This project was support in part by Johns Hopkins University, Office of the Provost through the Gateway Science Initiative.

.1 כניסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלטון את Bioreactor. לחץ בכל מקום כדי לפתוח את דף הכניסה. בחר שם משתמש והזן את הסיסמה ולחץ על &quot;כניסה&quot;. </li></ol> .2 כיול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכייל חיישן pH (2 נקודות לפני מעוקר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק חיישן pH ולאשר קצה חיישן מלא בתמיסת אלקטרוליט. הכן שתי כוסות עם פתרונות כיול pH (אלקטרוליט) pH 4 וpH 7 ויש לי בקבוק לשטוף זמין במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את כבל pH לחיישן pH. נווט אל &quot;פעולות&quot; הכרטיסייה על הממשק שלום ולחץ על &quot;לכייל&quot;. הזן טמפרטורת חיץ בתחום טמפ פתרון כיול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח חיישן pH במאגר 1 (pH 4) ולהזין ערך בשדה &quot;אפס&quot;. חכה לגרף כדי לייצב ולחץ על כפתור &quot;לכייל 1&quot;. יש לשטוף את חיישן pH במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיישן מקום במאגר 2 (pH 7). הזן חיץ2 ערך בשדה &quot;תוחלת&quot;. חכה לגרף כדי לייצב ולחץ לכייל 2 כפתור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;שמור&quot; לאחר מכן לחץ על &quot;סגור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל את חיישן חמצן המומס (DO). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא חיישן DO כבר מקוטב על ידי להיות מחובר למערכת במשך כמה שעות. נווט אל &quot;פעולות&quot; הכרטיסייה על הממשק שלום ולחצו לכייל. לחץ על כפתור ה &quot;DO&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתק את חיישן DO והזן 0 בשדה &quot;אפס&quot;. חכה לגרף כדי לייצב ולחץ על הלחצן &quot;כיול 1&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר מחדש את חיישן DO ולהיכנס 100 בשדה &quot;הטווח&quot;. חכה לגרף כדי לייצב ולחץ על הלחצן &quot;כיול 2&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;שמור&quot; לאחר מכן לחץ על &quot;סגור&quot;. </li></ol> חיישני .3 החיטוי ולהתקין וכלי שייט מגיב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כיול, חיישני מקום וגם תרמית בautocשקיות לרחוץ וחיטוי ל30 דקות ב121 מעלות צלזיוס, 15 psi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר שקיות החיטוי עם 70% איזופרופיל אלכוהול (IPA) ושקיות העברה לארון בטיחות ביולוגית (BSC). הסר אריזה חיצונית של כלי שיט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר אריזה פנימית עם 70% IPA ולהעביר כלי לארון ביולוגי בטיחות (BSC). הסר אריזה פנימית ולבדוק את הכלי וצינור לנזקים הנגרמים במהלך משלוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן את pH ולעשות חיישנים בשתי יציאות הקדמיות. התקן את גם התרמית ליציאה אחורית השמאלית. פתח את מכסה החיישן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדריך החיישן דרך יציאת החיישן. השחל את החיישן בחוזקה ליציאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הכלי מתוך BSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתלות DO וכבלי חיישן pH מחוץ לשרוול הכלי ולבדוק ששום דבר לא בשרוול. חלק את הכלי לתוך השרוול, רגליים הראשונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים בזהירות את חיישן הטמפרטורה לתוך באר תרמית הכלי. ודא שהחלק התחתון של הכלי מונח כנגד חימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרצינורות סטים התיקים שלהם. קידוד צבע התאמה בצינורות למחברים המתאימים והמשאבות ביחידת בקרת bioreactor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן את קו הגז הראשי על ידי לחיצה על המחבר לשקע הגז שלה. התקן את קו גז מיקרו על ידי סיבוב בכיוון השעון המחבר לשקע גז. התקן את צינורות מסנן פליטה: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתוח את תנור המסנן. אבטח את מסנן הפליטה על U-הערוץ כל כך צינורות שלה עוברים דרך שני הווים למסנן ויוצא מהתנור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן את צינורות על ידי שקית הקבל בבעל צינורות. סגור את הדלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קווי מסלול בנוסף וB, שניהם קווי התקשורת, ואת קו הקציר מאחורי