The authors thank Colleen Van Kirk for mouse retina and cerebellum samples, and Peter Gregory for figure generation. The authors also thank Dr. Allison Gillaspy and the Laboratory for Molecular Biology and Cytometry Research core for access to the MiSeq. This work was supported by NIH grants DA029405, EY021716, and AG026607 and the Donald W. Reynolds Foundation.

<ol>
	<li>Hotchkiss, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantitative+separation+of+purines,+pyrimidines,+and+nucleosides+by+paper+chromatography.">The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography.</a> The Journal of Biological Chemistry. 175 (1), 315-332 (1948).</li><li>Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+patterns+and+epigenetic+memory.">DNA methylation patterns and epigenetic memory.</a> Genes &amp; Development. 16 (1), 6-21 (2002).</li><li>Smith, Z. D., Meissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation:+roles+in+mammalian+development.">DNA methylation: roles in mammalian development.</a> Nature reviews. Genetics. 14 (3), 204-220 (2013).</li><li>Heard, E., Martienssen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenerational+epigenetic+inheritance:+myths+and+mechanisms.">Transgenerational epigenetic inheritance: myths and mechanisms.</a> Cell. 157 (1), 95-109 (2014).</li><li>Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+gene+silencing+in+cancer.">DNA methylation and gene silencing in cancer.</a> Nature Clinical Practice. Oncology. 2, S4-S11 (2005).</li><li>Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+epigenome:+its+origins,+contributions+to+tumorigenesis,+and+translational+implications.">The cancer epigenome: its origins, contributions to tumorigenesis, and translational implications.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 9 (2), 64-65 (2012).</li><li>Beck, S., Rakyan, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methylome:+approaches+for+global+DNA+methylation+profiling.">The methylome: approaches for global DNA methylation profiling.</a> Trends in Genetics : TIG. 24 (5), 231-237 (2008).</li><li>Laird, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+challenges+of+genomewide+DNA+methylation+analysis.">Principles and challenges of genomewide DNA methylation analysis.</a> Nature reviews. Genetics. 11 (3), 191-203 (2010).</li><li>Mikeska, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+quantitative+MGMT+promoter+methylation+analysis+using+pyrosequencing+and+combined+bisulfite+restriction+analysis.">Optimization of quantitative MGMT promoter methylation analysis using pyrosequencing and combined bisulfite restriction analysis.</a> The Journal of Molecular Diagnostics : JMD. 9 (3), 368-381 (2007).</li><li>Kreutz, M., Hochstein, N., Kaiser, J., Narz, F., Peist, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+powerful+and+quantitative+sequencing+technology.+Current+Protocols+In.">Pyrosequencing: powerful and quantitative sequencing technology. Current Protocols In.</a> Molecular Biology / edited by Frederick M. Ausubel ... [et al.]. 104 (Unit 7 15), (2013).</li><li>Dikow, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+methylation+status+of+the+PWS/AS+imprinted+region:+comparison+of+two+approaches+based+on+bisulfite+sequencing+and+methylation-sensitive+MLPA.">Quantification of the methylation status of the PWS/AS imprinted region: comparison of two approaches based on bisulfite sequencing and methylation-sensitive MLPA.</a> Molecular And Cellular Probes. 21 (3), 208-215 (2007).</li><li>Parrish, R. R., Day, J. J., Lubin, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+bisulfite+sequencing+for+examination+of+DNA+methylation+with+gene+and+nucleotide+resolution+from+brain+tissues.">Direct bisulfite sequencing for examination of DNA methylation with gene and nucleotide resolution from brain tissues.