עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי דה לה סנטה et de la המשוכלל והנדיר Médicale, המרכז הלאומי דה לה המשוכלל והנדיר Scientifique, האוניברסיטה לדה שטרסבורג, Hôpital דה שטרסבורג, האגודה לשפוך la משוכלל ונדיר sur le הסרטן, המכון הלאומי du הסרטן, סוכנות הידיעות Nationale de la המשוכלל והנדיר ואלזס האזור. פייטרו Laneve כבר נתמך על ידי Fondation לשפוך la המשוכלל והנדיר Médicale. נכון לעכשיו, הוא מקבל מלגת Istituto Italiano Tecnologia (IIT). עלויות פרסום נתמכות על ידי רשת Neurex (TriNeuron - תכנית Interreg IV העליון הריין)

אוסף 1 לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק 2 התאים של שניידר למחצה חסיד, (1-5 x 10 6 תאים בממוצע), על ידי pipetting ולמסוק אותם על ידי צנטריפוגה (1 דקות 100 XG). במקרה של במבחנה תאים חסיד תרבותיים, trypsinize אותם בתנאים סטנדרטיים או ישירות לאסוף אותם מצלחות לסכום נוח של מגיב מיצוי RNA, על ידי עזרה של מגרד תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאוסף עובר, לגדול זני דרוזופילה בכלובי זבוב ועוברים לתת להצטבר על צלחות הטלת ביצים. נגבו את העוברים על ידי מכחול במים מזוקקים (DH 2 O), להשליך פסולת על ידי סינון מסננת, לשטוף ולשחזר עוברים ב48 בקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כטכניקה חלופית, לנתח באופן ידני רקמות / איברים. לבודד אשכים (מערכת מועדפת לניתוח Pirna) מבטן דרוזופילה בופר פוספט (PBS) תחת סטראו (הגדלה 20X), על ידי שימוש במחטים לנתיחה או מלקחיים כמו מולualized בסאליבן et al 49. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העלי homogenize דגימות על התמכרות של 0.5 כרכים של מגיב מיצוי RNA. </li></ol> 2 הפקת RNA / ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההוראות של היצרנים הבאים לבצע בידוד RNA באמצעות חומרים כימיים מסחריים. זהירות! סוכני מיצוי RNA הם בדרך כלל רעילים ומאכל. לחלופין, להחיל פרוטוקול מבוסס K proteinase לבידוד RNA 50, כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל דגימות לתוך 400 μl של Stop מיקס ולדגור על RT במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר רכיבי hydrosoluble ידי פנול הסטנדרטי: כלורופורם: אלכוהול isoamyl ועקירות כלורופורם ועל ידי אתנול (EtOH) ממטרים / כביסה. אוויר יבש הדגימות וresuspend לdiethylpyrocarbonate (DEPC) -treated מזוקק פעמיים (dd) H 2 O. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך ריכוז RNA על ידי מדידת spectrophotometric UV. כמו כן להבטיח את טוהר RNA הוא גבוה, קרוב ל2.0, basעורך על 260 / קריאה 280. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק הכנת RNA על denaturing agarose ג&#39;ל כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכוס נקייה, לפזר 1.2 גרם Agarose ב82 מ&quot;ל של DEPC-DDH 2 O, תחת בחישה מתמדת. מרתיחים עד שהיא נמסה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר פתרון ג&#39;ל להתקרר; כאשר הטמפרטורה מגיעה 60 ° C להוסיף 10 מ&quot;ל של 10X חומצה 4-morpholinepropanesulfonic (מגבים) חיץ לריכוז סופי 1X (FC), ו -8 מ&quot;ל של 37% פורמלדהיד עד 3% FC. זהירות! פורמלדהיד הוא חומר מסרטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את הג&#39;ל לתוך תא אלקטרופורזה אופקי. לאפשר את הג&#39;ל לביסוס מתחת למכסת מנוע לשעה לפחות 1. בעקבות מיצוק, להטביע את הג&#39;ל לתוך מגבים 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 2 מיקרוגרם של מדגם RNA ו1 מיקרוגרם של סולם (השתמש סמן RNA כאשר הערכה מדויקת היא רצויה). הוסף 3 כרכים של צבע agarose טעינה (ALD) לרנ&quot;א ולסולם. מחממים על 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות וקרירות באופן מיידי על קרח. CAUTION! תוכן של ALD (רומיד ethidium ופוראמיד, ראה חומרים) הוא mutagen ומאכל, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הדגימות ולהפעיל את הג&#39;ל על 50 V כ 1 שעות עם מחזור חיץ מדי פעם. בדוק את דפוס חלוקה RNA על ידי ההדמיה UV או הדמיה ג&#39;ל. להכיר להקות דיסקרטיות המתאימות ל28S ו18S rRNAs ולtRNAs (ראה איור 1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך צפון Assay או RNA חנות ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol> .3 Denaturing Acrylamide ג&#39;ל הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במנגנון קטן אנכי electrophoretic לצעד חלוקה זו (גודל צלחת על 8 סנטימטר x 9 סנטימטר, מ&quot;מ 0.75 עובי מסרק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב משקפיים נקיים יחד במסגרת ליהוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מ&quot;ל של 10 acrylamide% / bis-acrylamide (19: 1) פתרון במגבי 1X, 7 מ אוריאה. מייד לפני המזיגה, להוסיף 10% persulfate אמוניום 100 μl ו10 μl של TEMED ומהירות לערבב הפתרון. זהירות! Acrylamide הוא רעיל למערכת עצבים וקרצינוגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את הג&#39;ל בין לוחות זכוכית והכנס את המסרק היטב בזהירות כדי למנוע בועות. בואו ג&#39;ל לפלמר ב RT לפחות 45 דקות לפני השימוש. לחלופין, לאחסן O ג&#39;ל / N, עטוף בניירות מסנן ספוג מים ואטומים בניילון נצמד. </li></ol> הכנת .4 דוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot .5-20 מיקרוגרם של RNA הכולל לכל דגימה. אם הנפח עולה על 3-4 μl, ואקום לייבש את המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקביעת גודל, לרוץ aliquot (20-30 CPS) של סולם נמוך לטווח radiolabeled במקביל לדגימות, כסמן (ראה סעיף 4.3 ו4.4 להכנה). פנקו אותו במקביל לדגימות, כפי שמתואר בשלב 4.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סולם: להגדיר תגובה קדימה פוספט באמצעות 0.1 מיקרוגרם של סולם 10 נ&quot;ב צעד. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ולעצור את התגובה על ידי הוספת חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ל20 מ&quot;מ FC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר על ידי משקעים EtOH / כביסה, ייבוש באוויר וresuspend DDH 2 O (כ -100 μl). זהירות! 32 P הוא מקור רדיואקטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל דגימה להוסיף נפח שווה של צבע acrylamide הכחול (ABD). לפגל על ידי חימום על 80 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ומגניבות על קרח עד טעינה. זהירות! פוראמיד (תוכן בABD) הוא מאכל. </li></ol> .5 Electrophoretic פלזמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את לוחות זכוכית מתמיכת הליהוק וכראוי להרכיב אותם בתא אלקטרופורזה. מלא את שני החדר הפנימי וחיצוני עם מספיק מאגר פועל (RB). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר בעדינות את המסרק ומראש להפעיל את הג&#39;ל על 200 V עבור 10 דקות. לפני דגימות טעינה, לשטוף את פיקדונות אוריאה מהבארות על ידי התזה כמה RB באמצעות מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעצות שטוחות לזהירות דגימות רבד מצעד 4.5 בחלק התחתון של כל טוב. בדקו את חיבורי האנודה וקתודה, כדי למנוע ריצה הפוכה. לאחר הדגימות להיכנס לג&#39;ל ב100 V למשך 5 דקות, אניncrease המתח 200 V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאורך חלוקה של כ 7 סנטימטר, 45 דקות-טווח ארוך מספיק. הימנע bromophenol כחול (פיגמנט מעקב בABD) לעלות על גדותיו את הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו בג&#39;ל RNAs הארוך המופרד על ידי רומיד ethidium מכתים (EtBr), כצעד אופציונאלי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך 2 סנטימטר מהחלק העליון של ג&#39;ל ובקצרה לשטוף את הפרוסה בDDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הפרוסה ג&#39;ל ב RT ל15 דקות עם רועד עדין בRB, EtBr 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​FC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Destain ג&#39;ל ל15 דקות בRB, לדמיין rRNAs ארוך על ידי קרינת UV או הדמיה ג&#39;ל. הגעה לטעינת RNA ואיכות (ראה תרשים 1, לוח 7). זהירות! Ethidium ברומיד הוא mutagen. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים להמשיך סופג את החלק התחתון של ג&#39;ל המכיל מיני RNA קטנים. </li></ol> .6 ג&#39;ל סופג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך 6 חתיכות של נייר סופג כדי שיתאים לשטח הסופג וחתיכת uncharge שווה ערךקרום ניילון ד. לחלח גיליונות נייר, קרום ו2 רפידות סופגות בRB. הקפד לספוג לחלוטין את הרפידות על ידי סחיטתם שוב ושוב בRB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את הג&#39;ל מהמכשירים ולפתוח את המשקפיים על ידי ממוצע של מרית. השתמש בחותך נקי כדי להסיר את הבארות. הנח גיליון נייר Whatman הרטוב על הג&#39;ל בעדינות להרים את זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את קרום הניילון על פניו חופשיות של ג&#39;ל. סמן פינה כדי לכוון את המסנן בהתאם לטעינת מדגם. השלם את &quot;הכריך&quot; (חתיכות 3 נייר בכל צד). מרדדים מוט פלסטיק על פני השטח הכתם, כדי להסיר כל בועות אוויר אפשריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הכתם בין שתי רפידות סופגות ולאחר מכן בקלטת הסופג. להרכיב את הקלטת במודול הסופג, למלא את התא עם RB ולבדוק את הכיוון הנכון (קרום הניילון חייב להישאר בין ג&#39;ל והתחנה הסופי החיובית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר ב20 V עבור 20 דקות. הערה: על מנת להבטיח תנאים הומוגנית, לאחר 10 דקות לפתוח את המודול וr הסופגסוב הכריך ידי 180 ° לפני השלמת ההעברה. </li></ol> .7 ממברנה Crosslinking <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 6 מ&quot;ל של תמיסה הטרי Crosslinking (XLS). להרוות 10 סנטימטר x 10 סנטימטר (גדול מקרום ניילון) פיסת נייר סופג עם XLS. זהירות! HCl (מרכיב של XLS) הוא מאכל מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק את הכתם ולמקם את הקרום על נייר סינון 3MM הרטוב. הערה: RNA לא חייב להיות במגע ישיר עם הנייר הרווי. הנח את המסנן ונייר בין שני לוחות זכוכית ולעטוף בניילון נצמד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את הקרום ב60 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות, ואחריו DDH 2 O כביסה. אחסן ב-20 ° C או להמשיך לכלאה. </li></ol> .8 ממברנה Prehybridization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם טעינת RNA נבדקה (צעד אופציונאלי 5.5), ישירות להמשיך לכלאה. או אחר, לחתוך 1 סנטימטר לחלק העליון של מסנן הניילון, כדי למנוע hybridizatio צולב בדיקהns לRNAs הארוך המופרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים 10 מ&quot;ל של הכלאה פתרון (HS) על 37 מעלות צלזיוס. לפגל 1 מ&quot;ג של זרע סלמון על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, מגניב על קרח ולהוסיף לHS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המסנן בHS ב37 ˚ C במשך שעה לפחות 1, תחת סיבוב בתנור הכלאה. בדוק שRNA-הצד של המסנן עומד בפני HS. </li></ol> .9 Probe סינתזה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את התגובה קדימה פוספט ב10 pmol של מולקולת אנטיסנס קצרה ספציפית, כפי שמתואר ב4.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 כרכים של טריס-EDTA-NaCl (TEN) חיץ לתגובה ולטהר פריימר שכותרתו מנוקלאוטידים מאוגדים על ידי כרומטוגרפיה הדרת ג&#39;ל על עמודי G-25 Sephadex (או גם על ידי המשקעים EtOH). פעילות בדיקה ניתן להעריך על ידי נוזל נצנץ מתפרצות. </li></ol> 10. ממברנה הכלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את HS מותש עם טרי 10 מ&quot;ל aliquot (שהוכן והושלם כפי שתואר לעיל). מחממים את הבדיקה בC 95 מעלות עבור 10 דקות, מגניב על קרח ולהוסיף לHS רומן. דגירה המסנן על 37 מעלות צלזיוס ON. </li></ol> כביסה 11. ממברנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את פתרון ההכלאה ולאחסן אותו ב-20 מעלות צלזיוס בתיבת מיגון רדיואקטיביות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את המסנן בכביסה חוצץ (WB) ולשטוף אותו ביסודיות ל10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש גייגר מילר גלאי לבדיקת רדיואקטיביות שיורית בפינות המסנן. כאשר פליטת רקע היא סביב 5 CPS, להמשיך קרום אקספוזיציה. </li></ol> 12. גילוי אותות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את המסנן על סרטי autoradiography או על גבי מסך תרמי מולקולרי. לחשוף אותות על ידי עיבוד צילום או המרה דיגיטלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את עוצמת הלהקה על ידי תוכנה ייעודית כימות (ImageJ או Optiquant). </li></ol> 13. ממברנה חישוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר אותות עיקריים, להטביע את הקרום ב500 מ&quot;ל רותח פתרון חישוף, אז לדגור על RT דקות 1. המשך לרומן הכלאה (מראש) או לאחסן את המסנן ב-20 מעלות צלזיוס. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