חיישן DO ועל הספסל בסמוך ליחידת בקרת bioreactor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את הכבלים לחיישני DO וpH. </li></ol> .4 בינוניים ומיקרו ספקים הוספה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נווט אל הכרטיסייה &quot;פעולות&quot; ולחץ על &quot;בקרת משאבות&quot; על ממשק המחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טופס Steriחיבור le בין שורה שאינו בשימוש בינונית בנוסף (להקה כתומה 1) ומקור בקבוק / שקית הבינוני על ידי ריתוך צינורות או באמצעות אבזרי Luer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על המחוון כדי להפעיל את משאבת התקשורת ב. לחץ על המחוון להפוך את התקשורת לשאוב את הסכום לאחר תוספת הרצויה של מדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח חרוזים microcarrier בCa 2 +, Mg 2 + PBS ללא תשלום עבור 3 שעות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים כמה פעמים עם Ca 2 +, Mg 2 + PBS חופשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי במשך 15 דקות ב 115 ° C, 15 psi. הערה: הוסף L 3 גר &#39;/ (משקל יבש) בניסוי זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משאבה במייקרו ספקים כי כבר התייבשות, שטף וautoclaved לכור באותו אופן בינוני נוספה בשלב 4.1. </li></ol> .5 איזון ואחת נקודות DO כיול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הבקרים לאוטומטיים ולהיכנס לsetpoints הרצוי. כאן, להשתמש בתסיסת הסט פוינט (SP) = 15 סל&quot;ד, SP טמפרטורה = 37.0 ° C, pH = 7.2, DO = 100%. חכה לעמarameters לאזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר חיישן הוא מקוטב באופן מלא. אשר ערך הנוכחי DO התייצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נווט אל הכרטיסייה &quot;פעולות&quot; ולחץ על &quot;לכייל&quot;. לחץ על &quot;DO&quot;, לחץ על &quot;אחת נקודות&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן &#39;100&#39; בשדה &quot;הטווח&quot;. לחץ על הכפתור &quot;כיול 1&quot;, לחץ על &quot;שמור&quot; ולחץ על &quot;קרוב&quot;: </li></ol> .6 החל לרוץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נווט אל כרטיסיית פעולות. לחץ על &quot;אצווה&quot;. השתמש במקלדת שעל מסך או מקלדת חיצונית יש להזין שם אצווה 16 תווים או פחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצן &quot;הסתר&quot; של המקלדת שעל מסך. לחץ על &quot;התחילו אצווה&quot; לאשר על ידי לחיצה על &quot;התחל&quot; בכיסוי. </li></ol> .7 לחסן עם תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור קשר סטרילי בין שורה בנוסף בינונית שאינו בשימוש (להקה כתומה 1) ובקבוק תא / מקור שקית על ידי ריתוךצינורות או שימוש באבזרי Luer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן את סעיף סיליקון של צינורות במשאבת התקשורת כל כך נקודות החץ לכיוון הצינור בין המשאבה וכלי השיט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו מהדק צינורות פתוח ומהדק צינורות מסועף שלה סגור. לחץ על המחוון כדי להפעיל את משאבת תקשורת ובלחץ על &quot;כבוי&quot; לאחר הוספת תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נווט אל הכרטיסייה &quot;פעולות&quot; ולחץ על &quot;משאבות בקרה&quot;. </li></ol> .8 דגימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לחסן ובתדירות גבוהה ככל רצוי כדי לפקח על התרבות, לצייר מדגם מהתרבות באופן הבא: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נווט אל הכרטיסייה &quot;פעולות&quot; ולחץ על &quot;לקחת דגימה&quot;. הנח את צינור הדגימה במשאבת הדגימה ולתפעל את ברזלים דגימה על פי ההוראות שעל מסך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע לפחות תצפית יומית מיקרוסקופית וספירת תאים בדגימות אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התאים הגיעו הצפיפות הרצויה, בג זהASE 1.2 x 10 6 תאים / מ&quot;ל, להדביק את התאים עם התוספת של הבידוד נגיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסביבה נקיה מהחיידקים להוסיף הבידוד למזרק 20 מ&quot;ל, ולחבר את המזרק לאחת מהיציאות בנוסף החילוף בכור. להציג את הבידוד לכור על ידי לחיצה על בוכנת המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך דגימה וניתוח התרבות לריכוז החלקיקים תאיים אדנווירוס. </li></ol>

