This work was supported by the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) M&#252;nster (SEED 03/12, SB), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB TR128, TP B6 to S.G.M. ME3283/2-1 to S.G.M.) and by Innovative Medizinische Forschung, M&#252;nster (I-BI111316, SB and SGM).

כל הניסויים באמצעות עכברים צריכים להתבצע בהתאם להנחיות ועדת טיפול בבעלי החיים ושימוש המוסדית, בהתאמה. 1. הערות כלליות לניסויים בעכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על העכברים בתנאי הפתוגן ללא ולאפשר להם גישה כלרצונך מזון ומים. הערה: חשוב להשתמש בעכברי גיל והתאמת מין בקבוצות ניסוי כי דפוסים חיסוניים יכולים להשתנות עם גיל ומין. </li></ol> 2. CD8 + T לתאי הכנה והפעלה של OVA ספציפי (OT-I) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע גירוי של תאי OT-T אני כמתואר להלן 5 ימים לפני הכנת פרוסות מוח. הערה: 5 x 10 5 מפעיל מופעל CD8 + OT-אני תאי T ריכוז 5 x (CD8 + T-תאים של עכברים הטרנסגניים הכרת פפטיד OVA 257-264 רק בהקשר של מולקולות MHC-I) יש צורך לכל פרוסה 10 5 נבחר ניסויברית כאופטימלית לטובת אינטראקציה תאי תאים טובה ברגע שהתאים מתחילים נודדים לפרוסה ו, באותו הזמן, את כמות התאים היא לא גבוהה מדי כדי לגרום לתגובת יתר המאפשר תא בודד ספירת 8,18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדיום לculturing OT-T-תאים. להשלים DMEM 500 מיליליטר עם 5% עוברי עגל בסרום (FCS), 10 מ&quot;מ HEPES, L-גלוטמין 2 מ&quot;מ, 50 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, חומצות אמינו החיוני 1% ו- 25 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין. אחסן הבינוני על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הטחול של עכברים הטרנסגניים OT-כמו לכל התייחסות 16. העבר אותם למדיום מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור השעיה תא בודדת על ידי רסוק טחולים דרך מסננת השעיה ו צנטריפוגות 70 מיקרומטר ב XG 300 דקות 5, 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השעיה תא עם 5 מיליליטר אמוניום כלוריד, אשלגן (ACK) חיץ (150 מ&quot;מ NH 4 Cl, 10 מ&quot;מ KHCO 3, 0.1 מ&quot;מ EDTA, pH 7.3) במשך 5 דקות כדי lyse תאי דם אדומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפסיק incubatiעל עם מדיום 10 מיליליטר ו צנטריפוגות זה שוב כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל השעיה התא בינוני ולחשב מספרים. פלייט תאים בצפיפות של 3 x 10 7 תאים / גם בצלחת 12 גם ו ראש על ידי דגירה עם OVA 257-264 (SIINFEKL; 1 ננומטר) ואינטרלוקין 2 (IL-2) (500 IU / ml) ל 5 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 4 ימים, להוסיף IL-2 בריכוז של 500 IU / ml שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר גירוי, לטהר OT-אני תאי T מהשעית תא באמצעות עכבר סלקציה שלילי מבוסס ערכת בידוד תא T CD8 + הבאים הוראות יצרן. טיהור מבוססת על הדלדול של כל מי שאינו CD8 + התאים באמצעות קוקטייל של נוגדנים נגד CD4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC Class II, Ter-119, וTCRγ / Δ אשר לאחר מכן הושלך על ידי שימוש בעמודות מגנטיות עבור elution של