המחברים מבקשים להאריך הרבה תודות לבני זוג. פפ Planas וחואן קסטיו למומחיותם המקצועית בפיתוח והיישום של פרוטוקול תרבות זו לדגים קטנים ודו חיים. תודה גם לאינספור אנשים שיש להם ללא לאות בסיוע עם הנתיחה והניתוק של רקמת שריר מדגים רבים (שניהם במין ומספר), ובם מתיו טעינה, Delci כריסטנסן, זכריה פאולר, ברוק פרנזן, נתן Froehlich, קירה מרשל, בן מאיר, איתן Remily, וSinibaldo רומרו. עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת אלבמה בבירמינגהם מחלקת כספים הזנק ביולוגיה, המרכז לפרוטאז NIH מענק המחקר # 2P20 RR015566, NIH NIAMS גרנט # R03AR055350, וNDSU Advance קדימה NSF גרנט # HRD-0,811,239 לPRB. תמיכה הייתה גם מסופקת על ידי P30DK056336 # הפרס UAB התזונה השמנת יתר מרכז המחקר, NIH NIDDK. תכניו הם באחריות בלעדית של הכותבים ואינם בהכרחמייצג את הדעות הרשמיות של NIH.

אין מה לחשוף.

תכנית myogenic, במבין מינים שנבדקו, ניתן ללמוד אותם בקלות באמצעות מערכת במבחנה. ואכן, על בידוד, תאים מבשר myogenic (MPCs) בדגים או תאי myosatellite (MSCs) ביונקים בקלות להיכנס לתהליך המוסדר הזה מאוד מעורב ההתפשטות, נסיגת מחזור התא, ובידול מסוף של myoblasts וההיתוך של myoblasts אלה לmyotubes המתהווה. המחסור הכללי של זנים מהונדסים גנטי כתב של מיני piscine (עם החריגה האפשרית של דג הזברה 67 ופורל קשת 69) מגביל בעבודת vivo של הפעלת MPC / MSC, שגשוג, והתמיינות, ולכן מבחנה המערכת שבהוצגה כאן היא פלטפורמה אטרקטיבית ללימודים במינים דגים. התרבות המוצלחת של MPC / MSCs, לא משנה המין, תלויה מאוד ב) תשומת לב קפדנית לעקרות; ב) ניתוק מכאני יסודי של t שרירי שלדנושא; וג) אופטימיזציה של עיכול אנזימטי. במהלך השלבים הראשוניים של בידוד רקמת שריר, יש לנקוט בזהירות רבה כדי להבטיח כי הכמות הנחוצה של רקמה הוא נכרת ללא זיהום. זה הוא בעל חשיבות עליונה, כי דגים (או כל בעלי חיים מנוצלים, לצורך העניין) הם חיטוי כראוי ב70% אתנול ובמשך זמן מספיק. בידיים שלנו, 30 שניות עובדת הכי טובות; תקופות קצרות של זמן עלולות לגרום לזיהום ועוד, אובדן שלמות רקמות וכדאיויות תא. אתנול יכול לשמש כמקבע, ולכן יש להקפיד שלא ליבש את הדג לפני הנתיחה. נתיחה ניתן לעשות זאת מחוץ למכסת מנוע בתרבית תא זרימה למינרית; עם זאת, אנו ממליצים שתהליך זה ייעשה תוך מכסה המנוע כדי למזער את זיהום חיידקים או פטרייתי פוטנציאלית. בעוד שהניתוק המכני שתואר לעיל אולי נראה גולמי ו / או מייגע בהתחלה, זה הוא קריטי להליך הבידוד. שני להבי אזמל גדולים, עבר משךאחד את השני בתנועת החלקה (כפי שמוצגת בפרוטוקול וידאו), מייצר את התוצאות הטובות ביותר. סיים פעם אחת, את העקביות של homogenate צריכה להיות זה של תרחיף או פירה, ולאסוף בקלות עם טפטפת רחב נשא סרולוגיות (כלומר 25 מיליליטר). כל שעליך לעשות, טוב יותר את הניתוק המכני, גבוה יותר MPC תשואת MSC / וטובה יותר את התרבות וכתוצאה מכך. דיסוציאציה עניים יפריע עיכול אנזימטי ולהקטין תשואת תא. למרות שזה עשוי להיות מפתה לחשוב, השימוש בhomogenizers רקמות חשמלי באופן דרמטי מוריד את כדאיויות תא למרות הנוחות הברורה שלה, לפחות עם MPCs piscine. כמו בכל הפרוטוקולים, אופטימיזציה של ההליך שפורט לעיל היא לעתים קרובות יש צורך. זה הוכיח עצמו אמיתי בעבודה שלנו עם כמה מיני danionin. תוצאות מהמעבדה שלנו מצביעות על כך שdanionins הקטן יותר (לדוגמא: דג הזברה) יניב יותר MPCs לגרם של שרירי שלד מאשר מינים גדולים יותר (למשל במערכת העיכולDanio נמלה או המשופם). עם זאת, זה יתממש רק אם ריכוז גבוה יותר של collagenase (0.3%) נמצא בשימוש עם רקמות ממינים קטנים יותר. בידיים שלנו, ריכוז של .0.2% מתאים למיני salmonid (למשל פורל קשת;, פורל הרצחני [Oncorhynchusclarki] סלמון Chinook [Oncorhynchustschawytscha]), danionins הגדול יותר, האמביסטומה איבר (Ambystomamexicanum) וזנב, ואפילו עכבר שרירי שלד. כמו כן, יש להקפיד לבחור את collagenase המתאים. מניסיוננו, collagenase הסוג IV משמר כדאיות תא הרבה יותר טוב מאשר collagenases המומלץ לסיבי רקמות כגון עצמות ושרירים (סוג כלומר collagenase השני) 70. בעוד עיכול עשוי להיות שלם יותר בתקופת זמן קצרה יותר, יושרת קולט קרום תא היא סביר נפרצה על ידי פעילות מוגברת tryptic בהכנות אלה. עם כל הכבוד לטריפסין, המעבדה שלנו תמיד מנוצל פור הכנת טריפסין הגס יותרified מלבלב חזירי, ולא את ההכנות &#39;טהורה&#39; זמינות. בפעילויות התרבות שלנו עם מינים שונים, יש לנו לב השפעה חיובית קטנה של ריכוזי טריפסין שונים. טחינה