We thank Stephan Uphoff for discussions. 
R.C. was supported by Linacre College, Oxford University. A.P. was supported by the German Academic Exchange Service (DAAD), the German National Academic Foundation and EPSRC. M.S. was supported by the Wellcome Trust. A.N.K. was supported by a UK BBSRC grant (BB/H01795X/1), and a European Research Council Starter grant (261227).

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Leake, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+and+turnover+in+single,+functioning+membrane+protein+complexes.">Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes.</a> Nature. 443, 355-358 (2006).</li><li>Taniguchi, Y., Kawakami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+HaloTag+protein+to+covalent+immobilization+of+recombinant+proteins+for+single+molecule+force+spectroscopy.">Application of HaloTag protein to covalent immobilization of recombinant proteins for single molecule force spectroscopy.</a> Langmuir. 26, 10433-10436 (2010).</li><li>Xie, X. S., Choi, P. J., Li, G. W., Lee, N. K., Lia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+approach+to+molecular+biology+in+living+bacterial+cells.">Single-molecule approach to molecular biology in living bacterial cells.</a> Annual review of biophysics. 37, 417-444 (2008).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+subcellular+RNA+sequencing+in+situ.">Highly multiplexed subcellular RNA sequencing in situ.</a> Science. 343, 1360-1363 (2014).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+microscopy+coming+of+age:+from+concepts+to+biological+impact.">Localization microscopy coming of age: from concepts to biological impact.</a> J Cell Sci. 126, 3505-3513 (2013).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Hao Chen, K., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localizationbased+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localizationbased super-resolution imaging.</a> Nat Meth. 8, 1027-1041 (2011).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Meth. 2, 905-909 (2005).</li><li>Landgraf, D., Okumus, B., Chien, P., Baker, T. A., Paulsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+molecules+at+cell+division+reveals+native+protein+localization.">Segregation of molecules at cell division reveals native protein localization.</a> Nat. Methods. 9, 480-482 (2012).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+Parallel+Single-Cell+RNA-Seq+for+Marker-Free+Decomposition+of+Tissues+into+Cell+Types.">Massively Parallel Single-Cell RNA-Seq for Marker-Free Decomposition of Tissues into Cell Types.</a> Science. 343, 776-779 (2014).</li><li>Aldridge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AHT-ChIP-seq:+a+completely+automated+robotic+protocol+for+high-throughput+chromatin+immunoprecipitation.">AHT-ChIP-seq: a completely automated robotic protocol for high-throughput chromatin immunoprecipitation.</a> Genome Biol. 14, R124 (2013).</li><li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat Biotechnol. 21, 86-89 (2003).</li><li>Wombacher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+super-resolution+imaging+with+trimethoprim+conjugates.">Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates.</a> Nat. Methods. 7, 717-719 (2010).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+for+the+site-specific+modification+of+proteins+in+vivo.">A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo.</a> Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).</li><li>McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+incorporating+macromolecules+into+adherent+cells.">A method for incorporating macromolecules into adherent cells.</a> J Cell Biol. 98, 1556-1564 (1984).</li><li>Clarke, M. S., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syringe+loading+introduces+macromolecules+into+living+mammalian+cell+cytosol.">Syringe loading introduces macromolecules into living mammalian cell cytosol.</a> J Cell Sci. 102, 533-541 (1992).</li><li>Sakon, J. J., Weninger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+the+conformation+of+individual+proteins+in+live+cells.">Detecting the conformation of individual proteins in live cells.</a> Nat. Methods. 7, 203-205 (2010).</li><li>Taylor, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electromagnetic+syringe.">Electromagnetic syringe.</a> IEEE Trans. Biomed. Eng. 25, 303-304 (1978).</li><li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+E.+coli+by+high+voltage+electroporation.">High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation.</a> Nucleic Acids Res. 16, 6127-6145 (1988).</li><li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1, 841-845 (1982).</li><li>Sustarsic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+delivery+of+fluorescently+labeled+proteins+in+live+bacteria+using+electroporation.">Optimized delivery of fluorescently labeled proteins in live bacteria using electroporation.</a> Histochem Cell Biol. , (2014).</li><li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells.">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nat. Methods. 5, 159-161 (2008).</li><li>Sinha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cascade+of+DNA-binding+proteins+for+sexual+commitment+and+development+in+Plasmodium.">A cascade of DNA-binding proteins for sexual commitment and development in Plasmodium.</a> Nature. 000, 1-5 (2014).</li><li>English, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+investigations+of+the+stringent+response+machinery+in+living+bacterial+cells.">Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E365-E373 (2011).</li><li>Crawford, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+intracellular+single-molecule+fluorescence+using+electroporated+molecules.">Long-lived intracellular single-molecule fluorescence using electroporated molecules.</a> Biophys J. 105, 2439-2450 (2013).</li><li>Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+DNA+repair+in+live+bacteria.">Single-molecule DNA repair in live bacteria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 8063-8068 (2013).</li><li>Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Protein-DNA+Interactions+in+Live+Bacterial+Cells+Using+Photoactivated+Single-molecule+Tracking.">Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking.</a> J Vis Exp. , (2014).</li><li>Hohlbein, J., Gryte, K., Heilemann, M., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfing+on+a+new+wave+of+single-molecule+fluorescence+methods.">Surfing on a new wave of single-molecule fluorescence methods.</a> Phys Biol. 7, 031001 (2010).</li><li>Xie, X. S., Yu, J., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspective+-+Living+cells+as+test+tubes.">Perspective - Living cells as test tubes.</a> Science. 312, 228-230 (2006).</li><li>Santoso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+transitions+in+DNA+polymerase+I+revealed+by+single-molecule+FRET.">Conformational transitions in DNA polymerase I revealed by single-molecule FRET.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 715-720 (2010).</li><li>Hohlbein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+landscapes+of+DNA+polymerase+I+and+mutator+derivatives+establish+fidelity+checkpoints+for+nucleotide+insertion.">Conformational landscapes of DNA polymerase I and mutator derivatives establish fidelity checkpoints for nucleotide insertion.</a> Nature communications. 4, 2131 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

