Work in the authors' laboratory is supported by a grant from the National Institute of General Medical Sciences (GM41628) and by a grant to the Stowers Institute for Medical Research from the Helen Nelson Medical Research Fund at the Greater Kansas City Community Foundation.

מבחני Remodeling הנוקלאוזום .1 תלוי ATP כדי למדוד ATP תלוי פעילויות הנוקלאוזום שיפוץ, immunopurified INO80 או subcomplexes INO80 מודגרת עם ATP ומצע mononucleosomal, המכיל הנוקלאוזום יחיד ממוקם בקצה אחד של קטע DNA 216-BP, שכותרתו-P 32. תוצרי התגובה לאחר מכן נתון לאלקטרופורזה בג&#39;ל פולי-acrylamide ילידים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת ליצור את, בר 32 שכותרתו P &#39;601&#39; DNA, להגביר מpGEM-3Z-601 4 שבר 216 נ&quot;ב DNA המכיל 601 רצף מיצוב הנוקלאוזום מיקום סוף, באמצעות oligonucleotides 5&#39;-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG ו5&#39;-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG כ קדימה ולאחור פריימרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תגובת PCR 100 μl כפי שמתואר בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע PCR התגובות בCycler תרמית באמצעות התכנית הבאה: 1 דקות ב96 מעלות צלזיוס, followeד על ידי 45 שניות על 94 מעלות צלזיוס, 30 שניות ב57 ° C, 60 שניות ב72 מעלות צלזיוס במשך 30 מחזורים; כלה ב7 דקות ב72 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תגובת PCR נגמרה, להסיר את נוקלאוטידים מאוגדים על ידי העברת תוצרי התגובה פעמיים באמצעות עמודות ספין nuclease חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרוץ 5 μl של מוצר PCR המטוהר בagarose ג&#39;ל 1.2% כדי לאשר שתגובת PCR שנוצרה קטע DNA נ&quot;ב הרצוי ~ 216. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 5 μl של מוצר PCR המטוהר פי 20, ולמדוד את ריכוז DNA באמצעות ספקטרופוטומטר UV. התשואה הממוצעת היא ~ 40 ng / μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הרדיואקטיביות של 1 μl של מוצר PCR המטוהר במונה נצנץ. להעריך את יעילות התיוג על ידי חישוב עותקים לדקה / ng. תגובת תיוג מוצלחת צפויה להניב ~ 15,000 עותקים לדקה / ng של 601 קטע DNA. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את nucleosomes תא הלה על DNA 601 שכותרתו באמצעות שיטת דילול סדרתי 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב 2 pmol של32 קטע DNA 601 עם כותרת P 6 מיקרוגרם של nucleosomes הלה (שהוכן כמתואר 5) ב50 μl של מאגר המכיל 1.0 M NaCl, 10 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.1 מ&quot;מ PMSF, ו1 מ&quot;מ DTT ולדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף לדלל את התערובת ל0.8 M, 0.6 M, ו0.4 M NaCl על ידי דילול עם 12.5 μl, 20.8 μl, ו41.6 μl, בהתאמה, של 10 מ&quot;מ טריס-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.1 מ&quot;מ PMSF, ו 1 מ&quot;מ DTT, עם דגירה 30 דקות ב30 מעלות צלזיוס לאחר כל דילול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתר על כן לדלל את התערובת ל0.2 M ולאחר מכן ל0.1 M NaCl על ידי תוספת של 125 μl ולאחר מכן 250 μl מאותו המאגר המכיל 0.1% Nonidet P-40, גליצרול 20%, ו200 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​BSA, עם דגירה 30 דקות ב30 מעלות צלזיוס בין שני דילולים הסופיים. אחסן את מצע mononucleosome ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע תגובות הנוקלאוזום הזזה ATP תלויות בנפח כולל של 10 μl. המחשבהרכיבי ction מפורטים בטבלה 2. מאז ריכוז NaCl האופטימלי לפעילות שיפוץ הנוקלאוזום INO80 הוא ~ 50 mM NaCl (תוצאות לא פורסמו), להתאים את הריכוז הכולל של NaCl בכל תגובה ל50 מ&quot;מ, תוך לקיחה בחשבון את כמות NaCl הכלולה ב הכנות של nucleosomes ואנזים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שיתחיל בלהגדיר את מבחני, להטיל ג&#39;לי פולי-acrylamide ילידים (18 x 16 סנטימטר). כדי להכין ג&#39;ל יחיד המכיל 5% acrylamide (acrylamide: bisacrylamide 37.5: 1), TBE 0.5x (45 borate מ&quot;מ טריס, 1 mM EDTA), 0.01% persulfate אמוניום (APS), ו0.001% N, N, N&#39;, -tetramethylethylenediamine N&#39;(TEMED), לערבב את החומרים המפורטים בטבלה 3. אפשר ג&#39;ל לפלמר לפחות שעה 2 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, לכל תגובה שיש לבצע, לשלב בצינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge מראש צונן siliconized ~ 20 ננומטר INO80 או subcomplex INO80 (שהוכן כמתואר 3) עם סכום של חיץ EB100 ( <strאונג&gt; לוח 4) מספיק כדי לתת נפח של 4.75 μl. מייד מחדש להקפיא כל שברים המכיל INO80 שנותרו בקרח יבש אבקה או חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את קוקטייל הורים עם שאר החומרים, גמלון בפקטור של &quot;X&quot; (כאשר X = מספר כולל של תגובות +3). הסכום של כל מרכיב הנחוץ לתגובת 10 μl בודדת מופיע בטבלה 5; המתכון צריך להיות בקנה מידה גדול בהתאם למספר של תגובות שיש לבצע. מערבבים היטב על ידי הקשה על הצינור או על ידי pipetting למעלה ולמטה עם Pipetman ולסובב את הצינור לכמה שניות בmicrocentrifuge המעבדתיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 5.25 μl של קוקטייל האדון לכל אחד מצינורות התגובה הוקמו בצעד 1.3.2. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. התחל את התגובות על ידי העברת צינורות תגובה לאמבטית גוש חום C 30 מעלות או מים ודגירה עבור שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, להכין את &#39;הסרת לערבב&#39; קוקטייל המכיל DNA מתחרהוnucleosomes, גמלון בפקטור של X (X = מספר הכולל של תגובות + 4). הסכום של כל מרכיב הדרוש כדי להכין 1.5 μl הסרת תערובת לתגובה יחידה מופיע בלוח 6; המתכון צריך להיות בקנה מידה גדול בהתאם למספר מבחני שיש לבצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים תגובות על ידי הוספת 1.5 μl של תמהיל הסרת. מערבבים היטב, ספין למטה, ולדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, לפני לרוץ ג&#39;ל polyacrylamide הילידים ביחידת אלקטרופורזה אנכית ב100 V ל30 דקות ב 4 ° C, באמצעות TBE 0.5x כחיץ פועל עם בר ומערבב מגנטי בתוך החדר התחתון כדי לשמור על זרימת דם למאגר קבועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לטעון את המדגם, להוסיף 2.5 μl של טעינת צבע המכיל 3x TBE, גליצרול 30%, 0.25% כחול bromophenol, ו0.25% Cyanol FF קסילן. מערבבים היטב, ספין בקצרה הדגימות, ולהעמיס אותו על ג&#39;ל באמצעות עצות לטעינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הג&#39;ל על 200 V ל4.5 שעות על 4 מעלות צלזיוס עם זרימת חיץ.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות את האות, להעביר את הג&#39;ל לערימה של שני גיליונות של נייר סינון. לעטוף את נייר הסינון עם ג&#39;ל על גבי באמצעות ניילון נצמד ברור, ולאחר מכן לחשוף אותו למסך זרחן האחסון ב 4 מעלות צלזיוס למשך הזמן הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את המסך עם מערכת סורק הדמיה איזוטופ ולנתח את הנתונים באמצעות תוכנה מתאימה. </li></ol></li></ol> 2 מבחני כריכת Mononucleosome לassay הזיקה המחייבת של מורכב INO80 ניתנו לmononucleosomes, לבצע Shift electrophoretic ניידות Assay (Emsa) באמצעות מצע mononucleosomal שנוצר בשלב 1.2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תגובת תערובות לכריכה מבחני כפי שתואר עבור מבחני שיפוץ הנוקלאוזום אבל להשמיט ATP ותמהיל הסרת מהתגובות; לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.5 μl של טעינת צבע לכל תערובת תגובה, ותחול על ג&#39;ל polyacrylamide ילידים המכיל 3.5 acrylamide% (acrylamide: bis 31), 1% גליצרול, TBE 0.5x, APS 0.01%, ו0.001% TEMED: 7.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות TBE 0.5x כחיץ פועל, הפעל את הג&#39;ל על 200 V ל2.5 שעה על 4 מעלות צלזיוס עם זרימת חיץ ולחשוף למסך זרחן האחסון. </li></ol> .3 דנ&quot;א והנוקלאוזום תלוי מבחני ATPase לבצע מבחני ATPase בתערובות תגובת 5 μl מכילות 20 מ&quot;מ טריס-HCl (pH 7.5), 60 mM NaCl, 6.6 מ&quot;מ MgCl 2, 0.8 mM EDTA, 0.015% Nonidet P-40, גליצרול 2.5%, 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל BSA, 1 מ&quot;מ DTT, 0.1 מ&quot;מ PMSF, 2 מ&quot;מ ATP, 2 μCi של [P 32 α-] ATP (3,000 Ci / mmol). עבור כל מורכב INO80 או כמות מורכבת INO80 להיות assayed הקים שלוש תגובות מקבילות, חיץ EB100 מכיל אחד למדוד דנ&quot;א או הנוקלאוזום עצמאי ATPase, אחד מכיל סגורות פלסמיד דנ&quot;א העגול (נ&quot;ב 5,000, ~ 30 ננומטר) כדי למדוד דנ&quot;א ATPase תלוי, ואחד המכיל oligonucleosomes הלה (~ 185 ננומטר) כדי למדוד ATPase הנוקלאוזום תלוי. הגדר את כל התגובות על קרח. <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל תגובה, לשלב 10-50 ננומטר של subcomplexes INO80 או INO80 immunopurified עם סכום של חיץ EB100 מספיק כדי לתת נפח של 2.2 μl ב1.5 מ&quot;ל צינורות microcentrifuge משומן מראש צונן. מייד מחדש להקפיא כל שברים המכיל INO80 בקרח יבש אבקה או חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הקוקטייל שני. הסכום של כל מרכיב הנחוץ לתגובה יחידה מופיע בלוח 7. בהיקף של עד המתכון לפי קנה מידה על ידי גורם של 3 (X + 2) +1, כאשר X = מספר הכנות INO80 להיות assayed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין מאגר המכיל &#39;משנה הקוקטיילים&#39; בלבד, DNA, או nucleosomes, לוותר 2.5 (X + 2) μl של קוקטייל האב לשלושה צינורות נפרדים. הוספת 0.3 (X + 2) μl של שתי EB100, DNA הסגור המעגלי פלסמיד (1.5 מיקרוגרם / μl), או (1.5 מיקרוגרם / μl) oligonucleosomes הלה ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 2.8 μl של תת הקוקטייל המתאים לצינורות תגובה המכיל אנזים שהוקמו בstep 3.1. פיפטה בעדינות מעלה ומטה כדי לערבב; למנוע החדרת בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל את תגובות, להעביר את צינורות תגובה לגוש חום C 30 מעלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5, 15, 30, ו60 דקות של דגירה, לזהות 0.5 μl של כל תערובת תגובה על כרומטוגרפיה שכבה דקה polyethyleneimine תאית צלחת (TLC) (20 x 10 סנטימטר) בקו ישר לפחות 1.5 ס&quot;מ מהקצה התחתון . מייד לחזור צינורות תגובה לגוש חום C 30 מעלות ניתן לקחת נקודות זמן כל כך רבות מצינור אחד. אחרי שהבחנתי ב, לייבש את צלחות TLC באמצעות מכת מייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את צלחות TLC לתא זכוכית המכיל מספיק פוספט 0.375 M אשלגן (pH 3.5) כדי לאפשר 0.5 סנטימטר תחתית צלחת TLC להיות שקוע בפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה את התא, ולפתח עד החלק הקדמי של השלב הנוזלי מגיע העליון של צלחות TLC. מיידי לייבש את הצלחות באמצעות מכת מייבש ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את צלחות TLC המיובשים למסך זרחני אחסון ב RT.סרוק את המסך עם מערכת סורק הדמיה איזוטופ ולקבוע את סכום מצע ATP רדיואקטיבי לבין מוצר ADP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את הסכום של ATP הידרוליזה, להכפיל את ATP% הידרוליזה על ידי הכמות של הווה ATP בתערובת התגובה החל שימוש בנוסחה הבאה: ATP pmol הידרוליזה ATP pmol = 10 במתחילים x תגובה [ADP / (ATP + ADP)] </li></ol>

