שורות תאי ערמונית ניתנות באדיבות על ידי ד&quot;ר לינג-יו וואנג וינג אי-ד&quot;ר Jien קונג במרכז לחקר הסרטן, UC Davis. פרויקט זה נתמך על ידי מענק galvanotaxis NIH 4R33AI080604.

1. תאי culturing ערמונית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות pRNS-1-1 וערמונית PNT2 תאים על 100 מנות תרבות מ&quot;מ במדיום RPMI 1640 בתוספת 10% FBS ואנטיביוטיקת antimycotic על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. רענן מדיום התרבות בכל יום עד שהתאים מגיעים 80% confluency לניסויי galvanotaxis. </li></ol> 2. צ&#39;יימברס Galvanotaxis הרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכבת תאים תחתון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב קאמרי galvanotaxis פלסטיק עם 2-propanol. החל אוטם סיליקון הכיתה הימי סביב הפתחים עגולים בצד התחתון של קאמרי עם מזרק ולצרף coverglass גדול (איור 1). השתמש בצד האחורי של המוליך כותנה לדחוף את coverglass ולנגב את הדבק העודף עם צמר גפן. הפתחים עגולים יאפשר בינוני והזרם חשמלי לזרום על התאים הממוקמים בין שני המאגרים בינוניים הפנימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך coverglass קטן כדי להפוך את 6 מ&quot;מ x 25 מפרידי מ&quot;מ עם סמן נקודת יהלומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את התא. החל 2 פסים של דבק סיליקון עם מזרק ו / או מרית מתכת, כדי ליצור משטח ערוץ x 25 מ&quot;מ 10 מ&quot;מ לקובץ מצורף תא בין 2 הפתחים עגולים על הזכוכית התחתונה. דבק 2 חתיכות של spacer זכוכית בין 2 הפתחים עגולים. השתמש בצד האחורי של החלת מהכותנה לדחוף את מפרידי ולנגב את הדבק העודף עם צמר גפן ו / או קיסמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את התא למשך 24 שעות עד שדבק סיליקון הוא נרפא. משרים את התא בלילה מים מזוקק כדי להסיר את שאריות חומצה אצטית מהדבק. ייבש את התא לשימוש מיידי, או לאחסן את התא לשימוש מאוחר יותר במכל נקי. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1: עצרת של תא galvanotaxis התחתון. ) Coverglass גדול מחובר לחלק התחתון של חדר נקי. B) Tוו חתיכות של מפרידי זכוכית מודבקות בין 2 הפתחים עגולים כדי ליצור x 25 מ&quot;מ ערוץ 10 מ&quot;מ לתאים לצרף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זריעת תאים בתאי galvanotaxis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מספרם של התאים דורשים galvanotaxis הדרושים לניסוי. שורת תאים כל טיפול או דורשת קאמרית galvanotaxis יחיד. נגב את תאי galvanotaxis עם 2-propanol. לשטוף את התאים עם PBS 3 פעמים סטריליים ולבדוק את זרימת הנוזל בין 2 הפתחים עגולים בתאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקף את התאים בצלחות תרבית תאים סטריליים ולאפשר להם לאזן על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לנתק את תאי ערמונית ממנת התרבות שלהם באמצעות 5 מיליליטר 0.25% טריפסין-EDTA על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לנטרל את טריפסין-EDTA עם FBS 5 מיליליטר של 10% בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את תאי 15 מיליליטר צינורות וצנטריפוגה התאים למשך 5 דקות ב 200 XG, 37 ° C. לשאוב supernatant מחדש להשעות את התאים ב 1 מיליליטר של מדיום התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 20 μl של פתרון תא לטעון לחדר ספירה ולחשב את מספר התא. התאם את ריכוז התא עד 8 ​​x 10 4 תאים / מיליליטר עם מדיום התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את תאי galvanotaxis מתוך 37 ° C החממה. זרעי 350 μl של ההשעיה התא אל תא אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים בתאי הלילה בצלחת התרבות עם Kimwipe הרטוב או בתא לחות בחממה על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. </li></ol></li></ol><img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2:. מתזמן את התאים לתא התא התחתון הוא מיובש וניקה תאי ערמונית) הם trypsinized, נספרו ומועברים לתא וטופחו לילה B) coverglass עליון מחובר ללאטום את החדר לפני צילומים... <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl">ssembling תאים העליונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את התא העליון לפני צילומים. מיקרוסקופ יכול להכיל רק הדמיה קאמרית galvanotaxis אחת בכל פעם. להתחמם 10 מיליליטר של מדיום התרבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך כל תא galvanotaxis. העבר את תא galvanotaxis מהחממות לצלחת התחממות 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את התאים עם מדיום התרבות להסיר את התאים הפנויים. השאר 400 μl של מדיום בתא. השתמש במזרק ללמרוח משחה ואקום גבוהה על גבי שני מפרידי הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף coverglass קטן לאטום את החדר. לחץ בעדינות במורד coverglass עם הצד האחורי של המוליך כותנה. נגב את המדיום העודף עם צמר גפן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את משטח הזכוכית ולמרוח משחה ואקום גבוהה כדי לאטום את הפער בין coverglass והקאמרי. השתמש במרית מתכת כדי להפיץ את השומן. הוסף 4 מיליליטר של מדיום התרבות למאגרים הפנימיים ולבדוק את זרימת הנוזל בין המאגרים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך אגרגשרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך זוג צינורות PVC הארוך 2 אינץ &#39;(503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 כותל), להפוך ולהכניס אותם לתוך כוס מיליליטר 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד 200 מ&quot;ג Bacto-אגר ולהוסיף אותו בבקבוק 50 מיליליטר עם מדיום תרבות 10 מיליליטר כדי להפוך 2% ג&#39;ל אגר. מיקרוגל למשך 30 שניות. טען את הג&#39;ל אגר לצינורות פלסטיק עם pipet העברה. השאר את אגר גשרים בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות כדי לחזק את אגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני תרבות 2 מיליליטר למאגרים החיצוניים של תא galvanotaxis. הכנס את אגר גשרים למאגרים בינוניים הפנימיים וחיצוניים לנהל הנוכחי. </li></ol></li></ol><img alt="איור 3" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig3highres.jpg" width="350" /> איור 3:. צילומי התאים בתא תרשים כדי להדגים את ההרכבה הסופית של חדר galvanotaxis. התא אטום לחלוטין עם גריז ואקום גבוה. בינוני מתווסף to למלא את המאגרים, ושני גשרים אגר מוכנסים לתוך התא. אז קאמרי galvanotaxis מועבר לבמה מיקרוסקופ ואלקטרודות מחוברות ליישם השדה החשמלי. צדתי להציג של חדר galvanotaxis התאסף מוצג על מנת להוכיח כי הזרם החשמלי זורם על התאים באמצעות הגשרים אגר והרווח בין הזכוכית המכסה. הדמיה 3. זמן לשגות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התא הסביבתי על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 בשעת האוויר במחזור 2 לפני ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור על המיקרוסקופ וליזום את תוכנת רכישת התמונה. כייל את הבמה מיקרוסקופ ובחר את מטרת 10X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את תאי galvanotaxis לבמה מיקרוסקופ, לאבטח את החדר עם קלטת ולהתמקד בתאים. הכנס את האלקטרודות galvanotaxis למאגרים החיצוניים עם קתודה בצד ימין. לאבטח את החוט ואלקטרודות עם קלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את bo הכחx ליישם שדה חשמלי לתא. מדוד את מתח הפלט עם מד המתח על פני התא להגיע 2.5 וולט לתא 25 מ&quot;מ הארוך (100 mV / מ&quot;מ). לשמור על עוצמת השדה במהלך הניסוי על ידי התאמת התפוקה הנוכחית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 10 נקודות על פני התא לצלם בתוכנה כדי ליצור עשרה זמן לשגות סרטים. להגדיר את תנאי רכישה במרווחים של 10 דקות לשעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל צילומים ולהתאים את התפוקה הנוכחית במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של הניסוי, להסיר את התא מהבמה ולתקן את התאים עם אלכוהול 95%. לפרוץ את החדר עם סכין גילוח לנקות מחדש להשתמש בו. </li></ol> 4. כימות Galvanotaxis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את הזמן לשגות הסרטים ורי-אוריינט הקתודה לחלק העליון של התמונות. לייצא את הסרטים לתוכנת המעקב הסלולרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידני לעקוב (x, y) העמדה של 10-20 תאים בכל נקודת זמן מכל סרט (4 איור, B).מרחקי ההגירה והזוויות ביחס לכיוון צפון-דרום, באותו הכיוון של השדה החשמלי, יחושבו בתוכנת מעקב תא (איור 4C). הערה: מהירות ההגירה הממוצעת מומרת ממרחק ההגירה הכולל וכולל זמן צילומים. כיווניות מומרת מהזוויות לערך קוסינוס. אם תאים לנדוד עם יווניות אקראיות, הממוצע של קוסינוס נטו יהיה קרוב לאפס. אם התאים להעביר ישירות לכיוון הקתודה, ערך קוסינוס יהיה +1. אם התאים להעביר ישירות לכיוון האנודה, ערך קוסינוס יהיה -1. </li></ol><img alt="איור 4" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig4highres.jpg" width="400" /> איור 4: מעקב סלולארי למדוד יווניות) כיסוי של קווי מעקב עם תמונות תא.. העמדות (x, y) של התאים manuaמעקב lly בזמן לשגות הסרטים. . אם התאים לנדוד באופן אקראי, קוסינוס הממוצע הוא קרוב לאפס B) עם זאת, אם התאים נודדים לעבר הקתודה או האנודה, הערך של קוסינוס הממוצע הוא קרוב ל+ (קתודה) או -. (האנודה) 1.0 C ) כיווניות מוצגות על ידי ערך קוסינוס, אשר מומר מזוויות ההגירה (θ). קוסינוס (θ) שווה את היחס של המרחק (מרחק הגירה) לb מרחק (המרחק המוקרן לכיוון השדה החשמלי). <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את המדידות. לייבא את הנתונים ליישום מסד נתונים כדי לחשב את התוצאות המשולבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את הנתונים בשילוב של מהירות הגירה ממוצעת וערך קוסינוס הממוצע לגיליון אלקטרוני כדי לתכנן את הגרפים בר (איור 5). </li></ol>

