We would like to thank the Children&#8217;s Hospital at Montefiore, Department of Pediatrics, for providing support for these studies. We would like to thank the National Alopecia Areata Foundation for providing financial support for conducting studies with C3H/HeJ engrafted mice.

הצהרת אתיקה: כל המחקרים שכללו בעלי חיים חייבים להיות מאושרים על ידי IACUC של המוסד (לנתונים העוקב, פרוטוקולים אושרו על ידי מונטיפיורי IACUC, פרוטוקול # 11-6-240 ו# 13-7-100). בעלי חיים מסופקים הרדמה אור כפי שצוינו למטרה הבלעדית של שמירה עליהם עדיין בצילום, אין נהלים כואבים הנדרשים לפרוטוקול זה. 1. רכישת תמונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את מוקד ושדה הראייה לתרמי ג&#39;ל משתמש בנייר עם טקסט מודפס. ודא אחידות של מקור אור על פני אזור מצולם. כדי להבטיח אחידות, להשתמש תרמי ג&#39;ל עם שנבנה במקור אור לצילום רעיוני. אל תשתמש במקור אור שקוף, כמו זה ליצור צללית של החיה שאינה מתאים לניתוח בגווני אפור נוסף. הערה: זה יהיה מקום העכבר קצת מחוץ לפוקוס, המספק מיצוע אופטי על פני האזור של העניין (ROI) ולעזור להפחית את שגיאות quantal לאזורים (כלומר, &lt;10 פיקסל) קטנים מאוד של עניין. אזורים גדולים יותר של ריבית לא יושפעו על ידי קטין זה מתמקד התאמה, לא יהיה להם להיות מושפע מהבדלים בגודל של החיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים בעלי חיים באמצעות קטמין (100 מ&quot;ג / מיליליטר) / xylazine (20 מ&quot;ג / מיליליטר) (2: 1), כפי שזה מספק השפעת הרדמה מהירה והתאוששות מהירה ואופטימלי לצילום בעלי חיים רבים. הערה: הרדמה הוא אישר כאשר החיה היא עדיין מספיק כדי לאפשר צילום. כבעלי חיים בדרך כלל להתאושש מההרדמה האור הזה בתוך 10-15 דקות, הווטרינר לא מומלץ שימוש במשחות עיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח בעלי חיים הרדימו על תרמי ג&#39;ל ביישור אנכי (קרוב במקביל ככל האפשר). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצילומי גב, הנח את בעלי החיים במצב שכיבה עם גפיים מורחבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצילומי הגחון, למקם את בעלי חיים במצב שכיבה, דואג שבעלי החיים לא מסובבים רוחבי. </li&gt; </ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח סטנדרטי בגווני אפור באזור מצולם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלת גישה קרובה. החשוב: Ambient אור יכול להציג את השינויים בחשיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר F-stop לחשיפה המעמידה את האזור של עניין בטווח ליניארי של רכישה (קריאת F-stop). הערה: רוב המערכות תציג בי התמונה רוויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי F-להפסיק להגדרת חשיפה נוספת המעמידה את האזור של עניין בטווח ליניארי על ידי הגדלת או הקטנת F-stop על ידי 1, כך ששניהם הסטנדרטי באזור של עניין ולהישאר בטווח ליניארי של רכישה (התייחסות F- לעצור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע צילום הושלם, למקם את בעלי החיים על שולחן התחממות ולעקוב אחר עד שהם יכולים לשמור על כיבו sternal. חזור חיות בכלובים שלהם. להחזיר את הקבוצה של בעלי חיים לביבר לאחר שכל בעלי החיים התאוששו באופן מלא. </li></ol> 2. כימות קליטת אור &lt;/ P&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזורי מארק ריבית על התמונות של בעלי החיים באמצעות סיפקו תוכנה לתרמי ג&#39;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשקפת גב חיה שלמה, להשתמש בתמונה מלבנית או סגלגלה המשתרעת מהגפיים העליונים לגפיים התחתונים, המשתרעת לרוחב ככל האפשר כך ששום חלק של התיבה חורגת האחורי של בעלי החיים, כפי שמוצג באיור 1 א. הערה: אפשר גם לסמן את השטח של עניין באמצעות כלי ציור ביד חופשית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתצוגת הגחון בעלי חיים שלמה, להשתמש 2 מלבנים: אחד המכסה את אזור אגן ואחד המכסה את אזור החזה, כפי שמוצג באיור 1 ב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזור קטן יותר של עניין, כלומר, מיקום של מתן תרופה, סימן כמתאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מארק אזור (ים) של ריבית על תקן קליטה בגווני אפור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא קליטה מכל אחד מהאזורים המסומנים של עניין. </li></ol> 3. ניתוח obtaine רמות הקליטהד לאזורים של עניין ייתכן שיהיה הצורך מנורמל לסטנדרטי רקע להשוואה בין צילומים. מערכת היחסים של חשיפה לקליטה הוא לוג-לוג (כלומר, מערכת היחסים הוא ליניארי בין יומן (חשיפה) ולהיכנס (קליטה)). שימוש במערכת יחסים זו, הקליטה של האזור של עניין יכולה להיות מנורמלת לערך רקע סטנדרטי, אשר יאפשר קליטה להשוואה ישירה בין תמונות שונות, כוללים אלה שצולמו בנקודות זמן שונות (כלומר, מדידות סידוריים בתוך פרוטוקול מחקר). ההליך לביצוע תיקונים אלה מפורט בשלבים אופציונליים 3.1 ו -3.2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקומה (אופציונלית) מגרש של יומן (חשיפה) לעומת יומן (קליטה) תוך שימוש בערכים המתקבלים מתקן קליטה בגווני אפור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי) כוון לוריאציות ברמת כל תצלום כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר F-stop לקריאה (כפי שנקבע בשלב 1.6) ו- F-stop להתייחסות (כפי שנקבע בסעיףTEP 1.8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב קליטה ממוצעת של סטנדרטי בכל התמונות בF-להפסיק לקרוא. ממוצע זה הוא התייחסות תקן הערך (RSV). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב הבדל בקליטה בין הקריאה והגדרות F-stop התייחסות בכל תצלום לסטנדרטי (דלתא-S) ולכל ROI המוגדר (דלתא-ROI-1, דלתא-ROI-2 ... ..delta-ROI-X) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הספיגה המתוקנת לכל החזר על השקעה באופן הבא: קליטה מתוקנת (ROI-X) = קליטה (ROI-X) בקריאת F-stop + (RSV - קליטה סטנדרטית בקריאת F-stop) * (דלתא-ROI-X / דלתא-S) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקמפל נתוני ניסוי ולבצע ניתוח נתונים תוך שימוש בטכניקות סטטיסטיות סטנדרטית למשתנים רציפים (כלומר, ANOVA, T-test). </li></ol>