דקה היא קריטית לפרוטוקול זה. זה גם מנתק את המטריצה ​​של סיבי שריר שלד ומגדיל את פני שטח לעיכול tryptic כל תוך הפגיעה בשלמות המבנית של myofibers באופן ידני. בעת ביצוע triturations, ברציפות באמצעות טפטפות שעמם קטנה יותר וקנולה להרבה יותר קל מאשר באמצעות הצינורית ומזרק מייד. שתמשיך ישירות לtriturations עם צינורית ומזרק יכול לגרום קנולה פקוקות ו / או לחץ מוגזם מוחל על תאים. החלת עיכול tryptic בלי טחינה דקה נאותה יהיה להפחית באופן דרמטי תשואות תא. ברגע שבודד, תהליך התרבות הוא פשוט למדי. רוב הפרסומים עד כה מנוצלים שנינות פרוטוקולתקשורת h אחד עבור שניהם ריבוי והתמיינות 33,71-75, כוללים שלנו; עם זאת, יותר מאמרים האחרונים שנכתבו על ידי כמה חוקרים צרפתים תארו פרוטוקול שתי תקשורת, עם תקשורת מבוססת נפרדת ותוכן בסרום לריבוי והתמיינות 33. פרוטוקול &#39;חדש&#39; זה מחקה באופן הדוק יותר אלה המשמשים בתרבות של MSCs וmyoblastsand העכבריים מופיע כדי לשפר את ההתפשטות של myoblasts השלב מוקדם 33 ועשויים להיות מתאים יותר כדי לשלוט בהפצה ו / או התמיינות של תאים. עם זאת, ללא אפיון מקיף של ביטוי גנים, קשה להגיע למסקנה האם תקשורת &quot;התפשטות&quot; כאלה גם חוסכת למדינה יותר &quot;כמו היצמדות למנגנון-&#39;מ עושה את המתודולוגיה מדיה אחד המסורתית. פרסומים קודמים המתארים ביטוי גנים, בין אם בתמליל או ברמת חלבון, דיווחו על שימוש בפרוטוקול תקשורת אחד המסורתי 3. לחלופין, תקשורת יחידה (DMEM מתואר כאן) ניתן להשלים עם ריכוזים שונים של סרום שור העובר (FBS): 10% עבור הפצה ו -2% לבידול. בעוד חוקרי העסקת מערכות תרבית תאים של יונקים ניתן הסתגלו לשימוש באטמוספרות פחמן דו חמצני לגידול של תאים אלה, את ההבדלים המהותיים בין שיחת חילוף גזים יבשתית וימית לגישה שונה, כאשר culturing piscine או תאי urodele-מרותק מים, כולל MPCs. מדיה המפורטים כאן נאגרה עם נגזרות piperazine, תרכובת אורגנית [HEPES: 4 - חומצת piperazine-1-ethanesulfonic (2-Hydroxyethyl)] zwitterionic וסודיום ביקרבונט (NaHCO 3). לפיכך, חממה עם הזרקת גז אין צורך או חובה לתרבות של תאים אלה. יותר מכך, חממות כזה צריכה להחזיק את היכולת לקרר ולא חום, כמו הטמפרטורות הדרושות לpiscine התרבות וMPCs urodele נעים בין 18-26 ° C. יתר על כן, MPCs salmonid יכול להיות גultured בטמפרטורות נמוכות יותר במידת צורך, המדגיש את הצורך בחממת קירור נוסף. בנוסף, מצאנו (כמו שיש לי חוקרים אחרים, כפי שנמסר בעבר) האיטום של צלחות תרבות הוא הכרחי כדי לשמר את הכדאיות סלולרית. פשוט עוטף את הממשק בין המכסה התרבות והצלחת עם קלטת מעבדה סטנדרטית הוא מספיק כדי להגשים מטרה זו. בעוד passaging של שתי MPCs / MSCs / myoblasts העיקרית הוא נפוץ בתרבית תאים של יונקים, זה לא נראה אפשרי עם תאי piscine, לפחות לפני שלב Mb המאוחר (סביב יום 6 של תרבות). לכן, המספר המתאים של תאים מספיקים כדי לתמוך בריבוי ולהגיע למטרות של הניסוי חייב להיות זרע בייזום של התרבות. יתר על כן, אם פחות מהצפוי תשואות תא מתקבלות, לא ניתן להפיץ תאים ולאחר מכן replate הצאצאים מאוחר יותר. יש לנו לייחס את המאפיין הזה להסתמכות המוגברת על extracelמטריקס lular (ECM) של MPC / myoblasts piscine. לחלופין, אפשר כי מדובר בחפץ של מצע laminin ובכך נוסף אמפירי קביעת רכיבי ECM הכרחיים להתפשטות MPC piscine / Mb ובידול הוא מוצדק. אנחנו לציין, עם זאת, שכמה ממשתפי הפעולה שלנו הוסרו בהצלחה myoblasts בשלב מאוחר (~ יום 6 של תרבות) מתשתית התרבות וreplated תאים אלה (JM Froehlich ויחסי הציבור Biga, תקשורת אישית). שימוש בפרוטוקול זה או דומה לו, ניסויים מעורבים RT-PCR 3,71-74,76-78, כתם מערבי 32,79-81, immunocytochemistry 32,33, מבחני התפשטות 32,33,59, transfection גן 15, morphometric ניתוח 78, סינון הרעלים 82, וimmunoprecipitation הכרומטין (שבב; JM Froehlich ויחסי הציבור Biga, תוצאות לא פורסמו) כבר נעשו. עם זאת, תיאורים נוספים של נוסף בvitפרוטוקולי ro, כלומר אלה הקשורים passaging והתפשטות משובט, יש צורך מאוד. ואכן, המעבדה רוג&#39;רס 15 עשתה התקדמות משמעותית בתרבות של MPCs / myoblasts piscine על ידי אופטימיזציה של פרוטוקול לגרימת transfection של myoblasts דג הטרוטה. המבוסס על מתודולוגיה זו, חקירות נוספות מעורבים RNAi או ביטוי יתר של מטרות שרירים ספציפיים לשלד, במיוחד אלה הניחו להיות מעורבים עם מסלולי צמיחה לכל החיים של דגי חוליות, הם לא רק אפשריות, אלא עשויים להוביל להתקדמות משמעותית בחקלאות הימית ובשדות ביו של מדע.