<ol>
	<li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+chromatin+remodeling+complexes.">The biology of chromatin remodeling complexes.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).</li><li>Narlikar, G. J., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+functions+of+ATP-dependent+chromatin-remodeling+enzymes.">Mechanisms and functions of ATP-dependent chromatin-remodeling enzymes.</a> Cell. 154 (3), 490-503 (2013).</li><li>Chen, L., Ooi, S. K., Conaway, J. W., Conaway, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+purification+of+human+INO80+chromatin+remodeling+complexes+and+subcomplexes.">Generation and purification of human INO80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes.</a> , (2013).</li><li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning.">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> J. Mol. Biol. 276 (1), (1006).</li><li>Owen-Hughes, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+nucleosome+disruption+by+ATP-driven+chromatin+remodeling+complexes.">Analysis of nucleosome disruption by ATP-driven chromatin remodeling complexes.</a> Methods Mol. Biol. 119, 319-331 (1999).</li><li>Udugama, M., Sabri, A., Bartholomew, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+INO80+ATP-dependent+chromatin+remodeling+complex+is+a+nucleosome+spacing+factor.">The INO80 ATP-dependent chromatin remodeling complex is a nucleosome spacing factor.</a> Mol. Cell Biol. 31 (4), 662-673 (2011).</li><li>Jin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+chromatin+remodeling+complex+with+similarities+to+the+yeast+INO80+complex.">A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (1074).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+organization+of+the+human+INO80+chromatin+remodeling+complex:+an+evolutionarily+conserved+core+complex+catalyzes+ATP-dependent+nucleosome+remodeling.">Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).</li><li>Hamiche, A., Sandaltzopoulos, R., Gdula, D. A., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-dependent+histone+octamer+sliding+mediated+by+the+chromatin+remodeling+complex+NURF.">ATP-dependent histone octamer sliding mediated by the chromatin remodeling complex NURF.</a> Cell. 97 (7), 833-842 (1999).</li><li>Polach, K. J., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+enzymes+as+probes+of+nucleosome+stability+and+dynamics.">Restriction enzymes as probes of nucleosome stability and dynamics.</a> Methods Enzymol. 304, 278-298 (1999).</li><li>Anderson, J. D., Thastrom, A., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+access+of+proteins+to+buried+nucleosomal+DNA+target+sites+occurs+via+a+mechanism+that+is+distinct+from+nucleosome+translocation,+Mol.Cell+Biol.">Spontaneous access of proteins to buried nucleosomal DNA target sites occurs via a mechanism that is distinct from nucleosome translocation, Mol.Cell Biol.</a> 22 (20), 7147-7157 (2002).</li><li>Saha, A., Wittmeyer, J., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+remodeling+through+directional+DNA+translocation+from+an+internal+nucleosomal+site.">Chromatin remodeling through directional DNA translocation from an internal nucleosomal site.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 12 (9), 747-755 (2005).</li><li>Gottschalk, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribosyl)ation+directs+recruitment+and+activation+of+an+ATP-dependent+chromatin+remodeler,+Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.">Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.</a> 106 (33), 13770-13774 (2009).</li><li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+ISWI+involves+inhibitory+modules+antagonized+by+nucleosomal+epitopes.">Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes.</a> Nature. 492 (7428), 280-284 (2012).</li><li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Direct Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Measurement+of+Rapid+Inorganic+Phosphate+Release+Using+a+Novel+Fluorescent+Probe+and+Its+Application+to+Actomyosin+Subfragment+1+ATPase,+Biochemistry.">Real-Time Measurement of Rapid Inorganic Phosphate Release Using a Novel Fluorescent Probe and Its Application to Actomyosin Subfragment 1 ATPase, Biochemistry.</a> 33 (27), 8262-8271 (1994).</li><li>Luk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+histone+replacement+by+SWR1+requires+dual+activation+with+histone+H2A.Z+and+canonical+nucleosome.">Stepwise histone replacement by SWR1 requires dual activation with histone H2A.Z and canonical nucleosome.</a> Cell. 143 (5), 725-736 (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