CD8 + T לתאים המטוהרים. הערה: צעדים קריטיים בprocedu זהמחדש מסומנים על ידי מייצר: חשובה שהתגובה כרוכה רק תאים בודדים, כי הנוכחות של גושים יכולה לחסום את הטור במהלך שלב elution; הספירה של התא לפני הוספת קוקטייל Byotin חשובה לתואר של טוהר של המדגם וההליך צריכה להתבצע על קרח כדי למזער איגודי נוגדן נוקבים. </li></ol> 3. הכנת פרוסות המוח חריפה ושיתוף התרבות עם OT-אני תאי T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הכנת המוח החריף פרוס 19, להכין פתרון placedine קר כקרח פיסיולוגי מלוח באמצעות 200 סוכרוז מ&quot;מ, 20 מ&quot;מ צינורות, 2.5 מ&quot;מ KCL, 1.25 דקסטרוז 0.5 CaCl 2 ו -10 מ&quot;מ לאא 2 PO 4, 10 מ&quot;מ MgSO 4, ומלאכותי נוזל השדרתי (ACSF) באמצעות 125 mM NaCl, 2.5 KCl, 1.25 לאא 2 PO 4, 24 מ&quot;מ NaHCO 3, 2 מ&quot;מ MgSO 4, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 10 מ&quot;מ דקסטרוז. התאם את ה- pH של כל פתרון ל7.35 על ידי using NaOH. לפני התאמת pH של ACSF, פתרון חייב להיות בועות בתערובת של 95% O 2, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לקרר את הפתרונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי 8 - עכברים 10 שבוע ישנים (למשל, C57Bl / 6 כשליטה או עכברי ODC-OVA מהונדסים 17 עם שאיפה באמצעות isoflurane 5.0%, 5.0% halothane או להזריק 100 מ&quot;ג / קילוגרם קטמין ו -10 מ&quot;ג / xylazine קילוגרם משקל גוף באמצעות ה- IP חכה להרדמה ולהשתמש בקמצוץ הבוהן כדי להעריך את הרמה של הרדמה ולערוף אותם בבת אחת. להרדים את העכברים כמו לכל טיפול בבעלי חיים מוסדי ולהשתמש בקריטריוני וועדה להמתת חסד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים עכבר בעמדת הגחון. לחטא ולחתוך קרקפת sagittally. פתח את עצם גולגולת sagitally, להסיר את המוח במהירות בעזרת סקופ ולתקן אותה על הצלחת של vibratome באמצעות דבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את הצלחת עם הפתרון מוכן placedine קר כקרח הפיזיולוגי מלוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך 300 מיקרומטר פרוסות העטרה עם vibratome. הערה: הליך זה הוא יודעn להניב דגימות רקמה שלמות קיימא מתאימות ללימודים סלולריים פונקציונליים בתוך פרק זמן של לפחות 8 שעות 19-21 זמן. ואכן, לאחר פרק זמן זה, כבר מתחיל לאחר 6 שעות, הכנת תערוכות איכות מופחתת, כלומר שינויים במאפיינים בסיסיים ופונקציונליים כמו דור פוטנציאל פעולה והפצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חתך, להעביר פרוסה אחת מייד לבאר כל צלחת 12 גם מלא בACSF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להוסיף 5 x 10 5 תאי OT-T אני לכל פרוסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה פרוסות לתקופה של עד 8 ​​שעות בחממה (37 ° C, 5% CO 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הדגירה, פרוסות קציר ולהטביע אותם על ידי שימוש ברקמה-tek מתחם OCT ולהקפיא אותם בחנקן נוזלי. לאחסן אותם ב -20 ° C ללימודים היסטולוגית נוספים לדוגמה, להעריך מבנה עצבי (למשל, אנטי-MAPII באמצעות או נוגדנים נגד synaptophysin) או אפופטוזיס (למשל, באמצעות אנטי caspase-3 נוגדנים ואנטי-אנטי NeuNגופים) על פי נהלים קבועים. </li></ol>