</a> Current Protocols In Neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley ... [et al.]. 7 (Unit 7 24), (2012).</li><li>Shapiro, R., Servis, R. E., Welcher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactions+of+uracil+and+cytosine+derivatives+with+sodium+bisulfite.+A+specific+deamination+method.">Reactions of uracil and cytosine derivatives with sodium bisulfite. A specific deamination method.</a> Journal of the American Chemical Society. 92, 422-424 (1970).</li><li>Hayatsu, H., Wataya, Y., Kazushige, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+addition+of+sodium+bisulfite+to+uracil+and+to+cytosine.">The addition of sodium bisulfite to uracil and to cytosine.</a> Journal of the American Chemical Society. 92 (3), 724-726 (1970).</li><li>Wang, R. Y., Gehrke, C. W., Ehrlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+bisulfite+modification+of+5-methyldeoxycytidine+and+deoxycytidine+residues.">Comparison of bisulfite modification of 5-methyldeoxycytidine and deoxycytidine residues.</a> Nucleic Acids Research. 8 (20), 4777-4790 (1980).</li><li>Masser, D. R., Berg, A. S., Focused Freeman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high+accuracy+5-methylcytosine+quantitation+with+base+resolution+by+benchtop+next-generation+sequencing.">high accuracy 5-methylcytosine quantitation with base resolution by benchtop next-generation sequencing.</a> Epigenetics &amp; Chromatin. 6 (1), 33 (2013).</li><li>Caruccio, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+next-generation+sequencing+libraries+using+Nextera+technology:+simultaneous+DNA+fragmentation+and+adaptor+tagging+by+in+vitro+transposition.">Preparation of next-generation sequencing libraries using Nextera technology: simultaneous DNA fragmentation and adaptor tagging by in vitro transposition.</a> Methods in Molecular Biology. 733, 241-255 (2011).</li><li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms:+comparison+of+Ion+Torrent,+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers.">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13, 341 (2012).</li><li>Adey, A., Shendure, J. U. l. t. r. a. -. l. o. w. -. i. n. p. u. t. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tagmentation-based+whole-genome+bisulfite+sequencing.">tagmentation-based whole-genome bisulfite sequencing.</a> Genome Research. 22 (6), 1139-1143 (2012).</li><li>Smallwood, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome-wide+bisulfite+sequencing+for+assessing+epigenetic+heterogeneity.">Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity.</a> Nature Methods. 11 (8), 817-820 (2014).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+endogenous+gene+controls+for+bisulphite+conversion+in+analysis+of+plant+DNA+methylation.">Universal endogenous gene controls for bisulphite conversion in analysis of plant DNA methylation.</a> Plant Methods. 7, 39 (2011).</li><li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences.">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).</li><li>Ivanov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-solution+hybrid+capture+of+bisulfite-converted+DNA+for+targeted+bisulfite+sequencing+of+174+ADME+genes.">In-solution hybrid capture of bisulfite-converted DNA for targeted bisulfite sequencing of 174 ADME genes.</a> Nucleic Acids Research. 41 (6), e72 (2013).</li><li>Booth, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+bisulfite+sequencing+of+5-methylcytosine+and+5-hydroxymethylcytosine.">Oxidative bisulfite sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Protocols. 8 (10), 1841-1851 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