הבנה ניכרת של myogenesis יונקים הושגה באמצעות המחזר של תהליך זה בשתי תרבויות וההיצמדות למנגנון עכבר עיקרי (מאסכאלאס) ושורת תאי שמקורם בעכבר היטב תאר, C2C12 5. החל משנת 1950s 6, תרבויות אלה הביאו להתקדמות רבה בהבנה של תכנית murinemyogenic, ובהרחבה, myogenesis בחוליות אחרות. בנוסף, טכניקות myofiber explant תא בודד הגבירו את ההבנה של יחסי גומלין בין תאי לווין וmyofibers סביב 7-9. בתרביות תאים הן אטרקטיביות במיוחד לחקירות של myogenesis בשל הזמן הקצר ממבשרת לתא מובחן 10, קלות היחסית של transfection לRNAi 14,17,18 התרחבות 11-14, 15,16 וביטוי יתר מהונדס לימודים, במבחנה ואחרי השתלת in vivo 18-20, ואפילו compאריסון לתאי myogenic מבשר וסוכני הוויסות שלהם על פני מיני 21,22. בעוד הבדלים בשל הסביבה המלאכותית של מערכת התרבות תוארו 5,23, במבחנה מערכות אלה הוכיחו להיות הכרחיים לנתיחה של התכנית המורכבת המסדירה את הקמתה של multinucleated, myofibersfrom הבדיל סופני mononucleated תאי שגשוג המכונים myosatellite תאים (MSCs) בקרב היונקים. מחוץ לכיתת היונקים, לעומת זאת, השימור ו / או הסטייה של מנגנוני השליטה myogenesis הם הבינו היטב, במידה רבה בשל הקושי בתאי culturing myogenic מבשר (MPCs) וmyoblasts ממינים שונים. אכן, תרבויות והיצמדות למנגנון עיקריות שרק תוארו בשלוש ציפורים 24-26, זוחל אחד 27, כמה דו חיים 28-30, וכמה דגים 1,3,4,31-33. שורות תאי myogenic רציפים מvertebrates האחר מאשר המכרסמים 34-36 הם אפילו יותר נדירים, עם הקו רק שאינו יונקים myogenic התא שנגזר משליו יפני (japonica Cortunix), QM7 37. למרות ניסיונות רבים בהנצחה, שורת תאי myogenic חוליות נותרת חמקמקה ופרוטוקול עבור transfection יעיל של תאים אלה יצא לאור השנה 15 בלבד. לפיכך, פרוטוקולים ברורים ומותאמים היטב לculturing MPCs וmyoblasts עיקריים ממגוון רחב של בעלי חוליות יש צורך מאוד לא רק להרחיב עוד יותר את הידע של האבולוציה של תכנית myogenic שלנו, אבל כדי להעסיק את כוחה של פיזיולוגיה השוואתית לבצע פריצות דרך ב לטיפול במחלות אנושיות שלד שרירים והפרעות. בעוד שהספרות מכילה דיווחים רבים של בידוד MPC / היצמדות למנגנון 38-49, מקובל עבור סופרים לתאר את הפרוטוקולים לבידודים כגון בקצרה, לעתים קרובות לא שלמים, פורמטים. יתר על כן, הפרוטוקולים המאלף ביותר ריפוrted פותחו עבור עכברי 50-53, וחלק מאלה מסתמך על בחירת נוגדן 54,55 או transgenes הקרינה 56,57, מה שהופך את הפרוטוקולים הללו לבלתי שמישות או מינים שאינם מכרסמים מעשיים כמוסים מנוצלים על ידי ביולוגים שריר. עם מעט ידוע על piscine, דו חיים, הזוחלים וmyogenesis, פרוטוקול מפורט ויסודי, שתוארה עם הדרכה קולית וויזואלית וביעילות הפגינה במינים שאינם קרובים, יהיה מועיל ביותר בתחום. תואר לראשונה על ידי פאוול ועמיתיו בשנת 1989 58, הפרוטוקול הבא פותח בתחילה כדי לבודד MPCs וmyoblasts מדגי salmonid (כלומר, פורל קשת, Oncorhynchus mykiss, וסלמון האטלנטי, סאלאר Salmo) וחלק cyprinids גדול יותר (כלומר, דג זהב, Carassiusauratusauratus) . ב2000, Fauconneau וPaboeuf מותאם תרבות והיצמדות למנגנון עיקרי לפורל קשת 59, ואמא minoroptimizationsדה שהפרוטוקול לניצול בכמה דגיגים קטנים יותר של clade Danioninae (דג הזברה, rerio Danio, וDanio הענק, Devario aequipinnatus) 32 בשל כלים גנטיים הרבים הזמינים לעבודת דג הזברה ובכך קרובי משפחתה הקרובים. דגי חוליות הם אורגניזמים אטרקטיביים למחקר בשל אסטרטגיית הצמיחה מסתעפת (לפחות ברוב המינים). salmonids הגדול, כמו רוב הדגים, גדל אבד את הכיוון, עם פוטנציאל צמיחה בלתי מוגבל על ידי אסימפטוטה במועד הפירעון, גם בגיל המבוגר 60-62. שלא כמו דג הזברה, danionins הגדול כגון Danio הענק 63 ופוטנציאל צמיחת תצוגת Danio משופם טיפוסי של דגי חוליות, מה שהופך את צירופם הישיר פלטפורמה אידיאלית להבנה אם בחירת גורל תא MPC משחקת תפקיד בהיפרפלזיה שרירי שלד לעומת היפרטרופיה. כמו כן, אנו מראים כי פרוטוקול זה יכול לשמש גם עם עכברים וaxolotls, עם תשואת תא גבוהה יחסית וviabמדדי ility. סלמנדרות Urodele, כגון האמביסטומה המקסיקנית (Ambystomamexicanum), להחזיק את היכולת יוצאת דופן כדי לחדש רקמות, כוללים גפיים וזנבות 64-66 כולו. מאפיין זה הופך את הדגמים מעניינים דו חיים אלה של בזבוז שריר שלד ואת הזדקנות. באמצעות הפרוטוקול המתואר להלן, בגישה דומה יכולה להתבצע כפי שנעשה במינים דגים רבים, מתן הקשר השוואתי רחב עוד יותר ללימודים כאלה. ביולוגים באמת השוואתיים כפי שרבים מעריכים, ההתקדמות המשמעותית ביותר בביולוגיה בסיסית ויו translational יכולה להתבצע כאשר הנתונים מנותחים בתוך הספקטרום הרחב ביותר (כאן, כל שושלת החוליות).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="743">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. Detailed Reagent Information</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42" style="height:43px;width:205px;">Reagent</td>
			<td style="width:217px;">Company (Preferred v. Alternate)</td>
			<td style="width:160px;">Catalog Number (Preferred v. Alternate)</td>
			<td style="width:161px;">Quantity per Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">&#947;-irradiated poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MP Biomedicals)</td>
			<td>P5899 (ICN19454405)</td>
			<td>5 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">DMEM (high glucose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (cellgro)</td>
			<td>MT-50-003-PB (D7777)</td>
			<td>2 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Laminin</td>
			<td>BD Biosciences (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>CB-40232 (L2020)</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="41" style="height:41px;width:205px;">Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BP328-500 (S5761)</td>
			<td>1.51 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">HEPES (C8H18N2O4S)</td>
			<td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BP310-1 (H6147)</td>
			<td>9.53 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Antibiotic/Antimycotic</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SV3007901 (A5955)</td>
			<td>17-20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Lonza (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BW17-519Z (G1397)</td>
			<td>2-3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Donor Equine Sera</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SH3007403 (H1270)</td>
			<td>75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Fetal Bovine Sera</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SH3007103 (F2442)</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Collagenase (Type IV)</td>
			<td>Worthington (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>LS004189 (C9891)</td>
			<td>0.44 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Trypsin (from Pancreas)</td>
			<td>MP Biomedicals (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>ICN15357125 (T5266)</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. Consumables, Tools and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42" style="height:43px;width:239px;">Consumable</td>
			<td style="width:204px;">Tools</td>
			<td style="width:199px;">Equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;">Cell Culture Plates</td>
			<td>Forceps (Coarse)</td>
			<td>Serological Pipettor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Sterile 50 mL Conical Tubes</td>
			<td style="width:204px;">Forceps (Fine)</td>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Laboratory Tape</td>
			<td style="width:204px;">Scalpel Handles</td>
			<td>Chilling Incubator (Echotherm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">0.2 &#956;m Vacuum Sterilization Systems</td>
			<td style="width:204px;">Scalpel Blades (#10, #11)</td>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Water-repellant Autoclave Paper</td>
			<td style="width:204px;">Surgical Scissors</td>
			<td>Vacuum Manifold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Serological Pipettes</td>
			<td>Glass Petri Dishes</td>
			<td>Microosmolality Meter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;"></td>
			<td>12-16 G Cannulas with Luer Locks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:167px;">Plate Size</td>
			<td style="width:192px;">cm^2 per Well</td>
			<td style="width:132px;">Poly-L-lysine*</td>
			<td style="width:145px;">Laminin**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">6 well</td>
			<td>9.5</td>
			<td>1.6 mL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">24 well</td>
			<td>1.9</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">48 well</td>
			<td>0.95</td>
			<td>0.16</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">96 well</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.06</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">*0.1 mg/mL concentration</td>
			<td colspan="2">** 0.020 mg/mL concentration</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:163px;">Reagent</td>
			<td style="width:155px;">Isolation</td>
			<td style="width:127px;">Wash</td>
			<td style="width:127px;">Dissociation</td>
			<td>Complete</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">Base Medium</td>
			<td>419.25 mL</td>
			<td>395.40 mL</td>
			<td>297.00 mL</td>
			<td>178.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">PSF*</td>
			<td>5.00 mL</td>
			<td>4.00 mL</td>
			<td>3.00 mL</td>
			<td>2.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Gentamicin Sulfate**</td>
			<td>0.75 mL</td>
			<td>0.60 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Donor Equine Serum</td>
			<td>75.00 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Fetal Bovine Serum***</td>
			<td style="width:155px;">-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>20.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4" height="19" style="height:19px;width:660px;">* PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:75px;">Plate Size</td>
			<td style="width:103px;">cm^2 per Well</td>
			<td style="width:145px;">Dilution</td>
			<td style="width:111px;">Plating Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">6 well</td>
			<td>9.5</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">24 well</td>
			<td>1.9</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>250 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">48 well</td>
			<td>0.95</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>150 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">96 well</td>
			<td>0.32</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>50-100 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 6. Average number of cells per g tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="24" style="height:24px;width:201px;">Species</td>
			<td colspan="2" style="width:273px;">Average # cells/g tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Danio rerio</td>
			<td colspan="2">6,400,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Danio dangila</td>
			<td colspan="2">1,783,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Devario aequipinnatus</td>
			<td colspan="2">1,797,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Oncorhynchus mykiss</td>
			<td colspan="2">66,800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 7. Recommended Incubation Temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="24" style="height:24px;width:201px;">Species</td>
			<td colspan="2" style="width:273px;">Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Danio/ Devario spp.</td>
			<td colspan="2">26 - 28 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Oncorhynchus/Salmo spp.</td>
			<td colspan="2">10* - 18 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Ambystoma mexicanum</td>
			<td colspan="2">18&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3" height="20" style="height:20px;">* Lower temperatures support lower proliferation rates.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary myogenic precursor cell/myoblast cultures from basal vertebrate lineages