<ol>
	<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications. , (2010).</li><li>Healthcare, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcarrier+Cell+Culture+Principles+and+Methods.">Microcarrier Cell Culture Principles and Methods.</a> GE Healthcare Data File 18-1140-62. , (2005).</li><li>Simaria, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+cell+therapy+bioprocess+economics+and+optimization+Single-Use+cell+expansion+Technologies.">Allogeneic cell therapy bioprocess economics and optimization Single-Use cell expansion Technologies.</a> Biotechnol and Bioeng. 111 (1), 69-83 (2014).</li><li>Lee, B., Fang, D., Croughan, M., Carrondo, M., Paik, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+novel+pneumatic+mixing+for+single-use+bioreactor+application.">Characterization of novel pneumatic mixing for single-use bioreactor application.</a> BMC Proc. 5 (S8), O12 (2011).</li><li>Eibl, R., Eibl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposable+bioreactors+in+cell+culture-based+upstream+processing.">Disposable bioreactors in cell culture-based upstream processing.</a> BioProcess Int. 7 (S1), 18-23 (2009).</li><li>Chaubard, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposable+bioreactors+for+viral+vaccine+production+challenges+and+opportunities.">Disposable bioreactors for viral vaccine production challenges and opportunities.</a> Biopharm Int Supp. , (2010).</li><li>Croughan, M. S., Hamel, J. F., Wang, D. I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+Effects+on+Animal+Cells+Grown+in+Microcarrier+Cultures.">Hydrodynamic Effects on Animal Cells Grown in Microcarrier Cultures.</a> Biotechnol and Bioeng. 95 (2), 295-305 (2006).</li><li>DePalma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-use+Equipment+on+Cusp+of+Industrialization.">Single-use Equipment on Cusp of Industrialization.</a> Genet Eng Biotechnol News. 32 (1), (2012).</li><li>Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , (2010).</li><li>Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures. , (2012).</li></ol>

המחברים ד ג&#39;ירו וי &#39;Hashimura הם עובדים של PBS ביוטק שמייצר חומרים כימיים ומכשירים המשמשים במאמר זה.

מערכת bioreactor שימוש יחיד זה היא יחסית פשוטה לשימוש ומספקת ניתוח בזמן אמת לניטור כור וניתוח. הוא מאוד מתאים גם לתרבית תאים של יונקים וחרקים עם צפיפות תאים מגיעה ליותר מ 30 מיליון תאים / מ&quot;ל. חוץ תאי A549 מתוארים בדוח זה 11, יש לנו גדלתי SF-9 תאי חרקים בbioreactor גם כן. הערבוב העדין הניתן על ידי גלגל אוויר פנאומטי מפחית נזק לתאים. כמה צעדים הם קריטיים בעת הגדרת כור זה. הכיול הראשון, נכון של pH ולעשות חיישנים חשוב לניטור אופטימלי של התרבות ולתוספת של חומרים כימיים כדי להתאים את pH או החמצן במערכת. שנית, הבקבוקים מגיב וזרע חייבים להיות מלאים ואת הקבצים המצורפים luer שנעשו בסביבת סטרילית, כגון BSC. ברגע שהבקבוקים מגיב מועברים אל מחוץ לסביבת סטרילית, החיבורים לקווי הזנת bioreactor חייבים להיעשות בזהירות כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; בעוד מערכת bioreactor זה עובדת היטב עבור שורות תאי יונקים וחרקים זה אינו מיועד לתרבויות חיידקים. המערכת אינה יכולה לספק את הערבוב המהיר וחמצון שנדרש לתאי חיידקים. התפתחות חיידקים נעשה הכי טובה בbioreactor טנק עורר. בהשוואה לbioreactors ליחד אחר לתרבית תאי יונקים או חרקים, מערכת זו היא קלה לשימוש, מספקת נתונים מספיקים לניתוח של ריצות, ויש צמיחת תאים דומה או טובה יותר מהמערכת לשימוש חד אחרת שהערכנו. מערכת bioreactor פנאומטי ליחד יש פוטנציאל לפגוש רב של המחקר ויישומים קליניים בתחומי יות&#39;רפיוטיקס, חיסונים, תאי גזע, ורפואה אישית 4. בנוסף, הגמישות של מערכת זו מאפשרת לתצווי, Fed-אצווה, זלוף, ויישומי bioreactor Transfection מבוסס 5. לבסוף, יש לי מערכות bioreactor חד פעמיות לשימוש חד פעמי אין הסופיותTial כדי לענות על הצרכים של ייצור תעשייתי בקנה מידה גדולה ולדבוק בהנחיות והמלצות של גופי רגולטורים לאומיים ובינלאומיים 6-10.