BSAS מאפשר להתמקד quantitation, מתילציה DNA מדויק עם יכולות תפוקה גבוהות בשני מספר הדגימות ומספר המטרות. בנוסף, דור ספרייה זו באמצעות tagmentation תיווך transposome דורש DNA קלט פחות, הוא מהיר יותר ומכיל פחות שלבים מאשר גז מסורתי וטכניקות קשירת מתאם שלאחר מכן. שיפורים אלה על פני שיטות קיימות מאפשרים ניתוח מתילציה DNA מדויק ברמת בסיס של כל מטרה של עניין. יתר על כן, BSAS מספק שיטה חדשה לאישור של אזורים של עניין (אזורי מתילציה באופן דיפרנציאלי (DMRS), איי CPG, אזורי רגולטורים) שזוהו באמצעות הגנום כולו 22 או 23 ללכוד גישות bisulfite. תוך שימוש בגישות המאונכות אישור ויותר כמותית שיטות מדויקות משפרת את הקשיחות אנליטי של מחקרי epigenomic. עומק הקריאה הגבוה שהושג עם BSAS מאפשר quantitation מדויק במרווח ביטחון צר, מחדשsulting בquantitation המדויק 16. בנוסף, את היכולת להפעיל דגימות רבות בניסוי אחד יכולה להגדיל את גודל המדגם לאישורים של שיטות הגנום כולו, אשר יגדילו את הכח הסטטיסטי; חולשה של מחקרים רבים אפיגנטיים הנוכחיים. חשוב לציין, BSAS מספק quantitation מתילציה CPG בסיס ספציפי, המאפשר לדור של השערות הניתנות לבדיקה למחקר אפיגנטיים. השערות כגון מתילציה עלתה באלמנט תגובה ספציפי תוביל לירידה בכריכה של גורם שעתוק ספציפי. BSAS, בשילוב עם נתונים ביטוי mRNA לזווג, מספק שיטה להשגת שתי רגולציה אפיגנטיים וביטוי mRNA בתוך פיסת רקמה או אוכלוסיית תא בודדת. מדידות מותאמים של רגולציה וביטוי גם להגדיל את הקשיחות ואת ההשפעה של הממצאים המדעיים. צעדים קריטיים בפרוטוקול BSAS כוללים עיצוב פריימר, amplicon אופטימיזציה, ודור ספרייה /QC. ההטיה PCR הוא הציג אם פריימרים אינם מתוכננים כראוי ולהגביר את יעילות בשונה 8. שימוש בסטנדרטים מתילציה, כגון תקני ציטוזין 100% ו 0% שנוצרו אנזימים מפוגלים, ניתן להשתמש כדי לקבוע את המידה, אם בכלל, של ההטיה quantitation מתילציה, ושליטה מתודולוגיים נכונה כאשר כימותי מתילציה 16. בדומה לכך, יש לנקוט בזהירות בעת ביצוע אופטימיזציה לתגובות PCR ליצירת amplicon באיכות גבוהה יחיד. אם לא amplicon נוכחת באמצעות ההנחיות הציעו מפורטות בפרוטוקול, צעדי אופטימיזציה כוללים