יכולים להיות מגוונים פרמטרים רבים במהלך electroporation התא ורכישת נתונים בהתאם למערכת הביולוגית של עניין ואופייה המדויק של הניסוי (ברמת תא או ניתוח מולקולה בודדת). לדוגמא, כאשר electroporating DNA של חיידקים, 0.25-5 pmol של שברי dsDNA כותרת מוביל ליעילות הפנמה נמוכה, המאפשר זיהוי מולקולה בודדת ישיר (כלומר., ללא צורך בphotobleaching לפני כן). מעל 5 pmol dsDNA, תאים נוטים להיות עמוסים במיוחד, משטר מתאים יותר לניתוח תא בודד. כל DNAs שהכותרת צריך להיות גם בעבר על מנת להסיר כל שמץ של צבע חופשי מטוהר ג&#39;ל (לא הגיב fluorophore) מפתרון מניות DNA. חוץ מזה, בעיות פוטנציאליות עם השפלה DNA, במיוחד עבור ניסויי smFRET, ניתן לטפל באמצעות DNAs עם חומצות טבעיות גרעין, או מוטיבים המגנים על termini exonuclease הנגיש כגון לולאות סיכת ראש. adjustabl נוסףפרמטר דואר בelectroporation הוא עוצמת השדה מיושמת במהלך electroporation. עוצמת שדה נמוכה (~ ק ו 1 / סנטימטר) יוביל ליעילות טעינה נמוכה מתאימה ללימודי מולקולה בודדת. עוצמת שדה גבוהה יותר (עד 1.8 קילו וולט / סנטימטר) תגביר את יעילות הטעינה; עם זאת, יש מתאם הפוך בין עוצמת שדה וכדאיויות תא לאחר electroporation (ראה איור 4). להתייחסות, עוצמת שדה רגילה המשמשת לחיידקים והשמרים electroporation היא ~ 1.5 kV / סנטימטר. קבוע הזמן, המייצג את האורך של הריקבון הזה, הוא פרמטר נוח למעקב, שכן טיפות קבועות הזמן בהקדם כל תופעה קשתית מתרחשת בקובט. תחת הגדרות רגילות, קבוע הזמן צריך להיות גדולה מ 4 ms; ערכים נמוכים עלולים להוביל ליעילות טעינה נמוכה או תאים שניזוקו אף שאינם טעונים. רוב electroporators מציע תארים אחרים של חופש (כמו &quot;חיתוך דופק&quot; או &quot;דופק צורה&quot;) אשר יכול להיות שונה כדי לכוון שניטעינת תא כדאיות. אנחנו מוחלים בשיטה זו לשני החיידקים ושמרים, אולם הליכים דומים צריכים גם לאפשר להפנמה של מולקולות ביולוגיות שכותרתו לתוך תאי יונקים באמצעות הגדרות מתאימות electroporator מאז הקרום שלהם הוא למעשה פחות מורכב (bilayer שומנים יחיד) ומאז electroporation כבר נעשה שימוש בתאים כאלה 21. כאשר הפנמת חלבונים שכותרתו, כל הצבע החופשי צריך להיות מוסר מelectroporation לפני פתרון מניות חלבון שכותרתו. מולקולות צבע חינם, בשל הגודל הקטן שלהם, יכולות להיות מופנמות באופן מועדף על החלבונים של עניין, וקשה להבחין בניתוח נתונים (למרות דיפוזיה מהירה יותר הצפויה שלהם). כמדריך, למדגם בחלבון הנקרא באופן אורגני להיות מתאים לelectroporation, כמות שנותר לצבוע חופשיים צריכה להיות מתחת ל -2% (שזוהה באמצעות סריקת ניאון של SDS-PAGE) 22. תהליך זה הוא חשוב במיוחד,כחלק ממולקולות עלולות להידבק לקרומים החיצוניים של חיידקים או פטריות electroporated. מבחינה זו, מדגם הביקורת השלילי צריך להציג עוצמת הקרינה לכל תא באופן ברור נמוכה מתאי electroporated, באופן אידיאלי נמוכה כמו רמת autofluorescence של תאים ריקים (תאים שלא היה מודגרות עם כל מולקולות ביולוגיות שכותרתו fluorescently ולא