למרות ההערכה של המתוחכם משתרג דרכו RNA מסדיר נוירוגנזה שלנו עולה בהתמדה, ההשלכות מכניסטית של circuitries מבוסס RNA המשפיע על ביולוגיה של תאי גזע עצבי, הבחנה עצבית / אינטגרציה פונקציונלית, פיתוח של פתולוגיות וסוגי הסרטן עצביים להישאר שלא נחקרו. התחזוקה של רשתות כגון דרך הממלכות עושה את הפוטנציאל של מערכות גנטיות כתסיסנית סייעה לפענח מסלולים סלולריים שלא נחקרו, שבו RNAs noncoding הקצר וגורמי שעתוק נחשבים שחקנים מולקולריים גדולים. בתצוגה זו, הפרופיל של רמות ביטוי RNA הקטנות מועמד הוא propaedeutic לניתוחים תפקודיים מדויקים: דוגמא מגיעה מההפגנה האחרונה שלנו שDmel-miR279 מודולציה הקובע גורל GCM / דאיית in vivo, נעשתה באמצעות גרסה משופרת של assay הצפון סופג כ כלי לניתוח ביטוי. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; מאז הפיתוח הראשוני שלה בשינה 1977 51, NB כבר נחשב שיטת התייחסות לניתוח RNA. למרות כמה מגבלות פנימיות של assay זה, כמרה קשה זמנית שגיאות פורמט או אפשרי עם כימות אות, פריצות הדרך האחרונות בתחום הביולוגיה מולקולרית RNA גילו מחדש טכניקה קונבנציונלית זו כמערכת &quot;מהירה ונקיה&quot; למנסה לאמוד ביטוי אנדוגני של ריבונוקלאית קטנים חומצות או לאימות האפקטיביות של gain- או גישות אובדן של הפונקציה. כדוגמה פרדיגמטי, ניתוח צפון מניח בבסיס התגלית המקורית של מייקרו RNA, ואילו הגישה נשארה בחוד החנית להרלוונטיות שלה באפיון של נכסים הולכים וחדשים של RNAs הרגולציה 52. הגרסה המתוארת כאן מבוססת על רגישות מוגברת בשל crosslinking כימי של RNA. אנו believethe שיטה עדיין מועסקים בצורה גרועה בדרוזופילה, ב<html> ut כאשר ניצלו הוביל לתגליות משמעותיות 52, שכן הוא הופך את ביטוי RNA פרופיל אפשרי מדגימות קטנות (מיקרוגרם פחות מ 1), עם שיפור של פי 10-30 ממוצע של גילוי מטרת RNA 41,43, כפי שהשגנו בתנאים שלנו (דמויות 2 ו -3). שלמות RNA מהווה נושא קריטי על מנת להשיג תוצאות עקביות ולשעתק. מניפולציות RNA דורשות דיוק ומהירות להגביל השפלה מדגם אפשרית המתרחשת בין החילוץ וטעינה. במטרה זו, כל הפתרונות צריכים להיות diethylpyrocarbonate- (DEPC) שטופל לפני השימוש (הדגירה שעה 2 בנוכחות DEPC 0.1% על 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן autoclaved) לעקוף פעילות RNase. טיפול פתרון מבטיח כבוד תוצאות טוב יותר לשימוש במי DEPC כממס. כל הציוד יהיה שטוף באותה מידה בDEPC ddH20, לאחר הניקוי על ידי decontaminant משטח RNase הספציפי. &gt; בידוד RNA: פרוטוקולים שונים ניתן להשתמש כדי לבודד RNA ללא פגע. כל מגיב thiocyanate-פנול, כלורופורם המסחרי guanidinium יכול להיות מועסק בהצלחה: הם מומלצים ביותר, כאשר הביטוי קטן RNA הוא נמוך במיוחד (למשל, rasi4, Figure2) או כאשר טיהור RNA לא מבוצעת על דגימות טריות (למשל, השתמר לאחסון רקמות ריאגנטים). מניסיון, בידוד RNA מן הדגימות התייצבו הביא חמור יותר באופן משמעותי ונדרש תנאי חילוץ דרסטיים יותר. בתנאים סטנדרטיים, שיטה המבוססת על K proteinase תיארה מבטיחה הכנות באיכות טובה, כמו גם, (דוגמא משמעותית מיוצגת בFigure1) אבל זה לא הבחירה האופטימלית עבור דגימות נשמרו בריאגנטים אחסון. לבסוף, מאז הליך זה נועד לגילוי ספציפי RNA קטן, יכולות להיות מועסקות ערכות המבוססת על טיהור טור מוקדש לבידוד RNA קטן ישיר, למרות הכלומר הופך קשה יותר כדי לאמת את שלמות RNA. בחלופה להליך המבוסס על ג&#39;ל הקלאסי לבקרת שלמות RNA שתוארה לעיל, ניתן להעריך איכות RNA על ידי מכשירים לניתוח זעיר על השבב של דפוסי חומצות גרעין. מאגר בחירה: מגבים-NaOH חיץ (pH 7) הוצעה כחיץ מועדף עבור שתי אלקטרופורזה משופרת צפון ג&#39;ל וסופג. אנחנו גם באופן משביע רצון בשימוש טריס- borate EDTA-חיץ (TBE) בניסויים שלנו. במקרה זה, שכן הנוכחות של קבוצות האמינים nucleophile של טריס aminomethane (hydroxymethyl) הייתה hydrolyze ולהשבית DEPC במהלך הטיפול עצמו, מומלץ המסת טריס למים DEPC שטופל במקום חיץ TBE טיפול כבר מוכן. Electrophoretic הפעלה וסופג: טרום ריצת ג&#39;ל היא חיונית להסרת persulfate העודף וביטול מיקוד יתר. פרמטרים טרום ריצה יש לשמור גם במהלך