אנו מודים למעבדת הקושי הזה כולו לדיונים מועילים. אנו מודים לפטי Jansma ואוניברסיטת אריזונה Neuroscience המחלקה לייעוץ ועזרתי בהדמיה. אנו מודים גם למעבדה Porreca לשימוש Vibratome. מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי האמריקאי לבריאות (NIH NS065116, AAK).

הערה: עכברים גדלו ומתוחזק במבוקר חדר טמפרטורה ולחות עם 12 שעות התהפכו מחזורי אור / חושך עם אוכל וכרצונך מודעה זמין מים באוניברסיטת אריזונה. ניסויים נערכו בהתאם להנחיות ואישור ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של אוניברסיטת אריזונה. כל המאמצים שנעשו כדי למזער את הסבל. עכברי Cre-הכתב הם על C57BL / 6 רקע 11 והם זמינים באופן מסחרי. 1. זיהום עכבר הערה: השיטה של זיהום עכבר עם gondii Toxoplasma המתואר להלן נעשתה שימוש במחקרים שפורסמו בעבר 10 - 12. <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול זני Toxoplasma בבני עורלת fibroblasts (HFFs) בתרבית הגבוה גלוקוז השתנה Dulbecco נשרים בינוניים (DMEM) בתוספת 10% FBS, 100 U / ml פניצילין, 100 מ&quot;ג / מיליליטר streptomycin, ו- L-גלוטמין 2 מ&quot;מ (cDMEM) בבקבוק T-25 בתוך 5% CO 2 באינקובטור עד טפילים יצרו vacuoles parasitophorous הגדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טפילי מזרק-שחרור על ידי גירוד תאים מהחלק התחתון של הבקבוק ועובר פתרון שהתקבל באמצעות מחט 25 מד מחוברת למזרק 3 מיליליטר 2 פעמים בתוך הבקבוק ולאחר מכן להעביר את כל הפתרון למקרה מזרק 5 מ&quot;ל מחובר למחט 27 מד ש הושם במהופך בתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר. חבר את בוכנת המזרק ולהעביר את הפתרון הטפיל לתוך צינור חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור במשך 10 דקות ב 300 x גרם. לשאוב supernatant אז resuspend גלולה בpH 4-6 הכיתה USP מיליליטר סטרילי 1x בופר פוספט (PBS) 7.4 (פתרון במלאי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון hemocytometer עם 10 μl של פתרון מניות, לחכות 5-10 דקות לטפילים להתיישב אז לספור את מספר הטפילים בארבעת ריבועי פינה ומרכז הכיכר הגדולה באמצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל paraאתרים לגודל הבידוד מתאים של 100K / 200 μl 1X PBS אז להזריק עכברי intraperitoneally (IP) בהיקף כולל של 200 μl. הערה: להליך זה, עכברים מחוסן עם 100K סוג III (CEP) 13 tachyzoites ב200 μl 1x PBS. כאשר מדביקים עכברים עם זנים אחרים של Toxoplasma, ריכוז של הבידוד ייתכן שיצטרך להיות מותאם לדין וחשבון על רמת האלימות. </li></ol> 2. זלוף וקציר המוח הערה: פרוטוקול זה נערך על 21 ימים לאחר פגיעה (dpi) כמו זה מייצג את נקודת הזמן שבו מספרי שיא של ציסטות נמצאים במוח העכבר, אך ניתן להשתמש בי נקודות זמן אחרות. גודל, מספר, מיקום, ונוכחות או עדר של ציסטות תלויות בגורמים רבים, כולל זן עכבר, סוג זן טפיל, כמו גם גודל הבידוד 7,14 - 17. חוקרים יצטרכו לקבוע את הבידוד המתאים לעכבר וToxoplas בנפרדמתח ma הוא / היא משתמשת. <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הכלים ההתקנה הניתוחיים קצירה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל עכבר, להכין ולשמור על קרח: מזרק 20ml מלא בשיעור של 0.9% נתרן כלוריד (NaCl) + 10 U / ml הפרין בכיתה USP סטרילי 1X PBS (הפרין / מלוח); מזרק 20 מיליליטר מלא עם 4% Paraformaldehyde (PFA); בקבוקון נצנץ עם 15 מיליליטר PFA 4%. לעכברים מרובים, להכין כוס מלאה את כל הסכום של כל פתרון נחוץ לכל העכברים אז לצייר את מזרק טרי מלא של פתרון לכל זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את ip העכבר עם 200 μl / 25 גרם ממשקל הגוף של קוקטייל / Xylazine קטמין (24 מ&quot;ג / מיליליטר &amp; 4.8 מ&quot;ג / בהתאמה מ&quot;ל) ביום של עניין. לפקח על העכבר לרמה של הרדמה על ידי בדיקת רפלקס קמצוץ הבוהן. תמשיך עם פרוטוקול רק פעם אחת על העכבר לא מראה תגובה לקמצוץ הבוהן חברה. הערה: שיטות אחרות של הרדמה עשויה לשמש עוד כרמה המתאימה של הרדמה הוא הגיעה לפנישתמשיך עם הפרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר במצב שכיבה על פלטפורמת הקצף