כדי להבטיח ששיפוץ הנוקלאוזום ופעילויות ATPase שאנו רואים במבחנים תלויים בפעילות הקטליטית של מתחמי INO80, ולא על זיהום ו / או אנזימי ATPase שיפוץ, אנו הנוקלאוזום באופן שגרתי assay שיפוץ ופעילות ATPase של גרסאות כקטליזאטור פעילים של מתחמי INO80, מטוהר ב במקביל עם הסוג בר INO80 תוך שימוש באותו ההליך. גם תגובת ביקורת שלילית חסרת ATP צריכה להתבצע כאשר מנסים לאמוד את פעילות שיפוץ הנוקלאוזום כדי לבדוק את קיומו של זיהום ATP ו / או פעולות שיפוץ ATP-עצמאיות, אשר עלול לסבך את הפרשנות של ניסויי השוואת הפעילות של תכשירים שונים של מורכבות INO80 או subcomplexes. כקטליזאטור גרסאות פעילה של INO80 או subcomplexes INO80 צריכה להפגין לא שיפוץ הנוקלאוזום או פעילויות ATPase. בנוסף, זיהוי של דנ&quot;א או הנוקלאוזום עצמאי פעילות ATPase מעיד על קיומו של זיהום ATPase (ים) בenzymחלק דואר. אם הפעילות היא עדיין מזוהה בנוכחות Ino80 כקטליזאטור לא פעיל או אם יש דנ&quot;א המשמעותי או פעילות ATPase הנוקלאוזום עצמאית גם לאחר אופטימיזציה של טיהור כפי שמתואר ב&#39;נציג תוצאות, &quot;מתחמים יכולים להיות מטוהרים נוסף באמצעות צעדים נוספים כגון חילוף יונים או כרומטוגרפיה ג&#39;ל סינון או שקיעה הדרגתית. כאשר מודדים שיפוץ הנוקלאוזום ופעילויות ATPase, רצוי לבצע מבחני לתקופות שונות ובריכוז יותר מסוג אחד של INO80 או subcomplexes INO80 כדי להבטיח מדידות ננקטות כאשר מוצר בזמן ומנת תגובה עקום הוא ליניארי. בדומה לכך, יש לבצע מבחני הנוקלאוזום מחייב שימוש במספר ריכוזים של מתחם INO80 (es); אחרת, לא ניתן באופן מהימן להשוות את פעילותם של הכנות INO80 שונות. הנוקלאוזום הזזה ומבחנים מחייבים תמיד צריכים לכלול תגובות שליטההכולל mononucleosome מצע לבד כסמן כדי לעבור לניידות electrophoretic של אוכלוסיית הנוקלאוזום מתחילה. בדרך זו, אפשר בקלות לזהות שינויים עקב במיוחד לנוכחות של שבריר האנזים. תגובות שליטה כזו גם להעריך את היושרה של mononucleosomes מחדש. על מנת לנהל הנוקלאוזום לפרש בקלות הזזה ומחייב מבחני, כדאי ליצור מצעי mononucleosomal הומוגנית; מסיבה זו, assay שתואר בפרוטוקול זה משתמש בnucleosomes התאסף בקטע DNA המכיל רצף מיצוב הנוקלאוזום חזק. למרות מורכב INO80 נוטה למקם nucleosomes ממוקם רוחבי למקום מרכזי יותר בקטע DNA, אנזימי הכרומטין שיפוץ אחרים, כגון מורכב NURF ISWI המכיל 9, להעביר nucleosomes מיותר עמדות מרכזיות כלפי הקצוות של שברי DNA. כך, במהלך האפיון של כל שיפוץ הכרומטין enzyme כדאי להכין מצעי mononucleosome בי רצף מיצוב הנוקלאוזום הוא במקומות שונים. לחלופין, אפשר להעסיק מצעים שבי nucleosomes הורכבו על שברי DNA ללא רצף מיצוב הנוקלאוזום. במקרה זה, אוכלוסיית הנוקלאוזום מתחילה תכלול תערובת של nucleosomes יותר הממוקם במרכז ורוחבי. תהליך שיפוץ הנוקלאוזום תלוי ATP יכול להוביל לתוצאות שיפוץ שונות, כוללים עקירה מוחלטת הנוקלאוזום מDNA, תנועת הנוקלאוזום על DNA, או שינויים זמניים במבנה הנוקלאוזום כי לא יכול להביא לשינויים בעמדות של nucleosomes פעם התגובה מגיעה לשיווי משקל אבל בכל זאת מבחינה תפקודית משמעותיים. Assay הנוקלאוזום הזזה תאר יכול לפקח על שתי התגובות הראשונות, אבל לא יכול להיות מסוגל לזהות שינויים זמניים במבנה הנוקלאוזום. assay אחד שיכול לזהות כמה גובה חולף כגוןמיישמים מנצלים את העובדה שDNA nucleosomal על פני השטח של octamer הנוקלאוזום הוא במידה רבה בלתי נגיש לחיתוך על ידי אנזים הגבלה, ואילו DNA מקשר שכבר נעקר ממשטח octamer ידי הנוקלאוזום הזזה או ההתרה חלקית של DNA nucleosomal היא רגישה לגזירה 10,11,12. כגון assay יכול גם להיות שימושי במיוחד במקרה שאנזים שיפוץ הנוקלאוזום נקשר כל כך חזק למצע שלה שהיא לא יכולה להסיר על ידי מתחרה 13. הנוקלאוזום זזים ומחייב מבחני למדוד פעילויות INO80 באמצעות מצעי mononucleosomal מוכנים עם ההיסטונים תא הלה ילידים. עם זאת, פעילות שיפוץ של INO80 או אנזימי הכרומטין שיפוץ אחרים יכולה באופן עקרוני להיות מושפעת מנוכחותו או היעדריו של שלאחר translational שינויים ספציפיים או גרסאות היסטון. בנוסף, mononucleosomes עשוי לעורר את הפעילות של מתחם INO80 שונה מdi-nucleosomes,או מערך של nucleosomes. לפיכך, הפעילות של מתחם INO80 מדידה באמצעות מצע nucleosomal יותר מסובך ומגוון עשויה לספק תובנות לגבי המנגנון שבאמצעותו מתחמי שיפוץ הכרומטין INO80 מוסדרים. כחלופה לשימוש שבברי DNA radiolabeled בשיפוץ הנוקלאוזום ומבחנים מחייבים, כמה חוקרים לחזות nucleosomes ו / או DNA על ידי צביעת DNA nucleosomal ברומיד ethidium 14; עם זאת, מבחני שבוצעו תוך שימוש בשיטות זיהוי שאינו רדיואקטיבי יכולים להיות הרבה פחות רגיש מזו שתוארה בפרוטוקול זה, בדרך כלל דורש שימוש בהרבה יותר אנזים. מעקב אחר ההתקדמות של תגובות ATPase כפונקציה של זמן באמצעות assay מבוסס P 32 המתוארים כאן דורש סבבים נפרדים של טיפול מדגם וניתוח בכל נקודת זמן. כגישה חלופית, פעילות ATPase ניתן למדוד באמצעות מבחני הקרינה מבוססת <sup&gt; 15,16, שמנצל את העובדה שהשינוי של אות הקרינה ניתן לנטר בקלות בזמן אמת, ובכך לספק הזדמנות טובה יותר כדי לעקוב אחר המרה של מצע למוצר בזמן אמת. מבחני מסוג זה יכול, עם זאת, להיות מאתגרים מבחינה טכנית והן באופן כללי פחות רגיש מאשר assay שתואר כאן. הנהלים שתוארנו במאמר זה יופיטר היו בשימוש כדי לאפיין שלוש תכונות הביוכימיות שונות של subcomplexes INO80 או INO80 בתהליך של שיפוץ הנוקלאוזום תלוי ATP. באמצעות subcomplexes INO80 שונים או מוטציות INO80 במבחנים אלה, ניתן לנתח את התרומה הפונקציונלית של יחידות משנה שונות INO80 ו / או מבני תחום לפעילות שיפוץ הנוקלאוזום INO80 ולהגדיר צעד (ים) בתגובת שיפוץ שביחידות משנת INO80 ו / או תחומים עשויים להיות חשובים. נהלים אלה יכולים להיות מותאמים למחקר של שיפוץ הנוקלאוזום אחר ואנזימים מחייבים וATPases with שני דנ&quot;א ופעילויות הנוקלאוזום תלויים או בלתי תלויות. נציין, כי ייתכן שיש לי אנזימי הכרומטין שיפוץ שונים פעילויות ATPase או שיפוץ הנוקלאוזום גבוהות יותר או נמוך יותר מאשר פנימיות המורכב INO80 האנושי. לפיכך, כאשר התאמת פרוטוקולים אלה לניתוח של אנזימי הכרומטין שיפוץ אחרים, אחד צריך להשתנות ריכוזים של אנזים, ATP, DNA או nucleosomes, וזמני תגובה ו / או טמפרטורות על מנת לייעל את מבחני לאנזימים מסוימים הנלמדים.