ניתן לסווג קווי תאי יונקים לאחת משלוש קטגוריות המבוססות על המאפיינים שלהם צמיחה: תאים שגדלים בהשעיה, תאים שגדלים כאגרגטים, ותאים שגדלים מעוגן למצע. למרות bioreactor אוויר הגלגל הפגין בסרט הזה הוא מסוגל לגדול כל שלושת סוגים של תאים, בסרטון זה ידגים שימוש בbioreactor לגדל תאים תלויים מעגן במייקרו ספקים. תאי יונקים תלויים Anchorage ניתן לגדל לצורך הפקת תאים נוספים - שבו התאים עצמם הם התוצר. לדוגמא, תאי גזע mesenchymal מח עצם נגזר אנושי נמצאים בשלבים טיפחו במטרה לקצור את התאים והזרקה אותם לרקמה חולה. Bioreactor פנאומטי הפגין בסרט הזה הוכיח מתאים לייצור תאי גזע mesenchymal כזה עבור יישום זה (Serra et al., תקשורת אישית, 2013). dep Anchorageתאי יונקים endent בדרך כלל גדלים בקנה מידה קטנה בכלי תרבות 2D כגון צלחות תרבית תאים, צלוחיות תרבית תאים, או בקבוקי רולר, שבו הם לדבוק משטח צמיחת טיפול מיוחד 1. כאשר יותר תאים רצויים, ניתן להרחיב את הצלחות או צלוחיות באמצעות יותר או גדולים יותר כלים. עם זאת, לגידול חסכוני יותר של כמויות גדולות של תאים תלויים מעגן, הגדלת שטח הפנים להתקשרות סלולארי ניתן להשיג על ידי שימוש בחרוזים מוצקים קטנים בשם מיקרו ספקים. בהתאם למאפייני ההתקשרות של התא, כמה סוגים שונים של מיקרו-נשאים זמינים מסחרי, כגון dextran, פפטיד, או קולגן מצופה. יש לי מייקר נשאים שטח פנים גדול יחס נפח מתן שטח פנים גדול יותר לצמיחת תאים; ויכולים להישמר מיקרו ספקים בהשעיה עם תסיסה, המאפשרת לתאים להיות מעובדות לצפיפויות גבוהות במערכות bioreactor 2. נכון לעכשיו, את סוגי bioreactors בי תאים חסיד גדלים על מיקרו-נשאים כוללים צלוחיות טווה ומערכות טנק עוררו, אשר משתמשות במדחפים צירי כדי לשמור על השעיה של מיקרו-נשאי התא מצופה. מספר גורמים חשובים לגידול המוצלח של תאים כולל מתח חמצן, מאמץ גזירה, מטריצת פני השטח, ומזין וריכוזי המטבוליט. השימוש בbioreactors מאפשר ניטור בזמן אמת של תנאי גידול ואת הפוטנציאל לעלויות ייצור נמוך באופן משמעותי 1. ישנם מספר עיצובי bioreactor הנפוץ לגידול במבחנה תא כולל, השעיה עוררה, קיר כלי מסתובב, חלולים סיבים, bioreactor תיק על פלטפורמת נדנדה, ומערכות מיטה מרחפות 3. רבות ממערכות אלה להציג את הבעיות ייחודיות לטיפוח תא ואת קנה המידה -up, כגון עלות גבוהה, שיפועי ריכוז חומרי תזונה, גזירה הידרודינמית, צבירת תא, וקושי בדגימה, ניטור, וcel שליטהבהיקף של עד ליטר. שורות תאים חסיד שונות המשמשות בייצור של וירוסים, או בייצור של חיסונים נגיפיים או לייצור של וקטורים ויראליים ליישומי ריפוי גנטי. בסרטון הזה, באמצעות פנאומטי ליחד המערכת (Air-Wheel) bioreactor, אנחנו מדגימים את התרבות של תאים אנושיים קרצינומה של ריאה (A549) תאים על מיקרו-נשאים לייצור של אדנווירוס oncolytic. עיצוב bioreactor פנאומטי משתמש בגלגל תסיסה אנכי המופעל על ידי כוח העילוי של גז sparged לתוך החלק התחתון של bioreactor. שיטת ערבוב עדינה זה מגבילה כוחות גזירה הידרודינמית, אבל עדיין מבטיחה בינוני ותא אופטימליים ערבוב 4. בהשוואה לכור הטנק עורר, יש כור פנאומטי מתח קיר גזירה נמוך אפילו עם מערכות בנפח גבוה bioreactor Air-הגלגל (איור 1). בניגוד לbioreactors טנק עורר, המאיץ האנכי של כור ליחד זו מופעל על ידי זרם של בועות גז בתוךהכלי, המאפשר לערבוב עדין ואחיד בינוני (איור 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="626">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS 3&#160;</td>
			<td style="width:124px;">PBS</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Single Use Assembly</td>
			<td style="width:124px;">PBS</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;">Human Lung Carcinoma Cells (A549)</td>
			<td style="width:124px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">&#160;CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM High Glucose Medium</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA, 0.25%</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytodex 1 Microcarriers</td>
			<td style="width:124px;">GE</td>
			<td align="right">3781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antifoam C</td>
			<td style="width:124px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8011</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivation of mammalian cells using a single-use pneumatic bioreactor system