המכוסה. הצמד את כל ארבעת הגפיים החוצה בכפות הרגליים ולאחר מכן לרסס את החזה והבטן עם אתנול 70% (EtOH) (איור 2 א). תוספת של כמה מגבות נייר סטרילי שמתחת לעכבר יכולה לשמש כדי לסייע בספיגת עודפי נוזלי זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עור מעלית ממש מתחת לעצם החזה עם מלקחיים ולאחר מכן להשתמש במספריים לעשות חתך. משוך עור לאחור כדי לחשוף את החזה (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם xiphoid תהליך ולהפוך את חתך בבטן ממש מתחת לסרעפת, חושף את הכבד שגזור בצורה בוטה מהסרעפת. לעשות שני חתכים, אחד בצד שמאל ואחד בצד ימין דרך הסרעפת והחלק התחתון של הצלעות. להאריך את החתכים מהשמאל ומימין דרך 1 / 2-2 / 3 כ עד בית החזה, אשר לאחר מכן בא לידי הביטוי בחזרה כדי לפתוח את בית החזה (איור 2 ג). הערה: טיפול קח לא לחתוך כל איברים או כלי דם גדולים duלצלצל בהליך זה ככך יתפשר על איכות זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse transcardially עם 10-20 מיליליטר הפרין / מלוח ואחרי 10-20 מיליליטר PFA 4%. הערה: אם זלוף נעשה כראוי, הכבד יהפוך מאדום להשתזף (איור 2 ד). אם לא נעשה כראוי, כלי דם יהיו (2E איור) הגלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפכתי את העכבר על הבטן שלה, רגליים מחדש פינים לאחר מכן לרסס ראש וצוואר עם 70% EtOH. הרם את העור מבסיס הצוואר ולעשות חתך. להסיר עור לחשוף את הגולגולת (איור 2F). לערוף את הראש ברמה של הכתפיים. הסר את הגולגולת, להסיר בעדינות את המוח, ולמקם אותו לתוך בקבוקון נצנץ מלא PFA 4% (איור 2G-H). הערה: אם perfused היטב, המוח יופיע לבן ללא כלי דם גלויים (איור ט 2). אם המוח אינו perfused היטב, כלי דם יהיו (י 2 איור) הגלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את השביבבקבוקון tion עם מוח PFA 4% על 4 מעלות צלזיוס לילה, מכוסה מן האור. יש לשטוף את המוח שבאינו USP הכיתה 1x PBS והעברה לבקבוקון נצנץ חדש מלאים במצונן 1x PBS. אחסן את המוח ב1x PBS על 4 מעלות צלזיוס, מכוסה מהאור. הערה: ניקוי והדמיה מוצלחים הושגה עם קטעים מאוחסנים ב1x PBS לעד חודש אבל עדיף סעיף המוח תוך כמה ימים כאחסון ממושך בPBS יהיה להפוך את קיבעון PFA ועלול להוביל לפחות מאופטימליות תמונות . Autofluorescence ולטשטש עלה כבר ציינו בכמה סעיפים צילמו לאחר האחסון ב1x PBS במשך חודש אחד או יותר. </li></ol> 3. מוח חתך <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח מ1x PBS ולמקם אותו לתוך מטריצת מוח (איור 3 א), כדי לאפשר למדויק יותר ואף חוצה את המוח. חתוך את נורות המוח הקטן וחוש ריח, אם קיימים, ולאחר מכן לחתוך את המוח coronally לתוך 2 או 3 חלקים. <br /&gt; הערה: זמירה וחיתוך של המוח ניתן לעשות זאת ללא סיוע של מטריצת מוח. בשימוש מספר החלקים לחתוך coronally יהיה תלוי במרחק החיתוך של Vibratome. המוח יכול להיות מחולק בכל אורינטציה, אם כי חלקי sagittal ו העטרה הם נפוצים ביותר לזיהוי neuroanatomical. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק כל חלק במוח על בלוק דגימת הרכבה עם cyanoacrylate. להדביק בלוק קטן של 5% ג&#39;ל agarose מאחורי סעיף המוח לתמיכה (איור 3). הערה: ניתן להשתמש במנגנוני תמיכה אחרים, אבל ללא תמיכה, Vibratome עשויה לדחוף במוח גורם לחתך לא אחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך רקמה לתוך 160 מיקרומטר (מרחק עבודה של המטרה המשמשת להדמיה) חלקים עבים עם Vibratome להגדיר למהירות של 4 והמשרעת של 9. הערה: ההגדרות למהירות ומשרעת עשויות להיות מותאמות בהתאם למכונה המסוימת בשימוש על מנת להשיג אפילו, חלקים חלקים. אם ההגדרותלא נכון, התוצאה יכולה להיות חלקים לא אחידים, קריעה של רקמה או סימני פטפוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף חלקי רקמות לתוך בקבוקון נצנץ מלא טרי, המצונן 1x PBS אם הם הולכים להיות מסומנות בתוך שבוע אחד. אם חלקים לא הולכים להיות מסומנות בתוך שבוע אחד, סעיפי מקום לתוך צינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge מלא פתרון cryopreservative ולאחסן ב -20 ° C. </li></ol> 4. סליקה אופטית של סעיפים רקמת מוח הערה: פרוטוקול זה שונה משיטה שפורסמה בעבר 8. <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 25%, 50%, 75% ו 90% גליצרול כרך / כרך ב 1x PBS Tween-20 + 2% (Gl / PBST). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר חלקים מ1x PBS או, אם בcryopreservative, לשטוף ב1x PBS ולהעביר לבקבוקון נצנץ המכיל 10 מיליליטר של 25% Gl / PBST. בקבוקון מקום על שייקר ב 4 מעלות צלזיוס, מכוסה מחשיפה לאור, לשעה 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שכל החלקים שקעו לbottom של הבקבוקון. לשאוב 25% Gl / PBST, והשאיר רק מספיק כדי לכסות את החלקים ולאחר מכן למלא את הבקבוקון עם 10 מיליליטר 50% Gl / PBST ומקום על שייקר ב 4 מעלות צלזיוס, מכוסים מחשיפה לאור, לשעה 12. חזור על תהליך זה עבור 75% Gl / PBST אז 90% Gl / PBST. השאר חלקים ב -90% Gl / PBST למשך 24 שעות כדי להגיע לסליקה מקסימלי. במהלך תהליך הסליקה, להתבונן סליקה הדרגתית אופטית (איור 4). הערה: תהליך זה עשוי להיות מזורז אם פתרונות משתנים מייד לאחר הסעיפים שקעו לתחתית של הבקבוקון. בפתרונות של 75% ו- 90%, סעיפים לא ישקעו כל הדרך עד לתחתית של הבקבוקון אבל יצופו באמצע. </li></ol> 5. סעיפים רקמות הרכבה מוח <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך coverslip 1.5 מס &#39;ל -5 חלקים כדי ליצור spacer. השתמש בעיפרון שליט ושקצו יהלום להבקיע ולשבור את coverslip לאורך הקווים מקווקווים שמוצגים באיור 5 א. בטל tהוא מרכז חתיכה, לסדר את 4 חתיכות חיצוניות בשקופית זכוכית רגיל כדי ליצור חלון, ולאחר מכן לצחצח ברור לק על התפרים לדבוק החתיכות של spacer לשקופית בתצורה הנכונה (איור 5). הערה: spacer ישמש ליצור את המרחב הדרוש בין השקופיות וcoverslip להרכבת החלקים פינו. Coverslip ניתן לחתוך בדרכים שונות כדי ליצור כל גודל חלון הכרחי. מפרידי קצף חתוכים מראש זמינים גם מבחינה מסחרית. כדי לאפשר ללק להתייבש לחלוטין, דרך טובה ביותר הוא לעשות שקופיות עם מפרידי לפחות יום אחד לפני סעיפי הרכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת חלקים לשקופית באמצעות pipet העברת פלסטיק עם הקצה מנותקים. הקפד למלא בסביבה עם 90% Gl / PBST. בזהירות להוריד coverslip על החלקים כדי לוודא שלא להציג את כל בועות. עודף Gl / PBST עלול להיות רשע משם עם לנגב ונטול מוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> GFP תמונה + נוירונים המכילים RFP + <em&gt; ציסטות Toxoplasma gondii עם מיקרוסקופ confocal מייד (7 א-B איור) ולאחר מכן שקופיות חנות שטוחה ומכוסות מהאור ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: לחלופין, חותם מחליק לחלוטין סביב כל הקצוות כדי לאחסן וצלמו במועד מאוחר יותר. שימוש בלק ברור לאטום שקופיות הוא אופציונאלי ועשוי להפוך אותו קשה יותר להסיר coverslip אם אחד היה כדי להסיר חלקים מהשקופית במועד מאוחר יותר לעיבוד נוסף. </li></ol> 6. הדמיה הערה: כל מיקרוסקופ ניתן להשתמש שביש את יכולת קבלת Z- ערימות ברזולוציה גבוהה. <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בתחילה למצוא את מישור המוקד ב10X, לשנות למטרת 20X ולסרוק באמצעות הסעיף לזהות ציסטה ממוקמת בתוך GFP + תא. מרכז את האזור של העניין (ROI) בשדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות למטרת 40X. פוקוס למעלה ולמטה דרך כל ROI לוודא שכל התא וCYרח &#39;גלוי. הערה: תמונות התקבלו באמצעות מיקרוסקופ confocal עם מטרת הנפט דסק&quot;ש M27 40X / 1.30. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתוכנת ההדמיה המותקנת, להשיג Z- מחסנית הכוללת את כל התא עם ציסטה. הגדרות ממוצעת בשימוש כדי להשיג תמונות מוצגות באיור 6. הערה: הגדרות ייתכן שתצטרכנה להיות מותאמות בהתאם לכל סעיפי רקמות חוקרים ויכולות מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבל תמונת הקרנה המרבית של Z- המחסנית על ידי קביעת מספר התחזיות ל1. השג מבט סיבוב מלא על ידי קביעת מספר התחזיות ל -64. הערה: חבילות תוכנה אחרות זמינות וניתן להשתמש כדי להשיג הקרנה המרבית, סיבוב, כמו גם דעות אחרות של Z- מחסנית תמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את התמונה עם תוכנת ניתוח הדמיה. </li></ol>