מתחמי שיפוץ הכרומטין משפחת SNF2 כוללים מקטע ATPase מרכזי כמו SNF2-1,2. פונקציה מסוימת כמו SNF2-ATPases כאנזימים למקטע אחד, בעוד שאחרים לתפקד כמקטע קטליטי של מתחמים רב למקטע גדולים יותר. הבהרת המנגנונים המולקולריים שבאמצעותו כל אחד מיחידות המשנה של הכרומטין מתחמי שיפוץ לתרום לפעילויות שלהם דורש את היכולת לבצע מבחני ביוכימיים שלנתח את תהליך שיפוץ. שיפוץ הנוקלאוזום תלוי ATP על ידי מורכב INO80 האנושי ואנזימי הכרומטין שיפוץ אחרים יכול להיות שחזה כתהליך רב שלבים שמתחיל בכריכה של אנזים שיפוץ לnucleosomes, ואחרי הפעלה של דנ&quot;א ו / או ATPase הנוקלאוזום תלוי, טרנסלוקציה של אנזים שיפוץ על DNA nucleosomal, ומיצוב מחדש סופו של הדבר nucleosomes 1,2. הבנת הפרטים המולקולריים של r תהליך שיפוץ הכרומטין תלוי ATPequires נתיחה של תגובת שיפוץ לשלבים הבודדים שלה והגדרתה של תרומתם של יחידות משנה נפרדות של מתחם שיפוץ הכרומטין לכל צעד של התגובה. ניתוח מסוג זה דורש היכולת לנתח שיפוץ הנוקלאוזום ופעילויות אחרות באמצעות מצעים מולקולריים מוגדרים במבחנה. בפרוטוקול יופיטר קודם, שתארנו תהליכים המשמשים ליצירת מתחמי INO80 שיפוץ הכרומטין וsubcomplexes עם יצירות למקטע מוגדרים 3. כאן, אנו מציגים שלושה מבחני ביוכימיים שיאפשר ניתוח כמותי של הנוקלאוזום המחייב, דנ&quot;א וATPase מופעל הנוקלאוזום, ופעילויות שיפוץ הנוקלאוזום הקשורים למתחמים כאלה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="839">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:212px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:123px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">P8340</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x PCR reaction buffer&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Roche Applied Science&#160;</td>
			<td style="width:147px;">11435094001</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Roche Taq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:212px;">Roche Applied Science&#160;</td>
			<td style="width:147px;">11435094001</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NucAway Nuclease-free Spin Columns&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td style="width:147px;">Cat. # AM10070</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ultrapure ATP&#160;</td>
			<td>USB/Affymetrix</td>
			<td style="width:147px;">77241 25 UM</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bovine serum albumin&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">A9418&#160;</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">N,N,N&#180;,N&#180;-tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td style="width:212px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">17919</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40% Acrylamide/Bis 37.5:1</td>
			<td style="width:212px;">Amresco</td>
			<td style="width:147px;">0254-500ML</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sonicated salmon sperm DNAs&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td style="width:147px;">27-4565-01</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10% ammonium persulfate (APS)</td>
			<td style="width:212px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">17874</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">benzonase&#160;</td>
			<td>Novagen</td>
			<td style="width:147px;">Cat. No. 70664</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">[&#945;-32P] ATP (3000 Ci/mmol)</td>
			<td style="width:212px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:147px;">BLU003H250UC</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">dCTP, [&#945;-32P]- 6000Ci/mmol</td>
			<td style="width:212px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:147px;">BLU013Z250UC</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;"></td>
			<td style="width:212px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Equipment</td>
			<td style="width:212px;">Company</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR thermal cycler PTC 200</td>
			<td>MJ Research</td>
			<td style="width:147px;">PTC 200</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoefer vertical electrophoresis unit</td>
			<td style="width:212px;">Hoefer</td>
			<td style="width:147px;">SE600X-15-1.5</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Costar</td>
			<td style="width:147px;">3207</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Storage Phosphor Screen&#160;</td>
			<td>Molecular Dynamics</td>
			<td style="width:147px;">63-0034-79</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3MM filter paper</td>
			<td>Whatman&#160;</td>
			<td style="width:147px;">28458-005</td>
			<td style="width:123px;">VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Typhoon PhosphorImager&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td style="width:147px;">8600</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageQuant software</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td style="width:147px;">ver2003.02</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">TLC Glass Plates, PEI-Cellulose F</td>
			<td style="width:212px;">Millipore</td>
			<td style="width:147px;">5725-7</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4</td>
			<td style="width:212px;">Millipore</td>
			<td style="width:147px;">IPFL07810</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">General purpose survey meter with end-window or pancake GM (Geiger-Mueller) probe</td>
			<td style="width:212px;">Biodex</td>
			<td style="width:147px;">Model 14C</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biochemical assays for analyzing activities of atp-dependent chromatin remodeling enzymes