<ol>
	<li>Moll, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+demyelination+in+PML+and+MS:+Similarities+and+differences.">Cortical demyelination in PML and MS: Similarities and differences.</a> Neurology. 70 (5), 336-343 (2008).</li><li>Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transected+neurites,+apoptotic+neurons,+and+reduced+inflammation+in+cortical+multiple+sclerosis+lesions.">Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions.</a> Ann Neurol. 50 (3), 389-400 (2001).</li><li>Bo, L., Vedeler, C. A., Nyland, H. I., Trapp, B. D., Mork, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpial+demyelination+in+the+cerebral+cortex+of+multiple+sclerosis+patients.">Subpial demyelination in the cerebral cortex of multiple sclerosis patients.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 62 (7), 723-732 (2003).</li><li>Babbe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+expansions+of+CD8(+)+T+cells+dominate+the+T+cell+infiltrate+in+active+multiple+sclerosis+lesions+as+shown+by+micromanipulation+and+single+cell+polymerase+chain+reaction.">Clonal expansions of CD8(+) T cells dominate the T cell infiltrate in active multiple sclerosis lesions as shown by micromanipulation and single cell polymerase chain reaction.</a> J Exp Med. 192 (3), 393-404 (2000).</li><li>Junker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+T-cell+receptor+expression+in+distinct+brain+regions.">Multiple sclerosis: T-cell receptor expression in distinct brain regions.</a> Brain. 130 (11), 2789-2799 (2007).</li><li>Skulina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+brain-infiltrating+CD8++T+cells+persist+as+clonal+expansions+in+the+cerebrospinal+fluid+and+blood.">Multiple sclerosis: brain-infiltrating CD8+ T cells persist as clonal expansions in the cerebrospinal fluid and blood.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2428-2433 (2004).</li><li>Friese, M. A., Fugger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoreactive+CD8++T+cells+in+multiple+sclerosis:+a+new+target+for+therapy.">Autoreactive CD8+ T cells in multiple sclerosis: a new target for therapy.</a> Brain. 128 (8), 1747-1763 (2005).</li><li>Melzer, N., Meuth, S. G., Wiendl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+cells+and+neuronal+damage:+direct+and+collateral+mechanisms+of+cytotoxicity+and+impaired+electrical+excitability).">CD8+ T cells and neuronal damage: direct and collateral mechanisms of cytotoxicity and impaired electrical excitability).</a> FASEB J. 23 (11), 3659-3673 (2009).</li><li>Booss, J., Esiri, M. M., Tourtellotte, W. W., Mason, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistological+analysis+of+T+lymphocyte+subsets+in+the+central+nervous+system+in+chronic+progressive+multiple+sclerosis.">Immunohistological analysis of T lymphocyte subsets in the central nervous system in chronic progressive multiple sclerosis.</a> J Neurol Sci. 62 (1-3), 219-232 (1983).</li><li>Hauser, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+analysis+of+the+cellular+infiltrate+in+multiple+sclerosis+lesions.">Immunohistochemical analysis of the cellular infiltrate in multiple sclerosis lesions.</a> Ann Neurol. 19 (6), 578-587 (1986).</li><li>Hoftberger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules+on+the+different+cell+types+in+multiple+sclerosis+lesions.">Expression of major histocompatibility complex class I molecules on the different cell types in multiple sclerosis lesions.</a> Brain Pathol. 14 (1), 43-50 (2004).