<ol>
	<li>Luft, B., Remington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasmic+encephalitis+in+AIDS.">Toxoplasmic encephalitis in AIDS.</a> Clin Infect Dis. 15 (2), 211-222 (1992).</li><li>Hill, D., Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+transmission,+diagnosis+and+prevention.">Toxoplasma gondii: transmission, diagnosis and prevention.</a> Clin Microbiol Infect. 8 (10), 634-640 (2002).</li><li>Ingram, W. M., Goodrich, L. M., Robey, E., Eisen, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+infected+with+low-virulence+strains+of+Toxoplasma+gondii+lose+their+innate+aversion+to+cat+urine,+even+after+extensive+parasite+clearance.">Mice infected with low-virulence strains of Toxoplasma gondii lose their innate aversion to cat urine, even after extensive parasite clearance.</a> PloS one. 8 (9), 75246 (2013).</li><li>Evans, A. K., Strassmann, P. S., Lee, I. -. P., Sapolsky, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+Toxoplasma+gondii+cyst+distribution+in+the+forebrain+associate+with+individual+variation+in+predator+odor+avoidance+and+anxiety-related+behavior+in+male+Long-Evans+rats.">Patterns of Toxoplasma gondii cyst distribution in the forebrain associate with individual variation in predator odor avoidance and anxiety-related behavior in male Long-Evans rats.</a> Brain Behav Immun. 37, 122-133 (2013).</li><li>Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host-parasite+relationship+of+Toxoplasma+gondii+in+the+brains+of+chronically+infected+mice.">The host-parasite relationship of Toxoplasma gondii in the brains of chronically infected mice.</a> Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 411 (1), 39-43 (1987).</li><li>Ferguson, D. J., Graham, D. I., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+changes+in+the+brains+of+mice+infected+with+Toxoplasma+gondii:+a+histological,+immunocytochemical+and+ultrastructural+study.">Pathological changes in the brains of mice infected with Toxoplasma gondii: a histological, immunocytochemical and ultrastructural study.</a> Int J Exp Pathol. 72 (4), 463-474 (1991).</li><li>Melzer, T. C., Cranston, H. J., Weiss, L. M., Halonen, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Cell+Preference+of+Toxoplasma+gondii+Cysts+in+Murine+Brain:+A+Confocal+Study.">Host Cell Preference of Toxoplasma gondii Cysts in Murine Brain: A Confocal Study.</a> J Neuroparasitology. , (2010).</li><li>Selever, J., Kong, J. -. Q., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+approach+to+high-resolution+fluorescence+imaging+in+semi-thick+brain+slices.">A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li><li>Koshy, A., Fouts, A., Lodoen, M., Alkan, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+secreting+Cre+recombinase+for+analysis+of+host-parasite+interactions.">Toxoplasma secreting Cre recombinase for analysis of host-parasite interactions.</a> Nat Methods. 7 (4), 307-309 (2010).</li><li>Koshy, A. a., Dietrich, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+co-opts+host+cells+it+does+not+invade.">Toxoplasma co-opts host cells it does not invade.</a> PLoS pathog. 8 (7), (2012).</li><li>Madisen, L., Zwingman, T. a., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Caffaro, C. E., Koshy, A. s., Liu, L., Zeiner, G. M., Hirschberg, C. B., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nucleotide+sugar+transporter+involved+in+glycosylation+of+the+Toxoplasma+tissue+cyst+wall+is+required+for+efficient+persistence+of+bradyzoites.">A nucleotide sugar transporter involved in glycosylation of the Toxoplasma tissue cyst wall is required for efficient persistence of bradyzoites.</a> PLoS pathog. 9 (5), (2013).</li><li>Saeij, J. P. J., Boyle, J. P., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+among+the+three+major+strains+of+Toxoplasma+gondii+and+their+specific+interactions+with+the+infected+host.">Differences among the three major strains of Toxoplasma gondii and their specific interactions with the infected host.</a> Trends in parasitology. 21 (10), 476-481 (2005).</li><li>Dubey, J. P., Lindsay, D. S., Speer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Structures+of+Toxoplasma+gondii+tachyzoites,+bradyzoites,+and+sporozoites+and+biology+and+development+of+tissue+cysts.">a Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites, bradyzoites, and sporozoites and biology and development of tissue cysts.</a> Clin Microbiol Rev. 11 (2), 267-299 .</li><li>Prandota, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+Link+Between+Toxoplasma+Gondii+and+the+Anosmia+Associated+With+Neurodegenerative+Diseases.">Possible Link Between Toxoplasma Gondii and the Anosmia Associated With Neurodegenerative Diseases.</a> Am J Alzheimers Dis Other Demen. 29 (3), 205-214 (2014).</li><li>Berenreiterov&#225;, M., Flegr, J., Kub&#283;na, A., N&#283;mec, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+Toxoplasma+gondii+cysts+in+the+brain+of+a+mouse+with+latent+toxoplasmosis:+implications+for+the+behavioral+manipulation+hypothesis.">The distribution of Toxoplasma gondii cysts in the brain of a mouse with latent toxoplasmosis: implications for the behavioral manipulation hypothesis.</a> PloS one. 6 (12), 28925 (2011).</li><li>Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrastructural+study+of+the+early+development+and+tissue+cyst+formation+of+Toxoplasma+gondii+in+the+brains+of+mice.">An ultrastructural study of the early development and tissue cyst formation of Toxoplasma gondii in the brains of mice.</a> Parasitol Res. 73 (6), 483-491 (1987).</li><li>De Chiara, G., Marcocci, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+agents+and+neurodegeneration.">Infectious agents and neurodegeneration.</a> Mol Neurobiol. 46 (3), 614-638 (2012).</li><li>Scott, C. a., Rossiter, J. P., Andrew, R. D., Jackson, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+abnormalities+in+neurons+are+sufficient+to+explain+the+clinical+disease+and+fatal+outcome+of+experimental+rabies+in+yellow+fluorescent+protein-expressing+transgenic+mice.">Structural abnormalities in neurons are sufficient to explain the clinical disease and fatal outcome of experimental rabies in yellow fluorescent protein-expressing transgenic mice.</a> J Virol. 82 (1), 513-521 (2008).</li><li>Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