חלוקה, הימנעות electropho מהר מדיretic ריצה. לפני הטעינה, הקפד להסיר משקעי אוריאה אפשריים מבארות, על ידי התזת חיץ בתוך. זה יגביל את המדגם לשפוך מעל וערבויות ריבוד RNA מדויק, הפקת להקות autoradiographic נפתרו במהלך איתור אותות. כל קרום ניילון ניטראלי יכול לשמש כתמיכה להעברת חומצות גרעין. אל תמחה RNA ליותר מ 20-30 דקות בתנאים שצוינו. Crosslinking: crosslinking כימי מבוסס EDC מייצג מראש מתודולוגית הביקורתיים של גרסת כתם זה משופר צפון. האפשרות לcrosslink מיני RNA הקצר למשטחים ניטרליים על ידי גבולות קוולנטיים בין קבוצת RNA 5&#39;mono פוספט ואמינים ראשוניים ניילון משאיר את רוב הבסיסים זמינים להכלאה. זה משפר את הרגישות על ידי 10-20xrespect לcrosslinking מסורתי. זה חיוני כדי להכין כמות טריות של פתרון crosslinking לכל סופג, בכמות מספקת לרווית קרום נכונה. <html> הכלאה וכביסה: בדיקות רצוי להיות מתויגות טרי. לחקור פעילות ספציפית (תלוי בפעילות הספציפית וסכום של נוקלאוטיד radiolabeled התאגד וגם על הסכום של בדיקה זמינה להכלאה) קובע את הרגישות של זיהוי היעד. כאשר [γ- 32 P] ATP עם פעילות ספציפית של 3,000 Ci / mmol משמש, 10 6 עותקים לדקה / pmol לתיוג 100% מ5 &#39;מסתיים צפוי. פתרון ההכלאה ניתן לשחזר ומנוצל מחדש, בהתחשב בכך ש, בשל 32 ריקבון P, חצאים פעילות בדיקה בכ 14 ימים. בשל ניטרליות קרום, רעש רקע נמוך צפוי על הכלאה. אם תנאי כביסה מחמירים יותר נדרשים, בהדרגה להפחית את הכוח יוני חיץ הכביסה (עד 0.2X SSPE) או להוסיף כמויות גדלות והולכות של חומרי ניקוי יוניים (עד 0.5% SDS) או להעלות את טמפרטורת כביסה ל37 C °. = &quot;Jove_content&quot;&gt; כדי להימנע מחפיפת אותות עם הכלאה הבאה, מומלץ לוודא מחדש על ידי חשיפה שהבדיקה הראשונית הוסרה לחלוטין מהמסנן על הפשטה. עם זאת, בשל אובדן הדרגתי של RNA מהמסנן יש להימנע יותר מ 3-4 מחזורים של הפשטה ומחדש חיטוט. ניתוח כתם צפון הוא חיוני כאשר נדרש מדידת גודל RNA. למרות assay זה ייתכן חוסר הדיוק של qPCR הקרינה מבוססת גישות להערכת RNAs הזעיר, יתרון נובע משימוש בחלוקת denaturing / סופג והכלאת בדיקה תלויה כצעדים ייחודיים לפני הגילוי של RNAs היעד. כתוצאה מכך, ההתגלות של אותות ספציפיים מהמדגם היא ישירה ואינה דורשת כל צעד נוסף של טיפול / המרה / הגברה אנזימטית, שפירושה השימוש בערכות מסחריות ייעודיות. ניתן לכמת רמות RNA והשוואה בין דגימות מרובות על קרומים יחידים. כך Northeכתם rn מועסק בכינויו אימות מחמירה לנתונים qPCR. דרבן על ידי דרישות ניסוי ספציפיות, השיטה שופרה גם בשנים האחרונות, הן ברמת הרגישות ורזולוציה כך שכמות מוגבלת של RNAs (ראה איורים 2 ו -3) נדרשות לניתוח מוצלח. הפרוטוקול שהצגנו יכול להיות מותאם למגוון רחב של יישומים במיוחד שבו חומר זמין בכמויות מוגבלות. המקור הביולוגי של דגימות RNA יכול להיות הטרוגנית: ככל דרוזופילה היא מודאגת, עוברים או שלבי התפתחות אחרים הם מתאימים, אלא גם ניתחו באופן ידני רקמות או איברים, cytotypes מבודד מיון תאים בודדים או בתרביות תאים. יתר על כן, למרות שמייקרו RNA הוא בכיתה הנפוצה ביותר של RNAs רגולציה הקצר בתא והנושא העיקרי של חקירה בתחום בקרת ביטוי גנים בתיווך RNA, הם לא חסרונותtitute המשפחה היחידה של RNAs noncoding הסלולרי. אשכולות של RNAs הזעיר רבים לתפקד על פני ממלכות (למשל, siRNAs אנדוגני, piRNAs, snoRNAs, צמח tasiRNAs) ורובם מתאפיינים מתחנה סופית חופשית 5 &#39;(ללא שינוי), בדרך כלל נובעים מעיבוד אנדו-ribonucleolytic של מולקולות מבשרים. תכונה זו מהווה התנאי מוקדם מבני הייחודי הנדרש אך ורק ליישום מתודולוגיה המשופרת הספציפית המבוססת על crosslinking כימי, למרות שגודל RNA יש לקחת בחשבון, כמו גם, כאשר RNAs יותר מנותחים. באיור 2 אנו מדווחים ניתוח צפון כתם יחסית איתור הרמות של rasi4 54 חבר כיתה של RNA הקטן נבט אונליין ספציפי (Piwi אינטראקצית RNA או piRNAs.) בתנאים של רמות ביטוי עניות וספציפיות, הרגישות המשופרת בשיטה זו יכולה להכשיר תוצאות מוצלחות, במיוחד בהתחשב בכך שהפרוטוקול שדווח ניתן לשפר עוד יותר על ידי מסרקining אותו עם יישומים מעשיים אחרים שכבר תוארו בספרות 55,56.