בשל הקושי המובנה והזמן כרוך בלימוד תכנית myogenic in vivo, מערכות התרבות עיקריות נובעות מתאי גזע בוגרים תושב שרירי שלד, התאים המבשר myogenic (MPCs), הוכיחו הכרחיות להבנה של התפתחות שרירי שלד שלנו ושל יונקים צמיחה. במיוחד בקרב המינים הבסיסיים של Vertebrata, עם זאת, הנתונים הם מוגבלים המתאר את המנגנונים המולקולריים שליטה החידוש העצמי, שגשוג, והתמיינות של MPCs. עניין מיוחד הם מנגנונים אפשריים העומדים בבסיס היכולת של בעלי חוליות הבזליים לעבור היפרפלזיה ניכרת postlarval שלד myofiber (חוליות דגים כלומר) והתחדשות מלאה הבאות אובדן סרח (כלומר urodele דו חיים). בנוסף, השימוש בmyoblasts התרבותית יכול לסייע בהבנה של התחדשות והשחזור של תכנית myogenic וההבדלים ביניהם. אללצורך זה, אנו מתארים בפירוט פרוטוקול חזק ויעיל (ווריאציות בו) לבידוד ושמירה על MPCs וצאצאיהם, myoblasts וmyotubes לא בוגר, בתרבית תאים כפלטפורמה להבנת האבולוציה של תכנית myogenic, החל יותר בעלי חוליות בסיס. וניצול של מעמדו אורגניזם המודל של דג הזברה (Danio rerio), אנו מדווחים על היישום של פרוטוקול זה לדגים קטנים של clade cyprinid Danioninae. במקביל, פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל כדי להבין גישה השוואתית רחבה יותר על ידי בידוד MPCs מהאמביסטומה המקסיקנית (Ambystomamexicanum) ואפילו המכרסמים מעבדה. פרוטוקול זה הוא כיום בשימוש נרחב בלימוד myogenesis בכמה מיני דגים, ביניהם פורל קשת, דגי סלמון והדניס 1-4.