<ol>
	<li>McAndrews, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+Hair+Loss+Association.">American Hair Loss Association.</a> , (2011).</li><li>Safavi, K. H., Muller, S. A., Suman, V. J., Moshell, A. N., Melton, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+alopecia+areata+in+Olmsted+County,+Minnesota,+1975+through+1989.">Incidence of alopecia areata in Olmsted County, Minnesota, 1975 through 1989.</a> Mayo Clin Proc. 70 (7), 628-633 (1995).</li><li>Hussein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy-induced+alopecia:+new+developments.">Chemotherapy-induced alopecia: new developments.</a> South Med J. 86 (5), 489-496 (1993).</li><li>Trueb, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy-induced+hair+loss.">Chemotherapy-induced hair loss.</a> Skin Therapy Lett. 15 (7), 5-7 (2010).</li><li>Sato, N., Leopold, P. L., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+adenovirus-mediated+expression+of+Sonic+hedgehog+gene+on+hair+regrowth+in+mice+with+chemotherapy-induced+alopecia.">Effect of adenovirus-mediated expression of Sonic hedgehog gene on hair regrowth in mice with chemotherapy-induced alopecia.</a> J Natl Cancer Inst. 93 (24), 1858-1864 (2001).</li><li>McGarvey, E. L., Baum, L. D., Pinkerton, R. C., Rogers, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychological+sequelae+and+alopecia+among+women+with+cancer.">Psychological sequelae and alopecia among women with cancer.</a> Cancer Pract. 9 (6), 283-289 (2001).</li><li>Baxley, K. O., Erdman, L. K., Henry, E. B., Roof, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alopecia:+effect+on+cancer+patients'+body+image.">Alopecia: effect on cancer patients' body image.</a> Cancer Nurs. 7 (6), 499-503 (1984).</li><li>Stough, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychological+effect,+pathophysiology,+and+management+of+androgenetic+alopecia+in+men.">Psychological effect, pathophysiology, and management of androgenetic alopecia in men.</a> Mayo Clin Proc. 80 (10), 1316-1322 (2005).</li><li>Ogunmakin, K. O., Rashid, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alopecia:+the+case+for+medical+necessity.">Alopecia: the case for medical necessity.</a> Skinmed. 9 (2), 79-84 (2011).</li><li>Olsen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized+clinical+trial+of+5%+topical+minoxidil+versus+2%+topical+minoxidil+and+placebo+in+the+treatment+of+androgenetic+alopecia+in+men.">A randomized clinical trial of 5% topical minoxidil versus 2% topical minoxidil and placebo in the treatment of androgenetic alopecia in men.</a> J Am Acad Dermatol. 47 (3), 377-385 (2002).</li><li>Rossi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1+mg+daily+administration+on+male+androgenetic+alopecia+in+different+age+groups:+10-year+follow-up.">1 mg daily administration on male androgenetic alopecia in different age groups: 10-year follow-up.</a> Dermatol Ther. 24 (4), 455-461 (2011).</li><li>Gibbons, R. D., Fiedler-Weiss, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-aided+quantification+of+scalp+hair.">Computer-aided quantification of scalp hair.</a> Dermatol Clin. 4 (4), 627-640 (1986).</li><li>Fleming, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+a+structural+analysis+of+dermatoscopic+imagery.">Techniques for a structural analysis of dermatoscopic imagery.</a> Comput Med Imaging Graph. 22 (5), 375-389 (1998).</li><li>Chamberlain, A. J., Dawber, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+evaluating+hair+growth.">Methods of evaluating hair growth.</a> Australas J Dermatol. 44 (1), 10-18 (2003).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Kodak/Tiffen Q-13 Gray Scale*. , .</li><li>Freyschmidt-Paul, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+alopecia+areata+in+C3H/HeJ+mice+with+the+topical+immunosuppressant+FK506+(Tacrolimus).">Treatment of alopecia areata in C3H/HeJ mice with the topical immunosuppressant FK506 (Tacrolimus).</a> Eur J Dermatol. 11 (5), 405-409 (2001).</li><li>Katikaneni, R., Ponnapakkam, T., Matsushita, O., Sakon, J., Gensure, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+and+prevention+of+chemotherapy-induced+alopecia+with+PTH-CBD,+a+collagen-targeted+parathyroid+hormone+analog,+in+a+non-depilated+mouse+model.">Treatment and prevention of chemotherapy-induced alopecia with PTH-CBD, a collagen-targeted parathyroid hormone analog, in a non-depilated mouse model.</a> Anticancer Drugs. 25 (1), 30-38 (2014).</li><li>Peters, E. M., Foitzik, K., Paus, R., Ray, S., Holick, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+for+modulating+chemotherapy-induced+alopecia,+using+PTH/PTHrP+receptor+agonist+and+antagonist.">A new strategy for modulating chemotherapy-induced alopecia, using PTH/PTHrP receptor agonist and antagonist.</a> J Invest Dermatol. 117 (2), 173-178 (2001).</li><li>Katikaneni, R., Ponnapakkam, T., Seymour, A., Sakon, J., Gensure, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parathyroid+hormone+linked+to+a+collagen+binding+domain+promotes+hair+growth+in+a+mouse+model+of+chemotherapy+induced+alopecia+in+a+dose-dependent+manner.">Parathyroid hormone linked to a collagen binding domain promotes hair growth in a mouse model of chemotherapy induced alopecia in a dose-dependent manner.</a> Anti-cancer drugs. 25 (7), 819-825 (2014).</li></ol>