</li><li>G&#246;bel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collateral+neuronal+apoptosis+in+CNS+gray+matter+during+an+oligodendrocyte-directed+CD8(+)+T+cell+attack.">Collateral neuronal apoptosis in CNS gray matter during an oligodendrocyte-directed CD8(+) T cell attack.</a> Glia. 58, 469-480 (2010).</li><li>Melzer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+neuronal+cell+death+during+an+oligodendrocyte-directed+CD8++T+cell+attack+in+the+CNS+gray+matter.">Excitotoxic neuronal cell death during an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack in the CNS gray matter.</a> J Neuroinflammation. 10, 121 (2013).</li><li>Huseby, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pathogenic+role+for+myelin-specific+CD8(+)+T+cells+in+a+model+for+multiple+sclerosis.">A pathogenic role for myelin-specific CD8(+) T cells in a model for multiple sclerosis.</a> J Exp Med. 194 (5), 669-676 (2001).</li><li>McPherson, S. W., Heuss, N. D., Roehrich, H., Gregerson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bystander+killing+of+neurons+by+cytotoxic+T+cells+specific+for+a+glial+antigen.">Bystander killing of neurons by cytotoxic T cells specific for a glial antigen.</a> Glia. 53 (5), 457-466 (2006).</li><li>Hogquist, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+antagonist+peptides+induce+positive+selection.">T cell receptor antagonist peptides induce positive selection.</a> Cell. 76 (1), 17-27 (1994).</li><li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+transgenic+mice+expressing+ovalbumin+in+oligodendrocytes.">Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in transgenic mice expressing ovalbumin in oligodendrocytes.</a> Eur J Immunol. 36 (1), 207-215 (2006).</li><li>G&#246;bel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+CD25(+)+FoxP3(+)+regulatory+T+cells+suppress+cytotoxicity+of+CD8(+)+effector+T+cells:+implications+for+their+capacity+to+limit+inflammatory+central+nervous+system+damage+at+the+parenchymal+level.">CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) regulatory T cells suppress cytotoxicity of CD8(+) effector T cells: implications for their capacity to limit inflammatory central nervous system damage at the parenchymal level.</a> J Neuroinflammation. 9, 41 (2012).</li><li>Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thin+slice+preparation+for+patch+clamp+recordings+from+neurones+of+the+mammalian+central+nervous+system.">A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system.</a> Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).</li><li>Meuth, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+TWIK-related+acid-sensitive+K++channel+1+(TASK1)+and+TASK3+channels+to+the+control+of+activity+modes+in+thalamocortical+neurons.">Contribution of TWIK-related acid-sensitive K+ channel 1 (TASK1) and TASK3 channels to the control of activity modes in thalamocortical neurons.</a> J Neurosci. 23 (16), 6460-6469 (2003).</li><li>Misgeld, U., Frotscher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+the+viability+of+neurons+in+hippocampal+slices+on+oxygen+supply.">Dependence of the viability of neurons in hippocampal slices on oxygen supply.</a> Brain Res Bull. 8 (1), 95-100 (1982).</li><li>Ling, C., Verbny, Y. I., Banks, M. I., Sandor, M., Fabry, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+activation+of+antigen-specific+CD8++T+cells+in+the+presence+of+antigen+in+organotypic+brain+slices.">In situ activation of antigen-specific CD8+ T cells in the presence of antigen in organotypic brain slices.</a> J Immunol. 180, 8393-8399 (2008).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