<ol>
	<li>Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+measurement+of+bioelectric+currents+with+a+vibrating+probe.">Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe.</a> Nat Protoc. 2 (3), 661-669 (2007).</li><li>Cao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+electric+currents+might+guide+rostral+migration+of+neuroblasts.">Endogenous electric currents might guide rostral migration of neuroblasts.</a> EMBO Rep. 14 (2), 184-190 (2013).</li><li>Hotary, K. B., Robinson, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+electrical+currents+and+voltage+gradients+in+Xenopus+embryos+and+the+consequences+of+their+disruption.">Endogenous electrical currents and voltage gradients in Xenopus embryos and the consequences of their disruption.</a> Dev Biol. 166 (2), 789-800 (1994).</li><li>Hotary, K. B., Robinson, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+role+for+endogenous+electrical+fields+in+chick+embryo+development.">Evidence of a role for endogenous electrical fields in chick embryo development.</a> Development. 114 (4), 985-996 (1992).</li><li>Yamashita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+axon+guidance+in+embryonic+retina:+galvanotropism+revisited.">Electric axon guidance in embryonic retina: galvanotropism revisited.</a> Biochem Biophys Res Commun. 431 (2), 280-283 (2013).</li><li>Wood, M. D., Willits, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applied+electric+field+enhances+DRG+neurite+growth:+influence+of+stimulation+media,+surface+coating+and+growth+supplements.">Applied electric field enhances DRG neurite growth: influence of stimulation media, surface coating and growth supplements.</a> J Neural Eng. 6 (4), 046003 (2009).</li><li>Kucerova, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+electrical+signals+in+murine+corneal+wound+re-epithelialization.">The role of electrical signals in murine corneal wound re-epithelialization.</a> J Cell Physiol. 226 (6), 1544-1553 (2011).</li><li>Sillman, A. L., Quang, D. M., Farboud, B., Fang, K. S., Nuccitelli, R., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Dermal+fibroblasts+do+not+exhibit+directional+migration+on+collagen+I+in+direct-current+electric+fields+of+physiological+strength.">Human Dermal fibroblasts do not exhibit directional migration on collagen I in direct-current electric fields of physiological strength.</a> Exp Dermatol. 12 (4), 396-402 (2003).</li><li>Allen, G. M., Mogilner, A., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoresis+of+cellular+membrane+components+creates+the+directional+cue+guiding+keratocyte+galvanotaxis.">Electrophoresis of cellular membrane components creates the directional cue guiding keratocyte galvanotaxis.</a> Curr Biol. 23 (7), 560-568 (2013).</li><li>Nishimura, K. Y., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+keratinocytes+migrate+to+the+negative+pole+in+direct+current+electric+fields+comparable+to+those+measured+in+mammalian+wounds.">Human keratinocytes migrate to the negative pole in direct current electric fields comparable to those measured in mammalian wounds.</a> J Cell Sci. 109 (1), 199-207 (1996).</li><li>Farboud, B., Nuccitelli, R., Schwab, I. R., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DC+electric+fields+induce+rapid+directional+migration+in+cultured+human+corneal+epithelial+cells.">DC electric fields induce rapid directional migration in cultured human corneal epithelial cells.</a> Exp Eye Res. 70 (5), 667-673 (2000).</li><li>Fang, K. S., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+relocalization+and+kinase+activity+are+necessary+for+directional+migration+of+keratinocytes+in+DC+electric+fields.">Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields.</a> J Cell Sci. 112 (12), 1967-1978 (1999).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+T+lymphocytes+migrate+toward+the+cathode+of+DC+electric+fields+in+microfluidic+devices.">Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices.</a> Lab Chip. 11 (7), 1298-1304 (2011).</li><li>Meng, X., Arocena, M., Penninger, J., Gage, F. H., Zhao, M., Song, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+mediated+electrotaxis+of+embryonic+and+adult+neural+progenitor+cells+in+the+presence+of+growth+factors.">PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors.</a> Exp Neurol. 227 (1), 210-217 (2011).</li><li>Wu, D., Ma, X., Lin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DC+Electric+Fields+Direct+Breast+Cancer+Cell+Migration,+Induce+EGFR+Polarization,+and+Increase+the+Intracellular+Level+of+Calcium+Ions.+.">DC Electric Fields Direct Breast Cancer Cell Migration, Induce EGFR Polarization, and Increase the Intracellular Level of Calcium Ions. .</a> Cell Biochem Biophys. 67 (3), 1115-1125 (2013).</li><li>Martin-Granados, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+PP1/NIPP1+in+steering+migration+of+human+cancer+cells.">A role for PP1/NIPP1 in steering migration of human cancer cells.</a> PLoS One. 7 (7), 40769 (2012).</li><li>Yang, H. Y., Charles, R. P., Hummler, E., Baines, D. L., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epithelial+sodium+channel+mediates+the+directionality+of+galvanotaxis+in+human+keratinocytes.">The epithelial sodium channel mediates the directionality of galvanotaxis in human keratinocytes.</a> J Cell Sci. 126 (9), 1942-1951 (2013).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+signals+control+wound+healing+through+phosphatidylinositol-3-OH+kinase-gamma+and+PTEN.">Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN.</a> Nature. 442 (7101), 457-460 (2006).</li><li>Shanley, L. J., Walczysko, P., Bain, M., MacEwan, D. J., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influx+of+extracellular+Ca2++is+necessary+for+electrotaxis+in+Dictyostelium.">Influx of extracellular Ca2+ is necessary for electrotaxis in Dictyostelium.</a> J Cell Sci. 119 (22), 4741-4748 (2006).</li><li>Zhao, M., Agius-Fernandez, A., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+migration+of+corneal+epithelial+sheets+in+physiological+electric+fields.">Directed migration of corneal epithelial sheets in physiological electric fields.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 37 (13), 2548-2558 (1996).</li><li>Peng, H. B., Jaffe, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+of+fucoid+eggs+by+steady+electrical+fields.">Polarization of fucoid eggs by steady electrical fields.</a> Dev Biol. 53 (2), 277-284 (1976).</li><li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+adult+human+prostatic+epithelial-cells+immortalized+by+polybrene-induced+DNA+transfection+with+a+plasmid+containing+an+origin-defective+sv40-genome.">Characterization of adult human prostatic epithelial-cells immortalized by polybrene-induced DNA transfection with a plasmid containing an origin-defective sv40-genome.</a> Int J Oncol. 4 (4), 821-830 (1994).