Authors have nothing to disclose.

בדוח זה תיאור מפורט מסופק בטכניקה חדשה לכימות נשירת שיער במכרסמים. טכניקה זו מנצלת תרמי ג&#39;ל לרכישת תמונה וניתוח, ציוד שהוא זמין ברוב המעבדות. המדידות הוכחו להיות חזק כדי שינויים קלים בטכניקה (איורים 4-5), ומתואמים היטב לדרגת אובדן ראייה שיער במודלים של טיפול (איור 6). טכניקות אלו הועסקו בהצלחה בהערכה של טיפולים ניסיוניים להתקרחות 17. כלי כמותי להערכת צמיחת שיער במכרסמים יכול להיות בעל ערך רב בקידום מחקר בתרופה להתקרחות. יש מודלים של עכברים רבים להתקרחות שונות מהותי, שהופך אותו קשה לבסס תוצאות על ערכות סובייקטיביות של התערבויות טיפוליות. כמו כן, הערכה כמותית אשר מספקת תוצאה בצורהשל מדד רציף ניתן לסכם על ידי ממוצעי קבוצה וסטיית תקן / שגיאה סטנדרטית, וניתן לבדוק באמצעות טכניקות סטטיסטיות סטנדרטיים (ANOVA, T-test). הערכה כמותית זה יכול להיות מנוצל כדי למדוד תגובות על פני סדרה של נקודות זמן, וניתן להשתמש בו ביצירת עקומת מנה-תגובה למתחם בדיקה. ניתוח כמותי וכך מאפשר להערכות המבוססות על ראיות ליעילות של תרופות שנמצאות בפיתוח. טכניקה זו מנצלת את ההבדל בצבע בין מעיל שיער ובהווה עור בזני עכבר רבים. לעכברים עם שיער כהה, הגדולה יותר צפיפות השיער, הכמות הגדולה יותר של קליטה אופטית. קליטה אופטית ניתן לכמת באמצעות מכשיר ההדמיה ג&#39;ל, שנועד להעריך את הקליטה אופטית באזור מוגדר של עניין לכמת כמויות חלבון בניתוח כתם מערבי. בדומה לניתוח כתם מערבי, מדידות קליטה וכתוצאה מכך יכולות להיות אנאליתyzed באמצעות שיטות סטטיסטיות מקובלות להשוות צפיפות שיער בין קבוצות של עכברים (כלומר, טיפול לעומת קבוצת ביקורת). ניתוח כתם מערבי מתבצע בדרך כלל על תמונה אחת שהוא ניתח בהשוואה לסטנדרטים הניתנים על תמונה ש. עם זאת, עם יישום זה, זה הופך להיות נחוץ כדי לעשות השוואות בין תמונות שונות, שניתן לקחת בזמנים שונים. עם טכניקת צילום מאוד עקבית, וריאציות בין תמונות ניתן למזער. עם זאת, ליישום ניסיוני, זה מועיל אם שינויים קלים בחשיפה בין תמונות ניתן פיצוי ל. לפיכך, חשוב שסטנדרטי בגווני אפור ייכלל בתצלום (כלומר, התרשים בגווני אפור של Tiffen 15). עם זאת, הקשר בין הקליטה והחשיפה משתנה בהתאם לצפיפות האופטית של היעד (איור 2 א). לכן, אם יש בגווני אפור סטנדרטי צפיפות אופטית שונה מת&quot;אr קבל, התיקונים המתאימים עשויים להיות שונים. תיקוני לוגריתמי מועילים, אבל לא מספקים פתרון מושלם לבעיה זו (איור 2). על ידי לקיחת תמונות בF-2 תחנות שונות, ניתן לחשב קירוב ליניארי לסטנדרטי בגווני אפור ולכל יעד בתמונה, ובכך לספק קנה מידה מתאימה של התיקון למטרות האישיות. איור 3 מדגים כיצד מטרות עם אופטי שונה צפיפות תהיה גורמי תיקון שונים, אשר יכול להיות אינטרפולציה מהבדלים בקליטתו של כל יעד בF-2 תחנות שונות. לכן, אם אדם רוצה לנרמל הסטנדרטי לשווי של 150, יעד בצפיפות אופטית Tiffen 19 יהיה 148, אחד בTiffen 18 יהיה 140, אחד בTiffen 17 יהיו 119, וכן הלאה. במקום לפתור תיקונים אלה בצורה גרפית, אפשר להשתמש יחס של מדרונות בין סטנדרטי בגווני אפור והיעד בין 2 F-מפסיק לחשב את התיקון for כל יעד, כפי שמוסבר בדוגמא שסופקה (טבלה 1). כמו כל הטכניקות, יש ניתוח כמותי של צמיחת שיער באמצעות ניתוח בגווני אפור מספר מגבלות. בראש ובראשונה, יש מורכבות חישובית משמעותיות ביישום של טכניקה זו. זה נובע מהעובדה שתוכנת הניתוח להדמית ג&#39;ל היא מותאמת לניתוח כל דמות כניסוי נפרד. לפיכך, קיימת דרישה לתקן באופן ידני לכל שינוי בחשיפות בין תמונות. הקירוב לינארית לתיקונים כאלה עוזר לפשט את התהליך הזה. דוגמא מסופקת בטבלה 1: נתונים סימולציה של 2 סטים של צילומים, שצולמו בF-להפסיק 2.0 ו -3.0, עם תקן נפוץ. כל סט של תמונות יש 2 ROIs אשר צריך להיות בהשוואה בין קבוצות. הבדלים מזעריים בתנאי צילום גרמו את הסט הראשון של צילומים יש חשיפה מעט גדולה יותר מהקבוצה השנייה, evideNT על ידי הבדלים קלים בקליטת סטנדרטית הנפוצה. הדוגמא מראה כיצד הבדלים קלים בתנאי צילום יכולים ליצור הבדלים ניכרים בקליטה בהחזר על השקעה נתון, אבל אלה ניתן לתקן באמצעות תקן התייחסות, במקרה זה מראה כי ספיגה בROIs אינו שונה בין 2 הקבוצות של תמונות. חשוב לציין ששינוי בקליטת אור לא תמיד באופן ישיר כדי לתאם כמות השיער depigmentation או שינויים בצבע אחרים עלולים להיחשב בטעות לנשירת שיער או צמיחת שיער. למרבה הצער, את הדיוק של טכניקה זו לא ניתן להעריך, כי אין כיום סטנדרטי שבה להשוות זהב. עם זאת, שבו יש נשירת שיער ברורה, הטכניקה עושה לייצר תוצאות הצפויות (איור 6). לבסוף, אין כיום נתונים על מנת להעריך אם תוצאות שימוש בטכניקה זו תואמות את התוצאות בניסויים קליניים של תרופות פוטנציאליות. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; הניתוח בגווני אפור לכימות נשירת שיער בצורות שונות של התקרחות מהווה הזדמנות כדי לחדד ולתקנן שיטות לאפיון מודלים של התקרחות ולתגובות בדיקות לתרופות פוטנציאליות. יישום של טכניקה זו צריכה לשפר את זיהוי ופיתוח של טיפולים יעילים יותר בהתקרחות.