מספר גדל והולך PCR מחזור או סכום קלט bsDNA. אם יש מוצרי PCR מרובים, כוללים פריימר-הדימרים, צעדי אופטימיזציה כוללים הפחתת כמות קלט bsDNA, הפחתת ריכוזי קלט הטוחנות פריימר PCR, עלייה בטמפרטורות חישול, או להקטין את מספר מחזור PCR. אחד או שילוב של נהלי אופטימיזציה אלה מניב תוצאות מספקות כדי ליצור HIG אחתamplicon h-איכות. לחלופין, עיצוב מחדש של פריימרים הוא גישה טובה לקבוצות פריימר שלא להניב amplicon יחידה. לאלו אזורים שבם העיצוב מחדש אינו מתאים או אפשרי, מנוון סטי פריימר כולל שניהם עלול של ציטוזין והטימין של באתרי CPG בפריימרים קדימה ואדנין של וגואנין של באתרי CPG בפריימרים הפוכים לעבוד. עם זאת, ערכות פריימר אלה צריכים אופטימיזציה נוספת כדי להבטיח שאין PCR הטיה מתרחשת, תהליך מחוץ להיקף של פרוטוקול זה. ספריות איכות הן חשובות ביותר להצלחה. ודא שאמצעי QC מתבצעים כדי לקבוע את הגודל, איכות וכמות של ספריות לפני הרצף. תגובות רצף נוטות לכישלון עם קלט של ספריות באיכות נמוכה. הטיה בquantitation מתילציה ניתן למתן על ידי הבטחה כי תדרי מתילציה נמצאים בשני קדימה לאחור רצף קורא. בנוסף, ציוני איכות של בסיסי יישור לאתרי CPG צריכים להיות ≥Q30 גבוה שיתוףnfidence בquantitation. בעוד שאחרים הראו מעט קודם לכן לשום הטיה בתגובות tagmentation של DNA המרה bisulfite 19, להבטיח את המדדים שתוארו לעיל מאפשר לאישור quantitation מתילציה ההטיה הנמוך. BSAS מודד כיום מתילציה באתרי CPG, לעומת זאת, הרחבות עתידיות של שיטה זו תאפשר מדידות מזווגות של CPG 5-HMC עם התוספת של צעדים ניסיוניים הבחנה בין 5-MC ו-5- HMC כגון החדרת perruthenate אשלגן לפני המרת bisulfite 24. זה יגביר את ההשפעה של שירות BSAS כך שהוא מאפשר למתילציה לזווג, שני 5-MC ו-5- HMC, ונתונים ביטוי על מנת לקבוע תפקידי רגולציה של ביטוי גני מתילציה DNA. הכנת ספריית תיווך Transposome של amplicons PCR אין לגרום לעומק רצף ירידה בקצוות של אזורים מוגברים. לכן, אזורים של ריבית גבוהה צריכים להיות מתוכננים לישיבה באמצע amplicons. איךאי פעם, כי BSAS יוצר רצף לקרוא מעמקי&gt; 1000 X, דיוק כמותי של 5-MC מדידות ליד הקצוות של אזורים מוגברים נותרים גבוהות.