electroporated, איור 2). כמו בdsDNA, יעילות ההפנמה של חלבונים שכותרתו צמודה לסכום של מולקולות ביולוגיות הוסיפו לתאים לפני electroporation. עם זאת, פרמטרים אחרים, כגון גודל ותשלום, לשחק תפקיד בהפנמה. חלבונים קטנים להפגין יעילות הפנמה גבוהה, ואילו חלבונים גדולים יותר (עד 98 KDA) יכול להיות מופנם בהצלחה אבל עם יעילות נמוכה יותר (איור 5) 26. נקודת isolelectric של החלבון, אינטראקציות אפשריות עם קרום התא ופרמטרים physicochemical אחרים גםטעינת תא השפעה במהלך electroporation. כתוצאה מכך, משתמשים צריכים לייעל את הניסויים למערכת משלהם, בידיעה כי ריכוז ראשוני גבוה של חלבון שכותרת (&gt; 50 מיקרומטר) ייתן את הסיכוי הטוב ביותר לטעינה מוצלחת. Electroporation מציע גם כלי חדש להפריע ולנתח פונקציה סלולרית על ידי החדרת חלבונים ומולקולות ביולוגיות אחרות לתאים (שכותרתו או ללא תווית או). ניסויי RNA פולימראז T7 (איור 5 ג) הווה דוגמא כזו של ניסוי שבו אנחנו יכולים להציג את biomolecule שיכול לשנות ביטוי גני in vivo באמצעות electroporation. בעת ביצוע ניסויי הקרינה מולקולה בודדת, תאורת TIR בדרך כלל העדיפה על פני מצבי תאורה אחרים כפי שהוא מציע יחס אות לרעש הטוב ביותר על ידי fluorophores רק מרגשת בתוך קטע דק מעל פני השטח coverslip (~ 100 ננומטר). עם זאת מולקולות ביולוגי הדמיה שכותרתו לשדר בתוך מיקרואורגניזמים חיים עשויות מחדשמקהלת תאורה עמוקה יותר (עד 0.8 מיקרומטר לE. coli). תאורה עמוקה מושגת במצב חילו, תוך שמירה על יחס אות לרעש גבוה. מצד השני, הדמיה שדה רחבה היא חשובה במיוחד לניתוח photobleaching צעד חכם, שבו המשתמש הוא לאמוד את מספר המולקולות הופנמו על ידי photobleaching תא טעון כל עם כוח גבוה לייזר וחלוקת עוצמת הקרינה סלולארי הראשונית מעוצמת האחידה מיוצרת על ידי מולקולה בודדת (שלב photobleaching בודד, איור 3). ההדמיה Widefield נדרשה גם למעקב מולקולה ארוך טווח על מנת למקם את המולקולות לשדר עניין גם אם המסלולים שלהם לכסות את כל נפח התא. בפרוטוקול זה, אנו מציגים כיצד electroporation, טכניקה סטנדרטית לביולוגים וביוכימאים לאספקת חומצות גרעין בתאים, מהווה שיטה פשוטה להעברת מולקולות ביולוגי ניאון בסוגי תאים שונים. ההוא רומן, טכניקת תפוקה גבוהה מציעה כלי ייחודי להתבונן מולקולות שכותרתו בסביבה הטבעית שלהם. במולקולות ביולוגיות בנוסף שכותרתו עם fluorophores מכסה מגוון רחב של אורכי גל, electroporation יכול לספק מולקולות שונה עם קבוצות כימיות רבות, כגון נוקלאוטידים וחומצות אמינו לא טבעיים, chelators מתכת, crosslinkers, וקבוצות כולאות. אם המערכת הביולוגית של עניין היא לא חיונית להתפתחות התאים, הגן המקודד לחלבון המטרה יכול להיות גם שנמחק (או דפק למטה), על מנת להבטיח כי החלבונים נצפו לאחר הפנמה כל (או רוב) של בריכת החלבון תאית מייצגים . בעיקרו של דבר, electroporation יכול &quot;השתלה&quot; הגמישות של במבחנה bioconjugates לתאים חיים, ולכן תועלת מאמצים בביולוגיה סינתטית, ביולוגיה של מערכות, ובגילוי מולקולה בודדת vivo.