Alopecia (נשירת שיער) יכול להיות אירוע נפשי ורגשי מצער עם גורמים רבים. התקרחות גברית-תבנית היא הגורם השכיח ביותר של התקרחות, המשפיע על כשני שלישים מהגברים בגיל 35 1. דפוס דומה של אובדן שיער יכול להיות שנצפה בנשים עם תסמונת שחלות פוליציסטיות. בשתי הפרעות אלו, נשירת השיער היא אנדרוגן בתיווך. Alopecia יכול להתרחש גם כמחלה אוטואימונית, alopecia areata, אשר משפיעה על 1.7% מכלל האוכלוסייה 2. Alopecia יכול להתרחש כתופעת לוואי של כמה טיפולים רפואיים, כגון כימותרפיה 3. אחוז גבוה (65-85%) של חולי כימותרפיה חוויה מסוים של התקרחות 4,5. ההשלכות הפסיכולוגיות של אובדן שיער נחקרו היטב בהגדרת כימותרפיה. התקרחות בעקבות כימותרפיה יכולה לגרום לחרדה, דיכאון, דימוי גוף שלילי, הערכה עצמית נמוכה ותחושה של רווחה 6,7 מופחתת. Pe גבוהrcentage (47-58%) של חולי סרטן נשיים לשקול נשירת שיער להיות ההיבט הטראומתי ביותר של כימותרפיה, ועד טיפול ירידה של 8% מחשש ל4,6 נשירת שיער. יש גם עדויות בהתקרחות אנדרוגנית לתמוך טיפול להפחתת השלכות פסיכולוגיות ואפילו רפואיות של 8,9 נשירת שיער. כמו כן, אלופציה אריאטה דווחה להיות השלכות פסיכולוגיות קשות 2, ואת האופי אחיד של נשירת השיער יכול להוביל לתוצאה קוסמטית לא נעימות, יותר מרוב הגורמים אחרים לנשירת שיער. בעוד תרופות עם השפעות מתונות אנטי-אנדרוגנית (כלומר, ספירונולקטון) היו בשימוש עם הצלחה מוגבלת כטיפול להתקרחות, התרופה היעילה הראשונה להתקרחות מינוקסידיל הייתה 10. יש להורדת לחץ דם זה תופעות לוואי שנצפה בגרימת צמיחת שיער, ועכשיו משמשת כטיפול מקומי לצורות רבות של התקרחות. עם זאת, תגובות הן לעתים קרובות לא שלמות, עם כמה נושאים המראים רק איטיing של נשירת שיער ולא לצמיחה מחודשת בפועל 10. פינסטריד הוא אנטגוניסט תחרותי להקליד השני 5α-רדוקטאז שהמרה בלוקים של טסטוסטרון לדיהידרוטסטוסטרון, וכתוצאה מכך השיפור בהתקרחות אנדרוגנית על חשבון מצור אנדרוגן המערכתי חלקי. שיעורי תגובה עם טווח ארוך טיפול (10 שנים) הם סביב 50% -11. בסך הכל, למרות מחקר רב בתחום זה, עדיין אין טיפול הולם לנשירת שיער. במשך עשרות שנים, מדענים ורופאים בחנו את שיטות של מדידת צמיחת שיער קרקפת בניסויים קליניים. עם התפתחותה של תרופות המטפלות בהתקרחות, חל צורך גדול יותר באמצעי אמין, חסכוני ופולשנית למדידת צמיחת שיער ו, במיוחד, תגובה לטיפול. טכנולוגית ניתוח תמונה לכימות מדויק של צפיפות שיער בחולים עם הפרעות נשירת שיער הניבה תוצאות עקביות ותקפה בעבר תוך שימוש במגוון של techniques, כולל ניתוח של תמונות דיגיטציה 12, ניתוח תמונה של שערות בודדות ועור נגעים 13, וסריקה מיקרוסקופית לכמת המוני שיער באזור קרקפת מוגדר 14. למרבה הצער, בעת מתודולוגיות מעל סיפקו הערכה משופרת של יעילות לשיער צמיחה-קידום התערבויות בניסויים קליניים, שיטות אלה לא הוחלו על מחקרים במכרסמים בחקירות פרה-קליניים. המטרה שלנו היא לפתח שיטה עקבית ואמינה לכמת נשירת שיער בעכברים, שיאפשר לחוקרים להעריך בצורה מדויקת יותר ולהשוות גישות טיפוליות חדשות לצורות שונות של התקרחות. פיתחנו מתודולוגיה שימוש בציוד זמין ברוב המעבדות אשר תאפשר כימות מהיר ואמין של צפיפות שיער בעכברים עם שיער שחור או חום. מתודולוגיה זו נבדקה במודלים של עכברים של התקרחות בעקבות כימותרפיה, alopecia areata, והתקרחות מwaxing. פרוטוקול מפורט מוצג לביצוע מדידות אלה, ובכלל זה נתונים אימות מC57BL / 6 וC3H / זני HeJ של עכברים. כטכניקה זו מסתמכת על גילוי קליטת אור מפיגמנטים בשערה, זה לא יכול לשמש כדי לזהות את צמיחת שיער בעכברים לבנים או עכברים לבקן.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="623">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:121px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">KODAK Gel Logic 100 Imaging System&#160;&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Gel imager for obtaining and analyzing photographs, must have built in light source for reflective photography.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">The Kodak/Tiffen Q-13 Gray Scale</td>
			<td style="width:121px;">Imatest, http://www.imatest.com/docs/q13/</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Greyscale standard</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">C57BL/6J Mice</td>
			<td style="width:121px;">&#160;Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Mice for representative study</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">C3H/HeJ engrafted mouse</td>
			<td style="width:121px;">&#160;Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Mice for representative study</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a new technique for quantitative analysis of hair loss in mice using grayscale analysis