זה כבר יותר ממחצית המאה מאז הדו&quot;ח הראשון של מתרחש באופן טבעי שינויי DNA בצורה של מתילציה ציטוזין 1. מתילציה ציטוזין היא בסיס נוקלאוטיד ציטוזין שונה בי פחמן 5 th על טבעת הבסיס יש קבוצה מתיל (5-MC), שכיחה ביותר במוטיב dinucleotide CPG בגנומים של יונקים. הנוכחות הפונקציונלית של 5-MC ביזמי גן מזוהית בדרך כלל עם דיכוי תעתיק, ואילו ההעדר קשור פעילות תעתיק 2. התקדמות עצומה נעשתה בהבנה של תפקיד המתילציה של הדנ&quot;א בפיתוח 3, התפשטות transgeneration פרופילים אפיגנטיים 4, פתוגנזה סרטן 5,6, ומספר תחומי מחקר האחרים שלנו. רבים מפיתוחים אלו הגיעו בשנים האחרונות כמתודולוגיות חדשות פותחו לפרופיל מתילציה DNA 7. עם כניסתו ופופולריזציה של טכניקות של הדור הבא רצף (NGS) יש כיום מספר השיטות לפרופיל מתילציה DNA על פני הגנום כולו או אזורים גדולים של הגנום 8. גישות אלו פותחות את האפשרות של לימודי גילוי שלכמת דפוסי מתילציה DNA והבדלים במתילציה DNA. בנוסף לגישות השערת מניבה אלה, יש צורך משמעותי לשיטות לכמת מתילציה DNA בדיקות ממוקדות / השערה. Pyrosequencing, PCR הספציפי מתילציה, וסנגר רצף ישיר של ה- DNA המרה bisulfite היה השיטות הנפוצות ביותר לניתוח של אזורים ממוקדים (כלומר, אזור אמרגן של גן יחיד או אי CPG) 9-12. כל השיטות האלה מסתמכים על המרת bisulfite, תגובה כימית שבי דיאמינציה ציטוזין unmethylated של מומרות לאורציל של, בעוד ציטוזין מפוגל של להישאר 13,14 ללא פגע. ההגברה PCR של bisulfite-תוצאות המרה DNA בהחלפת אורציל של עם תימין 15 מאפשרות מתילציה ההפרש לקרוא את דרכו כהבדל בסיס. אמנם שימושי מאוד, המגבלות לשיטות אלה כוללות דיוק נמוך כמותי, אורך קריאה קצר, ותפוקת מדגם נמוכה. כדי לתת מענה למגבלות אלה פיתחנו שיטה שכינינו Bisulfite Amplicon רצף (BSAS) 16. מטרתה של שיטה זו היא להיות מסוגלת לנתח אזורים הגנומי היעד של עניין במספר גדול של דגימות עם דיוק כמותית גבוה. BSAS משתמש באלמנטים של שיטות קיימות (המרה bisulfite והגברת PCR ספציפית לאזור) ומשלב אותם עם בנייה פשוטה של הדור הבא ספרייה (בתיווך transposome) 17 וbenchtop NGS 18 (איור 1). גישה זו מספקת לשיטת תפוקה יותר גבוהה כמותי ולבחון את מתילציה ציטוזין בכל אזור של עניין. כאן אנו מציגים אתשיטה בפירוט ותיאור גישות לפתרון בעיות ובדיקת איכות תהליך BSAS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="840">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:304px;">Name</td>
			<td style="width:255px;">Company</td>
			<td style="width:97px;">Cat #</td>
			<td style="width:185px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent 2100 Bioanlyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G29393AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent RNA 6000 Nano kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent High Sensitivity DNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Typhoon 9200</td>
			<td>Amersham/GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agencourt AMPure XP - PCR Purification</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>164-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">twin.tech PCR plate 96&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951020362</td>
			<td>semi-skirted</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heatsealing Film</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030127838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heatsealing Foil</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030127854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat Sealer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5390000.024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.1-10ul Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030073.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-200ul Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030073.045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50-1000ul Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030073.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MixMate&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5353000.014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030121.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424000.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2.0 mL Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nextera XT DNA Sample Preparation Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td>24 rxn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nextera XT Index Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1001</td>
			<td>24 indexes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MiSeq Desktop Sequencer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MiSeq Reagent Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-2002</td>
			<td>300cycle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK4824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ProFlex 96-well PCR system</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4484075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Novex 6% TBE DNA gel</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EC6261BOX</td>
			<td>10-well</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Novex TBE Running Buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC6675</td>
			<td>5X (1 L)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Novex Hi-Density TBE Sample Buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC6678</td>
			<td>5X (10 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10787-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xcell SureLock Mini-Cell</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UltraPure 10mg/mL Ethidium Bromide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15585-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">7900HT Fast Real-Time PCR system</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4329001</td>
			<td>384well block</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DynaMag-96 Side Skirted</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices/VWR</td>
			<td>89429-532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stainless Steel Beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td>5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CLC Genomics Workbench</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>Software for methylation pipeline</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAQuick PCR Purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>50 rxn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TissueLyser II</td>
			<td>Retsch/Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TRIS hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PHG0002-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">384-well Full-Skirted Plate, Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-1384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Absolute qPCR Seal</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EZ DNA Methylation-Lightning kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5030</td>
			<td>50 rxn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZymoTaq DNA Polymerase</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>E2001</td>
			<td>50 rxn</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted dna methylation analysis by next-generation sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