רוב מחקרי הקרינה בתוך תאי חיים תלויים בשילובי חלבון עם חלבוני ניאון (fps), כגון GFP 1. תגי ניאון אלה מאפשרים לימודים של עותק מספר, דפוס דיפוזיה או לוקליזציה של חלבונים מעורבים בתהליכים כגון ביטוי גנים או תחבורת קרום 2-7. FPS מציע סגוליות תיוג גבוה, יישום קל, והם זמינים במלאי גדול של גרסאות עם photophysical השונים ותכונות כימיות 1. עם זאת, fluorophores האורגני יישאר בחירת ראש לניסויים במבחנה בשל photostability הגדולה יותר (עד 100 פי יציב יותר מFPS) 8,9 גודל קטן, (עד 100 פי נפח קטן יותר FPS) וקלות תיוג intramolecular (בעיקר באמצעות השימוש בשאריות ציסטאין). כל הגורמים הללו הם חשובים במיוחד לקרינת מולקולה בודדת וסריג לומד 10. COMBIN שיטות הפנמה כמהing היתרונות של תיוג אורגני ובאיתור vivo הוכנס בעשור האחרון; עם זאת, שיטות כאלה או להעסיק תגי פוליפפטידים גדולים יחסית (תגים למשל, TMP, HALO, או 20 kDa SNAP) 11-14, דורשות השימוש בחומצות אמינו לא טבעיות 15, או מוגבלות לתאים גדולים, חד-קרום האיקריוטים (למשל. , לגרד טעינה, טעינת מזרק, microinjection) 16-19. פרוטוקול זה מתאר שיטת הפנמת רומן, פשוט ותפוקה גבוהה כי זוגות היתרונות של fluorophores האורגנית עם תצפית in vivo. כדי ששיטה זו, אנו מותאמים הליך electroporation הנפוץ להפוך תאים עם DNA פלסמיד 20,21 כדי לטעון מיקרואורגניזמים, כגון E. coli או S. cerevisiae עם מולקולות ביולוגיות שכותרתו אורגנית. הפרוטוקול כולל 4 צעדים פשוטים: דגירה של תאים עם מולקולות ביולוגיות שכותרתו,electroporation, התאוששות תא, ושטיפת תא כדי להסיר מולקולות ביולוגיות-הפנים שאינם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול זה electroporation, כמו גם את תהליכי ההדמיה תא וניתוח נתונים ללמוד הקרינה מבוססת תאים ומולקולה בודדת וסריג אותות. Electroporation מסתמכת על פריקת שדה חשמלי במתח גבוה על פני השעיה תא כוח יונית נמוכה כדי ליצור נקבוביות קרום חולף דרכו מולקולות ביולוגיות יכולות להיכנס לתאים (איור 1) 20,21. בדיוק כמו עם הפיכתו של חיידקים או פטריות עם פלסמיד דנ&quot;א, תאים צריכים להיות מוכנים לפני electroporation כדי להבטיח electrocompetency. הליך זה, בהיקף של כמה צעדי שטיפה במים, מגדיל את החדירות הממברנה ומוריד את החוזק היוני של פתרון התא, כדי למנוע קשתי בקובט electroporation. בפרוטוקול זה, יכולים להיות מוכן תאים כמפורט להלן (ראה פרוטוקול: 1.1) או שנרכשו מספק מסחרי<html> s. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig1.jpg" /> איור 1: ייצוג סכמטי של פרוטוקול ההפנמה משמאל לימין:. להוסיף כמה מיקרוליטר של מולקולות ביולוגיות שכותרת לaliquot של תאי electrocompetent (קטעי דנ&quot;א כפול שכותרתו וחיידקים בדוגמא זו); דגירה 1 עד 10 דקות על קרח ומעביר לקובט electroporation טרום צונן; electroporate ולאחר מכן להוסיף 0.5-1 מיליליטר בינוני עשיר לתאים מייד לאחר; לדגור על 37 ° C (או בטמפרטורה הנדרשת על ידי האורגניזם, למשל, 29 ° C עבור שמרים) כדי לאפשר לתאים להתאושש; לבצע 5 צעדי כביסה כדי להסיר כל