</li><li>Berthon, P., Cussenot, O., Hopwood, L., Leduc, A., Maitland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+sv40+in+normal+human+prostatic+epithelial+and+fibroblastic+cells+-+differentiation+pattern+of+non-tumorigenic+cell-lines.">Functional expression of sv40 in normal human prostatic epithelial and fibroblastic cells - differentiation pattern of non-tumorigenic cell-lines.</a> Int J Oncol. 6 (2), 333-343 (1995).</li><li>Aurich-Costa, J., Vannier, A., Gr&#233;goire, E., Nowak, F., Cherif, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IPM-FISH,+a+new+M-FISH+approach+using+IRS-PCR+painting+probes:+application+to+the+analysis+of+seven+human+prostate+cell+lines.">IPM-FISH, a new M-FISH approach using IRS-PCR painting probes: application to the analysis of seven human prostate cell lines.</a> Genes Chromosomes Cancer. 30 (2), 143-160 (2001).</li><li>Tyson, D. R., Inokuchi, J., Tsunoda, T., Lau, A., Ornstein, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+requirements+of+prostatic+epithelial+cell+lines+for+acinar+morphogenesis+and+lumen+formation+in+vitro:+role+of+extracellular+calcium.">Culture requirements of prostatic epithelial cell lines for acinar morphogenesis and lumen formation in vitro: role of extracellular calcium.</a> Prostate. 67 (15), 1601-1613 (2007).</li><li>Lang, S. H., Sharrard, R. M., Stark, M., Villette, J. M., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+epithelial+cell+lines+form+spheroids+with+evidence+of+glandular+differentiation+in+three-dimensional+Matrigel+cultures.">Prostate epithelial cell lines form spheroids with evidence of glandular differentiation in three-dimensional Matrigel cultures.</a> Br J Cancer. 85 (4), 590-599 (2001).</li><li>Babona-Pilipos, R., Popovic, M. R., Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+galvanotaxis+assay+for+analysis+of+neural+precursor+cell+migration+kinetics+in+an+externally+applied+direct+current+electric+field.">A galvanotaxis assay for analysis of neural precursor cell migration kinetics in an externally applied direct current electric field.</a> J Vis Exp. (68), (2012).</li><li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-controlled+directed+migration+of+neural+progenitor+cells+in+2D+and+3D+environments.">Electric field-controlled directed migration of neural progenitor cells in 2D and 3D environments.</a> J Vis Exp. (60), (2012).</li><li>Pullar, C. E., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP+mediates+keratinocyte+directional+migration+in+an+electric+field.">Cyclic AMP mediates keratinocyte directional migration in an electric field.</a> J Cell Sci. 118 (9), 2023-2034 (2005).</li><li>Sheridan, D. M., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imposition+of+a+physiologic+DC+electric+field+alters+the+migratory+response+of+human+keratinocytes+on+extracellular+matrix+molecules.">Imposition of a physiologic DC electric field alters the migratory response of human keratinocytes on extracellular matrix molecules.</a> J Invest Dermatol. 106 (4), 642-646 (1996).</li><li>Feng, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guided+migration+of+neural+stem+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells+by+an+electric+field.">Guided migration of neural stem cells derived from human embryonic stem cells by an electric field.</a> Stem Cells. 30 (2), 349-355 (2012).</li><li>Mukerjee, E. V., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R., Collins, S. D., Smith, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedle+array+for+measuring+wound+generated+electric+fields.">Microneedle array for measuring wound generated electric fields.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1, 4326-4328 (2006).</li><li>Nuccitelli, R., Nuccitelli, P., Li, C., Narsing, S., Pariser, D. M., Lui, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electric+field+near+human+skin+wounds+declines+with+age+and+provides+a+noninvasive+indicator+of+wound+healing.">The electric field near human skin wounds declines with age and provides a noninvasive indicator of wound healing.</a> Wound Rep. and Reg. 19, 645-655 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הניתוח של תגובת galvanotaxis של תא היה חיווי פונקציונלי חשוב עבור רבים נודדים או צמיחה סלולריות מעבד 27, 28. כאן אנו משתמשים קאמריים מחוייט עם משטח זכוכית לצלם את שתי שורות תאי ערמונית. שורות תאים אלה הפגינו דרגות שונות של galvanotaxis, ואנחנו משערים כי הלוקליזציה תאית או ההפעלה של החלבונים מתווכים-galvanotaxis עלולה להתנגש בתהליך של יצירת שורות תאים האלמותיות, וכתוצאה מכך ההבדל שנצפה בתגובת galvanotaxis. בהשוואה לעיצובים קאמריים galvanotaxis אחרים שנעשו בכלי תרבות 27, 28, יש כמה יתרונות לעיצוב הנוכחי. ראשית, משטח הזכוכית מתאים להדמיה וcoverglass עם תאים יכול להישמר לאחר galvanotaxis לimmunostaining. במחקר זה השתמשנו בהגדלה נמוכה של מטרת 10X לפקח קבוצה של תאים. עם זאת, עם thesאופטיקה זכוכית משופרת הדואר, ניתן לצלם תא בודד בהגדלה גבוהה יותר עם ​​מטרת נפט 60x, למעקב אחר הסיומת וההכחשה מהירות של lamellipodial בחוד החנית של התאים 17, או מעקב אחר תאים שכותרתו עם חלבוני ניאון. שנית, משטח הזכוכית יכול להיות שונה עם ציפוי חלבון מטריקס 10, 12 או בדוגמת עם מיקרו-ערוצים. טיפולים כימיים גם אפשריים לשימור טיפול בתאים לפני צילומי 29. מטריקס ציפוי אינו נדרש לשורות תאי הערמונית משמשות כאן, וציפוי המטריצה ​​הוא סוג תא תלוי. לדוגמא, אני קולגן ציפוי נדרש לgalvanotaxis של קרטינוציטים אדם 30, אבל ציפוי laminin נדרש לgalvanotaxis של תאי גזע עצביים אנושיים 31. בדקנו galvanotaxis keratinocyte אדם עליי קולגן, קולגן IV, פיברונקטין, וlaminin. חלבוני מטריצה ​​שונים שינו מהירות נדידת תאים, אבל לא שינו את migrati cathodal<html> בgalvanotaxis 29. שלישית, אלקטרודות הפלטינה שעברו שינוי הנן אינרטי בשדה החשמלי. בהשוואה לאלקטרודות הכסף המשמשת בשיטות אחרות galvanotaxis 27, הם לא לשבור או לשחרר יונים של מתכות למדיום, אשר מפחית את cytotoxicity בgalvanotaxis. רביעית, אנו עשויים לשנות את המרווחים של לכידת מסגרת, אשר מסייעת לנו לעקוב אחר נדידת תאים מהירה או איטית. מיקרוסקופ הממונע מספק גם ההזדמנות לרכוש סרטים מרובים מאזורים שונים בחדר אחד. ניסוי שליטה ללא שדה חשמלי מיושם חשוב לקביעה אם השדה החשמלי משנה את מהירות הנדידה של התאים. עם זאת, תאי galvanotaxis הנוכחיים מוגבלים לנדידת תאי צילומים לעד 4 שעות בשל הנפח הקטן של מדיום במאגרים. עם גרסה מוגדלת של עיצוב החדר, אפשר יהיה לצלם תאים לתקופה ארוכה יותר של זמן. <html> ve_content &quot;&gt; חלק מהבעיות הפוטנציאליות בשיטה כוללות:. 1) התאים עלולים למות בהרכבה הקאמרית אם הם הופכים מיובשים מכיוון שנפח קטן מאוד של מדיום בתא (400 μl), חשוב להימנע מהשמנת אוויר בועות בתא ולשמור על כמה נוזל מכסה את התאים במהלך שלב שטיפת תא. 2) הקאמרית יכול לדלוף במהלך הדמיה, שהיה מקטין את הזרם העובר דרך התא. זרימת הנוזל בתא יש לבדוק בקפידה לפני ש הועבר לבמה מיקרוסקופ וגריז ואקום גבוה יותר מיושם במידת צורך. 3) נמרחו משחה ואקום גבוהה עלולה להפריע לצילומים. משטח הזכוכית ניתן לנקות עם אלכוהול 95% כדי להסיר שומן. 4) להיסחף שלב או כל תזוזה של התאים ב במה מיקרוסקופ ממונעת יכול להטות את המדידות של ההגירה כיוונית. לכן, חשוב לשמור על תאי galvanotaxis עם בעל במה נאות וקלטת תיוג. ntent &quot;&gt; בסך הכל, שיטת galvanotaxis שימושית כדי לחשוף את הכיווניות הפנימית של תאי ניעתי בשדה חשמלי שימושי, שיעזור לנו להבין את ההגירה כיוונית באורגניזמים נוספים.