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

הנתונים מראים תוצאות נציג של מבחני ביוכימיים משמשים כדי לאפיין פעילויות INO80, כוללים הנוקלאוזום הזזה (איור 1) ומחייב (איור 2) מבחני ודנ&quot;א או מבחני הנוקלאוזום תלוי ATPase (איור 3). הניסוי שמוצג באיור 1 משווה את היכולת של מתחמי INO80 שלמים מטוהר באמצעות FLAG-Ies2 או FLAG-INO80E ושל INO80 subcomplexes מטוהר או דרך FLAG-Ino80ΔN או Ino80ΔNΔHSA לזרז שיפוץ של mononucleosomes התאסף ב216 נ&quot;ב, קטע DNA radiolabeled. העמדה של הנוקלאוזום בקטע DNA משפיעה על ניידות electrophoretic; רוחבי nucleosomes ממוקם לרוץ מהר יותר בג&#39;ל מnucleosomes יותר הממוקם במרכז. מאז מתחמי שיפוץ הכרומטין INO80 מעדיפים להעביר mononucleosomes לכיוון המרכז של פיסת DNA 6,7,8, פעילות שיפוץ הוא מוניהנמצאת על ידי הופעתה של אוכלוסייה של nucleosomes כי תערוכת ירד ניידות electrophoretic. בסופו של התגובה, עודף של oligonucleosomes הלה וזרע סלמון או DNA האחר יש להוסיף לתערובת התגובה כמתחרה כדי להסיר כל subcomplexes INO80 או INO80 הנכנס מצע, מאז אנזים שיפוץ הכרוך ישנה את ניידות electrophoretic של הנוקלאוזום מצע. מתחמים המטוהרים באמצעות Ino80ΔN FLAG חסרי יחידות משנה מטזואניים ספציפי INO80D, INO80E, אמידה, MCRS1, NFRKB, וUCH37, תוך שבמטוהר באמצעות Ino80ΔNΔHSA גם חוסר Arp4, Arp8, וYY1. יש לי מתחמים המטוהרים באמצעות FLAG-Ies2, FLAG-INO80E, והדגל-Ino80ΔN פעילויות דומות, מצביעים על כך שיחידות המשנה מטזואניים ספציפית הן מיותרות עבור שיפוץ הנוקלאוזום על ידי מורכב INO80. בניגוד לכך, מתחמים מטוהרים באמצעות FLAG-Ino80ΔNΔHSA אינם פעילים בassay זה, מצביעים על כך שפעילות שיפוץ תלויה בתחום HSA של ATP Ino80ASE ו / או יחידות משנה הקשורים אליו. הניסויים באיור 2 להשוות הנוקלאוזום מחייב פעילות של INO80 וsubcomplexes INO80 באמצעות מבחני משמרת ניידות electrophoretic. מבחני אלה מבוצעים באופן דומה למבחני שיפוץ הנוקלאוזום, פרט לכך שאין תוספת של oligonucleosomes וDNA בסיומה של התגובה להסרת מתחמים מאוגד הנוקלאוזום. בהתאם לכך, דגירה של nucleosomes עם כמויות הולכים וגדלות של מתחמי INO80 שלמים מטוהר באמצעות מקטע INO80E מוביל להיעלמות תלוית מינון של הלהקה המתאימה לmononucleosomes החופשי ומראה של חדש &#39;להחליף&#39; מינים שנודדים בחלק העליון של ג&#39;ל (נתיבים 6-8). בניגוד לכך, כאשר nucleosomes מודגרת עם מתחמים קטנים יותר שמטוהרים באמצעות Ino80ΔN ושאין להן קבוצת משנה של יחידות משנה INO80, המינים השתנו נודדים במהירות רבה יותר (נתיבי 2-5 ו9-11), המצביעים על כך האספסוף היחסיility של הלהקה העביר סופר נקבע על ידי הגודל של מתחמי assayed. איור 3 מוצג תוצאות של assay השוואת דנ&quot;א ופעילויות ATPase מופעל הנוקלאוזום של שתי subcomplexes INO80 שונה. הכתמים הנודדים לאט יותר מתאים לα- ההתחלה 32 P שכותרתו ATP, ומינים במהירות רבה יותר הנודדים הם תוצרי תגובת ADP; חיצים מצביעים על הכיוון של הגירת ממס. אחד מהמתחמים assayed כאן, INO80ΔN, כולל מקטע Ino80 ATPase המשתרע על C-הסופי הנורמלי של החלבון, ואילו אחרים, INO80ΔNC, חסר את אזור C-מסוף Ino80. למרות ששני מתחמים אלה מלבד זאת הם זהים, השיעור של הידרוליזה ATP (שנמדדה על ידי המרה של ATP שכותרת רדיו לADP) הוא גדול יותר בנוכחות INO80ΔNC, המצביע על C-הסופי של ATPase Ino80 עלול להשפיע לרעה להסדיר את פעילותה. שימו לב שהשיעור של hydr ATPolysis על ידי שני מתחמים גדול בנוכחות nucleosomes מ DNA, המצביע על הנוקלאוזום INO80 שיפוץ מתחמים מעדיפים מצעי nucleosomal להידרוליזה ATP. בassay שמוצג באיור, יש רק רמה נמוכה מאוד של הידרוליזה ATP בתגובות שאין להן DNA או nucleosomes (הנע בין גילוי ל&lt; 5% מזה שנצפה בנוכחות DNA / nucleosomes). בגלל פעילות ATPase של INO80 ואנזימי הכרומטין משפחת SNF2 אחרים שיפוץ מגורה מאוד על ידי DNA או nucleosomes, הנוכחות של דנ&quot;א המשמעותי ו / או בפעילות ATPase הנוקלאוזום עצמאית בהכנות המטוהרת של מתחם INO80 הייתי מציעה נוכחות של זיהום סלולארי DNA, או לחלופין, זיהום ATPases אינו INO80 שלא הוסרו בהצלחה במהלך טיהור. אפשר לנקוט במספר צעדים כדי למזער את החדרת DNA לא רצוי ו / או ATPase במהלך הטיהור. 1 להגדיל) שלריכוז גובה (NaCl) בצעדים המחייבים וכביסה במהלך הטיהור. שימוש בפחות מ -200 mM NaCl במחייב ושלבים כביסה בדרך כלל מניב הכנות של מתחמי שיפוץ עם רמות מקובלות של זיהום DNA ו / או ATPases. אנחנו באופן שיגרתי לטהר מתחמי INO80 באמצעות מאגר המכיל 450 mM NaCl כדי למזער מזהמים (שתואר ב3). יש לנו בשימוש מאגרים המכילים ככל 1 M NaCl לטהר מתחמי INO80 פעילים; עם זאת, אנו מקבלים תשואה נמוכה יותר של מתחמים פעילים בתנאים אלה; 2) ירידת היחס של דגל agarose לlysate תא במהלך immunopurification; הכמות האופטימלית של FLAG-agarose צריכה להיקבע על ידי טיטרציה; 3) מלווים תלוי ATP עשויים להישאר מחויבים לחלבונים מתויג דגל במהלך immunopurification. אלה לעתים קרובות ניתן להסיר על ידי כולל 1 מ&quot;מ ATP בכביסת החיץ במהלך immunopurification; 4) יש לנו מוצלחy הוסר זיהום DNA על ידי הכללת Benzonase בריכוז של 25 יחידות / מ&quot;ל ​​במהלך דגירה של תמצית עם חרוזים FLAG-agarose. זהירות: זה חיוני כדי להפוך את Benzonase בטוח יוסר במהלך שלבי כביסה שלאחר מכן, כDNase השיורי יהיה לבזות DNA מצע או nucleosomes במהלך מבחני לפעילות INO80. הפרשנות של מבחני ATPase אלה יכולים, באופן עקרוני, להיות מסובכת על ידי העובדה כי מתחמי שיפוץ הכרומטין INO80 להכיל מספר ATPases הפוטנציאלי, כוללים ליבה כמו SNF2 ATPase Ino80, החלבונים כמו יקטינו Arp5, Arp8, Baf53a, אקטין, ו+ AAA ATPases Tip49a וTip49b. למרות נוכחותם הפיסית של ATPases מרובה, עם זאת, מחקרים קודמים הראו כי מתחמים בלבד המכילים הפעיל כקטליזאטור Ino80 יכול לתמוך דנ&quot;א או הידרוליזה ATP-מופעל הנוקלאוזום; מתחמים המכילים את טופס E653Q קטליזאטור פעיל של Ino80 ATPase אינם מגלים דנ&quot;א לגילוי או מגורה הנוקלאוזום ATPase activity בכל תנאים שנבדק 8. לפיכך, דנ&quot;א ו / או פעילות ATPase מגורה הנוקלאוזום של INO80 או subcomplexes INO80 בעיקר שנתרמו על ידי מקטע Ino80 ATPase. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/51721/51721fig1highres.jpg" /> פעילות שיפוץ הנוקלאוזום .1 INO80 איור תלוי בתחום Ino80 HSA ו / או יחידות משנה הקשורות אך אינה תלוי בNTD Ino80 ויחידות משנה מטזואניים ספציפית. מבחני שיפוץ הנוקלאוזום בוצעו עם מתחמים-immunopurified FLAG מתמציות גרעיניות מוכנות משורות תאים המבטאות FLAG גרסאות -tagged של סוג בר או יחידות משנה INO80 מוטציה. מתחמי INO80 שלמים היו מטוהרים משורות תאים המבטאות FLAG-Ies2 או FLAG-INO80E; subcomplexes INO80 היו מטוהר משורות תאים המבטאות FLAG-Ino80ΔN או FLAG-Ino80ΔNΔHSA. ריכוז יחסי (rel. קונצרט כלשהו.) של 1 מתאים ל~ 10 ננומטר מורכב INO80. <a<html> href = היעד &quot;https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51721/51721fig1highres.jpg&quot; = &quot;_blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/51721/51721fig2highres.jpg" /> איור 2 הנוקלאוזום כריכה במתחם INO80 הוא עצמאי של NTD Ino80 ויחידות משנה מטזואניים ספציפית. מבחני מחייבים הנוקלאוזום בוצעו בנוכחות של כמויות משתנות של מתחם INO80-immunopurified דגל המצוין. כריכה של INO80 או subcomplexes INO80 לmononucleosomes תוצאות בהופעה של להקות נודדות איטית &quot;העבירו סופר&quot; המקביל לmononucleosomes קשור ביציבות על ידי INO80 או subcomplexes INO80. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51721/51721fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> איור 3 &quot;src =&quot; &quot;/&gt; / קבצים / ftp_upload / 51721 / 51721fig3highres.jpg איור 3 דנ&quot;א ומבחני ATPase הנוקלאוזום תלוי. TLC (כרומטוגרפיה שכבה דקה) מבוססת מבחני ATPase בוצעו כדי למדוד את השיעור של ATP הידרוליזה על ידי INO80 subcomplexes מטוהר באמצעות FLAG-Ino80ΔN (ΔN) או FLAG-Ino80ΔNC (ΔNC) ב הנוכחות של להרוות סכומי DNA או nucleosomes. מבחני בוצעו באמצעות שני ריכוזים שונים של כל אחד מורכב (5 ננומטר ו10 ננומטר) ובמשך שלושה זמני תגובה שונים. הסכום של ATP הידרוליזה (בpmol) בתגובות מצויינים מתחת לכל פנל. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51721/51721fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 67.5 μl </td><td> H 2 O </td></tr><tr><td> 10 μl </td><td> 10x PCR חיץ תגובה (ראה חומרי רשימה) </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> 1 μl </td><td> pGEM-3Z-601 (10 ng / μl) </td></tr><tr><td> 5 μl </td><td> פריימר קדימה (10 מיקרומטר) </td></tr><tr><td> 5 μl </td><td> פריימר ההפוך (10 מיקרומטר) </td></tr><tr><td> 0.5 μl </td><td> פתרון מניות dNTP מכיל 10 מ&quot;מ כל אחד 4 dNTPs </td></tr><tr><td> 1 μl </td><td> תקי DNA פולימראז (5 יחידות / μl) </td></tr><tr><td> 10 μl </td><td> [P 32 α-] dCTP (6,000 Ci / mmol, 3.3 מיקרומטר) </td></tr></tbody></table> שולחן תערובת 1 תגובה להגברת PCR של בר radiolabeled DNA &#39;601&#39;. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 20 ננומטר </td><td> subcomplexes INO80 או INO80 </td></tr><tr><td> 2.8 ננומטר </td><td> nucleosomes (מורכב מתערובת של mononucleosomes על 601 nucleosomes קטע DNA ותא הלה שכותרת P 32) </td></tr><tr><td> 1 מ&quot;מ </td><td> ultrapure ATP </td></tr><tr><td> 20 מ&quot;מ </td><td> HEPES-NaOH (pH 7.9) </td></tr><tr><td> 50 מ&quot;מ </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 5 מ&quot;מ </td><td> MgCl 2 </td></tr><tr><td> 1 מ&quot;מ </td><td> dithiothreitol (DTT) </td></tr><tr><td> 0.1 מ&quot;מ </td><td> פלואוריד phenylmethanesulfonyl (PMSF) </td></tr><tr><td> 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> אלבומין בסרום שור (BSA) </td></tr><tr><td> 5% </td><td> גליצרול </td></tr><tr><td> 0.02% </td><td> Nonidet P-40 </td></tr><tr><td> 0.02% </td><td> טריטון X-100 </td></tr></tbody></table> .2 רכיבי לוח מבחני הנוקלאוזום ATP תלוי שיפוץ. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 32.6 מ&quot;ל </td><td> H 2 O </td></tr><tr><td> 5 מ&quot;ל </td><td> 40 acrylamide% / Bis (37.5: 1) </td></tr><tr><td> 2 מ&quot;ל </td><td> TBE 10x (900 מ&quot;מ Tris-borate, 20 mM EDTA) </td></tr><tr><td colspan="2"> מוסיף את המרכיבים הבאים מייד לפני מזיגת ג&#39;ל: </td></tr><tr><td> 0.4 מ&quot;ל </td><td> 10% persulfate אמוניום </td></tr><tr><td> 0.1 מ&quot;ל </td><td> TEMED </td></tr></tbody></table> הכנת לוח 3 של ג&#39;ל polyacrylamide המקורי עבור מבחני הנוקלאוזום שיפוץ תלוי ATP. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 10 מ&quot;מ </td><td> pH HEPES 7.9 </td></tr><tr><td> 10% </td><td> גליצרול </td></tr><tr><td> 100 מ&quot;מ </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 1.5 מ&quot;מ </td><td> MgCl 2 </td></tr><tr><td> 0.05% </td><td> TritonX-100 </td></tr><tr><td colspan="2"> הוסף רק לפני שימוש: </td></tr><tr><td> 1 מ&quot;מ </td><td> DTT </td></tr><tr><td> 200 מיקרומטר </td><td> PMSF </td></tr><tr><td> 1: 1,000 דילול </td><td> מעכבי פרוטאז Cocktail (ראה חומרי רשימה) </td></tr></tbody></table> לוח 4: חיץ EB100. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 3.9 μl </td><td> H 2 O </td></tr><tr><td> 1 μl </td><td> 10x שיפוץ חוצץ (200 HEPES מ&quot;מ-NaOH (pH 7.9), 0.2% NP-40, 0.2% טריטון X-100, 50% גליצרול, 50 מ&quot;מ MgCl 2, 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל BSA) </td></tr><tr><td> 0.1 μl </td><td> 100 מ&quot;מ ATP </td></tr><tr><td> 0.01 μl </td><td> 1 M DTT </td></tr><tr><td> 0.01 μl </td><td> 100 מ&quot;מ PMSF </td></tr><tr><td> 0.25 μl </td><td> מצע mononucleosome מחדש משלב 1.2 </td></tr></tbody></table> לוח 5: רכיבים של קוקטייל האב למבחני הנוקלאוזום שיפוץ תלוי ATP. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 0.33 μl </td><td> 400 nucleosomes ננומטר הלה </td></tr><tr><td> 0.75 μl </td><td> 100 ננומטר DNAs זרע סלמון sonicated </td></tr><tr><td> 0.01 μl </td><td> 1 M DTT </td></tr><tr><td> 0.01 μl </td><td> 100 מ&quot;מ PMSF </td></tr></tbody></table> לוח 6: הסרת קוקטייל תערובת. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 2 μl </td><td> H 2 O </td></tr><tr><td> 0.25 μl </td><td> 20x ATPase מאגר המכיל 400 מ&quot;מ טריס-HCl (pH 7.5), 200 mM NaCl, 132 מ&quot;מ MgCl 2, 16 mM EDTA, 0.3% Nonidet P-40, גליצרול 50%, 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל BSA </td></tr><tr><td> 0.1 μl </td><td> 100 מיקרומטר ATP </td></tr><tr><td> 0.005 μl </td><td> 1 M DTT </td></tr><tr><td> 0.005 μl </td><td> 100 מ&quot;מ PMSF </td></tr><tr><td> 0.1 μl </td><td> [P α- 32] ATP (3,000 Ci / mmol) </td></tr></tbody></table> &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; לוח 7 רכיבים של קוקטייל האב למבחני ATPase.