עשרים וארבע שעות שלאחר זריעה, תאים מבשר myogenic (MPCs) צריכה להיות גלויות מחובר לתשתית laminin (ראה איורים 1 א ו1D). בעקבות זריעה, תאים (MPCs) לאמץ צורה כמו ציר, מעידה על סוג תא זה (איור 1) והם MyoD1 (איור 2) +. במיני Danio, MPCs להיראות קומפקטי עם תהליכים דו קוטביים קטנים יותר מאשר לעשות MPCs ממינים Oncorhynchus וSalmo. עם זאת, במהלך ארבעה ימים של תרבות, MPCs מכל מיני piscine בדק לאמץ מורפולוגיות דומות ונראים בבירור כמו myoblasts (1b דמויות ו1E). תקשורת מלאה יש להסיר, וMPCs יש לשטוף פעמיים עם מדיום שטיפה. Myofibroblasts יכול לזהם תרבויות myogenic וניתן להבחין בקלות מMPCs / myoblasts ידי המורפולוגיה כמו הכוכבים שלהם (לעומת צורת הכישור של ההיצמדות למנגנון). שטיפת הצלחות מאוד improves הסרת fibroblasts כזה. במינים שתוארו כאן (ראה לוח 7), שינויים בתקשורת יומיים לייצר את התוצאות הטובות ביותר. MPCs וצאצאים (myoblasts וmyotubes המתהווה) יש לשטוף פעם או פעמיים לפני התוספת של מדיה מלאה טרי. לחלופין, ניתן להפחית שינויי תקשורת בכל יום אחר לאחר שהתאים הגיעו לשלב הסופי וההיצמדות למנגנון (כ 4 יום של תרבות). Myotubes צריך להקים בתוך 2-3 ימים (1c דמויות ו1F) ולהיות myogenin (איור 2) +, במיוחד כאשר בתרבית בינונית בידול (ראה להלן). בעוד תקופות של שבועות עד חודשים דווחו בכמה מיני יונקים, MPCs piscine וmyoblasts אינו מופיעים לסבול כגון תקופות של זמן. תאים להתרבות בשישה הימים הראשונים של התרבות (איור 3), עם בידול שלאחר מכן בין ימים 7 ו 9-11 של התרבות. לאחר מכן, תאי הזדקנות או<html> poptose. טבע myogenic של MPCs וצאצאיהם מבודדים באמצעות פרוטוקול זה נקבע 3,32,33 מבוסס על ביטוי גנים. שלא כמו מערכות תרבות של יונקים, ריבוי MPCs והצאצאים והיצמדות למנגנון הוא יחסית נמוך בימים הראשונים של התרבות (בהשוואה למערכות ניצול myoblasts העכברית ראשונית או C2C12), עם גידול מהיר שזוהה כתאי טופס myotubes בשלה בימים 6-9 בתרבות במינים Danio 32. דיווחים מפורל הקשת ניצלו את מדיום התמיינות (נפוצים בתרבויות והיצמדות למנגנון של יונקים, אבל לא חובה במערכות piscine) ומצביעים על כך שמדדי ההתפשטות להקטין כצפוי עם myotube היווצרות 33. בידיים שלנו, myotubes התוצאה יכול להישאר בתרבות של עד 9-11 ימים (מיני Danio) ו11-13 ימים (מיני Oncorhynchus) לפני הזדקנות או אפופטוזיס סלולריים מתרחש. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing</html style=";text-align:right;direction:rtl">= &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> מגיב </td><td> חברה (מועדף נ חלופי) </td><td> מספר קטלוגי (מועדף נ חלופי) </td><td> כמות לתרבות </td></tr><tr><td> פולי-L-ליזין מוקרן-γ </td><td> סיגמא אולדריץ (Biomedicals מגה פיקסל) </td><td> P5899 (ICN19454405) </td><td> 5 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> DMEM (גלוקוז גבוהה) </td><td> סיגמא אולדריץ (Cellgro) </td><td> MT-50-003-PB (D7777) </td><td> 2 L </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> BD Biosciences (סיגמא אולדריץ) </td><td> CB-40,232 (L2020) </td><td> 1 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> סודיום ביקרבונט (NaHCO 3) </td><td> פישר סיינטיפיק (סיגמא אולדריץ) </td><td> BP328-500 (S5761) </td><td> 1.51 גרם </td></tr><tr><td> HEPES (C 8 H 18 N 2 O 4 S) </td><td> פישר סיינטיפיק (סיגמא אולדריץ) </td><td> BP310-1 (H6147) </td><td> 9.53 גרם </td></tr><tr><td> אנטיביוטיקה / antimycotic </td><td> Thermo Scientific (Sigma אולדריץ) </td><td> SV3007901 (A5955) </td><td> 17-20 מיליליטר </td></tr><tr><td> גנטמיצין סולפט </td><td> Lonza (סיגמא אולדריץ) </td><td> BW17-519Z (G1397) </td><td> 2-3 מיליליטר </td></tr><tr><td> תורם סוסים סרה </td><td> Thermo Scientific (סיגמא אולדריץ) </td><td> SH3007403 (H1270) </td><td> 75 מיליליטר </td></tr><tr><td> שור עוברי סרה </td><td> Thermo Scientific (סיגמא אולדריץ) </td><td> SH3007103 (F2442) </td><td> 25 מיליליטר </td></tr><tr><td> Collagenase (סוג ד &#39;) </td><td> וורטינגטון (סיגמא אולדריץ) </td><td> LS004189 (C9891) </td><td> 0.44 גרם </td></tr><tr><td> טריפסין (מלבלב) </td><td> Biomedicals מגה פיקסל (סיגמא אולדריץ) </td><td> ICN15357125 (T5266) </td><td> 1 גרם </td></tr></tbody></table> טבלת 1. רשימה מגיב מפורטת עם יצרן מועדף ומספר קטלוג. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מתכלה </td><html><td> כלי עבודה </td><td> ציוד </td></tr><tr><td> צלחות תרבית תאים </td><td> מלקחיים (גס) </td><td> Pipettor סרולוגיות </td></tr><tr><td> מיליליטר 50 סטרילי צינורות חרוטי </td><td> מלקחיים (פיין) </td><td> ה-pH מטר </td></tr><tr><td> קלטת מעבדה </td><td> ידיות אזמל </td><td> חממה מצמררת (Echotherm) </td></tr><tr><td> 0.2 מערכות עיקור מיקרומטר אבק </td><td> להבי אזמל (# 10, 11 #) </td><td> הזרימה למינרית הוד </td></tr><tr><td> דוחה המים החיטוי נייר </td><td> מספריים כירורגי </td><td> סעפת ואקום </td></tr><tr><td> פיפטות סרולוגיות </td><td> צלחות פטרי זכוכית </td><td> Microosmolality Meter </td></tr><tr><td></td><td> 12-16 G Cannulas עם Luer מנעולים </td><td></td></tr></tbody></table> טבלת 2. מתכלה, כלים והציוד דרושים לתרבית