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

באיור 3, הפרמטרים לייזום של ריצת bioreactor מוצגים. נתון זה מראה את המסך לפני קביעת הפרמטרים של טמפרטורה, חמצן מומס, pH ותסיסה. ברגע שהפרמטרים מוגדרים, הפרמטרים הריצה ברציפות במעקב והתאמות יכולות להתבצע כדי לשמור על התנאים הנדרשים. התוכנה מייצרת קריאה רציפה המאפשרת זיהוי קל של בעיות. בניסוי זה באמצעות 2.5 L של DMEM מכיל 10% FBS, 250 ppm של C SAFC אנטי קצף, L-גלוטמין 2 מ&quot;מ ו3 גר &#39;/ L של מיקרו ספקים, המערכת התייצבה ולכן חמצן אחוזים הוא 50%, טמפרטורה היא 37 מעלות צלזיוס, וpH הוא 7.2. הכור מחוסן עם תאי A549 בריכוז של 7 x 10 4 תאים / מ&quot;ל (או 10 תאים / מיקרו מוביל). הפרמטרים שנבחרו לריצה זו הביאו ברוב המכריע של תאי שמירה על מיקרו-נושאות בתוך שעה 2 (איור 4). לאחר שעה 12, תאי שדיםסימני trating של השטחה ומתפשט על פני השטח מיקרו מוביל (איור 5). על ידי 24 שעות, יש לי מייקר ספקים אפילו יחסית חלוקת תאים, ללא מיקרו ספקים ללא תאים וללא גושים גדולים של תאים על מיקרו-הנשאים (איור 6). אחוז של קולוניזציה מיקרו מוביל על ידי תאי A549 הוא 75% על ידי 24 שעות ו90% לאחריו (איור 7). התאים ממשיכים לגדול באופן אקספוננציאלי ל~ 1 מיליון תאים / מ&quot;ל לאחר 48 שעה (איור 8). לאחר הדבקה על ידי מינון של אדנווירוס oncolytic (2 x 10 8 מ&quot;ל / virions) בשעה 50 שעה, הצפיפות מוגברת ל1.2 מיליון תאים / מ&quot;ל ולאחר מכן החלה לרדת כזיהום ממס התקדם. הייתה ~ 10,000 הגברה חיק הבידוד הנגיפי. בניסויים קודמים, שמצאנו כי הניטור והתאמת זרימת גז היא קריטי למקסם את צמיחת תאים (נתונים שלא פורסמו). במהירות תאי גידול יכולים לרוקן את המערכת של חמצן עם<html> רמת DO יורדת לאפס. בעוד התאים המשיכו לגדול, זה היה בקצב הרבה יותר איטי. זה קריטי כדי לפקח ולכוון את זרימת החמצן כדי לעמוד בדרישות של התאים בשלב צמיחת לוגריתמים. כל ריצה ניתן לנתח לצמיחה אופטימלית על ידי השוואת pH, DO, וטמפרטורה עם ספירת תאים יומית. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig1highres.jpg" /> איור 1 דינמיקת נוזלים של המערכה bioreactor פנאומטיים (PBS) בהשוואה לbioreactor טנק סטירר מדידת כוחות גזירת קיר בהיקפי כור שונים. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig2highres.jpg" /> איור 2 מאיץ כור פניאומטיים אוויר גלגל. <html> 52008 / 52008fig3highres.jpg &quot;/&gt; איור 3 צילום מסך תוכנת פניאומטיים אוויר גלגל הפרמטרים ליזום ריצת bioreactor. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" /> .4 קולוניזציה איור מיקרו מוביל עם תאי A549 לאחר חיסון 2 שעות. (קוטר מיקרו מוביל הממוצע ~ 180 מיקרומטר.) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig5highres.jpg" /> איור 5 שעות 12 לאחר תחילתה של התרבות, תאי A549 מצרפים, השטחה, ומתפשטים על מיקרו ספקים.&quot;Target =&quot; 5highres.jpg _blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" /> איור 6 מיקרו ספקים מצופים בתאים לאחר 24 שעות בתרבות. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig7highres.jpg" /> אחוז .7 איור של קולוניזציה מיקרו מוביל על ידי תאי A549 חיסון הודעה. <img alt="איור 8" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig8highres.jpg" /> איור 8 מספר תאי A549 קיימא בטרום תרבות ולאחר זיהום עם adenovirשלנו. שים לב שצעד זיהום ויראלי התרחש ב50 שעה.