בהתחשב בכך ששינויים תאיים בתאי מארח נגועים נקשרו לתוצאות מחלה בזיהומים עם אורגניזמים תאיים אחרים כגון HIV, כלבת, וכלמידיה 18,19, שפיתחנו טכניקה שתאפשר לנו ללמוד את יחסי הגומלין האינטימיים המתרחשים בין מערכת העצבים המרכזית לארח תא וToxoplasma. השיטה המתוארת כאן משיגה מטרה זו על ידי הפעלת הדמיה יעילה של תאי עצב נגועים כרוני. לפני פיתוחה של שיטה זו, ההדמיה כזו הייתה גוזל זמן יקר, או לא אפשרי. כעת אנו יכולים להשתמש בטכניקה זו כדי לענות על שאלות בסיסיות בנוגע לאינטראקצית -neuron Toxoplasma, כגון אזורים עצביים ספציפיים הממוקדים על ידי הטפיל? האם זה שונה בין זני Toxoplasma? האם האזורים הסלולריים שבציסטה מתגוררת שונה משאר תאים (כלומר אל נגוע ויש לי דנדריטים נגוע מאותו תא העצב אותו המספר של עמוד השדרה)? מהם המאפיינים המשותפים לסלולריים נוירונים נגועים? היכולת לענות על שאלות כאלה היא חיונית להבנה כיצד זיהום Toxoplasma משנה את מערכת העצבים המרכזית, כולל ברמה של התנהגות. כדי להשיג את התמונות הטובות ביותר אפשריים, זה מאוד חשוב לוודא הרקמות היא חתכו לתוך אפילו חלקים. אם החלקים הם לא אחידים, coverslip לא יושב כמו שצריך בקטע המוביל למגע לא אחיד במטרה וכתוצאה מכך ההדמיה תת-אופטימלית. במהלך אופטימיזציה של פרוטוקול זה, כמה שינויים נעשו. תהליך הסליקה המקורי נעשה בפרוקטוז בניסיון לשחזר את תוצאות ניתן לראות בטכניקה המכונית SeeDB 20. שיטה זו אינה מתיישבת עם המודל הזה כפי שהוא הרווה RFP (במיוחד mCherry). עוד צעד מפתח וכנראה החשוב ביותר מכולם הוא שמאפשר לסליקה מקסימלי של חלקי רקמות. אם לא ניקה כראוי, עקיפת אור הרקע תהיה גבוהה יותר והתמונות הפכו רועשות. מצאנו כי תוספת של Tween-20 לגליצרול נתנה תמונה מעט ברורה יותר מגליצרול לבד. טכנולוגיה נוכחית מאפשרת לנו להשיג Z- מחסנית תמונות באמצעות קטעי רקמת המוח עבים 160μm אבל בעתיד, אנו מחפשים להגדיל את עובי זה ל -500 מיקרומטר או יותר כדי לאפשר לעוד יותר בניתוח מעמיק. זה רק מלהסתכל על כל התא והקשרים שלה שאנחנו יכולים להתחיל לפתח רעיון המכניסטי של איך המוח מושפע באופן גלובלי על ידי Toxoplasma. פרוטוקול חדש זה מציע הזדמנות ללמוד האינטראקציה -neuron Toxoplasma ברמת התא הבודד ולעשות זאת בצורה מהירה, חסכונית. יש לנו עדיין לחקור את כל השימושים האפשריים לפרוטוקול זה ואיך זה יכול לתרגם למערכות אחרות, אבל אנו צופים שיהיה לה מספר רב של יישומים.