מודלים של בעלי חיים שונים תוארו בעשורים האחרונים לטיפול במאפייני פתולוגיים של הפרעות demyelinating דלקתיות כמו טרשת נפוצה. בvivo מודלים עכבר והחולדה נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקות את תכונות pathophysiological של המחלה, כלומר, ניתוח של ההשלכות של תהליכי demyelination וחידוש יצירת המיאלין ושל פרקים מתמזגים של דלקת וניוון של מערכת עצבים. עם זאת, רק גישה vivo לשעבר מאפשרת לנתח את המנגנונים העומדים בבסיס המדויק. הכנת פרוסות מוח חריפות היא גם מודל לתפוצה רחבה ויכולה להיחשב כאמין ושכפול. בשילוב עם הבידוד והדגירה של תאי מערכת חיסון oligodendrocyte ספציפי, ניתן להשתמש בו כדי לענות על שאלות ניסוי ספציפיות, במיוחד במונחים של לימוד מנגנון וקינטיקה של התקפת תא ותא חיסון - אינטראקציות תא. vivo לשעבר גישות אחרות ידועות ונרחבותמשמש 22 אבל החידוש של הפרוטוקול שלנו בהספציפיות של היעד שניתן לערער על ידי ביצוע שיתוף stainings &quot;הדרה&quot; שונה, כלומר אימות immunoreactivity Caspase3 בWT נחשף או לא נחשף לתאי OT-T אני (ראה איור 2 ג) . כמה נקודות קריטיות בעת העריכה צריכה להילקח בחשבון, כלומר ההגדרות הניסיוניות, כדי להבטיח שניסויים מבוצעים נכונים מתודולוגית; לתוקף פנימי, בידוד וגירוי של התאים חיסוניים המשמשים צריך להיות מבוקר על בסיס קבוע באמצעות למשל, cytometry זרימת ניתוחים (FACS). יתר על כן, חיוניות בדיקה של פרוסות מוח מומלצת מאוד. קבוצות ניסוי צריכה להיות לגיל ומין בהתאמה. תמיד צריכים להיות ביצעו ניסויים בעמידה בתקנות צער בעלי חיים. מגבלות מסוימות של הפרוטוקול צריכים להיות כל הזמן בראש. והכי חשוב, המודל שהוצג הואגישה לשעבר vivo אינה מתאימה לחקות את המצב החיסוני המורכב של הפרעות במערכת עצבים מרכזיות באופן מלא אוטואימוניות. צריך להיות גם נחשב כי המודל משתמש CD8 + T-cell רק מונע תגובה חיסונית. CD4 + T לתאים ותאי B יש תפקיד פחות בולט. פרוטוקולים חלופיים באמצעות תת תא חיסון oligodendrocyte הספציפי אחרים יש לשקול בעת טיפול בסוגי התאים. הממצא היסטולוגית הצפוי הוא oligodendroglial (ראה איור 2 א) ואפופטוזיס העצבי (ראה איור 1 ג). לחלופין, אפופטוזיס של סוגי תאים אחרים יכול להיות מושגת באמצעות למשל, astroglial או תאי מערכת חיסון אנטיגן הספציפי עצביים ומערכות מהונדסים. בפרוטוקול ספציפי זה immunoreactivity של Caspase3 בתאי astroglial היה שלילי בשל ייחודה של המערכת (איור 2). הפרוטוקול המתואר יכול להיחשב כנוירו בסיסיגישה ניסויית חיסונית ועשויה להיות שונה עבור יישומים אחרים. ההליך ניסיוני יכול להיות מיושם בקלות לפרוטוקולים אחרים על ידי פרוסות שונות במוח (למשל, זני עכברים הטרנסגניים שונים) בשילוב עם תת-סוגים שונים אנטיגן הספציפי לתאי מערכת חיסון (למשל, להשתמש בגליקופרוטאין oligodendrocyte המיאלין (ש&quot;א) - CD4 + T הספציפי לתאים ו פרוסות המוח הוכנו מC57Bl עכברים / 6 כדי לטפל בהשפעות שלהם על oligodendroglial ואפופטוזיס העצבי). הפעלה במבחנה של תאי מערכת חיסון יכולות להיות מגוונות לשאלות חיסוניות ספציפיות (למשל, קיטוב לT H 1 או T H 17 תאים). לפעמים, אפופטוזיס מוגבר או מופחת בפרוסות מוח עשוי להיות אתגר ניסיוני. המלצות לפתרון בעיות מסוימות הן: בתחילה, איכות פרוסות מוח תלויה מאוד זמן הכנה, כמו גם מעמד ערך ה- pH, osmolarity וחמצון שלנופתרון ed. יש להבטיח כי תנאים דומים בין הניסויים בלתי תלויים. יתר על כן, הפעלת תאים חיסוניים צריכה להיות מבוקרת על בסיס קבוע. ריכוז אנטיגן אופטימלי עשוי להשתנות. שקול טיטרציה של אנטיגן משמש בעת הקמת הניסויים. כפי שתואר לעיל, הפרוטוקול שהוזכר יכול לשמש כנקודה מוצא לניתוח ההשפעה של תת תא חיסון נוסף (לדוגמא, CD4 + T לתאים, B-תאים) על תקינות מערכת עצבים מרכזית. גישות אלו הן מתאימות במיוחד להפרדה השפיעה על תאי oligodendroglial ועצביים כניתוח היסטולוגית ניתן להעריך באופן יסודי.