שדות חשמליים אנדוגני מתגלים ברקמות שונות, כגון עור 1, 32, 33 ומוח 2. השדה החשמלי הפיזיולוגי משרת פונקציות ביולוגיות ספציפיות, כוללים פיתוח בימוי עובר 3, 4, המנחה את תולדה של תהליכים עצביים 5, 6 וקידום סגירת אפיתל קרני ופצע 1, 7. במבחנה, יישום של שדה חשמלי נוכחי ישיר לתאים בתרבית מחקה את השדה החשמלי הפיזיולוגי וגורם הגירה כיוונית תא, או galvanotaxis. Galvanotaxis נחקר בfibroblasts 8, קרטינוציטים דגים 9, אפיתל אדם וקרטינוציטים קרנית 10-12, לימפוציטים מסוג 13, neuroblasts 2, ובתאים עצביים 14. כאשר נחשפו לשדה המופעל, רוב התאים למדו להעביר directionally כלפי cathodal (-) הקוטב. ובכל זאת, כמה תאי סרטן, כוללים מאוד גרורתיתאי סרטן השד אנושיים ושורת תאי סרטן הערמונית האנושית PC-3M, לעבור לanodal (+) קוטב 15, 16. מספר מנגנונים מוצעים לתווך galvanotaxis או להסביר את היכולת של התאים לחוש את השדה החשמלי, כולל הפעלה של EGF קולטני 12, ערוץ נתרן אפיתל 17, PI3K וPTEN 18, ושחרורו של סידן יונים 15, 19. המנגנון הוא עדיין לא הבין באופן מלא וזה אפשרי, כי מסלולי איתות מרובים מעורבים בgalvanotaxis. שיטת galvanotaxis 2-ממדית אנחנו מדגימים כאן היא שימושית כדי לאפיין את ההגירה כיוונית של חסיד, תאי ניעתי, או כדי לפקח על הגירת תאים בודדת 10, 12, 17 או הגירה של גיליון של תאים ומחוברות 18, 20. טכניקה זו שונה מ פנג והיפה 21, וNishimura et al. 10 עם, תאי PVC ברורים מחוייט, עם coversl הנשלףשב&quot;ס מאפשר לאחזור תא קל לאחר galvanotaxis לניתוח משני, כגון הדמיה חיסונית הקרינה. משטח הזכוכית של תאי galvanotaxis הוא אופטי תואם, המאפשר לצלם בהגדלה גבוהה ועם תאי fluorescently שכותרתו. זה גם מאפשר עיצוב ניסיוני עם שינוי של משטח הזכוכית, כגון שינוי ציפוי פני השטח או חיובים. מפרידי עשויים מס &#39;1 coverglass משמשים בתאי כדי למזער את הזרימה הנוכחית על התאים; לכן חימום ג&#39;אול, שהוא פרופורציונאלי לריבוע של הזרימה הנוכחית, לא לחמם יותר מדי את התאים במהלך הניסוי. הגשרים אגר החיבור למנוע מגע ישיר של אלקטרודות עם התאים ולמנוע שינוי של pH הבינוני או ריכוז יון בgalvanotaxis. שתי שורות תאי ערמונית אנושית שאינם סרטניות נבדקו לתגובת galvanotaxis במחקר זה. PRNS-1-1 22 וPNT2 23 שניהם SV40-הונצחו, שורות תאי גורם תלוי צמיחה המבטאות את סמני אפיתל cytokeratin 5, 8, 18 ו -19 עם ביטוי נמוך או לא של אנטיגן הספציפי לערמונית (PSA). שני שורות התאים לשמור על מורפולוגיה המצולעים של תאי האפיתל נורמלים, אבל הנורמליות של כרומוזום נצפתה בkaryotyping 22, 24. למרות שpRNS-1-1 וPNT2 לשתף התנהגויות דומות ברוב הניסויים, הם עושים להראות הבדלים במבנה של מבנה acinar וב galvanotaxis. על מטריצת 3-D, Matrigel, pRNS-1-1 תאים ליצור מבני acinar חלולים עם לומן הדומה לרקמת בלוטת הערמונית הרגילה 25. עם זאת, תאי PNT2 יוצרים spheroids המוצק ללא לומן או אפיתל המקוטב 26. תאי pRNS-1-1 גם להפגין תגובת galvanotactic גבוהה מPNT2 במחקר הנוכחי. המתאם בין ההיווצרות של מבנה acinar וgalvanotaxis בpRNS-1-1 מצביע על כך שאותות galvanotactic עשויים לשחק תפקיד בארגון יחסי הציבורתנועות ostate בלוטת רקמה בתגובה לשדות חשמליים אנדוגני, ומספקת מאפיינים נוספים להפלות בין 2 שורות תאים אלה.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Cells&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>pRNS-1-1 prostate cells</td><td></td><td></td><td>Lee, &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; (1994)</td></tr><tr><td>PNT2 prostate cells</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95012613-1VL</td><td>Berthon, &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; (1995)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Medium and solutions&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td>warm up to 37 &amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum - Premium</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>10% in PBS, warm up to 37 &amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>15240</td><td>add 5 ml to 500 ml medium</td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>VWR</td><td>BDH1133-5GL</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>-</td><td>-</td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; and 1.5 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; in 1,000 ml of H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37 &amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td>warm up to 37 &amp;deg;C before use, treat cells for 3-5 min at 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Galvanotaxis device&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Galvanotaxis chambers</td><td>Precision Plastics Inc, CA</td><td></td><td>Custom-designed (1/4&quot; x 2&quot; x 3.5&quot;), non-toxic, clear PVC chambers. Please contact the authors for the design specs.</td></tr><tr><td>Galvanotaxis electrodes</td><td>UCD electric shop</td><td></td><td>platinum coiled electrodes with flexable cords</td></tr><tr><td>Galvanotaxis power box</td><td>Substrate Engineering, CA</td><td></td><td>custom-designed DC power output with voltmeter</td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass, Large, 45 x 50 mm, No. 1.5</td><td>Fisher</td><td>12-544-F</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass, small, 25 x 25 mm, No. 1</td><td>ThermoScientific</td><td>3307</td><td></td></tr><tr><td>Diamond point marker</td><td>ThermoScientific</td><td>750</td><td></td></tr><tr><td>Marine grade silicon sealer, clear</td><td>3M</td><td>051135-08019</td><td></td></tr><tr><td>High vacuum grease</td><td>Dow Corning</td><td>2021846-0807</td><td></td></tr><tr><td>6 ml syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-561-64</td><td></td></tr><tr><td>Nichiryo Syringe, 1.5 ml</td><td>Nichiryo</td><td>SG-M</td><td></td></tr><tr><td>Cotton applicators</td><td>Purtian Medical Products</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Qtips</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson</td><td>729389</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 180 PVC tubing&amp;nbsp;</td><td>Nalgene</td><td>8000-9030</td><td>503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall</td></tr><tr><td>Bacto-Agar</td><td>Difco</td><td>0140-01</td><td>make 2% agar solution</td></tr><tr><td>Razor Blade</td><td>Personna</td><td>74-0001</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipments and Software&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Benchtop Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>operated with an A-4-62 rotor</td></tr><tr><td>Cellometer Auto T4</td><td>Nexcelom</td><td>Auto T4</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer counting chambers</td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-SD100-002</td><td>load 20 &amp;#956;l cell solutions to count</td></tr><tr><td>Culture Temp Warming plate</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>370150000</td><td>to keep the galvanotaxis chambers at 37 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Fluor 10X/0.30 objective len</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Retiga EX CCD camera&amp;nbsp;</td><td>Qimaging</td><td></td><td>Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit</td></tr><tr><td>Compressed air with 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Airgas</td><td></td><td>special order</td></tr><tr><td>Volocity 6.3</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Image acquiring software</td></tr><tr><td>Improvision OpenLab 5.5.2</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Cell tracking software and customized to measure migration angles</td></tr><tr><td>FileMaker Pro Advanced, 8.0</td><td>FileMaker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel 2008 for Mac</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