A correction was made to <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/52237">"3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii"</a>. The ordering of the authors was inverted. The order has been updated from:
 Anita A. Koshy, Carla M. Cabral
to:
Carla M. Cabral, Anita A. Koshy

A correction was made to <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/52237">"3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii"</a>.

Erratum: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להשיג ברזולוציה גבוהה, תמונות תלת ממדיות של נוירונים בודדים שנדבקו בטפיל תאיים לחייב Toxoplasma gondii. Toxoplasma נחשב לאחד מהטפילים המצליחים ביותר לעתים קרובות בגלל מגוון הגדול שלה ביניים מארח, הכולל בני אדם ומכרסמים. בשני בני אדם ומכרסמים, לאחר זיהום חריף בבליעה של מזון או מים מזוהמים, Toxoplasma הוא מסוגל לגרום לזיהום מתמשך של מערכת העצבים המרכזית על ידי המרה מצורתו מהירה משכפלת (tachyzoite) לאיטי המשכפל וencysting טופס (bradyzoite ). אצל אנשים עם מערכת חיסון תקינים, הוא חשב זיהום במערכת העצבים המרכזית סמוי זה להיות יחסית ללא תסמינים, אבל אצל אנשים מדוכאי חיסון כגון חולי איידס או מושתלים, התפרצות מחודשת של הטפיל עלולה לגרום לדלקת קרום מוח toxoplasmic הקטלנית 1,2. בנוסף, מחקרים שנעשה לאחרונה חההוכיח כי זיהום סמוי עם Toxoplasma יכול להוביל לשינויים התנהגותיים במכרסמים 3,4, אם כי המנגנון אינו ידוע. באופן מפתיע, למרות נתונים אלה מדגישים את החשיבות של האינטראקציה CNS- Toxoplasma, קטן יחסית ידוע על הקשר הזה, במיוחד ברמה התאית ומולקולרית. היכולת ללמוד היבטים אפילו פשוטים של האינטראקציה המוח-טפיל כבר הקשתה בחלקו על ידי מגבלות טכנולוגיות. לדוגמא, רוב העבודה שהראה כי תאי עצב הם התאים שבי ציסטות להתמיד נעשתה עם מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) 5,6. למרות EM נותן ברזולוציה גבוהה, שזה זמן רב, עבודה אינטנסיבית, ויקר. לאחרונה Immunofluorescence מבחני (IF) היו בשימוש בשילוב עם מיקרוסקופיה confocal כדי לאשר את העבודה שנעשתה על ידי 7 EM. אם מבחני הם קלים מבחינה טכנית לבצע וזולים יחסית, אך תוך שימוש בטכניקות אלה לאחורייםtand הקשר המרחבי בין ציסטה ונוירון הנגוע דורש שיקום סדרתי, שזה זמן רב, קשה מבחינה טכנית, ועלול להוביל לאובדן של מידע בעל ערך. לפיכך, פיתחנו שיטה שיכול לשמש עם מודל העכבר של טוקסופלזמוזיס CNS ומאפשרת לנו תמונת השלמות של תאי עצב נגועים ללא EM או אימונוהיסטוכימיה (IHC). על ידי פיתוח טכניקה כזו, אנחנו יכולים להתחיל לחקור את מערכת היחסים בין סלולארי התא הנגוע וציסטה באופן מהיר יחסית ולא יקר. השיטה שפיתחנו משלבת טכניקות חדשות לסליקה אופטית וחלקים במוח עבים הדמיה על ידי מיקרוסקופ confocal 8 עם מערכת שמסמנת בתאי vivo שכבר הזריקו עם חלבוני טפיל 9,10. במערכת זו, אנו להדביק עכברי Cre-כתב שמבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) רק לאחר Cre בתיווך רקומבינציה 11 עם Toxoplasma </em&gt; זנים המבטאים חלבון אדום פלורסנט (RFP) ולהזריק recombinase Cre לתאי מארח 9. שילוב זה מאפשר לנו לקצור את מוח העכבר הנגוע לאחר הדבקת CNS הוקמה, לחתוך חלקים במוח עבים, ולזהות במהירות אזורים רלוונטיים לתמונה על ידי מציאת RFP + ציסטות. חשוב לציין כי כביטוי תא המארח של GFP תלוי אך ורק בהזרקה של Cre על ידי טפילים, ולא על זיהום, מספר תאי GFP + אינם מכיל טפילי 10. כמטרה של פרוטוקול זה היא להיות מסוגל נוירונים נגועים תמונה כולה, הדגש הוא רק על GFP + תאי עצב שמכיל גם RFP + ציסטה, אלא גם את הפרוטוקול יכול לשמש לתמונת GFP + / RFP - נוירונים. ברגע שהמוח הנגוע שנקטפו ומחולק, הקטעים ניתנים על ידי שקופים סליקת גליצרול. אזורים מתאימים סעיפים לאחר מכן צילמו עם מיקרוסקופ confocal, אלהדמיה חסרת תקדים געיית תאי מארח נגועים וטפילי ביצת הקיימא בשלמותם. כאן אנו מספקים פרוטוקול מלא לזיהוי, סליקה אופטית, ונוירונים הדמיה נגועה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1877">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:265px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:1008px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome Series 1000 Sectioning System</td>
			<td>Technical Products International, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Other vibratomes are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Premium Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">#1.5 Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diamond Scriber</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52865-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketaject&#174; Ketamine HCl Inj., USP 100mg/ml</td>
			<td>Western Medical Supply, Inc.</td>
			<td>4165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AnaSed&#174; Injection Xylazine 20mg/ml</td>
			<td>Lloyd Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ZsGreen Mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>7906</td>
			<td>B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surgical equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>These are primary cells from human foreskins.&#160; We make these in-house but they may be purchased from outside vendors.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Penicillin Streptomycin Solution, 100X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">200mM L-alanyl-L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-015-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:469px;">25cm2 Canted neck flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1012639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-Buffered Saline, 10X, USP Sterile Ultra Pure Grade</td>
			<td>amresco</td>
			<td>K813-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:265px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Bright-Line Hemocytometer</td>
			<td style="width:265px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Brain Slicer Matrix</td>
			<td>Zivic Instruments</td>
			<td>BSMAS005-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td style="width:265px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:135px;">H3393-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:265px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">O4042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">20ml Disposable Scintillation Vials</td>
			<td style="width:265px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">FS74500-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof</td>
			<td style="width:265px;">In-house</td>
			<td>17212945</td>
			<td>This product is purchased from an in-house stockroom.&#160; Other companies are compatible.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Imaris Software</td>
			<td style="width:265px;">Bitplane</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Clear nail polish</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Other brands are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">10ml Syringe with Luer-Lok</td>
			<td style="width:265px;">VWR</td>
			<td>BD309604</td>
			<td>Other syringes are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Three-way Stopcock</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Any brand is compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Hypodermic needle</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Any brand is compatible - used to pin down mouse.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Cell Scraper</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Any brand is compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25G x 12&#34; Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter</td>
			<td style="width:265px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:135px;">450099</td>
			<td>Other brands are compatible</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3-d imaging and analysis of neurons infected in vivo with toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii הוא טפיל לחייב, תאית עם מגוון רחב מארח, כולל בני אדם ומכרסמים. בשני בני האדם ומכרסמים, Toxoplasma קובע זיהום מתמשך לכל החיים במוח. בעוד זיהום מוח זה הוא ללא תסמינים ברוב האנשים עם מערכת חיסון, בעובר המתפתח או אנשים מדוכאי חיסון כגון תסמונת כשל חיסוני נרכשת חולים (איידס), נטייה זו ולהתמדה במוח יכול להוביל למחלות נוירולוגיות הרסניות. לפיכך, ברור כי האינטראקציה Toxoplasma המוחין היא קריטית למחלה סימפטומטית המיוצרת על ידי Toxoplasma, עדיין יש לנו מעט הבנה של האינטראקציה הסלולרית או מולקולרית בין התאים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) וטפיל. במודל העכבר של מערכת העצבים המרכזית טוקסופלזמוזיס זה כבר ידוע במשך 30 שנים שהנוירונים הם התאים שבו הטפיל נמשך, אך מעט מידע זמין על שחלק מתא העצב בדרך כלל נגוע (סומה, דנדריט, אקסון) ואם מערכת יחסים סלולריים זה משתנה בין זנים. בחלקו, חוסר זה הוא משניים לקושי של הדמיה חזותי נוירונים נגועים כולו מבעלי חיים. תמונות כאלה בדרך כלל ידרשו חתך ותפרים של רקמה צילמה על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים או confocal לאחר immunostaining סדרתי. על ידי שילוב של מספר טכניקות, השיטה המתוארת כאן מאפשרת השימוש בחלקים עבים (160 מיקרומטר) כדי לזהות ותאי תמונה שלמה המכילים ציסטות, המאפשר הדמיה וניתוח של נוירונים בודדים, נגועים כרוני תלת-ממדיים ללא הצורך בimmunostaining, מיקרוסקופיה אלקטרונית , או חתך סידורי ותפרים. שימוש בטכניקה זו, אנו יכולים להתחיל להבין את הקשר בין סלולארי הטפיל ונוירון הנגוע.