שאינן מופנמת-מולקולות עודפות שכותרתו; resuspend את הכדור האחרון ב100-200 μl של חיץ PBS ופיפטה 10 μl על כרית agarose; לכסות את משטח עם coverslip ניקה ותמונה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי (במצב רחב שדה או במצב חילו). התחת = &quot;jove_content&quot;&gt; תאי Electrocompetent מודגרת עם המולקולות הביולוגיות שכותרתו רק לפני electroporation, אשר יכול להתבצע באמצעות תקן electroporators נמצא ברוב המעבדות ביוכימיה. מייד לאחר electroporation, תאים מודגרת במדיום עשיר המאפשר ההתאוששות שלהם לפני הכביסה (איור 1). העודף של אי-הפנימו מולקולות ביולוגיות שכותרתו יוסר ראשון על ידי שטיפה במאגר המכיל ריכוז גבוה למדי של מלח וקצת חומר ניקוי (ראה פרוטוקול: 3.3). הנוכחות של מלח משבשת אינטראקציות אלקטרוסטטיות שאינם ספציפיות שהוקמו על ידי אי-הפנימו מולקולות ביולוגיות שכותרתו שאחרת עשוי להידבק בקרום החיצוני. בדומה לכך, הנוכחות של חומר ניקוי בכביסת החיץ משבשת אינטראקציות הידרופוביות שאינם ספציפיות. בעוד הפנמת DNA היא פשוטה (איור 2), אמצעי זהירות יש לנקוט כאשר הפנמת חלבונים שכותרתו באמצעות electroporation. ראשית, מניית המדגם של חלבון הנקרא באופן אורגני עשוי עדיין מכיל אחוז קטן של צבע חופשי. מולקולות צבע חינם הן הרבה יותר קטנות מאשר חלבונים ולפיכך יתכן כי הפנימו מועדף. כדי להבטיח כי רובם המכריע של נצפו מולקולות ניאון הפנימו מתאים לחלבון של עניין, מדגם החלבון הראשוני צריך להכיל פחות מ ~ 2% צבע חופשי (איור 5) 22. העודף של אי-הפנימו חלבונים שכותרתו יכול גם להיצמד לקרום התא החיצוני לאחר electroporation; תופעה זו היא חלבון ספציפי וצריכה להיבדק לכל חלבון חדש. אנו מציעים מספר אפשרויות המאפשרות את הסרתם של חלבונים-הפנים שאינם ממדגם התא הטעון (ראה פרוטוקול: 3.3.3). לבסוף, תאי resuspended בנפח קטן של חיץ פוספט וpipetted על כרית agarose, המאפשרים ההדמיה שלהם במיקרוסקופ פלואורסצנטי. קיבוע על רפידות agarose הוא simplדואר ודרך יעילה של תאי הדמיה על coverslip מבלי לפגוע שלמותם. הכרית צריכה להכיל מדיום תרבות נמוכה הקרינה. הדמיה תא יכולה להתבצע במיקרוסקופ או בwidefield, סך הקרינה השתקפות פנימית (TIRF) או באמצעות הילו (מאוד משופע וגיליון אופטי רבודה). בתצורה חילו, קרן הלייזר חודרת עמוקה יותר לתוך הדגימה מאשר בTIRF, עדיין לא להאיר את המדגם כולו כלwidefield, המאפשר יחס אות לרעש גדול יותר 23. בהתאם לרזולוצית כוח הלייזר וזמן שימוש, ניתן לספור מולקולות ביולוגיות הפנימו (באמצעות ניתוח photobleaching-שלבים, איור 3), מקומיות, או במעקב 24-28. הפנמה של מבנים שכותרתו כפליים עם זוג סריג של fluorophores מאפשרת כימות של סריג הן בתא בודד או רמות מולקולה בודדת (איור 6). יכולים להיות מגוונים פרמטרים שוניםבהתאם לפלט הרצוי והמערכת הביולוגית למדה. ראשית, כמות החומר הפנים לכל תא יכולה להיות מכוונת על ידי שינוי הריכוז של מולקולות ביולוגיות שכותרתו נוספה לelectroporation התאים הקודם (איור 2). עוצמת שדה Electroporation תשפיע גם הן את יעילות הטעינה וכדאיויות