utilizing custom-designed galvanotaxis chambers to study directional migration of prostate cells

השדה החשמלי הפיזיולוגי משרת פונקציות ביולוגיות ספציפיות, כגון בימוי נדידת תאים בפיתוח עובר, תולדה עצבית וריפוי פצע אפיתל. הפעלת שדה חשמלי של זרם ישיר לתאים בתרבית במבחנה גורמת הגירה כיוונית תא, או galvanotaxis. שיטת galvanotaxis 2-ממדית אנחנו מדגימים כאן היא שונה עם פולי מחוייט (ויניל כלוריד) (PVC) תאים, משטח זכוכית, אלקטרודות פלטינה והשימוש בבמה ממונעת שבו התאים הם צילמו. תאי PVC ואלקטרודות פלטינה להציג cytotoxicity נמוך והם סבירים ומחדש שמישים. משטח הזכוכית והבמה מיקרוסקופ הממונעת לשפר את האיכות של תמונות ומאפשרים שינויים אפשריים למשטח הזכוכית וטיפולים לתאים. אנחנו צילמנו את galvanotaxis של שני קווים שאינם סרטניים-הונצח SV40 ערמונית תא, pRNS-1-1 וPNT2. שתי שורות תאים אלה מראות מהירויות הגירה דומות ושניהם נודדים לעברהקתודה, אבל הם עושים להראות במידה שונה של יווניות בgalvanotaxis. התוצאות שהתקבלו באמצעות פרוטוקול זה מצביעים על כך שpRNS-1-1 ושורות תאי PNT2 עשוי להיות מאפיינים מהותיים שונים המסדירים תגובות הנדידה כיוונית שלהם.