תאים. <table border="0" cellpadding="0" cellspacin</html style=";text-align:right;direction:rtl">g = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> גודל צלחת </td><td> 2 סנטימטר לכל טוב </td><td> פולי-L-ליזין * </td><td> Laminin ** </td></tr><tr><td> 6 כן </td><td> 9.5 </td><td> 1.6 מיליליטר </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 24 גם </td><td> 1.9 </td><td> 0.32 </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> 48 גם </td><td> 0.95 </td><td> 0.16 </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> 96 גם </td><td> 0.32 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> * ריכוז 0.1 מ&quot;ג / מיליליטר </td><td> ** ריכוז 0.020 מ&quot;ג / מיליליטר </td><td></td></tr></tbody></table> לוח 3. אופטימלי כרכים לציפוי צלחות תרבית תאים עם פולי-L-ליזין וlaminin. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> בדידות </td><td> לשטוף </td><td> דיסוציאציה </td><td> מלא </td></tr><tr><td> בסיס בינוני </td><td> 419.25 מיליליטר </td><td> 395.40 מיליליטר </td><td>297.00 מיליליטר </td><td> 178.00 מיליליטר </td></tr><tr><td> * כוחות הביטחון הפלסטיניים </td><td> 5.00 מיליליטר </td><td> 4.00 מיליליטר </td><td> 3.00 מיליליטר </td><td> 2.00 מיליליטר </td></tr><tr><td> גנטמיצין סולפט ** </td><td> 0.75 מיליליטר </td><td> 0.60 מיליליטר </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> תורם סוסים סרום </td><td> 75.00 מיליליטר </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> בסרום שור עוברי *** </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 20.00 מיליליטר </td></tr><tr><td> * כוחות הביטחון הפלסטיניים: פניצילין / סטרפטומיצין / קוקטייל fungizone (100x); ** 50 ריכוז מ&quot;ג / מיליליטר; מאופיין *** </td></tr></tbody></table> לוח 4. הכנות מדיה שונות לבידוד והתרבות של תאי myogenic מבשר (MPCs). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> גודל צלחת </td><td> 2 סנטימטר לכל טוב </td><td> מהילה </td><td> נפח ציפוי </td></tr><tr><td> 6 כן </td> &lt;td&gt; 9.5 </td><td> 1.5-2.0 x 10 6 תאים / מיליליטר </td><td> 1 מיליליטר </td></tr><tr><td> 24 גם </td><td> 1.9 </td><td> 1.5-2.0 x 10 6 תאים / מיליליטר </td><td> 250 μl </td></tr><tr><td> 48 גם </td><td> 0.95 </td><td> 1.5-2.0 x 10 6 תאים / מיליליטר </td><td> 150 μl </td></tr><tr><td> 96 גם </td><td> 0.32 </td><td> 1.5-2.0 x 10 6 תאים / מיליליטר </td><td> 50-100 μl </td></tr></tbody></table> לוח 5. דילולים מומלצים וכרכי ציפוי לפי גודל גם צלחת תרבית תאים. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מין </td><td> רקמת תאים # / g ממוצע </td></tr><tr><td> rerio Danio </td><td> 6,400,000 </td></tr><tr><td> dangila Danio </td><td> 1,783,000 </td></tr><tr><td> Devario aequipinnatus </td><td> 1,797,000 </td></tr><tr><td> Oncorhynchus mykiss </em&gt; </td><td> 66,800 </td></tr></tbody></table> . לוח 6 מספר ממוצע של תאים מבשר myogenic מבודד מ1 גרם של רקמת שריר מבעלי חוליות שונות: Danio rerio (דג הזברה), Daniodangila (moustacheddanio), Devario aequipinnatus (Danio הענק), וmykiss Oncorhynchus (פורל קשת). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מין </td><td> טמפרטורה </td></tr><tr><td> spp Danio / Devario. </td><td> 26-28 ° C </td></tr><tr><td> spp Oncorhynchus / Salmo. </td><td> 10 * - 18 ° C </td></tr><tr><td> Ambystoma mexicanum </td><td> 18 ° C </td></tr><tr><td> * טמפרטורות נמוכות תומכות בשיעורי תפוצה נמוכים יותר. </td><td></td></tr></tbody></table> טמפרטורות דגירה לוח 7. מומלץ לpiscine וp myogenic דוחיתאי recursor (MPCs). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51354/51354fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51354/51354fig1.jpg" /> איור 1. נציג תמונות בהירות תחום MPCs (השמאלי ביותר), myoblasts (באמצע), וmyotubes המוקדם (הימני ביותר) משני מינים, פורל קשת (Oncorhynchus mykiss, למעלה) ודג הזברה (Danio rerio, למטה). <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51354/51354fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51354/51354fig2.jpg" /> איור 2. מכתים immunocytochemical נציג MPCs (א, ג) וmyotubes (ב, ד) מבודד ומתורבת מDanio הענק (Devario aequipinnatus, למעלה) ופורל קשת (Oncorhynchus mykiss, למטה). בתרבות, myoblasts הן MyoD1 + חיובי (א, ג)כדמיין באמצעות + נוגדני MyoD1 זמינים מסחרי (Danio: 20-C, סנטה קרוז ביוטכנולוגיה; פורל: NB100-80,899, ביולוגיים נובוס). בנוסף, כmyoblasts להבדיל, שהם מבטאים myogenin (ב, ד) כדמיין באמצעות נוגדני myogenin זמינים מסחרי (Danio: M-225; פורל: SC-567; שניהם מסנטה קרוז ביוטכנולוגיה). <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51354/51354fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51354/51354fig3.jpg" /> איור 3. נתוני התפשטות תאים מייצגים באמצעות BrdU למדוד שיעורי התפשטות תאים לאורך זמן בתרבות. נתונים שהתקבלו מMPCs המבודד ומתורבת מDanio הענק 67.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages at JoVE.com