BSAS קורא מיושר כהלכה לרצף התייחסות המומר יהיה דומה איור 5. ניתן לזהות בבירור dinucleotides CPG וניתן לאמוד במדינות מתילציה על ידי התבוננות שיחות בסיס באתרי CPG בממופה קורא. לדוגמא, עם פקדי מתילציה, 0 מתילציה% תגרום לכל קורא ממופה לאתרים המכילים CPG (איור 5 א) של טי. בקרות מתילציה 100% יגרמו לכל קורא ממופה קוראת לאתרים המכילים CPG של C (איור 5). לכמת את תדירות ציטוזין (C / C + T) באתרי CPG מניב את תדירות מתילציה במדגם המקורי. עקומה סטנדרטי נציג המופקת מבקרות כל מתילציה הגנום (n = 3 / יחס מתילציה) מראה הליניאריות של quantitation מתילציה, כמו גם דיוק בquantitation בכל יחס מתילציה (איור 6). כדוגמא לשיטה זו בסך הכל, RNA ו- DNA היו שיתוף iso<html> קשורות זו לזו מהמוח הקטן עכבר ורשתית (n = 4 / קבוצה). ביטוי רודופסין, הביע באופן סלקטיבי ברקמת רשתית, נמדד באמצעות qPCR. ביטוי זוהה רק ברשתית (איור 7 א). באמצעות BSAS, רמות מתילציה CPG היו לכמת באזור אמרגן רודופסין. רמות מתילציה מצטברות ברחבי אזור האמרגן היו&gt; 80% במוח הקטן בהשוואה ל&lt; 15% ברשתית (p &lt;0.001, t-test פרמטרית) (איור 7). יתרונות BSAS quantitation מתילציה מquantitation מתילציה ספציפי לאתר, ורמות מתילציה ניתן להשוות על בסיס CPG ספציפי על פני כל אזור גנומי נתון. רמות מתילציה CPG פני אמרגן רודופסין היו גבוהות יותר משמעותי בדגימות המוח הקטן בהשוואה לדגימות רשתית (p &lt;0.001, t-test פרמטרית בכל אתר CPG) (איור 7 ג). 1highres.jpg &quot;/&gt; איור 1:. סכמטי של שיטת BSAS בשיטה זו, הדנ&quot;א הגנומי הוא bisulfite המרה לשנות cytosines unmethylation לuracils. בהמשך לכך, במהלך PCR uracils אלה השתנו לthymines. PCR הגברה מכוונת נגד אזורים של עניין ומעשירה מאוד עבור רק רצפים אלה. Amplicons PCR כתוצאה מכך הם הפכו לספריות צמודות כפולים בתהליך tagmentation פשוט. בהמשך לכך ספריות רצף ברצף הדור הבא benchtop ורצף כניסות ממופים למתילציה בסיליקון והמיר רצף התייחסות ואחוזים של ציטוזין של נקבע באופן ספציפי לבסיס. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig2highres.jpg" /> איור 2:. בהמרת bisulfite סיליקון ושל האזור של עניין כל אזור של עניין מכל התייחסות הגנומי יכול להיות אין תמיכה בבחירהטד בהמרת bisulfite סיליקון. cytosines ללא CPG מוחלף בתימין של ברצף ההתייחסות. cytosines CPG להישאר cytosines בbisulfite המיר התייחסות. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig3highres.jpg" /> איור 3:. פריימרים מיקום פריימר Bisulfite PCR נועדו נגד בbisulfite סיליקון והמיר רצף התייחסות. Primers הוא להיות מתוכנן כך שהם אינם חופפים dinucleotides CG או תוכנן בסמוך לdinucleotides CG. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig4highres.jpg" /> איור 4: דוגמאות לamplicons PCR באיכות הגבוהה ועניה וספריות רצף עקבות electropherogram נציג ותכנית ג&#39;ל () amplicon האידיאלית עבור דור ספרייה בתיווך transposome עם אחד גבוה.<html> מוצר ריכוז. הספרייה (B) שהופקה מamplicon זה מראה ריכוז גבוה ואפילו הפצת גודל. amplicons PCR (C) מאיכות ירודה, יכולה להיות נמוכה בגודל, ריכוז, ומכיל מספר רב של מוצרים ו / או הדימרים פריימר. amplicons האיכות הירודה אלה תוביל ל( D) נכשלה דור ספרייה עם ריכוז נמוך והתפלגות גודל נמוכה. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig5highres.jpg" /> איור 5: דוגמאות לפלטי רצף מפקדי מתילציה. (א) בסיליקון והמיר רצף התייחסות עם אתרי CPG מסומן באדום. 0% שליטת מתילציה ממופות קוראת לthymines נבחר האזור מראה (שיא תאוות בצע) מיפוי באתרי CPG. שליטת מתילציה 100% (B) הממופה קוראת להראות המיפוי של ציטוזין (גולת כותרת הכחולה) באתרי CPG. together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig6highres.jpg" /> איור 6:. Quantitation מתילציה על פני מגוון של בקרות מתילציה בקרות מתילציה הגנום כולו מעורבות ביחסי מתילציה (n = 3 / יחס) בין 0% ל 100% היו לכמת באמצעות BSAS. זומם לכמת צפוי לעומת לכמת מדגים הליניאריות של quantitation שליטת מתילציה. בכל הפקדים, היה דיוק גבוה בquantitation מתילציה. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig7highres.jpg" /> איור 7: דוגמא לניתוח מתילציה DNA וביטוי גנים לזווג מדגימות רקמה. מתילציה אמרגן הממוצעת Rhodopsin לכמת ידי BSAS בין המוח הקטן וDNA רשתית (*** p &lt;0.001, t-test פרמטרית) ביטוי mRNA היחסי Rhodopsin מהמוח קטן עכבר ורקמת רשתית (). (ב). &lt;רמות strong&gt; C ספציפי לאתר CPG) מתילציה פני אמרגן רודופסין (-244 +6, ביחס לאתר תחילת שעתוק [TSS]) במוח קטן עכבר וDNA הרשתית.