איור 7 כולל תמונות מייצגות של שני GFP + תאי עצב משני 160 מיקרומטר חלקים שונים עבים, כמו גם מדידת נציג של המרחק מציסטה אל התא-גוף לאיור 7. איורים המכיל ציסטה 7 ו- B להמחיש שזה חדש פרוטוקול מאפשר להדמיה של תא העצב הנגוע בשלמותו. איור 7C מראה כי עם טכניקת הדמיה זו, ניתן כיום לכמת את המרחק בין ציסטה וגוף התא (Imaris 7.7). איור 7D הוא נוף סיבוב מלא של איור 7 ב. ויזואליזציה של Z- המחסנית בצורה זו מאפשרת לאימות לכידתו של התא וציסטה המלאה. איור 7E הוא סרט סיבוב 3D המראה כיצד התמונה מ7D יכולה להיות מנותחת על ידי תוכנת Imaris 7.7 כדי למדוד את המרחק מציסטה ל גוף התא או ממרכז ל- בינונית or קצה לקצה. למרות שהמדידה הראתה שנעשתה שימוש בקו ישר בין ציסטה וגוף התא, מדידה הבאה GFP בפועל + תהליך לגוף התא יכול גם להיות שנוצר (מידע לא מוצג). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52237/52237fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1: ציוד כירורגי להסרת מוח עכבר. כרית סופגת (). מחטי בלוק (B) קצף. (C) להצמיד את הרגליים. 25 סט אוסף דם G (D). ברזלים 3-כיווניים (E). מזרק 20 מיליליטר להפרין / מלוח (F). ( G) מזרק 20 מיליליטר למלקחי Thumb PFA. (H) 4%. (I) המספריים פיין, זווית לצד, חד-חד. (J) מספריים חדים-חד. (Hemostats K) קלי. (L) מספריים מאיו. (M) </מרית strong&gt; מיקרו. בקבוקון נצנץ (N) לPFA 4%. בר סולם = סנטימטר 8. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52237/52237fig2highres.jpg" /> איור 2: מוח עכבר קציר. כבד () עכבר מרותק וחזה ריסס עם 70% EtOH. חזה (B) חשוף. החלל (C) חזה פתוח. כבד (ד &#39;) לאחר זלוף הנכון. (E) לאחר זלוף לא תקין. גולגולת חשופה (F). ( מוח G) עם חצי גולגולת הוסרה. (H) מוח שנקטפו בבקבוקון מלא PFA 4% (מוח. I) לאחר זלוף הנכון. (מוח J) לאחר זלוף לא תקין. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52237/52237fig3highres.jpg" /> איור 3: חתך מוח עכבר. מתרי מוח () עכבר<html> x. מוח העכבר (B) וג&#39;ל agarose המודבק הרכבה בלוק עם cyanoacrylate בתוך תא Vibratome המלא מצונן 1x PBS. <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52237/52237fig4highres.jpg" width="600" /> איור 4: ניקוי תהליך נציג תמונות של סעיף מוח עכבר בכל שלב של תהליך הסליקה.. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52237/52237fig5highres.jpg" /> איור 5: חיתוך ותיקון spacer להחליק. Coverslip. מס &#39;1.5 עם סימני נציג לחיתוך coverslip לתוך 5 חתיכות. B. שקופיות זכוכית רגילים עם כל פיסת coverslip החתך מודבקת למקום עם לק ברור כדי ליצור חלון. <html> 2,237 / 52237fig6highres.jpg &quot;/&gt; איור 6: צילום מסך של פרמטרים כלליים המשמשים לרכישת תמונה. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/52237/52237fig7highres.jpg" /> איור 7:. ציסטות Toxoplasma gondii יכולה לשכון בתוך תהליכים עצביים רחוקים (AB) תמונות מרבי השלכה של GFP + תאי עצב המכילים RFP + ציסטות (חצים לבנים). בר סולם = 20 מיקרומטר. (CE) לספק להדמיה וניתוח נוספים של מערכת היחסים ציסטה-נוירון שמוצגים בB. (ג) מדידה שנוצר Imaris ישיר קו של מרחק מהקצה של ציסטה לקצה של גוף התא (149μm ). (ד) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52237/Animated-Video Figure 7D.avi" target="_blank">3-D סרט סיבוב.</a> (שנוצר Imaris E)&quot;Target =&quot; www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52237/Animated-Video איור 7E.avi _ blank &quot;&gt; 3-D סרט מראה מדידת ציסטה אל תא-גוף משני אמצע לאמצע (163 מיקרומטר) וקצה לקצה (149 מיקרומטר).

Watch this Scientific Journal Video about 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii at JoVE.com

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

השימוש בפרוטוקול זה, הצלחנו חלקים במוח העבה מיקרומטר 160 תמונה מעכברים נגועים בטפיל טוקסופלזמה גונדי, המאפשר הדמיה וניתוח של היחסים מרחביים בין טפיל encysting ונוירון הנגוע.

הדמיה 3-D וניתוח של נוירונים נגועים<em&gt; In vivo</em&gt; עם<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

3-d-imaging-analysis-neurons-infected-vivo-with-toxoplasma

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

11.4K Views.  University of Arizona.  השימוש בפרוטוקול זה, הצלחנו חלקים במוח העבה מיקרומטר 160 תמונה מעכברים נגועים בטפיל טוקסופלזמה גונדי, המאפשר הדמיה וניתוח של היחסים מרחביים בין טפיל encysting ונוירון הנגוע. 

