpg" /> איור 3. Murine S-100-GFP תאים + במגיב מקלעת myenteric המעי הגס לATP באתר. () S-100-GFP + תאי גליה (ירוקה) בגנגליון myenteric מעי הגס עכבר (שתואר על ידי קו מקווקו). שישה אזורים של עניין (ROIs) המקיף את תאי גליה בתוך הגרעינים מוצגים כעיגולים צהובים. חצים מצביעים על קטעי סיבים עבים המובילים לגנגליון. ד כוכביותמיקום enote של 2 נוירונים enteric. אותו גנגליון מראה Rhod-2 הקרינה בתנאים בסיסיים (B). (ג) בעקבות גירוי עם ATP / L 100 μmol, תאי גלייה להגיב בגדלו [Ca 2 +] i, כפי שמוצגת על ידי Rhod- המוגבר 2 הקרינה. (ד) עקבות המתאימות לכל אחד את ההחזר על ההשקעה שמוצגת ב- C. (E) בממוצע תגובה (ממוצע ± SEM) של ROIs 6 הראתה ב -24 D. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52506/52506fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig4highres.jpg" /> איור 4. בהדמיה באתרו של תקשורת נוירון לגליה enteric. (א) נציג תמונות (pseudocolored) מניסוי הדמיה Ca 2 + שבו כל הרהכנת מקלעת myenteric אותגרה עם אגוניסט העצבי קולט P2X7 BzATP (100 מיקרומטר, 30 שניות). שים לב שאגוניסט העצבי גורם לעלייה בקרינת Fluo4 בנוירון (א &#39;) לפני התאים המקיפים את מעי גליה (&quot;). (ב) ניתוח השינוי בקרינה לאורך זמן בגליה (הכחול) ותאי עצב (אדום ) לאחר יישום של אגוניסט העצבי, BzATP. (C) העצבית ותגובות גליה לBzATP במאגר רגיל (קווים מוצקים) ובמאגר המכיל Ca 2 + הנמוך וMg 2 + (קווים מקווקווים) להגברת קולטנים עצביים P2X7 13. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52506/52506fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> וידאו 1. תגובת Ca 2 + עורר אגוניסט בגליה enteric באתרם. סרט זה מראה גנגליון myenteric מהמעי גס דיסטלי העכבר עמוס צבע המחוון 2 + Ca, Fluo-4. אגוניסט תא גליה, ADP, מתווסף לאמבטיה כאשר הצביעו. ADP מעורר עלייה בCa 2 + תאיים בגליה enteric כפי שנצפה על ידי ההעלאה החולפת בFluo-4 הקרינה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52506/JOVE.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System at JoVE.com

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

בהדמיה 2 + Ca Situ של מערכת העצבים המעיים

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

in-situ-ca2-imaging-of-the-enteric-nervous-system

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

17.1K Views.  Michigan State University. The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging. 

Video: In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, the olfactory bulb (OB), the dorsal motor nucleus of the vagus (DMV)3, the intermediolateral nucleus of the spinal cord 4 and the substantia nigra, providing the basis for the neuropathological staging of the disease4,5. The ENS and the OB are the most exposed nervous structures and the first ones to be affected. Interestingly, PD has been related to pesticide exposure6-8. Here we show in detail two methods used in our previous study 9. In order to analyze the effects of rotenone acting locally on the ENS, we administered rotenone using a gavage to one-year old C57/BL6 mice. Rotenone is a widely used pesticide that strongly inhibits mitochondrial Complex I 10. It is highly lipophylic and poorly absorbed in the gastrointestinal tract 11. Our results showed that the administration of 5 mg/kg of rotenone did not inhibit mitochondrial Complex I activity in the muscle or the brain. Thus, suggesting that using our administration method rotenone did not cross the hepatoportal system and was acting solely on the ENS. Here we show a method to administer pesticides using a gavage and the image analysis protocol used to analyze the effects of the pesticide in alpha-synuclein accumulation in the ENS. The first part shows a method that allows intragastric administration of pesticides (rotenone) at a desired precise concentration. The second method shows a semi-automatic image analysis protocol to analyze alpha-synuclein accumulation in the ENS using an image analysis software.

Parkinson's disease has been related to the exposure to pesticides. Here we show a method to deliver pesticides using a gastric tube at the desired concentration and a method to analyze their effect in alpha-synuclein accumulation in the enteric nervous system.

אוראלית של Rotenone באמצעות Gavage וניתוח מקדימה של Alpha-synuclein תכלילים במערכת העצבים enteric

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

ויזואליזציה של מערכת העצבים כולה עובריים-Mount תסיסנית עוברים

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Multimodal הדמיה של השתלת תא גזע במערכת העצבים המרכזית של עכברים

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

תיוג של תאים בודדים במערכת העצבים המרכזית של<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

משלוח תוך חדרי ישיר של תרופות למערכת העצבים המרכזית מכרסם

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

בoptogenetic גירוי vivo של מערכת העצבים המרכזית מכרסם

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

ההדמיה Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamics בסופי קון קולטי האור אקסון של רשתית העכבר

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

סליקה אופטית של מערכת העצבים המרכזית עכבר שימוש CLARITY הפסיבי

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its highly-organized subcellular architecture, we recently developed a new imaging modality, named spectral reflectometry (SpeRe), which enables unprecedented label-free nanoscale imaging of the live myelinated axons in situ. The underlying principle is to obtain nanostructural information by analyzing the reflectance spectrum of the multilayered subcellular structure. In this article, we describe a detailed step-by-step protocol for performing a basic SpeRe imaging of the nervous tissues using a commercial confocal microscopic system, equipped with a white-light laser and a tunable filter. We cover the procedures of sample preparation, acquisition of spectral data, and image processing for obtaining nanostructural information.

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Here, we present a step-by-step protocol for imaging myelinated axons in a fixed brain slice using a label-free nanoscale imaging technique based on spectral reflectometry.