Death of oligodendrocytes and destruction of the myelin sheath accompanied by loss of neurons and axons are typical pathological findings in grey matter lesions in individuals suffering from multiple sclerosis (MS)1,2. Cortical lesions can be divided so far in three different subtypes2: subpial, intracortical and leukocortical lesions. In comparison to white matter plaques, infiltrates are characterized by a predominance of CD8+ T-cells, suggesting their possible decisive role in grey matter inflammation3. Furthermore, oligoclonal expansions in blood, cerebrospinal fluid (CSF) and within inflammatory lesions can be found for CD8+ T-cells themselves4-6. 
In line with this, it is assumed that CD8+ T-cells may be specific for different myelin proteins7,8. Indeed, CD8+ T-cells are found near oligodendrocytes and myelin sheaths9,10 that show MHC I expression11 and might therefore be responsible for the loss of the myelin sheath. This process is often seen together with extensive &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal and axonal damage within the central nervous system (CNS) grey matter1,2. In fact, direct and indirect death of oligodendrocytes and neurons is induced by CD8+ T-cells via two different mechanism: (i) cell membrane swelling and rupture due to the formation of cytotoxic granules following the release of perforins and granzymes and (ii) ligation to the Fas receptors or exposition of FasL on their surface8,12,13.
Different types of animal models are established to study the underlying mechanism of the mentioned processes. In this respect, primed CD8+ T-cells specific for autoantigens with induced expression in CNS glial cells, like oligodendrocytes or astrocytes, can be adoptively transferred to analyse &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal and axonal death in grey matter subsequently14,15. To perform such in vivo experiments is a big help to mimic some pathophysiological aspects of MS, however, this approach is not suited to resolve the underlying mechanism and kinetics of axonal damage and neuronal apoptosis.
To overcome these restrictions, an ex vivo approach was established to study the mechanisms and time course of neuronal cell death following a oligondendrocytes-directed CD8+ T-cell attack. Since only oligodendrocytes and therefore myelin sheath production should be targeted by immune cells, MHC class-I-restricted, ovalbumin (OVA)-reactive OT-I Tcells are used16. These cells are subsequently transferred into brain slices obtained from mice selectively expressing OVA in oligodendrocytes (ODC-OVA mice)17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="786">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:187px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:264px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">12-Well-plate</td>
			<td style="width:187px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:187px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">2-Methylbutan</td>
			<td style="width:187px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">3927.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">70 &#181;m strainer</td>
			<td style="width:187px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">CaCl2</td>
			<td style="width:187px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.02382.0500</td>
			<td>calcium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">CD8+-isolation kit</td>
			<td style="width:187px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:119px;">130-090-859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">D(+)-glukose</td>
			<td style="width:187px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.08337.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:187px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31966-021</td>
			<td>warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:187px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">FCS</td>
			<td style="width:187px;">PAA Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">A15-151</td>
			<td>fetal calve serum</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">gentamicin</td>
			<td style="width:187px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">HEPES 1M</td>
			<td style="width:187px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15630-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">IL-2</td>
			<td style="width:187px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">212-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">Isofluran</td>
			<td style="width:187px;">Abbott</td>
			<td style="width:119px;">05260-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:187px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.04933.0500</td>
			<td>potassium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">KHCO3</td>
			<td style="width:187px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9144</td>
			<td>potassium hydrogen carbonate</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:187px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">MgSO4</td>
			<td style="width:187px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.05886.0500</td>
			<td>magnesium sulfate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:187px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">31434</td>
			<td>sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">NaH2PO4 * H2O</td>
			<td style="width:187px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.06346.0500</td>
			<td>sodium hydrogen phosphate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:187px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.06329.0500</td>
			<td>sodium hydrogen carbonate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">NaOH</td>
			<td style="width:187px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.09137.1000</td>
			<td>sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:187px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">213330</td>
			<td>ammonium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Non Essential Amino Acid</td>
			<td style="width:187px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">OVA (257-264)</td>
			<td style="width:187px;">Genscript</td>
			<td style="width:119px;">RP10611</td>
			<td>ovalbumin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">PIPES</td>
			<td style="width:187px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">Sukrose</td>
			<td style="width:187px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.07687.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">Tissue-Tek OCT</td>
			<td style="width:187px;">Sakura</td>
			<td style="width:119px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo model of an oligodendrocyte-directed t-cell attack in acute brain slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