Watch this Scientific Journal Video about Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System at JoVE.com

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

טיפוח של תאי יונקים באמצעות מערכת פניאומטיים Bioreactor יחיד שימוש

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

cultivation-mammalian-cells-using-single-use-pneumatic-bioreactor

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

24.3K Views.  Johns Hopkins University. Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells. 

Video: Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

הנדסה ביולוגית המבוססת דם שתלי שימוש bioreactor pulsatile

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

טיפוח האדם ובתאים עצבית ב Hydrogel עצמית להרכבת 3 מימדי פפטיד

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

גילוי חיידקים וזיהוי באמצעות חיישנים אלקטרוכימיים

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

We designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for transplantation. While the device primarily functions as a bioreactor that mimics the native mechanical strains, it is also outfitted with a load cell for providing force feedback or mechanical testing of the constructs. The device subjects engineered cartilage constructs to biaxial mechanical loading with great precision of loading dose (amplitude and frequency) and is compact enough to fit inside a standard tissue culture incubator. It loads samples directly in a tissue culture plate, and multiple plate sizes are compatible with the system. The device has been designed using components manufactured for precision-guided laser applications. Bi-axial loading is accomplished by two orthogonal stages. The stages have a 50 mm travel range and are driven independently by stepper motor actuators, controlled by a closed-loop stepper motor driver that features micro-stepping capabilities, enabling step sizes of less than 50 nm. A polysulfone loading platen is coupled to the bi-axial moving platform. Movements of the stages are controlled by Thor-labs Advanced Positioning Technology (APT) software. The stepper motor driver is used with the software to adjust load parameters of frequency and amplitude of both shear and compression independently and simultaneously. Positional feedback is provided by linear optical encoders that have a bidirectional repeatability of 0.1 &mu;m and a resolution of 20 nm, translating to a positional accuracy of less than 3 &mu;m over the full 50 mm of travel. These encoders provide the necessary position feedback to the drive electronics to ensure true nanopositioning capabilities. In order to provide the force feedback to detect contact and evaluate loading responses, a precision miniature load cell is positioned between the loading platen and the moving platform. The load cell has high accuracies of 0.15% to 0.25% full scale.

We designed a novel mechanical loading bioreactor that can apply uniaxial or biaxial mechanical strain to a cartilage biocomposite prior to transplantation into an articular cartilage defect.

עיצוב של Bioreactor טוען מכונות Biaxial להנדסת רקמות

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to carefully control temperature, pH, and dissolved oxygen concentrations in particular makes them essential to efficient large scale growth and expression of fermentation products. This video will briefly describe the advantages of the fermentor over the shake flask. It will also identify key components of a typical benchtop fermentation system and give basic instruction on setup of the vessel and calibration of its probes. The viewer will be familiarized with the sterilization process and shown how to inoculate the growth medium in the vessel with culture. Basic concepts of operation, sampling, and harvesting will also be demonstrated. Simple data analysis and system cleanup will also be discussed.

Fermentors are used to increase culture yield and productivity of bioengineered cells. After screening multiple microbial or animal cell culture candidates in shake flasks, the next logical step is to increase the selected culture&#x2019;s biomass with the fermentor. This video demonstrates the setup and operation of a typical benchtop bioreactor system.