Watch this Scientific Journal Video about Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes at JoVE.com

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

מבחני ביוכימיים לניתוח פעילויות של ATP תלוי הכרומטין שיפוץ אנזימים

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

biochemical-assays-for-analyzing-activities-atp-dependent-chromatin

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K Views.  Stowers Institute for Medical Research. Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

Video: Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental factors that might result in epigenetic alterations of gene expression and other molecular pathology. Traditionally, however, expression studies in postmortem brain were confined to quantification of mRNA or protein. The limitations encountered in postmortem brain research   such as variabilities in autolysis time and tissue integrities   are also likely to impact any studies of higher order chromatin structures. However, the nucleosomal organization of genomic DNA   including DNA:core histone binding - appears to be largely preserved in representative samples provided by various brain banks. Therefore, it is possible to study the methylation pattern and other covalent modifications of the core histones at defined genomic loci in postmortem brain. Here, we present a simplified native chromatin immunoprecipitation (NChIP) protocol for frozen (never-fixed) human brain specimens. Starting with micrococcal nuclease digestion of brain homogenates, NChIP followed by qPCR can be completed within three days. The methodology presented here should be useful to elucidate epigenetic mechanisms of gene expression in normal and diseased human brain.

Until recently, expression studies on human brain were limited to quantification of RNA or protein. With the chromatin immunoprecipitation techniques described in this paper, it will be possible to map histone methylation and other epigenetic regulators of gene expression in postmortem brain.

Assay הכרומטין של רקמת מוח האדם

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved cavities within the brain that are filled with cerebrospinal fluid.  In zebrafish, after neural tube formation, the neuroepithelium undergoes a series of constrictions and folds while it fills with fluid resulting in brain ventricle formation.  In order to understand the process of ventricle formation, and the neuroepithelial shape changes that occur at the same time, we needed a way to visualize the ventricle space in comparison to the brain tissue.  However, the nature of transparent zebrafish embryos makes it difficult to differentiate the tissue from the ventricle space.  Therefore, we developed a brain ventricle injection technique where the ventricle space is filled with a fluorescent dye and imaged by brightfield and fluorescent microscopy.  The brightfield and the fluorescent images are then processed and superimposed in Photoshop.  This technique allows for visualization of the ventricle space with the fluorescent dye, in comparison to the shape of the neuroepithelium in the brightfield image.  Brain ventricle injection in zebrafish can be employed from 18 hours post fertilization through early larval stages.  We have used this technique extensively in our studies of brain ventricle formation and morphogenesis as well as in characterizing brain morphogenesis mutants (1-3).

After neural tube formation, the neuroepithelium constricts and folds while the tube fills with embryonic cerebrospinal fluid (eCSF) to form the embryonic brain ventricles. We developed this ventricle injection technique to better visualize the fluid filled space in contrast to the neuroepithelial shape in a live embryo.

החדר דג הזברה המוח Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

מבחני photobleaching (FRAP &amp; FLIP) כדי למדוד Dynamics חלבון הכרומטין בתוך החיים בתאי גזע עובריים

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension and microscopically visualize sperm accumulation around the pipette1. Sperm chemoattraction in vertebrates such as frogs, rodents and humans is more difficult to detect and requires quantitative assays. Such assays are of two major types - assays that quantitate sperm movement to a source of chemoattractant, so-called sperm accumulation assays, and assays that actually track the swimming trajectories of individual sperm.
Sperm accumulation assays are relatively rapid allowing tens or hundreds of assays to be done in a single day, thereby allowing dose response curves and time courses to be carried out relatively rapidly. These types of assays have been used extensively to characterize many well established chemoattraction systems - for example, neutrophil chemotaxis to bacterial peptides and sperm chemotaxis to follicular fluid. Sperm tracking assays can be more labor intensive but offer additional data on how chemoattractancts actually alter the swimming paths that sperm take. This type of assay is needed to demonstrate the orientation of sperm movement relative to the chemoattrractant gradient axis and to visualize characteristic turns or changes in orientation that bring the sperm closer to the egg.
Here we describe methods used for each of these two types of assays. The sperm accumulation assay utilized is called a "two-chamber" assay. Amphibian sperm are placed in a tissue culture plate insert with a polycarbonate filter floor having 12 &mu;m diameter pores. Inserts with sperm are placed into tissue culture plate wells containing buffer and a chemoatttractant carefully pipetted into the bottom well where the floor meets the wall (see Fig. 1). After incubation, the top insert containing the sperm reservoir is carefully removed, and sperm in the bottom chamber that have passed through the membrane are removed, pelleted and then counted by hemocytometer or flow cytometer.
The sperm tracking assay utilizes a Zigmond chamber originally developed for observing neutrophil chemotaxis and modified for observation of sperm by Giojalas and coworkers2,3. The chamber consists of a thick glass slide into which two vertical troughs have been machined. These are separated by a 1 mm wide observation platform. After application of a cover glass, sperm are loaded into one trough, the chemoattractant agent into the other and movement of individual sperm visualized by video microscopy. Video footage is then analyzed using software to identify two-dimensional cell movements in the x-y plane as a function of time (xyt data sets) that form the trajectory of each sperm.

Eggs and the extracellular coatings around eggs frequently release peptides, proteins and small molecules that communicate with sperm to guide them to the egg thereby promoting fertilization. Using frog sperm we describe and compare two classes of assays used to detect sperm chemoattraction &#x2013; sperm accumulation assays and sperm tracking assays.