לאחר הדגירה של פרוסות מוח עם CD8 + תאי T-מכוון oligodendrocyte, oligodendrocytes כמו גם נוירונים עוברים אפופטוזיס (2A דמויות ו1C, בהתאמה). סימנים היסטולוגית של אפופטוזיס (למשל, caspase-3, Tunel) ניתן לאתרם מוקדמים לאחר 3 שעות של דגירה. תקופת דגירה לא צריכה להיות ארוכה יותר מ- 8 שעות על מנת להבטיח את איכות טובה של ההכנה ותוצאות לשחזור. ניתן למצוא תאים אפופטוטיים בכל רחבי פרוסה עם עליונות באזורי myelinated. צביעה היסטולוגית למופת של הפרוסה לשלמות מבנית ונוירונים אפופטוטיים מתוארת באיור 1 א-ג. יש נקודות זמן שונות במהלך הדגירה יש בם עניין להערכת פרמטרים תוצאה. כמובן זמן טיפוסי מבוצעים במעבדה שלנו כולל פרמטרים מנתח, כלומר, אינטראקציות תא-תא בזמן 0, ואז 3, 4 ו- 6 שעות (האינטראקציה המקסימלי שנצפו) לאחר<html> האינטראקציה התחילה. כמה מבחני טיפוסיים מעבר ניתוחים היסטולוגית אשר לעתים קרובות יכול להיות מיושמים מתוארות בקצרה: התאוששות T-cell וניתוח לאחר תקופת דגירה של עד 8 שעות, ניתן לשחזר תאי T מפרוסות וניתן להעריך לנתח פרמטרים ביחס למולקולות מפעיל תאיות כגון ייצור ציטוקינים או הפצה. כדי לאחזר תאי T, פרוסות היו מנותקות באופן מכאני ותקווינה ביחד לכל תנאי ניסוי. תאים היו מבודדים מהממשק 30% עד 50% Percoll (Amersham, פרייבורג, גרמניה) לאחר צנטריפוגה שיפוע הצפיפות למשך 30 דקות ב -2,500 סל&quot;ד. בדרך זו, ניתן להשיג תאי mononuclear שנשטפו ומוכתם באופן מיידי באמצעות זרימת cytometry טכניקות (FACS) באמצעות מספר וסוג שונים של נוגדנים המשתנים בהתאם למחקר שאנחנו רוצים לדבר, בפרוטוקול זה, למשל CD8 + 18. &gt; נזק &quot;jove_content&quot; עצבי בטחונות ופונקציונליות מידע על בריאות ופונקציונליות עצביות ניתן להעריך על ידי ביצוע למשל הקלטת אלקטרו, כדי להעריך את המאפיינים בסיסיים של תאי העצב כגון פוטנציאל פעולת דור (APS), כפי שמוצג באיור 1D. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52205/52205fig1highres.jpg" /> איור 1. מבנה מורפולוגי של הפרוסה, כמו גם תוצאות נציג. () מבנה מורפולוגי של פרוסת שעה 8 לאחר דגירה. בר סולם עולה 10 מיקרומטר. נוירונים (ארוחת בוקר) synaptically קשורים כפי שנחשפו על ידי שיתוף מכתים לMAPII (ירוקה) וsynaptophysin צביעה (אדום). בר סולם מייצג 10 מיקרומטר. תמונה מייצגת של תאים אפופטוטיים (caspase-3, אדום) ותאי עצב (NeuN, ירוק) בהיפוקמפוס (C)דגירה שעה חרה 6. בר סולם מייצג 10 מיקרומטר. (ד) הקלטות תיקון מהדק תא יחיד של דור פוטנציאל פעולה עצבית ביצוע שלבים הנוכחיים depolarizing בנוירון בקליפת המוח עכברי. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52205/52205fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52205/52205fig2highres.jpg" /> 2. stainings מרובה איור בוצע על מנת להעריך specifity של הפרוטוקול. () Co-הכתמה של NogoA (אדום), כסמן לoligodendrocytes הבוגרת (ODCs) וCaspase3 (אפופטוזיס, ירוק) מראה כי ODCs מותקף על ידי תאי CD8 + T. התוצאה (B) אינטראקציה שלילית כאשר Caspase3 (אדום) היא שיתוף מוכתם עם GFAP, סמן לתאי גליה (ירוקה). בר סולם מייצג 10 מיקרומטר. (C) Specificity של הפרוטוקול נתמך על ידי שיתוף צביעת תאים עצביים (DAPI, הכחול) עם Caspase3 (אדום), החל מהשמאל: בעלי החיים WT, בעלי חיים שנחשפו לWT-OTI אני תאי T, ODC-ביציות וODC-ביציות נחשף לתאי OTI-T אני. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52205/52205fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices at JoVE.com