תא; כצפוי, בזמן שמגביר את יעילות טעינה עם עוצמת שדה גובר, את הכדאיות של תאי electroporated יורדת (איור 4 א). ניתן לכמת את שני פרמטרים על ידי הקלטת אחוז טעון וחלוקת תאים לאחר electroporation. assay כדאיות זה בשילוב עם ההדמיה הקרינה גם מאמת את התצפית של מולקולות ביולוגיות הפנימו בתאים חיים ומאפשר תצפית רציפה במשך כמה דורות (איור 4). לסיכום, פרוטוקול זה מאפשר ההפנמה של מולקולות דנ&quot;א וחלבון fluorescently שכותרתו לE. coli או S. cerevisiae 26. מולקולות בודדות שכותרתו עם fluorophores האורגני יכולות להיות במעקב עם הרזולוציה spatiotemporal גבוהה ללוחות זמנים בסדר גודל יותר מFPS. לבסוף, שיטה זו תואמת widefield, TIRF וזיהוי confocal, כמו גם תוכניות עירור פעם, כגון ALEX (לסירוגין עירור לייזר 28,29).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="834">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:227px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:321px;">ElectroMax DH5-alpha Comptent cells</td>
			<td style="width:227px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11319-019</td>
			<td>or any other commercial or lab-mage electrocompetant bacteria or yeast.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">EZ Rich Defined Madia</td>
			<td style="width:227px;">Teknova</td>
			<td style="width:119px;">M2105</td>
			<td>low fluorescence rich media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroPulser Electroporation Apparatus&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">165-2100</td>
			<td>or any classical electroporator for microorganism transformation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Certified Molecular Biology agarose</td>
			<td style="width:227px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">161-3100</td>
			<td>low fluorescence agarose for agarose pad</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:321px;">Microscope coverslips No 1.5 thickness</td>
			<td style="width:227px;">Menzel</td>
			<td style="width:119px;">BB024060SC</td>
			<td>remove background particles by heating slides in furnace at 500 &#176;C for 1h</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Single-molecule fluorescence microscope</td>
			<td style="width:227px;">Home-built</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>described in REFs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Localization software</td>
			<td style="width:227px;">Custom-written, available online</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Tracking software</td>
			<td style="width:227px;">Available online</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>MATLAB implementation by Blair and Dufresne.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