שני סוגים של מבחני עבור Chemoattraction גילוי זרע צפרדע

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such architectures are not random and involve interactions between gene promoters and regulatory elements 13. The binding of transcription factors to specific regulatory sequences brings about a network of transcription regulation and coordination 1, 14. 
Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) was developed to identify these higher-order chromatin structures 5,6. Cells are fixed and interacting loci are captured by covalent DNA-protein cross-links. To minimize non-specific noise and reduce complexity, as well as to increase the specificity of the chromatin interaction analysis, chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used against specific protein factors to enrich chromatin fragments of interest before proximity ligation. Ligation involving half-linkers subsequently forms covalent links between pairs of DNA fragments tethered together within individual chromatin complexes. The flanking MmeI restriction enzyme sites in the half-linkers allow extraction of paired end tag-linker-tag constructs (PETs) upon MmeI digestion. As the half-linkers are biotinylated, these PET constructs are purified using streptavidin-magnetic beads. The purified PETs are ligated with next-generation sequencing adaptors and a catalog of interacting fragments is generated via next-generation sequencers such as the Illumina Genome Analyzer. Mapping and bioinformatics analysis is then performed to identify ChIP-enriched binding sites and ChIP-enriched chromatin interactions 8. 
We have produced a video to demonstrate critical aspects of the ChIA-PET protocol, especially the preparation of ChIP as the quality of ChIP plays a major role in the outcome of a ChIA-PET library. As the protocols are very long, only the critical steps are shown in the video.

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) is a method for de novo detection of chromatin interactions, for better understanding of transcriptional control.

הכרומטין ניתוח אינטראקציה עם מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) עבור מיפוי אינטראקציות הכרומטין הבנת תקנה תמלול

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of molecular events and therapeutic strategies as well as for evaluating the physiological mechanisms of some pathologies1. 
There are relatively few publications related to adult zebrafish physiology of organs and systems2, which may lead researchers to infer that the basic techniques needed to allow the exploration of zebrafish systems are lacking3. Hematologic biochemical values of zebrafish were first reported in 2003 by Murtha and colleagues4 who employed a blood collection technique first described by Jagadeeswaran and colleagues in 1999. Briefly, blood was collected via a micropipette tip through a lateral incision, approximately 0.3 cm in length, in the region of the dorsal aorta5. Because of the minute dimensions involved, this is a high-precision technique requiring a highly skilled practitioner. The same technique was used by the same group in another publication in that same year6. In 2010, Eames and colleagues assessed whole blood glucose levels in zebrafish7. They gained access to the blood by performing decapitations with scissors and then inserting a heparinized microcapillary collection tube into the pectoral articulation. They mention difficulties with hemolysis that were solved with an appropriate storage temperature based on the work Kilpatrick et al.8. When attempting to use Jagadeeswaran's technique in our laboratory, we found that it was difficult to make the incision in precisely the right place as not to allow a significant amount of blood to be lost before collection could be started. 
Recently, Gupta et al.9 described how to dissect adult zebrafish organs, Kinkle et al.10 described how to perform intraperitoneal injections, and Pugach et al.11 described how to perform retro-orbital injections. However, more work is needed to more fully explore basic techniques for research in zebrafish.
The small size of zebrafish presents challenges for researchers using it as an experimental model. Furthermore, given this smallness of scale, it is important that simple techniques are developed to enable researchers to explore the advantages of the zebrafish model.

This paper presents a technique for collection of blood from the dorsal aorta of Zebrafish. It also provides instructions for obtaining serum for use in biochemical analyses, such as tests for determining cholesterol and triglyceride levels.

הדם אוסף של ניתוח ביוכימי דג הזברה למבוגרים בלבד

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune diseases and cancer2. Our aim is to investigate the antigens recognized by human T cells in the autoimmune disease type 1 diabetes 1,3,4,5. To analyze human T-cell responses against tissue where the antigens recognized by T cells are not identified we developed a method to extract protein antigens from human tissue in a format that is compatible with functional assays 6. Previously, T-cell responses to unpurified tissue extracts could not be measured because the extraction methods yield a lysate that contained detergents that were toxic to human peripheral blood mononuclear cells. Here we describe a protocol for extracting proteins from human tissues in a format that is not toxic to human T cells. The tissue is homogenized in a mixture of butan-1-ol, acetonitrile and water (BAW). The protein concentration in the tissue extract is measured and a known mass of protein is aliquoted into tubes. After extraction, the organic solvents are removed by lyophilization. Lyophilized tissue extracts can be stored until required. For use in assays of immune function, a suspension of immune cells, in appropriate culture media, can be added directly to the lyophilized extract. Cytokine production and proliferation by PBMC, in response to extracts prepared using this method, were readily measured. Hence, our method allows the rapid preparation of human tissue lysates that can be used as a source of antigens in the analysis of T-cell responses. We suggest that this method will facilitate the analysis of adaptive immune responses to tissues in transplantation, cancer and autoimmunity.

A simple protocol for preparing extracts of human tissue to be used as a source of antigens in functional T-cell assays is described. This method allows T-cell responses to tissue-derived antigens to be measured in vitro.

הפקת אנטיגנים רקמות למבחנים פונקציונליים

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular metabolism. Many methods to detect glycogen already exist but only a few are quantitative. We describe here a method using the Abcam Glycogen assay kit, which is based on specific degradation of glycogen to glucose by glucoamylase. Glucose is then specifically oxidized to a product that reacts with the OxiRed probe to produce fluorescence. Titration is accurate, sensitive and can be achieved on cell extracts or tissue sections. However, in contrast to other techniques, it does not give information about the distribution of glycogen in the cell. As an example of this technique, we describe here the titration of glycogen in two cell lines, Chinese hamster lung fibroblast CCL39 and human colon carcinoma LS174, incubated in normoxia (21% O2) versus hypoxia (1% O2). We hypothesized that hypoxia is a signal that prepares cells to synthesize and store glycogen in order to survive1.

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

We describe here an accurate, reproducible and convenient biochemical method for titration of glycogen in vitro. This technique uses the Abcam Glycogen assay kit and is based on successive hydrolysis of glycogen to glucose and glucose titration by fluorescence.

כותרות ביוכימית של גליקוגן<em&gt; במבחנה</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

Viability Assays for Cells in Culture

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized viability assays are expensive in terms of equipment but can be faster and more objective than manual cell counts. The present report describes the use of three such viability assays. Two of these assays are infrared and one is luminescent. Both infrared assays rely on a 16&#160;bit Odyssey Imager. One infrared assay uses the DRAQ5 stain for nuclei combined with the Sapphire stain for cytosol and is visualized in the 700 nm channel. The other infrared assay, an In-Cell Western, uses antibodies against cytoskeletal proteins (&#945;-tubulin or microtubule associated protein 2) and labels them in the 800 nm channel. The third viability assay is a commonly used luminescent assay for ATP, but we use a quarter of the recommended volume to save on cost. These measurements are all linear and correlate with the number of cells plated, but vary in sensitivity. All three assays circumvent time-consuming microscopy and sample the entire well, thereby reducing sampling error. Finally, all of the assays can easily be completed within one day of the end of the experiment, allowing greater numbers of experiments to be performed within short timeframes. However, they all rely on the assumption that cell numbers remain in proportion to signal strength after treatments, an assumption that is sometimes not met, especially for cellular ATP. Furthermore, if cells increase or decrease in size after treatment, this might affect signal strength without affecting cell number. We conclude that all viability assays, including manual counts, suffer from a number of caveats, but that computerized viability assays are well worth the initial investment. Using all three assays together yields a comprehensive view of cellular structure and function.

Therapeutic compounds are often first examined in vitro with viability assays. Blind cell counts by a human observer can be highly sensitive to small changes in cell number but do not assess function. Computerized viability assays, as described here, can assess both structure and function in an objective manner.

מבחני כדאיות לתאים בתרבית

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...