Alopecia הוא צורה נפוצה של נשירת שיער אשר יכול להתרחש בתנאים רבים ושונים, לרבות אובדן זכר-דפוס שיער, תסמונת שחלות פוליציסטיות, וalopecia areata. Alopecia יכול להתרחש גם כתופעת לוואי של כימותרפיה בחולי סרטן. במחקר זה, המטרה שלנו הייתה לפתח שיטה עקבית ואמינה לכמת נשירת שיער בעכברים, שיאפשר לחוקרים להעריך באופן מדויק ולהשוות גישות טיפוליות חדשות לאלה צורות שונות של התקרחות. השיטה משתמשת תרמי ג&#39;ל סטנדרטי להשיג ותהליך תמונות של עכברים, מדידת קליטת האור, אשר מתרחשת בחלק מחוספס לכמות שיער שחור (או אפור) על העכבר. נתונים שכבר לכמת באופן זה אז יכול להיות מנותח באמצעות טכניקות סטטיסטיות סטנדרטיים (כלומר, ANOVA, T-test). מתודולוגיה זו נבדקה במודלים של עכברים של התקרחות בעקבות כימותרפיה, areata התקרחות ונשירת שיער מהשעווה. בדוח זה, הפרוטוקול מפורט הוא פרהented לביצוע מדידות אלה, ובכלל זה נתונים אימות מC57BL / 6 וC3H / זני HeJ של עכברים. טכניקה חדשה זו מציעה מספר היתרונות, ביניהם פשטות היחסית של יישום, הסתמכות על ציוד שהוא זמין ברוב מעבדות מחקר, ומיישום מטרה, הערכה כמותית שהוא יותר חזק מאשר הערכות סובייקטיביות. השיפורים בכימות של צמיחת שיער בעכברים ישפרו מחקר של מודלים התקרחות ולהקל על הערכה של טיפולים חדשים ומבטיחים בניסויים פרה-קליניים.