שתי שורות של תאי ערמונית (pRNS-1-1 וPNT2) נחקרו בשיטה זו. תאים בשני הקווים להעביר במהירויות דומות של 1.0 +/- 0.3 מיקרון / min במהלך 2 שעות (איור 5 א). עם זאת, כיווניות לשדה החשמלי היא 0.7 +/- 0.3 לpRNS-1-1 הקו, ו -0.2 +/- 0.8 לקו PNT2 (איור 5). התוצאות מראות הבדל משמעותי בgalvanotaxis של שתי שורות תאים אלה (p &lt;0.01, 100 תאים היו במעקב), המצביע על כך שיש להם מנגנוני איתות תאיים שונים הגורמים לתגובות שונות כיוונית לרמזים positional. <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig5highres.jpg" width="500" /> איור 5: Galvanotaxis של תאי ערמונית. ) במהירויות ההעברה של pRNS-1-1 וקווי PNT2 דומות כאשר התאים נחשפים לשדה החשמלי.B) עם זאת, קו pRNS-1-1 הראה יווניות גבוהות לכיוון קתודה (קוסינוס = 0.7), ואילו קו PNT2 הראה יווניות נמוכות (קוסינוס = 0.2) בשדה החשמלי.

Watch this Scientific Journal Video about Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells at JoVE.com

Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells

We present a method to apply a physiological electric field to migrating, immortalized prostate cells in a custom-made galvanotaxis chamber. Using this method, we demonstrate that 2 lines of non-tumorigenic prostate cells demonstrate different degrees of migration directionality in the field.

ניצול לשכות Galvanotaxis המעוצב מותאמות אישית לחקר כיוונית נדידה של תאי ערמונית

The physiological electric field serves specific biological functions, such as directing cell migration in embryo development, neuronal outgrowth and ...

utilizing-custom-designed-galvanotaxis-chambers-to-study-directional

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.1K Views.  University of California, Davis. We present a method to apply a physiological electric field to migrating, immortalized prostate cells in a custom-made galvanotaxis chamber. Using this method, we demonstrate that 2 lines of non-tumorigenic prostate cells demonstrate different degrees of migration directionality in the field.

Video: Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement membrane (BM) during age-related pathologies and metabolic disorders (e.g. cancer, diabetes, microvascular disease, retinopathy, nephropathy and neuropathy). The premise of the model is non-enzymatic crosslinking of reconstituted BM (rBM) matrix by treatment with glycolaldehyde (GLA) to promote advanced glycation endproduct (AGE) generation via the Maillard reaction. Examples of laboratory techniques that can be used to confirm AGE generation, non-enzymatic crosslinking and increased stiffness in GLA treated rBM are outlined. These include preparation of native rBM (treated with phosphate-buffered saline, PBS) and stiff rBM (treated with GLA) for determination of: its AGE content by photometric analysis and immunofluorescent microscopy, its non-enzymatic crosslinking by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE) as well as confocal microscopy, and its increased stiffness using rheometry. The procedure described here can be used to increase the rigidity (elastic moduli, E) of rBM up to 3.2-fold, consistent with measurements made in healthy versus diseased human prostate tissue. To recreate the biophysical microenvironment associated with the aging and diseased prostate gland three prostate cell types were introduced on to native rBM and stiff rBM: RWPE-1, prostate epithelial cells (PECs) derived from a normal prostate gland; BPH-1, PECs derived from a prostate gland affected by benign prostatic hyperplasia (BPH); and PC3, metastatic cells derived from a secondary bone tumor originating from prostate cancer. Multiple parameters can be measured, including the size, shape and invasive characteristics of the 3D glandular acini formed by RWPE-1 and BPH-1 on native versus stiff rBM, and average cell length, migratory velocity and persistence of cell movement of 3D spheroids formed by PC3 cells under the same conditions. Cell signaling pathways and the subcellular localization of proteins can also be assessed.