Video: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted in neurological and psychiatric disorders--would be greatly facilitated by a technology for rapidly targeting genes to complex 3-dimensional neural circuits, enabling fast creation of "circuit-level transgenics." We have recently developed methods in which viruses encoding for light-sensitive proteins can sensitize specific cell types to millisecond-timescale activation and silencing in the intact brain. We here present the design and implementation of an injector array capable of delivering viruses (or other fluids) to dozens of defined points within the 3-dimensional structure of the brain (Figure. 1A, 1B). The injector array comprises one or more displacement pumps that each drive a set of syringes, each of which feeds into a polyimide/fused-silica capillary via a high-pressure-tolerant connector. The capillaries are sized, and then inserted into, desired locations specified by custom-milling a stereotactic positioning board, thus allowing viruses or other reagents to be delivered to the desired set of brain regions. To use the device, the surgeon first fills the fluidic subsystem entirely with oil, backfills the capillaries with the virus, inserts the device into the brain, and infuses reagents slowly (&lt;0.1 microliters/min). The parallel nature of the injector array facilitates rapid, accurate, and robust labeling of entire neural circuits with viral payloads such as optical sensitizers to enable light-activation and silencing of defined brain circuits. Along with other technologies, such as optical fiber arrays for light delivery to desired sets of brain regions, we hope to create a toolbox that enables the systematic probing of causal neural functions in the intact brain. This technology may not only open up such systematic approaches to circuit-focused neuroscience in mammals, and facilitate labeling of brain regions in large animals such as non-human primates, but may also open up a clinical translational path for cell-specific optical control prosthetics, whose precision may enable improved treatment of intractable brain disorders. Finally, such devices as described here may facilitate precisely-timed fluidic delivery of other payloads, such as stem cells and pharmacological agents, to 3-dimensional structures, in an easily user-customizable fashion.

Controlling and analyzing neural circuits in vivo would be facilitated by a technology for delivery of viruses and other reagents to desired 3-dimensional sets of brain regions. We demonstrate customized fluidic injector array fabrication, and delivery of virally-encoded optical sensitizers, enabling optical manipulation of complex brain circuits.

Scalable Fluidic Injector מערכים עבור ויראלי הכוונת של 3-D מעגלים פגוע המוח

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous activity of participating neurons leads to the emergence of the integral functionality of the network. Here we present the methodology of application of this technique to identified pattern generating neurons in the crab stomatogastric ganglion. We demonstrate the loading of these neurons with the fluorescent voltage-sensitive dye Di-8-ANEPPQ and we show how to image the activity of dye loaded neurons using the MiCAM02 high speed and high resolution CCD camera imaging system. We demonstrate the analysis of the recorded imaging data using the BVAna imaging software associated with the MiCAM02 imaging system. The simultaneous voltage-sensitive dye imaging of the detailed activity of multiple neurons in the crab stomatogastric ganglion applied together with traditional electrophysiology techniques (intracellular and extracellular recordings) opens radically new opportunities for the understanding of how central pattern generator neural networks work.

Here we present the methodology for fast and high resolution fluorescent voltage-sensitive dye imaging of detailed activity of neurons in the crab stomatogastric ganglion.

דימות אופטי של נוירונים גנגליון סרטן Stomatogastric עם מתח רגיש צבעים

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

תיוג של פלורסנט מדרדר מאפשר להקלטה ממוקדת חד תאית מיחידת נוירונים שזוהו<em&gt; בvivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In vivo שני פוטוני הדמיה של שינויים מולקולריים ניסיון תלוי בנוירונים בקליפת מוח

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

שינוי של Colliculo-thalamocortical עכבר המוח פרוסה, שילוב הדפסת 3-D של לשכת רכיבים ודימות אופטי רב בקנה מידה

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this protocol, we aim to guide the reader not simply through the technical considerations of generating laser-induced lesions to trigger neovascular processes, but rather focus on the powerful information that can be obtained from multimodal longitudinal in vivo imaging throughout the follow-up period.
The laser-induced mouse CNV model was generated by a diode laser administration. Multimodal in vivo imaging techniques were used to monitor CNV induction, progression and regression. First, spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) was performed immediately after the lasering to verify a break of Bruch&#39;s membrane. Subsequent in vivo imaging using fluorescein angiography (FA) confirmed successful damage of Bruch&#39;s membrane from serial images acquired at the choroidal level. Longitudinal follow-up of CNV proliferation and regression on days 5, 10, and 14 after the lasering was performed using both SD-OCT and FA. Simple and reliable grading of leaky CNV leasions from FA images is&#160;presented. Automated segmentation for measurement of total retinal thickness, combined with manual caliber application for measurement of retinal thickness at CNV sites, allow unbiased evaluation of the presence of edema. Finally, histological verification of CNV is performed using isolectin GS-IB4 staining on choroidal flatmounts. The staining is thresholded, and the isolectin-positive area is calculated with ImageJ.
This protocol is especially useful in therapeutics studies requiring high-throughput-like screening of CNV pathology as it allows fast, multimodal, and reliable classification of CNV pathology and retinal edema. In addition, high resolution SD-OCT enables the recording of other pathological hallmarks, such as the accumulation of subretinal or intraretinal fluid. However, this method does not provide a possibility to automate CNV volume analysis from SD-OCT images, which has to be performed manually.

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Here, we present the usefulness of longitudinal in vivo imaging in the follow-up of morphological changes of laser-induced choroidal neovascularization in mice.

אין ויוו הדמיה עם מודאלים מרובים וניתוח של עכבר לייזר המושרה חיבור כורוידאלית דגם

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

אין ויוו שני הפוטונים הדמיה של נוירונים בקליפת המוח בעכברים Neonatal

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

דור של 3-D הידרוג'לים קולגן מבוססי לנתח צמיחה Axonal התנהגות במהלך פיתוח מערכת העצבים

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

הדמיה טרנס-אימונית של שני פוטונים In vivo של רשתית העכבר

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...