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

בתרבות חוץ גופית מערכות הוכיחו הכרחיות להבנה של myogenesis חוליות שלנו. עם זאת, הרבה עדיין לא למד על פיתוח שרירי שלד nonmammalian וצמיחה, במיוחד במינים הבזליים. פרוטוקול יעיל וחזק לבידוד בתאי גזע בוגרים של רקמה זו, התאים המבשר myogenic (MPCs), ושמירה על ההתחדשות העצמית שלהם, שגשוג, ובידול בהגדרת תרבות העיקרית מאפשר זיהוי של מנגנוני פיקוח שימור ומסתעפים לאורך שושלות חוליות.

הכנת תא / תרבויות והיצמדות למנגנון הראשי myogenic מבשר משושלות חוליות בסל

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

preparation-primary-myogenic-precursor-cellmyoblast-cultures-from

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

20.2K Views.  University of Alabama at Birmingham.  בתרבות חוץ גופית מערכות הוכיחו הכרחיות להבנה של myogenesis חוליות שלנו. עם זאת, הרבה עדיין לא למד על פיתוח שרירי שלד nonmammalian וצמיחה, במיוחד במינים הבזליים. פרוטוקול יעיל וחזק לבידוד בתאי גזע בוגרים של רקמה זו, התאים המבשר myogenic (MPCs), ושמירה על ה...