Here we explain a protocol for modelling the biophysical microenvironment where crosslinking and increased stiffness of the basement membrane (BM) induced by advanced glycation endproducts (AGEs) has pathological relevance.

איך ללמוד מרתף ממברנה נוקשות כמפעיל Biophysical הערמונית סרטן ומחלות גיל הקשורות אחרים או מחלות מטבוליות

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

Cancer Research

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

שדה חשמלי מבוקר בימוי הגירה של ובתאים עצביות בסביבות 2 ד ו 3D

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Bioengineering

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major obstacle for improving patient outcomes is the poor understanding of mechanisms underlying cellular migration associated with aggressive cancer cell invasion, metastasis and therapeutic resistance1. Glioblastoma Multiforme (GBM), the most prevalent primary malignant adult brain tumor2, exemplifies this difficulty. Despite standard surgery, radiation and chemotherapies, patient median survival is only fifteen months, due to aggressive GBM infiltration into adjacent brain and rapid cancer recurrence2. The interactions of aberrant cell migratory mechanisms and the tumor microenvironment likely differentiate cancer from normal cells3. Therefore, improving therapeutic approaches for GBM require a better understanding of cancer cell migration mechanisms. Recent work suggests that a small subpopulation of cells within GBM, the brain tumor stem cell (BTSC), may be responsible for therapeutic resistance and recurrence. Mechanisms underlying BTSC migratory capacity are only starting to be characterized1,4.
Due to a limitation in visual inspection and geometrical manipulation, conventional migration assays5 are restricted to quantifying overall cell populations. In contrast, microfluidic devices permit single cell analysis because of compatibility with modern microscopy and control over micro-environment6-9.
We present a method for detailed characterization of BTSC migration using compartmentalizing microfluidic devices. These PDMS-made devices cast the tissue culture environment into three connected compartments: seeding chamber, receiving chamber and bridging microchannels. We tailored the device such that both chambers hold sufficient media to support viable BTSC for 4-5 days without media exchange. Highly mobile BTSCs initially introduced into the seeding chamber are isolated after migration though bridging microchannels to the parallel receiving chamber. This migration simulates cancer cellular spread through the interstitial spaces of the brain. The phase live images of cell morphology during migration are recorded over several days. Highly migratory BTSC can therefore be isolated, recultured, and analyzed further. 
Compartmentalizing microfluidics can be a versatile platform to study the migratory behavior of BTSCs and other cancer stem cells. By combining gradient generators, fluid handling, micro-electrodes and other microfluidic modules, these devices can also be used for drug screening and disease diagnosis6. Isolation of an aggressive subpopulation of migratory cells will enable studies of underlying molecular mechanisms.

A compartmentalizing microfluidic device for investigating cancer stem cell migration is described. This novel platform creates a viable cellular microenvironment and enables microscopic visualization of live cell locomotion. Highly motile cancer cells are isolated to study molecular mechanisms of aggressive infiltration, potentially leading to more effective future therapies.

הערכה של נדידת תאי גזע סרטני באמצעות מכשירי microfluidic מידור והדמית תא חייה

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major ...

Medicine

Migratory Behavior of Cells Generated in Ganglionic Eminence Cultures

Migration of cells is a common process that leads to the development and maturation of the vertebrate central nervous system (Hatten, '99). The cerebral cortex consists of two basic neuronal types: excitatory and inhibitory. These cells arise in distinct areas and migrate into the cortex along different routes (Pearlman et al., '98). Inhibitory interneurons migrate tangentially from subcortical sources, mostly from different regions of the ganglionic eminences (Gelman et al., '09; Xu et al., '04). Their movement requires precise spatiotemporal control imposed by environmental cues, to allow for the establishment of proper cytoarchitecture and connectivity in the cerebral cortex (Caviness &amp; Rakic, '78; Hatten, '90; Rakic, '90). To study the migratory behavior of cells generated in proliferative zones of the ganglionic eminences (GE) in newborn ferrets in vitro we used a 3 dimensional culture arrangement in a BD Matrigel Matrix. The culture setup consisted of two GE explants and a source of tested proteins extracted from the cerebral cortex and adsorbed on fluorescent latex Retrobeads IX positioned between the explants (Hasling et al., '03; Riddle et al., '97). After 2-3 days of culture, the cells start to appear at the edge of the explant showing a propensity to leave the tissue in a radial direction. Live imaging allowed observation of migratory patterns without the necessity of labeling or marking the cells. When exposed to fractions of the protein extract obtained from isochronic ferret cortex, the GE cells displayed different behaviors as judged by quantitative kinetic analysis of individual moving cells.

Time lapse imaging of 3D tissue culture allows studying migratory behavior of individual cells originating from ganglionic eminence in reaction to fractionated protein extract from cerebral cortex.

התנהגות הנדידה של תאים שנוצר תרבויות רוממות Ganglionic

Migration of cells is a common process that leads to the development and maturation of the vertebrate central nervous system (Hatten, '99). The cerebral ...

Neuroscience

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include rapid proliferation and pervasive invasion into the normal brain. Recurrence is thought to result from the presence of radio- and chemo-resistant brain tumor stem cells (BTSCs) that invade away from the initial cancerous mass and, thus, evade surgical resection. Hence, therapies that target BTSCs and their invasive abilities may improve the otherwise poor prognosis of this disease. Our group and others have successfully established and characterized BTSC cultures from GBM patient samples. These BTSC cultures demonstrate fundamental cancer stem cell properties such as clonogenic self-renewal, multi-lineage differentiation, and tumor initiation in immune-deficient mice. In order to improve on the current therapeutic approaches for GBM, a better understanding of the mechanisms of BTSC migration and invasion is necessary. In GBM, the study of migration and invasion is restricted, in part, due to the limitations of existing techniques which do not fully account for the in vitro growth characteristics of BTSCs grown as neurospheres. Here, we describe rapid and quantitative live-cell imaging assays to study both the migration and invasion properties of BTSCs. The first method described is the BTSC migration assay which measures the migration toward a chemoattractant gradient. The second method described is the BTSC invasion assay which images and quantifies a cellular invasion from neurospheres into a matrix. The assays described here are used for the quantification of BTSC migration and invasion over time and under different treatment conditions.