internalization and observation of fluorescent biomolecules in living microorganisms via electroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation. 
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisi&#230;, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.

Watch this Scientific Journal Video about Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation at JoVE.com

Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.

הפנמה והתבוננות של פלורסנט מולקולות ביולוגיים במיקרואורגניזמים שחיים דרך Electroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

internalization-observation-fluorescent-biomolecules-living

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

16.8K Views.  University of Oxford. Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.

Video: Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

Electroporation of Mycobacteria

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly caused by the thick and waxy cell wall, but is compounded by the fact that most molecular techniques have been developed for distantly-related species such as Escherichia coli and Bacillus subtilis. In spite of these obstacles, mycobacterial plasmids have been identified and DNA transformation of many mycobacterial species have now been described. The most successful method for introducing DNA into mycobacteria is electroporation. Many parameters contribute to successful transformation; these include the species/strain, the nature of the transforming DNA, the selectable marker used, the growth medium, and the  conditions for the electroporation pulse. Optimized methods for the transformation of both slow- and fast-grower are detailed here. Transformation efficiencies for different mycobacterial species and with various selectable markers are reported.

Mycobacterial pathogenic strategies remain poorly understood. The slow growth rate of most species, the impenetrable nature of the cell-wall, and the hazards of working with pathogens make mycobacteria difficult to study and are largely responsible for our poor understanding of these organisms. In this video we will demonstrate the technique of electroporation, which involves subjecting cells to a brief high electrical impulse to allow the entry of DNA. It is the most widely used method for introducing DNA into mycobacterial cells.