ביוכימיה RNA חוותה התקדמות מרהיבה בשנים האחרונות 1. ההבנה שלנו של פוטנציאל RNA בבקרת ביטוי גנים כבר פרצה על ידי זיהוי של ribo-רגולטורי noncoding החזקים 2, על ידי הגילוי של מנגנונים מבוססי RNA רומן הרגולציה 3,4 ועל ידי אפיון מעמיק יותר של אירועים שלאחר התעתיק כבר ידועים 5. כל הביולוגיה RNA יחד מחקרים אלה אפשרו לעשות באופן דרמטי את הסצנה, הפך נושא המחקר מרכזי בנוף המדעי הנוכחי. בפרט, בשנים האחרונות אנחנו מקבלים תחושה של ההשפעה המתפשטת של &quot;עולם RNA&quot; בנוירוביולוגיה המולקולרית 6, אחד מתחומי המחקר הדינמיים ביותר במדעי החיים מודרניים. בעשור האחרון של המאה שעברה, התרחיש המדעי הכולל כבר מהפכה על ידי הגילוי של התערבות RNA 7,8 ושל RNAs הרגולציה הקטן 9,10ביחס מסוים ל11 מייקרו RNA, באופן אנדוגני הביע RNAs noncoding הקטן מעורב בשליטה כמעט את כל הפונקציות הסלולריות כרגולטורי pleiotropic וקומבינטורית של ביטוי גנים. כמעט 10 שנים לאחר הגילוי ראשוני מירנה בelegans Caenorhabditis ידי אמברוס והמעבדות של Ruvkun, תשומת לב מחודשת הפכה לשדה כאשר מספרים גבוהים של miRNAs זוהו בדרוזופילה ובתאים אנושיים, כמו גם 12-15. מאז, הודות לגישות מהונדסים תכליתיות, melanogaster דרוזופילה יש התבלט כהקשר ביולוגי יקר ערך עבור להתעמק ביוסינתזה ופעילות מירנה. דרוזופילה miRNAs חשפו פונקציות שונות בתהליכי חרקים ספציפיים או אבולוציונית משומרת, פורש מהזדקנות לחילוף חומרים, מסלולי איתות , התנהגות, וכמובן, נוירוגנזה. לאורך כיוון זה, אנו חשפו לאחרונה קישור רומן 16 בשיתוף המסקרןrrelation מתרחש בין GCM / דאיית גן האדון ומסלול RNA. גורם שעתוק זבוב GCM / Glide 17-19 מהווה דוגמא ייחודית של הקובע גורל תא, אשר מכתיב את בחירת הגורל העצבית גליה לעומת בmultipotent לטוס מבשרים עצביים 20. עשרים שנה מחקר ארוך בנושא זה באופן ברור הדגיש את התרחשותם של מספר רב של תשומות והחופפות של רגולציה ביטוי גנים מתכנסת על GCM / להחליק 21-28 להקים את רמות הסף הנדרשות לאיזון היחס העדין בין עמיתים עצביים וגליה במהלך התפתחות עצבית. גילינו כי רגולציה, באמצעות מיקוד לפי Dmel-miR279 מייצגת רמת שליטה נוספת שתרמה לכוונון עדין שלאחר תעתיק של GCM / להחליק ביטוי 16. שיפורים מתודולוגיים ספציפיים בעולם, קווי מחקר אלה נדרשים: לאורך שנים, במספר טכנולוגיות שפותחו במקור כדי לנתח מסורתיתRNAs itional הוסב לכימות RNAs לא קטן קידוד, כמו כמבחני הגנה RNAse, מערכי cDNA 29-31, שיטות PCR בזמן אמת 32-35 ורצף 36,37. בצד השני, כיול של גישות טכניות טפח התקדמות רציפה בתחום. צפון הכתם assay (NB, או assay כתם ג&#39;ל RNA) מהווה דוגמא מייצגת: הוא מועסק במידה רבה לפרופיל הצטברות RNA, שכן הוא מבטיח שני quantitation רמת הביטוי, כמו גם קביעת גודל. עם זאת, רגישות העניים המהותית של השיטה היא להגביל כאשר הוא שיחול על מקלטי קנס ביטוי גנים נמוכים בשפע, כמו RNAs הקצר. תוצאה מזיקה היא הדרישה של כמויות גדולות של רנ&quot;א הכל, מה שהופך את היישום שלה קשה לדגימות ביולוגיות ספציפיות. מסיבות כאלה, וריאנטים NB ספציפיים לגילוי RNA קטן פותחו 38-40: אנו ניצלנו proc NB השתפרedure 41 (ENB, משופר צפון כתם), ואילו הבהרת הגומלין הנ&quot;ל בין Dmel-miR279 וGCM / דאייה. שיטה זו מסתמכת על צעד כימי crosslinking מבוסס על הפעילות של נגזר Carbodiimide [1-אתיל 3-carbodiimide (3-dimethylaminopropyl), EDC] לתקן חומצות גרעין על תמיכה מוצקה. Carbodiimide הוא מקשר צלב צדדי הידוע לזרז את הקמתה של אגרות חוב אמיד בין קבוצות carboxyl או פוספט מופעלות וקבוצות האמינים 42. מאפיין זה יכול להיות מנוצל לזוג קוולנטית RNA הקטן באמצעות קבוצת 5&#39;-הידרוקסיל מונו פוספורילציה לאמין קבוצות על פני השטח של קרום ניילון. תצורת הקובץ המצורף וכתוצאה מכך מגדילה את הנגישות של חומצות גרעין המשותקים ו, בתורו, את היעילות של הכלאת בדיקה-יעד, וכתוצאה מכך שיפור גילוי מדהים 43. הטכניקה מניחה relevanc מסויםדואר במחקרים מולקולריים דרוזופילה, שבו ההתרחשות של כיתות רומן וייחודיות של RNAs noncoding הקטן מתגלה 44. בין אלה, rasiRNAs 45,46 מהווים תת סוג ספציפי של RNAs אינטראקציה-piwi (piRNAs 47), מעורב בהשתקת גני רצף ספציפי. פרטים אופרטיביים של שיטה זו מתוארים באופן מלא ומדמיינים להלן, ביחס לניתוח של מייקרו RNA Dmel-miR279 וDmel-miR286 ו, בפעם הראשונה, של אחד rasiRNA, rasi4. אנחנו דחפתי למצבים קיצוניים ששיטה זו, אשר אפשרה לנו לחשוף את המטרות הביעו גרוע מכמויות מינימליות של RNA (מיקרוגרם פחות מ 1).