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

<em&gt; Ex vivo</em&gt; דגם של התקפת T-Cell-מכוון oligodendrocyte בפרוסות המוח חריף

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

an-ex-vivo-model-an-oligodendrocyte-directed-t-cell-attack-acute

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

6.8K Views.  University of Münster. To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Video: An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

Ex vivo הדמיה של תאים T ב Slices צומת Murine לימפה עם widefield ו מיקרוסקופים confocal

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

אינדוקציה של מחלת שתל נגד מארח ו<em&gt; In Vivo</em&gt; ניטור תא T תוך שימוש במודל Murine MHC התאמה

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been considered as the only source of &#945;&#946;T cells. Yet, thymic involution begins early in life leading to a drastically reduced output of na&#239;ve &#945;&#946;T cells into the periphery. Nevertheless, even centenarians can build immunity against newly acquired pathogens. Recent research suggests extrathymic &#945;&#946;T cell development, however our understanding of pathways that may compensate for thymic loss of function are still rudimental. &#947;&#948; T cells are innate lymphocytes that constitute the main T-cell subset in the tissues. We recently ascribed a so far unappreciated outstanding function to a &#947;&#948; T cell subset by showing that the scarce entity of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells can transdifferentiate into &#945;&#946;T cells in inflammatory conditions. Here, we provide the protocol for the isolation of this progenitor from peripheral blood and its subsequent cultivation. V&#948;1 cells are positively enriched from PBMCs of healthy human donors using magnetic beads, followed by a second step wherein we target the scarce fraction of CD4+ cells with a further magnetic labeling technique. The magnetic force of the second labeling exceeds the one of the first magnetic label, and thus allows the efficient, quantitative and specific positive isolation of the population of interest. We then introduce the technique and culture condition required for cloning and efficiently expanding the cells and for identification of the generated clones by FACS analysis. Thus, we provide a detailed protocol for the purification, culture and ex vivo expansion of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells. This knowledge is prerequisite for studies that relate to this &#945;&#946;T cell progenitor`s biology and for those who aim to identify the molecular triggers that are involved in its transdifferentiation.

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

ובידוד<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבות של Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; תאי T γδ, Extrathymic αβT-תא אב

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

הקמת הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה מולקולות קטנות לווסת ג-di-GMP איתות<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם-מוח באמצעות ספקטרוסקופיית עכבה: התמקדות T Cell-אנדותל אינטראקציה תא

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to efflux the DNA-binding dye Hoechst 33342. This "side population" of cells can be identified using flow cytometric methods after the Hoechst 33342 dye is excited by an ultraviolet (UV) laser. The side population of many cell types contains stem- or progenitor-like cells. However, not all cell types have an identifiable side population. Danio rerio, zebrafish, have a robust in vivo model of T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL), but whether these zebrafish T-ALLs have a side population is unknown. The method described here outlines how to isolate the side population cells in zebrafish T-ALL. To begin, the T-ALL in zebrafish is generated via the microinjection of tol2 plasmids into one-cell stage embryos. Once the tumors have grown to a stage at which they expand into more than half of the animal's body, the T-ALL cells can be harvested. The cells are then stained with Hoechst 33342 and examined by flow cytometry for side population cells. This method has broad applications in zebrafish T-ALL research. While there are no known cell surface markers in zebrafish that confirm whether these side population cells are cancer stem cell-like, in vivo functional transplantation assays are possible. Furthermore, single-cell transcriptomics could be applied to identify the genetic features of these side population cells.

Here, we describe a technique to isolate the side population cells from a zebrafish model of myc-induced T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). This side population assay is highly sensitive and is described for zebrafish T-ALL, but it may be applicable to other malignant and non-malignant zebrafish cell types.

בידוד של האוכלוסייה בצד Myc- המושרה T- תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה דג הזברה

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

אין ויוו Assay גילוי של הפונקציה Cytolytic תא T אנטיגן ספציפי באמצעות מודל החיסון

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

מודל העכבר In Vivo הפעלת תא T CD4 תמים מידה, התפשטות של בידול Th1 הנגרם על ידי תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

מודל תרבות Bursal-תא ראשי לשעבר Vivo עוף ללמוד פתוגנזה וירוס מחלה זיהומית Bursal

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

כימות מבוססי Cytometry זרימה ססגוניות של המיטוכונדריה, Lysosomes בתאי T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...