Electroporation של mycobacteria

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

דימות של תא חי F-אקטין Dynamics באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

תרבות ראשיים electroporation פלסמיד של האיבר Murine של קורטי.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

צורה הדמיה תא שינוי חיים תסיסנית עוברים

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

מדידת קינטיקה של שעתוק mRNA בתאים חיים יחיד

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. Maintenance of proteasome activity was implicated in many key cellular processes, like cell's stress response 3, cell cycle regulation and cellular differentiation 4 or in immune system response 5. The dysfunction of the ubiquitin-proteasome system has been related to the development of tumors and neurodegenerative diseases 4, 6. Additionally, a decrease in proteasome activity was found as a feature of cellular senescence and organismal aging 7, 8, 9, 10. Here, we present a method to measure ubiquitin-proteasome activity in living cells using a GFP-dgn fusion protein. To be able to monitor ubiquitin-proteasome activity in living primary cells, complementary DNA constructs coding for a green fluorescent protein (GFP)&#x2013;dgn fusion protein (GFP&#x2013;dgn, unstable) and a variant carrying a frameshift mutation (GFP&#x2013;dgnFS, stable 11) are inserted in lentiviral expression vectors. We prefer this technique over traditional transfection techniques because it guarantees a very high transfection efficiency independent of the cell type or the age of the donor. The difference between fluorescence displayed by the GFP&#x2013;dgnFS (stable) protein and the destabilized protein (GFP-dgn) in the absence or presence of proteasome inhibitor can be used to estimate ubiquitin-proteasome activity in each particular cell strain. These differences can be monitored by epifluorescence microscopy or can be measured by flow cytometry.

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

A method to monitor ubiquitin-proteasome activity in living cells is described. A degron-destabilized GFP- (GFP-dgn) and a stable GFP-dgnFS fusion protein are generated and transduced into the cell using a lentiviral expression vector. This technique allows to generate a stable GFP-dgn/GFP-dgnFS expressing cell line in which ubiquitin-proteasome activity can be easily assessed using epifluorescence or flow cytometry.

ניטור של פעילות יוביקוויטין-הפרוטאזום בתאי חיים באמצעות ערער-חלבון Degron (DGN) ירוק פלורסנט חלבון (GFP)-מבוסס כתב

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific properties, such as binding affinity, agonist or antagonist behavior, or stability, relative to the native sequence. Protein design lies at the center of current advances drug design and discovery. Not only does protein design provide predictions for potentially useful drug targets, but it also enhances our understanding of the protein folding process and protein-protein interactions. Experimental methods such as directed evolution have shown success in protein design. However, such methods are restricted by the limited sequence space that can be searched tractably. In contrast, computational design strategies allow for the screening of a much larger set of sequences covering a wide variety of properties and functionality. We have developed a range of computational de novo protein design methods capable of tackling several important areas of protein design. These include the design of monomeric proteins for increased stability and complexes for increased binding affinity.
To disseminate these methods for broader use we present Protein WISDOM (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>), a tool that provides automated methods for a variety of protein design problems. Structural templates are submitted to initialize the design process. The first stage of design is an optimization sequence selection stage that aims at improving stability through minimization of potential energy in the sequence space. Selected sequences are then run through a fold specificity stage and a binding affinity stage. A rank-ordered list of the sequences for each step of the process, along with relevant designed structures, provides the user with a comprehensive quantitative assessment of the design. Here we provide the details of each design method, as well as several notable experimental successes attained through the use of the methods.

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

We developed computational de novo protein design methods capable of tackling several important areas of protein design. To disseminate these methods we present Protein WISDOM, an online tool for protein design (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>). Starting from a structural template, design of monomeric proteins for increased stability and complexes for increased binding affinity can be performed.

חוכמת חלבון: Workbench ל<em&gt; בסיליקון</em&gt;<em&gt; דה נובו</em&gt; עיצוב של ביומולקולות

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

בVivo Microinjection וElectroporation של אשך העכבר

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

Receptor trafficking modulates signaling and cell responsiveness to ligands and is, itself, responsive to cell conditions, including ligand-induced signaling. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing drug-induced receptor trafficking using immunolabeling and colocalizational analysis.

מעקב אחר שינויים בהשפעת סמים בסחר פוסט-הפנמת קולטן על ידי ניתוח Colocalizational

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...