טכניקה זו קיבלה תוקף באמצעות C3H / עכברים HeJ engrafted, מודל העכבר של אלופסיה 16. בעלי חיים אלה לפתח נשירת שיער בעולם, אשר מתקדמת בהדרגה לאורך זמן. עם זאת, נשירת השיער מתרחשת בטלאים, ועשויה להשתנות מעכבר אחד למשנהו, מציגה השתנות ניכרת ופוגעת הערכות איכותיות. מודל זה סיפק הזדמנות לבחון מתאמים בין המדידות של צפיפות אופטית במקומות שונים בעכבר כהערכה של תוקף. הייתה השאלה הראשונה צעדים אם באמצעות חשיפות שונות, וריאציות בתיחום החזר על השקעה, ואת ההחזר על ההשקעה של מאזורים שאינם חופף באותו העכבר היה בקורלציה. היה קשר מובהק (p &lt;0.0001) ראה השוואת ROIs שהוגדרה על ידי סטנדרטים סגלגלים מלבניים לעומת על פני השטח הגבי של העכבר (איור 4 א). באופן דומה מתאמים גבוהים נראו באתרים שונים בבעלי החיים ובdiffeלשכור רמות חשיפה (לא מוצג). הדבר זה מצביע על רמה גבוהה של דיוק במדידות אלה. היה גם קשר מובהק בין הקליטה בF-להפסיק 2.0 לעומת 1.2 על פני השטח הגב של הגב באמצעות ROIs המלבני (p &lt;0.0001, איור 4). מתאם משמעותי נצפה גם כאשר משווה בין מדידות קליטת הגב ופני שטח הגחון של אותו עכבר (p &lt;0.0001, איור 4C). נתונים אלה מספקים הוכחה לכך שמדידות קליטה נלקחו מאתרים שונים באותו החיה מתואמות, כצפוי בC3H / HeJ engrafted מודל עכבר, והמתאמים אלה יישארו ליניארי על פני מגוון רחב של נשירת שיער. זה עוזר לבסס את התקפות של המדידות בגווני אפור וגם קובע את חוסן של טכניקה זו לשינויים ברכישת תמונה וטכניקת ניתוח. השאלה השנייה הייתה אם יש עקביות בין מדידות סידורי נלקחו מבעלי החיים זהים בנקודות זמן שונות. להעריך את זה, תמונות התקבלו מC3H / HeJ engrafted עכברים על בסיס שבועי למשך 3 שבועות. C3H העכבר / HeJ engrafted יהיה צפוי להציג נשירת שיער הדרגתית לאורך זמן זה. ניתוח בגווני אפור על פני השטח הגחון (אזור חזה, החזר על השקעה בצורת קופסא) הראה נשירת שיער צפויה זה, עם מגמת ירידה עקבית מנקודת זמן אחת לשנייה (איור 5). ראוי לציין, רק 80% מעכברי engrafted C3H / HeJ להראות נשירת שיער, ואלו עם הערכים הגבוהים ביותר בגווני אפור לא מראים ירידה זו, ולא להציג תוצאות עקביות בתקופת הניסוי. עקביות זו של מדד בבעלי חיים ללא נשירת שיער גם אושרה בC57BL / 6 העכבר 19. אותו הניתוח שבוצע באזור הירך של פני השטח הגחון ועל פני השטח הגבי הראה תוצאות דומות על פני זמן (לא מוצג). עם תוצאות מעודדות אלה מיישום של טכניקה זו בC3H / HeJ engrafted בעלי חיים,חקירות נוספות שנערכו במודל חיה שונה, אחד מההתקרחות בעקבות כימותרפיה. C57BL / 6 עכברים שקבלו 3 קורסים שבועיים של ציקלופוספמיד יהיה variably לפתח שיער דליל הגלובלי וdepigmentation. טכניקת הניתוח בגווני אפור שתתואר בהמשך הועסקה לכמת את השינויים הללו, וכדי להעריך את התגובה להתערבויות טיפוליות 17. במודל זה, הניתוח בגווני אפור הוכיח להיות כלי רב עוצמה במתן הערכות כמותיות של שינויים בעקבות כימותרפיה במעיל שיער, ומותר אימות של שפעות טיפול על ידי ניתוח סטטיסטי. במודל אחר של התקרחות כימותרפיה, היו אתגרים מיוחדים בניצול הניתוח בגווני אפור הזה. במודל זה, בעלי חיים בשעווה על המשטח הגבי לסנכרן את זקיקי שיער, ולאחר מכן טופלו במנה אחת של ציקלופוספמיד 9 ימים לאחר מכן, כאשר זקיקי שיער נכנסו שלב VI anagen ומקסימאלי רגישים לchemotherapeutics 18. שעווההאזור הוא האזור של עניין למחקר, אבל האזור של שעווה עשוי להיות בגודל משתנה. הגבלת ROI באזור בשעווה מאפשרת כימות של שני הפסדים וצמיחה מחודש של שיער לאחר מתן ציקלופוספמיד 19. יתר על כן, הטכניקה מאפשרת הערכה מדויקת של הבדלים תלויים-מינון בתגובה לטיפול של טיפול ניסיוני. יישום זה ממחיש את היתרונות שיש גמישות בהגדרת ROI בטכניקה זו. כדי להמחיש עוד יותר את היישום של טכניקה זו, ובלבד הם ניתוח נתוני ביניים של מחקר מתמשך בC57BL / 6 ניצול הפרוטוקול של ממשל cyclophosphamide השבועי שצוין לעיל. טופלו עכברים בן 8 שבוע עם רכב או ציקלופוספמיד / קילוגרם / wk 50 מ&quot;ג במשך 3 שבועות. עכברים שטופל בכימותרפיה הראו נשירת שיער חזותי לכאורה לאחר 2 חודשים, בעוד שבעלי חיים שטופל רכב מעיל שיער נורמלי (איור 6 א). ניתוח בגווני אפור היה לנוצר כפי שצוין לעיל, מראה הבדל (p &lt;0.05) משמעותי בין עכברי כימותרפיה ובקרות רכב (איור 6). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52185/52185fig1highres.jpg" /> איור 1: תצוגה גולמית של שיער שינויים בגב ופני שטח הגחון של C3H / HeJ engrafted עכברים, מודל העכבר של אלופציה אראטה הערה החיות לפתח נשירת שיער בעולם, אשר מתקדמת בהדרגה לאורך זמן תצוגה הגבי (), עם תיחום נציג.. של אזורים של עניין (ROIs) לניתוח בגווני אפור, סגלגל או מלבני כפי שצוין. תצוגה (B) הגחון עם אזורים שונים של עניין לניתוח בגווני אפור בחזה, המקביל לאזור ungroomed, או ירך, המקביל לאזור מטופח. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52185/52185fig2highres.jpg" width = &quot;450&quot; ​​/&gt; איור 2:.. גרף רמת Pixel על ניתוח בגווני אפור לעומת סטנדרטי המספר של Tiffen התרשים של Tiffen הסטנדרטי צולם על תרמי הג&#39;ל על F-עצירות מצויינים (א) לרמת פיקסל לעומת המספר של Tiffen, מראה צפוי קשר לוגריתמים (B. ) שינוי לוגריתמי, בטווח זה ממשיך לעקוב יחסים קוי. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52185/52185fig3highres.jpg" width="450" /> איור 3:. רמת Pixel על ניתוח בגווני אפור לעומת F-stop התרשים של Tiffen הסטנדרטי צולם על תרמי הג&#39;ל על F-עצירות מצויינים. זממו הם הווריאציות ברמת הפיקסל ראו בכמה תקנים של Tiffen שונים לעומת F-stop. שים לב שהקווים אינם מקבילים, מצביע על כך שתיקונים ליישר סטנדרטים בין photograPHS צריך להיות מחושב בנפרד עבור כל אזור של עניין. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52185/52185fig4highres.jpg" width="450" /> איור 4:. מתאם בין טכניקות צילום שונות ואזורים של עניין בניתוח בגווני אפור מוצגים הם מתאמים בין טכניקות מדידה המצוינות נלקחו מאותו C3H / HeJ engrafted עכבר באותה נקודת הזמן () מתאם של מלבן לעומת האזור הסגלגל של. ריבית על השקפת הגב. מתאם (B) של F להפסיק 2.0 לעומת 1.2 באמצעות אזור המלבני של עניין. מתאם (C) של ערכים בגווני אפור מתצוגות גב והגחון, אזור המלבני של עניין. כל המתאמים היו משמעותיים מבחינה סטטיסטית, כפי שנקבעו על ידי הניתוח ליניארי רגרסיה (p &lt;0.0001). <img alt="איור 5" src= &quot;/ קבצים / ftp_upload / 52,185 / 52185fig5highres.jpg&quot; width = &quot;550&quot; /&gt; איור 5: כמובן זמן של שינוי בקליטה באמצעות ניתוח בגווני אפור בC3H / HeJ engrafted עכברי צבעים מצביעים על מדידות סידורי מעכברים בודדים.. שים לב לעקביות לכל עכבר מנקודת זמן אחת לשנייה. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52185/52185fig6highres.jpg" /> איור 6:.. ניתוח גווני אפור בעכברי C57BL6 / J בעקבות כימותרפיה התקרחות 6 שבועות ישנים טופלו גם עם רכב (N = 6) או 3 מנות שבועיות של ציקלופוספמיד (50 מ&quot;ג / קילוגרם) (N = 6) (א) קבוצה מייצגת של 3 עכברים מכל אחת מקבוצות הטיפול, צילמה 2 חודשים לאחר תחילת הטיפול הכימותרפי. נתונים (B) מלוקט מניתוח בגווני אפור מכל קבוצה, המראה ירידה בקליטה עם ממשל cyclophosphamide (p &lt;0.05). שים לב להתאמה בין שיער הגלויהפסד בפנל והפחתה מובהקת סטטיסטי בקליטה בB. הפנל <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="4"> ערכי קליטה הם כדלקמן: </td></tr><tr><td> צילום </td><td> F-stop </td><td> החזר על השקעה </td><td> קליטה </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> סטנדרטי </td><td> 90 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> ROI-1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> ROI-2 