מבצע של Bioreactor Benchtop

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past studies have evaluated the performance of the reactor for the removal of COD1 and nitrogen species2-4 by heterotrophic and chemoautotrophic bacteria, respectively. The HDBR design eliminates the requirement for external flocculation/sedimentation processes while still yielding effluent containing low suspended solids. In this study, the HDBR is applied as a photobioreactor (PBR) in order to characterize the nitrogen removal characteristics of an algae-based photosynthetic microbial community. As previously reported for this HDBR design, a stable biomass zone was established with a clear delineation between the biologically active portion of the reactor and the recycling reactor fluid, which resulted in a low suspended solid effluent. The algal community in the HDBR was observed to remove 18.4% of total nitrogen species in the influent. Varying NH4+ and NO3- concentrations in the feed did not have an effect on NH4+ removal (n=44, p=0.993 and n=44, p=0.610 respectively) while NH4+ feed concentration was found to be negatively related with NO3- removal (n=44, p=0.000) and NO3- feed concentration was found to be positively correlated with NO3- removal (n=44, p=0.000). Consistent removal of NH4+, combined with the accumulation of oxidized nitrogen species at high NH4+ fluxes indicates the presence of ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria within the microbial community.

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Here, the HDBR is successfully applied in a photobioreactor (PBR) configuration for the study of nitrogen metabolism by a mixed high density algal community.

Bioreactor רומן לטיפוח צפיפות גבוה של קהילות חיידקים מגוונות

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based method is one of the simplest techniques for the mass production of cellular aggregates, but it does not protect the cultures against over-aggregation, which occurs when they gather at the bottom center of the culture vessel. To solve this problem, we developed an O-shaped dish and an O-shaped bag, neither of which contains a central region. Aggregates grown in either O-shaped culture vessel were noticeably more uniform in size than aggregates grown in conventional vessels. Histological analyses showed that aggregates in conventional culture dishes contained necrotic cores most likely caused by a poor oxygen supply. In contrast, aggregates that were grown in the O-shaped bag, even those with similar diameters to aggregates in conventional culture dishes, did not show necrotic cores. These results suggest that the O-shaped bag provides sufficient oxygen to the aggregates due to the oxygen permeability of the bag material. We, therefore, propose that this novel gas-permeable O-shaped culture bag is suitable for the mass production of uniform aggregates that are necessary in various biotechnological fields.

Here we present a protocol for using O-shaped vessels, specialized for suspension cultures of cellular aggregates, with orbital shaking. The HEK293 cells grown in this bag form more homogeneous aggregates than those grown in conventional culture vessels.

אורביטל טלטול התרבות של תאים בתרבית של צורת O כלי לייצר אגרגטים אחיד

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Construction of CRISPR Plasmids and Detection of Knockout Efficiency in Mammalian Cells through a Dual Luciferase Reporter System

Although highly efficient, modification of a genomic site by the CRISPR enzyme requires the generation of a sgRNA unique to the target site(s) beforehand. This work describes the key steps leading to the construction of efficient sgRNA vectors using a strategy that allows the efficient detection of the positive colonies by PCR prior to DNA sequencing. Since efficient genome editing using the CRISPR system requires a highly efficient sgRNA, a preselection of candidate sgRNA targets is necessary to save time and effort. A dual luciferase reporter system has been developed to evaluate knockout efficiency by examining double-strand break repair via single strand annealing. Here, we use this reporter system to pick up the preferred xCas9/sgRNA target from candidate sgRNA vectors for specific gene editing. The protocol outlined will provide a preferred sgRNA/CRISPR enzyme vector in 10 days (starting with appropriately designed oligonucleotides).

Here, we present a protocol describing a streamlined method for the efficient generation of plasmids expressing both the CRISPR enzyme and associated single guide RNA (sgRNAs). Co-transfection of mammalian cells with this sgRNA/CRISPR vector and a dual luciferase reporter vector that examines double-strand break repair allows evaluation of knockout efficiency.

בניית פלסמידים CRISPR וזיהוי יעילות נוקאאוט בתאים יונקים באמצעות מערכת כתב לוציפראז כפול

Although highly efficient, modification of a genomic site by the CRISPR enzyme requires the generation of a sgRNA unique to the target site(s) beforehand. ...