<table><tbody><tr><td>FINAL COMPOSITION/NAME</td><td>COMPANY</td><td>CATALOGUE (Stock)</td><td>COMMENTS</td></tr><tr><td colspan="4">GENERAL REQUIREMENT</td></tr><tr><td>Centrifuge, 5418</td><td>Eppendorf</td><td>5418 000.017</td><td></td></tr><tr><td>Decontaminant, RNase Away</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83931</td><td>Apply on glass/plasticware, wipe and rinse</td></tr><tr><td>RNase inhibitor, DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>Hazardous //// 1609-47-8</td></tr><tr><td colspan="4">SAMPLE PREPARATION</td></tr><tr><td>Stereo Microscope, M60</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X PBS Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>137 mM NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>2.7 mM KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>7447-40-7&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td>7558-79-4&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1.8 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>7778-77-0&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">RNA EXTRACTION/ANALYSIS</td></tr><tr><td>UV-Vis Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Gel Imager, ChemiDoc XRS+</td><td>Biorad</td><td>170-8265</td><td></td></tr><tr><td>Horizontal Electrophoresys, Mini-Sub Cell GT</td><td>BioRad</td><td>170-4487EDU</td><td></td></tr><tr><td>RNA extraction reagent, TRIzol Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15596026</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>PCA (25:24:1), 1:1 for extraction</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617</td><td>136112-00-0</td></tr><tr><td>Chlorophorm, 1:1 for extraction</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>67-66-3&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EtOH, 2.5 vol. for precipitation, 70% for washing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59844</td><td>64-17-5&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Gene Ruler 1Kb DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td></td></tr><tr><td>Stop Mix</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>300 mM NaOAc, pH 5.5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>127-09-3</td></tr><tr><td>1x RSB Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2% sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>Never cool down SDS to avoid&amp;nbsp; precipitation //// 151-21-3</td></tr><tr><td>2 mg/ml Proteinase K</td><td>Roche Applied Science</td><td>0-3115828001</td><td>EC 3.4.21.64 9</td></tr><tr><td>10X Reticulocyte Standard Buffer (RSB)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM Tris-Cl, pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td>1185-53-1&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>100 mM NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>30 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>7786-30-3</td></tr><tr><td>Denaturing Agarose Gel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.2% Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>Let the gel solidify for at least 1 hr //// 9012-36-2</td></tr><tr><td>10X MOPS Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 M MOPS sodium salt, pH 7</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9381</td><td>Do not confuse MOPS sodium salt with MOPS //// 71119-22-7</td></tr><tr><td>Agarose Loading Dye</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x MOPS Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3% formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Hazardous //// 50-00-0</td></tr><tr><td>50% formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47670</td><td>Hazardous //// 75-12-7</td></tr><tr><td>Ethidium bromide (EtBr) 30 &amp;mu;g/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>Hazardous //// 1239-45-8</td></tr><tr><td>Bromophenol blue&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td>115-39-9&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">SMALL RNA FRACTIONATION</td></tr><tr><td>Flat gel loading tips</td><td>Life Technologies</td><td>LC1002</td><td></td></tr><tr><td>Savant SpeedVac Concentrator</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>DNA120</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Electrophoresis, Mini-PROTEAN Tetra Cell&amp;nbsp;</td><td>Biorad</td><td>165-8000</td><td></td></tr><tr><td>Denaturing Acrylamide Gel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% acrylamide/bis-acrylamide (19:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3449</td><td>Hazardous. Let the gel polymerize for 45 min before use</td></tr><tr><td>1x TBE Buffer (or 1x MOPS Buffer)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7 M urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U6504</td><td>57-13-6</td></tr><tr><td>0.1% ammonium persulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215589</td><td>7727-54-0&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.1% TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td>110-18-9</td></tr><tr><td>Gene Ruler Ultra Low Range DNA Ladder (10 bp-step)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1211</td><td>Label 0.1 &amp;mu;g, as described in the &quot;probe labeling&quot; reaction</td></tr><tr><td>Acrylamide Blue Dye&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50% formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47670</td><td>Hazardous //// 75-12-7</td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td>115-39-9&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Running Buffer (RB)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x MOPS Buffer&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alternative RB: 1x TBE Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x TBE Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5X TBE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>445 mM Tris-base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>77-86-1&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>445 mM boric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td>10043-35-3</td></tr><tr><td>20 mM EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>60-00-4&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Gel Staining Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide 0.5 &amp;mu;g/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>Hazardous //// 1239-45-8</td></tr><tr><td>1x RB</td><td></td><td></td><td>Stain for 15 min with EtBr, destain for 15 min w/o EtBr</td></tr><tr><td colspan="4">BLOTTING</td></tr><tr><td>3MM Whatman paper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z270849</td><td></td></tr><tr><td>Neutral Nylon Membrane, Hybond NX</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>RPN203T</td><td>Photosensitive</td></tr><tr><td colspan="4">CROSSLINKING</td></tr><tr><td>Crosslinking Solution (XLS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% 1-methylimidazole (v/v)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>336092</td><td>Always prepare a fresh aliquot of XLS //// 616-47-7</td></tr><tr><td>12.5 mM HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td>Hazardous //// 7647-01-0</td></tr><tr><td>3.1% EDC (w/v)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3450</td><td>25952-53-8&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">(PRE)-HYBRIDIZATION</td></tr><tr><td>Liquid Scintillation Counter&amp;nbsp;</td><td>Beckmann</td><td>LS 6500</td><td></td></tr><tr><td>Sheared Salmon Sperm, 0.1 mg/ml&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM9680</td><td></td></tr><tr><td>rasi4 anti-sense probe</td><td></td><td></td><td>5&#039; CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3&#039;</td></tr><tr><td>5s-rRNA anti-sense probe</td><td></td><td></td><td>5&#039;-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3&#039;</td></tr><tr><td>Dmel-miR279 anti-sense probe</td><td></td><td></td><td>5&#039;-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3&#039;</td></tr><tr><td>Dmel-miR286 anti-sense probe</td><td></td><td></td><td>5&#039;-AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3&#039;</td></tr><tr><td>Purification Kit, Illustra MicroSpin G-25 Columns</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>(Pre)-Hybridization Solution (HS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5% SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>151-21-3&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>5x Denhardt&#039;s Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20X SSPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.6 M NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.2 M sodium phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td>7601-54-9&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>20 mM EDTA (pH 8.0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>&amp;nbsp;60-00-4&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>50x Denhardt&#039;s Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% Ficoll 400 (w/v)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2637</td><td>26873-85-8</td></tr><tr><td>1% Polyvinylpyrrolidone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP40</td><td>9003-39-8</td></tr><tr><td>1% BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>9048-46-8&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1X TEN Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-Cl (pH 8.0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>77-86-1&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>100 mM NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1 mM EDTA (pH 8.0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>60-00-4&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Probe Labelling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.4 &amp;mu;M oligonucleotide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 &amp;mu;l Ci/&amp;mu;l [&amp;gamma;-32P] ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG002A</td><td>Hazardous //// 51963-61-2</td></tr><tr><td>1x T4 Polynucleotide Kinase Buffer</td><td>Biolabs</td><td>B0201</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase 0.5 units/&amp;mu;l</td><td>Biolabs</td><td>M0201</td><td>EC 2.7.1.78</td></tr><tr><td colspan="4">WASHING</td></tr><tr><td>Geiger Mueller Detectors</td><td>Canberra Industries</td><td>MCB2/CPS &amp;ndash; EM77021</td><td></td></tr><tr><td>Washing Buffer (WB), 2x SSPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stringent Washing Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2x SSPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x SSPE, 0.5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2x SSPE, 0.5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">SIGNAL DETECTION</td></tr><tr><td>PharosFX Plus System</td><td>Biorad</td><td>170-9460</td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>Freely available</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantity One</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-ray films , BioMax XAR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5888</td><td>Photosensitive</td></tr><tr><td>Developer for X-ray films</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7042</td><td></td></tr><tr><td>Fixer for X-ray films</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7167</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">STRIPPING</td></tr><tr><td>Stripping Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl pH 8.8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>77-86-1&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>5 mM EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>60-00-4&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.1% SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>Add SDS after boiling to avoid foaming //// 151-21-3</td></tr></tbody></table>