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 3 </td><td> סטנדרטי </td><td> 150 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 3 </td><td> ROI-1 </td><td> 160 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 3 </td><td> ROI-2 </td><td> 230 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 2 </td><td> סטנדרטי </td><td> 110 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 2 </td><td> ROI-1 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 2 </td><td> ROI-2 </td><td> 210 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 3 </td><td> סטנדרטי </td><td> 160 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 3 </td><td> ROI-1 </td><td> 170 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 3 </td><td> ROI-2 </td><td> 235 </td></tr><tr><td colspan="4"> קריאה להפסיק F נבחר כ2.0, ההפניה F-מפסיק נבחר כ3.0. </td></tr><tr><td colspan="4"> התייחסות תקן ערך (RSV) = ממוצע של קליטה סטנדרטית מהתמונה 1 ותמונה 2 בF-להפסיק 2.0, RSV = ממוצע (90, 110) = 100 </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> לתמונה 1: </td></tr><tr><td colspan="4"> דלתא-S = 150-90 = 60 </td></tr><tr><td colspan="4"> דלתא-ROI-1 = 160-100 = 60 </td></tr><tr><td colspan="4"> דלתא-ROI-2 = 230-200 = 30 </td></tr><tr><td colspan="4"> קליטה מתוקנת לROI-1 = 100 + (100 - 90) * (60/60) = 110 </td></tr><tr><td colsמחבת = &quot;4&quot; קליטה&gt; מתוקנת לROI-2 = 200 + (100 - 90) * (30/60) = 205 </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> לתמונה 2: </td></tr><tr><td colspan="4"> דלתא-S = 160-110 = 50 </td></tr><tr><td colspan="4"> דלתא-ROI-1 = 170-120 = 50 </td></tr><tr><td colspan="4"> דלתא-ROI-2 = 235-210 = 25 </td></tr><tr><td colspan="4"> קליטה מתוקנת לROI-1 = 120 + (100 - 110) * (50/50) = 110 </td></tr><tr><td colspan="4"> קליטה מתוקנת לROI-2 = 210 + (100 - 110) * (25/50) = 205 </td></tr></tbody></table> טבלה 1:. חישוב לדוגמא לתיקון הבדלים בחשיפה בין תמונות השולחן מראה דוגמא של איך לפצות על הבדלים קלים בקליטתם של הסטנדרטים בין תמונות (שלב אופציונאלי 3.2).

Watch this Scientific Journal Video about A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis at JoVE.com

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

טכניקה חדשה לניתוח כמותי של נשירת שיער בעכברים באמצעות ניתוח גווני אפור

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

a-new-technique-for-quantitative-analysis-hair-loss-mice-using

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

8.9K Views.  Children's Hospital at Montefiore. Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Video: A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

ניתוח כמותי של הגירה אקראית של תאים באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופית וידאו

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

כושר ניתוח כמותי של זרימת עבודה

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

ניתוח כמותי של Autophagy באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 3D מתקדם

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

גישה חדשה לניתוח השוואתי של multiprotein מכלולים בהתבסס על<sup&gt; 15</sup&gt; N מטבולית תיוג וכמותי ספקטרומטריית המסה

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Assay עקידת התפוקה גבוה MHC II לניתוח כמותי של פפטיד אפיטופים

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...