Watch this Scientific Journal Video about Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing at JoVE.com

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

ממוקד DNA מתילציה ניתוח על ידי רצף של הדור הבא

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

targeted-dna-methylation-analysis-by-next-generation-sequencing

Research

JoVE Journal

Biology

36.9K Views.  University of Oklahoma College of Medicine. Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

Video: Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

קביעת מתילציה DNA של גנים מוטבעים ארבידופסיס האנדוספרם

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

מתילציה DNA: Bisulphite שינוי וניתוח

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

פלואורסצנטי, מיקרוסקופ הקרנת ואת הדור הבא הרצף: כלים שימושיים לזיהוי גנים המעורבים אברון Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

רצף של הדור הבא של 16S ריבוזומלי amplicons ג&#39;ין RNA

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine methylation patterns in cells. Reduced representation of whole genome bisulfite sequencing was developed to detect quantitative base pair resolution cytosine methylation patterns at GC-rich genomic loci. This is accomplished by combining the use of a restriction enzyme followed by bisulfite conversion. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing (ERRBS) increases the biologically relevant genomic loci covered and has been used to profile cytosine methylation in DNA from human, mouse and other organisms. ERRBS initiates with restriction enzyme digestion of DNA to generate low molecular weight fragments for use in library preparation. These fragments are subjected to standard library construction for next generation sequencing. Bisulfite conversion of unmethylated cytosines prior to the final amplification step allows for quantitative base resolution of cytosine methylation levels in covered genomic loci. The protocol can be completed within four days. Despite low complexity in the first three bases sequenced, ERRBS libraries yield high quality data when using a designated sequencing control lane. Mapping and bioinformatics analysis is then performed and yields data that can be easily integrated with a variety of genome-wide platforms. ERRBS can utilize small input material quantities making it feasible to process human clinical samples and applicable in a range of research applications. The video produced demonstrates critical steps of the ERRBS protocol.

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

משופר מופחת ייצוג Bisulfite רצף להערכה של DNA מתילציה ברזולוציה בסיסי זוג

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

ניתוח Glucocorticoid צואה: לא פולשני ניטור הכליה ב Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DamID-seq: מיפוי הגנום של אינטראקציות החלבון-DNA על ידי תפוקה גבוהה רצף של קטעי DNA-מפוגל אדנין

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

ממוקד RNA רצף Assay לאפיון ביטוי גנים ושינויים הגנום

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to poorly folding proteins or random open reading frames. We have developed a strategy where, by using TEM-1 &#946;-lactamase (the enzyme conferring ampicillin resistance) on a genomic scale, we can select collections of correctly folded protein domains from the coding portion of the DNA of any intronless genome. The protein fragments obtained by this approach, the so called &#34;domainome&#34;, will be well expressed and soluble, making them suitable for structural/functional studies.
By cloning and displaying the &#34;domainome&#34; directly in a phage display system, we have showed that it is possible to select specific protein domains with the desired binding properties (e.g., to other proteins or to antibodies), thus providing essential experimental information for gene annotation or antigen identification.
The identification of the most enriched clones in a selected polyclonal population can be achieved by using novel next-generation sequencing technologies (NGS). For these reasons, we introduce deep sequencing analysis of the library itself and the selection outputs to provide complete information on diversity, abundance and precise mapping of each of the selected fragment. The protocols presented here show the key steps for library construction, characterization, and validation.

The protocols described allow the construction, characterization and selection (against the target of choice) of a &#34;domainome&#34; library made from any DNA source. This is achieved by a research pipeline that combines different technologies: phage display, a folding reporter and next generation sequencing with a web tool for data analysis.

Interactome-Seq: פרוטוקול עבור ספריית Domainome ובניה, אימות בחירה Phage התצוגה ורצף הדור הבא

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...