enhanced northern blot detection of small rna species in drosophila melanogaster

העשורים האחרונים היינו עדים לפיצוץ של כ מנגנוני בקרת ביטוי גני עניין מדעי ברמת RNA. ענף זה של ביולוגיה מולקולרית כבר מתודלק באופן משמעותי כתוצאה מגילוי noncoding RNAs כשחקנים מרכזיים בויסות לאחר תעתיק. כגון פרספקטיבה מהפכנית כבר מלווה ומופעלת על ידי הפיתוח של טכנולוגיות רבות עוצמה לאפיון ביטוי RNAs קצר, הן ברמת התפוקה הגבוהה (זיהוי הגנום) או כניתוח בודד מועמד (הצטברות מצב יציבה של מינים ספציפיים). למרות שכמה אסטרטגיות המדינה של אמנות זמינות כעת למינון או חזותי מולקולות שברחו כזה, assay צפון הכתם נשאר הגישה זכאית בביולוגיה מולקולרית להערכה מיידית ומדויקת של ביטוי RNA. זה מהווה צעד ראשון בדרך ליישום של, וטכנולוגיות יקרות יותר מתוחכמות, במקרים רבים, נותר שיטה מועדפת לתובנה בקלותלביולוגית RNA. כאן אנו סקירה כללית של פרוטוקול יעיל (Enhanced צפון כתם) לאיתור מייקרו RNA מתבטא בחולשה (או מיני RNA קטנים אחרים רגולטורים) מתסיסנית כל עוברים, גזורים באופן ידני רקמות / מבוגר זחל או בתאים בתרבית מבחנה. כמות מוגבלת מאוד של RNA נדרש והשימוש בחומר מתאי הזרימה cytometry-מבודדים יכולים להיות גם בחזונו.

<html> על ידי ביצוע ההליך הכולל המתואר בטקסט ואופן סכמטי המיוצג באיור 1, אנו הערכנו ביטוי RNA הקטן מדוגמאות RNA מורכבות של מקורות שונים. בניסוי שהוצג באיור 1, RNA היה מבודד מ2 התאים של דרוזופילה שניידר על ידי מיצוי proteinase K, בדיקת תקינות ב( שלב אופציונאלי: denaturing חלוקה agarose ג&#39;ל) ועמוס בכפול. מחצית אחת של ג&#39;ל הייתה מחקה על קרום ניטראלי וכימי צולבים על ידי EDC; המחצית השנייה הועברה על מסנן ניילון במטען חיובי, אז UV צולב (1.2 x 10 5 μJ / 2 סנטימטר). הביטוי אנדוגני של שני מייקרו RNA השייך למשפחת Dmel-miR279 (Dmel-miR279 עצמו ו15 Dmel-miR286) אומת בשני התנאים. ההליך המשופר (ENB) מבטיח כבוד רגישות גבוה יותר לסטנדרטי אחד (SNB). s = &quot;jove_content&quot;&gt; היעילות שונה בין שתי השיטות היא אפילו טוב יותר מודגש באיורים 2 ו -3. רציונל הניסוי הוא כנ&quot;ל: כאן אנו מדווחים על תוצאת הנציג של איתור autoradiographic צפון כתם של rasi4 Pirna לאורך טיטרציה של רנ&quot;א הכל חולץ ממבוגרים לטוס אשכים. ENB כבר מאפשר גילוי להקה ספציפית כאשר 0.5 מיקרוגרם של רנ&quot;א נטען. הכימות בצד מראה כיצד האות יחסי עולה עם כמות הרנ&quot;א מופרד, מצביע על כך שיחס מינון / תגובה נמצא בטווח ליניארי של זיהוי. הפנל מתחת מאשרר את הרגישות המשופרת של שיטה זו בהשוואה לSNB. במקרה זה, אות לזיהוי מתקבלת על חלוקה electrophoretic של 10 מיקרוגרם של רנ&quot;א לפחות עבור הבנק המרכזי של שוויץ. תוצאות דומות הושגו עם מיני RNA noncoding שונים, למשל, rRNA 5s, כפי שדווחו באיור 3 &lt;/ Strong&gt;. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51814/51814fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1 ייצוג סכמטי של הליך צפון הכתם הכולל. צעדים פרוצדורליים ראשיהם מופיעים וממוספרים בהדרגה. תוצאות הן בהשוואה בין הכתם משופר הצפון (ENB) ורגיל צפון הכתם (SNB), שבוצע באותם תנאים: בידוד RNA מן 2 התאים של דרוזופילה שניידר (לוח 1), אלקטרופורזה (לוח 2), העברה (לוח 3) וכלאה ( לוח 5). ENB מתייחס להליך השיפור שתואר בדוח זה, אשר דורש מסנן ניטראלי (לוח 3, מחצית השמאלית של הקרום) וcrosslinking (לוח 4) המבוסס על EDC הקובעת קשר הקוולנטי בין RNA היעד 5&#39;-end וקרום ( נקודות ורודות בלוח 4). בבנק המרכזי של שוויץ, crosslinking RNA מתקבל על ידי טיפול UV (לוח 4) במטען חשמלי חיובי nylon קרום (לוח 3, מחצית ימנית של הקרום). אות ספציפית 5S RNA היא לא כיל בתנאים השוואתיים, כי זה גם מגיב להבדלים בין SNB והליך ENB. לפיכך, סכום (המקביל ל 10 CPS) של כותרת 5&#39;(ראה נקודות 4.3 ו4.4 לפרוטוקול), 50 oligonucleotide NT המקושקשת ארוך התווסף לכל דגימה לפני אלקטרופורזה, לתפקד כ&quot; עלייה חדה ב&quot; התייחסות ( לוח 7). טוען יכול להיות גם שהוערך על ידי מכתים EtBr בג&#39;ל של rRNAs הארוך (ראה נקודה 5.5 לפרוטוקול). L = סולם. FV = פרונטאלית צפה ב, LV = רוחב צפה ב, HV = צפה אופקי. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51814/51814fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51814/51814fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2 Comparניתוח יצירתי צפון כתם ביטוי rasi4. רמות אנדוגני של rasi4 Pirna האשך ספציפי מתגלים על ידי משופר (ENB) או סטנדרטי (SNB) צפון כתם, שבוצע על הגדלת כמויות של רנ&quot;א הכל (שצוין לעיל כל מסלול) שחולץ מן האשכים דרוזופילה מבוגרות , או מכל בטן (עבד). עבור כל מתודולוגיה, היסטוגרמות הצידה לדווח כמויות היחסית של כבוד rasi4 לאותה כמות של &quot;עלייה חדה ב&quot; שליטת טעינה. Quantifications משתי השיטות משולבים בגרף חותך ממוקם מתחת לג&#39;לי. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51814/51814fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51814/51814fig3highres.jpg" width="500" /> איור ניתוח .3 השוואתי צפון כתם של r 5SRNA ביטוי. כביקורת חיובית וכיול ניסיוני, ניתוח קודם הוארך עד rRNA 5s. פרטים כמו באיור 2. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51814/51814fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

מטרתו של פרסום זה היא לדמיין ולדון בצעדים האופרטיביים של פרוטוקול צפון כתם משופר על RNA שחולץ מתסיסנית עוברים, תאים ורקמות. פרוטוקול זה שימושי במיוחד לאיתור יעיל של מיני RNA קטנים.