Here, we describe live-cell imaging techniques to quantitatively measure the migration and invasion of glioblastoma brain tumor stem cells over time and under multiple treatment conditions.

מבחני הדמיה לחיות תאים מחקר המוח גליובלסטומה גידול תאי גזע ההעברה, הפלישה

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after undergoing an epithelial-mesenchymal transition 1,2. Following EMT, NCCs migrate large distances along stereotypic pathways until they reach their targets. NCCs differentiate into a vast array of cell types including neurons, glia, melanocytes, and chromaffin cells 1-3. The ability of NCCs to reach and recognize their proper target locations is foundational for the appropriate formation of all structures containing trunk NCC-derived components 3. Elucidating the mechanisms of guidance for trunk NCC migration has therefore been a matter of great significance. Numerous molecules have been demonstrated to guide NCC migration 4. For instance, trunk NCCs are known to be repelled by negative guidance cues such as Semaphorin, Ephrin, and Slit ligands 5-8. However, not until recently have any chemoattractants of trunk NCCs been identified 9. 
Conventional in vitro approaches to studying the chemotactic behavior of adherent cells work best with immortalized, homogenously distributed cells, but are more challenging to apply to certain primary stem cell cultures that initially lack a homogenous distribution and rapidly differentiate (such as NCCs). One approach to homogenize the distribution of trunk NCCs for chemotaxis studies is to isolate trunk NCCs from primary NT explant cultures, then lift and replate them to be almost 100% confluent. However, this plating approach requires substantial amounts of time and effort to explant enough cells, is harsh, and distributes trunk NCCs in a dissimilar manner to that found in in vivo conditions. 
Here, we report an in vitro approach that is able to evaluate chemotaxis and other migratory responses of trunk NCCs without requiring a homogenous cell distribution. This technique utilizes time-lapse imaging of primary, unperturbed trunk NCCs inside a modified Zigmond chamber (a standard Zigmond chamber is described elsewhere10). By exposing trunk NCCs at the periphery of the culture to a chemotactant gradient that is perpendicular to their predicted natural directionality, alterations in migratory polarity induced by the applied chemotactant gradient can be detected. This technique is inexpensive, requires the culturing of only two NT explants per replicate treatment, avoids harsh cell lifting (such as trypsinization), leaves trunk NCCs in a more similar distribution to in vivo conditions, cuts down the amount of time between explantation and experimentation (which likely reduces the risk of differentiation), and allows time-lapse evaluation of numerous migratory characteristics.

An approach to analyze the migration of explanted cells (trunk neural crest cells) is described. This method is inexpensive, gentle, and capable of distinguishing chemotaxis from both chemokinesis and other influences on migratory polarity such as those derived from cell-cell interactions within the primary trunk neural crest cell culture.

ניתוח של נדידת תאים עצביות קרסט טרונק באמצעות Assay השתנה Zigmond הקאמרי

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

חקר נדידת תאים בערוצי Microfabricated

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

The discovery of neural stem and progenitor cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult mammalian brain has led to a body of research aimed at utilizing the multipotent and proliferative properties of these cells for the development of neuroregenerative strategies. A critical step for the success of such strategies is the mobilization of NPCs toward a lesion site following exogenous transplantation or to enhance the response of the endogenous precursors that are found in the periventricular region of the CNS. Accordingly, it is essential to understand the mechanisms that promote, guide, and enhance NPC migration. Our work focuses on the utilization of direct current electric fields (dcEFs) to promote and direct NPC migration - a phenomenon known as galvanotaxis. Endogenous physiological electric fields function as critical cues for cell migration during normal development and wound repair. Pharmacological disruption of the trans-neural tube potential in axolotl embryos causes severe developmental malformations1. In the context of wound healing, the rate of repair of wounded cornea is directly correlated with the magnitude of the epithelial wound potential that arises after injury, as shown by pharmacological enhancement or disruption of this dcEF2-3. We have demonstrated that adult subependymal NPCs undergo rapid and directed cathodal migration in vitro when exposed to an externally applied dcEF. In this protocol we describe our lab's techniques for creating a simple and effective galvanotaxis assay for high-resolution, long-term observation of directed cell body translocation (migration) on a single-cell level. This assay would be suitable for investigating the mechanisms that regulate dcEF transduction into cellular motility through the use of transgenic or knockout mice, short interfering RNA, or specific receptor agonists/antagonists.

In this protocol we demonstrate how to construct custom chambers that permit the application of a direct current electric field to enable time-lapse imaging of adult brain derived neural precursor cell translocation during galvanotaxis.

Assay Galvanotaxis לניתוח של קינטיקס נדידת תאים העצביים המבשר בשדה חשמלי נוכחי לשימוש חיצוני ישיר

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

Metastasis is a process in which tumor cells shed from the primary tumor intravasate blood vascular and lymphatic system, thereby, gaining access to extravasate and form a secondary niche.&#160;The extravasation of tumor cells from the blood vascular system can be studied using endothelial cells (ECs) and tumor cells obtained from different cell lines.&#160;Initial studies were conducted using static conditions but it has been well documented that ECs behave differently under physiological flow conditions.&#160;Therefore, different flow chamber assemblies are currently being used to studying cancer cell interactions with ECs.&#160;Current flow chamber assemblies offer reproducible results using either different cell lines or fluid at different shear stress conditions.&#160;However, to observe and study interactions with rare cells such as circulating tumor cells (CTCs), certain changes are required to be made to the conventional flow chamber assembly.&#160;CTCs are a rare cell population among millions of blood cells. Consequently, it is difficult to obtain a pure population of CTCs.&#160;Contamination of CTCs with different types of cells normally found in the circulation is inevitable using present enrichment or depletion techniques.&#160;In the present report, we describe a unique method to fluorescently label circulating prostate cancer cells and study their interactions with ECs in a self-assembled flow chamber system.&#160;This technique can be further applied to observe interactions between prostate CTCs and any protein of interest.

In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

Our report describes a unique method to visualize and analyze CTC/EC interactions in prostate cancer under physiological flow conditions.

בשיטה חוץ גופית כדי לבחון אינטראקציות בתיווך-E-selectin בין תאים סרטניים בערמונית מחזור שמקורם בתאי חולים ואנדותל האנושי

Metastasis is a process in which tumor cells shed from the primary tumor intravasate blood vascular and lymphatic system, thereby, gaining access to ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

G הדמית חלבון בשילוב קולטן בתיווך Chemotaxis ואירועי האיתות שלה בתאי HL60 נויטרופילים דמויים

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...