Video: Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

תרבויות עצבית ראשונית של המוח של Late Stage תסיסנית גלמים

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

הכנת תרבויות העצבית מ Midgastrula עוברים שלב תסיסנית

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

הכנת ניתק תרבויות עכבר קליפתיים Neuron

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

ראשי ניתק דופמין במוח התיכון Cell תרבויות מן ילודים מכרסמים

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

הכנת 2-dGuo שטופלו תרבויות איברים קורנית

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to the restrictions imposed by a child's small size and their inevitable growth. Consequently, there is a genuine need for innovative therapies designed specifically for pediatric patients with cardiac rhythm disorders. We propose that a conductive biological alternative consisting of a collagen-based matrix containing autologously-derived cells could better adapt to growth, reduce the need for recurrent surgeries, and greatly improve the quality of life for these patients. In the present study, we describe a procedure for incorporating primary skeletal myoblast cell cultures within a hydrogel matrix to fashion a surgically-implantable tissue construct that will serve as an electrical conduit between the upper and lower chambers of the heart. Ultimately, we anticipate using this type of engineered tissue to restore atrioventricular electrical conduction in children with complete heart block. In view of that, we isolate myoblasts from the skeletal muscles of neonatal Lewis rats and plate them onto laminin-coated tissue culture dishes using a modified version of established protocols[2, 3]. After one to two days, cultured cells are collected and mixed with antibiotics, type 1 collagen, Matrigel&trade;, and NaHCO3. The result is a viscous, uniform solution that can be cast into a mold of nearly any shape and size[1, 4, 5]. For our tissue constructs, we employ type 1 collagen isolated from fetal lamb skin using standard procedures[6]. Once the tissue has solidified at 37&deg;C, culture media is carefully added to the plate until the construct is submerged. The engineered tissue is then allowed to further condense through dehydration for 2 more days, at which point it is ready for in vitro assessment or surgical-implantation.

Here, we demonstrate fabrication of collagen-based, tissue constructs containing skeletal myoblasts. These 3-D engineered constructs may be used to replace or repair tissues in vivo. For our purposes, we have designed these as an atrioventricular electrical conduit for the repair of complete heart block[1].

המצאה של Myogenic בונה רקמות מהונדסות

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to ...

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons. The neurons are large (up to 1 mm in diameter) and identifiable, with distinct sizes, shapes, positions and pigmentations, and the cell bodies are externally exposed in five paired ganglia distributed throughout the body of the animal. These properties have allowed investigators to delineate the circuitry underlying specific behaviors in the animal1. The monosynaptic connection between sensory and motor neurons is a central component of the gill-withdrawal reflex in the animal, a simple defensive reflex in which the animal withdraws its gill in response to tactile stimulation of the siphon. This reflex undergoes forms of non-associative and associative learning, including sensitization, habituation and classical conditioning. Of particular benefit to the study of synaptic plasticity, the sensory-motor synapse can be reconstituted in culture, where well-characterized stimuli elicit forms of plasticity that have direct correlates in the behavior of the animal2,3. Specifically, application of serotonin produces a synaptic strengthening that, depending on the application protocol, lasts for minutes (short-term facilitation), hours (intermediate-term facilitation) or days (long-term facilitation). In contrast, application of the peptide transmitter FMRFamide produces a synaptic weakening or depression that, depending on the application protocol, can last from minutes to days (long-term depression). The large size of the neurons allows for repeated sharp electrode recording of synaptic strength over periods of days together with microinjection of expression vectors, siRNAs and other compounds to target specific signaling cascades and molecules and thereby identify the molecular and cell biological steps that underlie the changes in synaptic efficacy.
An additional advantage of the Aplysia culture system comes from the fact that the neurons demonstrate synapse-specificity in culture4,5. Thus, sensory neurons do not form synapses with themselves (autapses) or with other sensory neurons, nor do they form synapses with non-target identified motor neurons in culture. The varicosities, sites of synaptic contact between sensory and motor neurons, are large enough (2-7 microns in diameter) to allow synapse formation (as well as changes in synaptic morphology) with target motor neurons to be studied at the light microscopic level.
In this video, we demonstrate each step of preparing sensory-motor neuron cultures, including anesthetizing adult and juvenile Aplysia, dissecting their ganglia, protease digestion of the ganglia, removal of the connective tissue by microdissection, identification of both sensory and motor neurons and removal of each cell type by microdissection, plating of the motor neuron, addition of the sensory neuron and manipulation of the sensory neurite to form contact with the cultured motor neuron.

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Primary cultures of Aplysia sensory-motor neurons provide a model preparation for studying synapse formation and synaptic plasticity in vitro. This video demonstrates the identification and microdissection of sensory and motor neurons from Aplysia ganglia as well as the methods for establishing and maintaining sensory-motor neurons in culture.

הכנת Aplysia חושי, מנוע תא תרבויות העצבית

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized. Primary cells are preferred in studies of cell cycle control, apoptosis, and DNA repair, as cancer cells carry mutations in genes involved in these processes. Primary cells cannot be cultured indefinitely due to the onset of replicative senescence or aneuploidization. Hence, new cultures need to be established regularly. The procedure for isolation of rodent embryonic fibroblasts is well established, but isolating adult fibroblast cultures often presents a challenge. Adult rodent fibroblasts isolated from mouse models of human disease may be a preferred control when comparing them to fibroblasts from human patients. Furthermore, adult fibroblasts are the only available material when working with wild rodents where pregnant females cannot be easily obtained. Here we provide a protocol for isolation and culture of adult fibroblasts from rodent skin and lungs. We used this procedure successfully to isolate fibroblasts from over twenty rodent species from laboratory mice and rats to wild rodents such as beaver, porcupine, and squirrel.

This article describes a protocol for isolation and maintenance of primary fibroblast cultures from skin and lung tissue of wild rodents.

הקמת ראשיים פיברובלסטים תרבויות למבוגרים מאת מכרסמים

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

תא תרבויות ראשי מ תסיסנית Gastrula עוברים

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...