Enhanced צפון כתם איתור של RNA קטן מינים ב<em&gt; תסיסנית</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

enhanced-northern-blot-detection-small-rna-species-drosophila

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

23.9K Views.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire.  מטרתו של פרסום זה היא לדמיין ולדון בצעדים האופרטיביים של פרוטוקול צפון כתם משופר על RNA שחולץ מתסיסנית עוברים, תאים ורקמות. פרוטוקול זה שימושי במיוחד לאיתור יעיל של מיני RNA קטנים. 

Video: Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

לייזר Microdissection לכידה של תסיסנית נוירונים היקפיים

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Neuroscience

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Genetics

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and animals. Most miRNAs act as negative switches of gene expression targeting key genes. In plants, primary miRNAs (pri-miRNAs) transcripts are generated by RNA polymerase II, and they form varying lengths of stable stem-loop structures called pre-miRNAs. An endonuclease, Dicer-like1, processes the pre-miRNAs into miRNA-miRNA* duplexes. One of the strands from miRNA-miRNA* duplex is selected and loaded onto Argonaute 1 protein or its homologs to mediate the cleavage of target mRNAs. Although miRNAs are key signaling molecules, their detection is often carried out by less than optimal PCR-based methods instead of a sensitive northern blot analysis. We describe a simple, reliable, and extremely sensitive northern method that is ideal for the quantification of miRNA levels with very high sensitivity, literally from any plant tissue. Additionally, this method can be used to confirm the size, stability and the abundance of miRNAs and their precursors.

This method demonstrates use of the northern hybridization technique to detect miRNAs from total RNA extract.

ה-RNA ניתוח כתמי לזיהוי וכימות של מיקרורונאס הצמח

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Biochemistry

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

בידוד טיהור תסיסנית נוירונים היקפיים על ידי מיון ביד מגנטי

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Single Nucleotide Polymorphism-sensitive FISH Detection of Locus-specific Ribosomal RNA Transcription in Drosophila melanogaster

In order to ensure sufficient ribosomal RNA (rRNA) is transcribed for ribosome function, genomes contain hundreds of tandem duplications of the sequences that encode rRNAs, composing regions called ribosomal DNA (rDNA) loci. Many organisms' genomes contain more than one rDNA locus distributed across different chromosomes, and rRNA may be transcribed from multiple rDNA loci or only a single locus. Changes in rRNA transcription sources often indicate ribosomal distress. However, the homogeneity of rRNA obstructs distinguishing if rRNA is transcribed from multiple or a single rDNA locus. Here, we describe a method that uses single nucleotide polymorphism-sensitive fluorescence in situ hybridization (SNP-FISH) to distinguish rRNA transcription between Drosophila melanogaster rDNA loci on the X and Y chromosomes. This method leverages locus-specific rRNA variants to enable easy detection of the source of rRNA transcription with single-cell resolution. This assay can be applied to any Drosophila cell type and may be adapted for use in other systems.

The protocol describes single nucleotide polymorphisms-sensitive fluorescence in situ hybridization (SNP-FISH) method to distinguish ribosomal RNA transcripts derived from the X or Y chromosome ribosomal DNA locus in Drosophila melanogaster.

זיהוי FISH רגיש לפולימורפיזם נוקלאוטידי יחיד של שעתוק RNA ריבוזומלי ספציפי ללוקוס ב-Drosophila melanogaster

In order to ensure sufficient ribosomal RNA (rRNA) is transcribed for ribosome function, genomes contain hundreds of tandem duplications of the sequences ...

איתור וכימות מולקולות mRNA בודדות בדרוזופילה

Studying Muscle Transcriptional Dynamics at Single-molecule Scales in Drosophila

Skeletal muscles are large syncytia made up of many bundled myofibers that produce forces and enable body motion. Drosophila is a classical model to study muscle biology. The combination of both Drosophila genetics and advanced omics approaches led to the identification of key conserved molecules that regulate muscle morphogenesis and regeneration. However, the transcriptional dynamics of these molecules and the spatial distribution of their messenger RNA within the syncytia cannot be assessed by conventional methods. Here we optimized an existing single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) method to enable the detection and quantification of individual mRNA molecules within adult flight muscles and their muscle stem cells. As a proof of concept, we have analyzed the mRNA expression and distribution of two evolutionary conserved transcription factors, Mef2 and Zfh1/Zeb. We show that this method can efficiently detect and quantify single mRNA molecules for both transcripts in the muscle precursor cells, adult muscles, and muscle stem cells.

מחבר זרקור: חקירת התפלגות מרחבית mRNA ברקמת שריר דרוזופילה 

Drosophila is a well-established model for studying key molecules that regulate myogenesis. However, current methods are insufficient to determine mRNA transcriptional dynamics and spatial distribution within syncytia. To address this limitation, we optimized an RNA fluorescence in situ hybridization method allowing the detection and quantification of mRNAs at a single-molecule scale.

חקר דינמיקת שעתוק שרירים בסקאלות של מולקולות בודדות בדרוזופילה

Skeletal muscles are large syncytia made up of many bundled myofibers that produce forces and enable body motion. Drosophila is a classical model to study ...

Developmental Biology

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

טיהור של תמלילים ומטבוליטים מ<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשים

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Enhanced צפון כתם איתור של RNA קטן מינים ב

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

לייזר Microdissection לכידה של תסיסנית נוירונים היקפיים

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

ה-RNA ניתוח כתמי לזיהוי וכימות של מיקרורונאס הצמח

בידוד טיהור תסיסנית נוירונים היקפיים על ידי מיון ביד מגנטי

זיהוי FISH רגיש לפולימורפיזם נוקלאוטידי יחיד של שעתוק RNA ריבוזומלי ספציפי ללוקוס ב-Drosophila melanogaster

חקר דינמיקת שעתוק שרירים בסקאלות של מולקולות בודדות בדרוזופילה

חקר דינמיקת שעתוק שרירים בסקאלות של מולקולות בודדות בדרוזופילה

חקר דינמיקת שעתוק שרירים בסקאלות של מולקולות בודדות בדרוזופילה

הר כולו RNA פלורסנט

טיהור של תמלילים ומטבוליטים מ