SZ וDW לקבל מענק בלתי מוגבל של ViroPharma.

1. הכנה של תאי דם אדומים שטופלו ברומלין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי דם אדומים לשטוף 0 הקלידו-3x עם 1x PBS (צנטריפוגה ב664 XG במשך 2-5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 1 נפח של תאי דם אדומים צפופים עם שני כרכים של פתרון ברומלין 0.5% עבור 10 דקות ב37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים 3x עם 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן לאחסן את התאים כפתרון 3% ב 4 ° C ב1x PBS למשך שבוע אחד לפחות. </li></ol> 2. C3 ו-C4 הפקדת ניתוח על פני כדוריות דם אדומים על ידי FACS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חום להשבית את הכמות הנדרשת של סרום מטופל (או במקור נוגדן אנטי RBC אחר) על ידי חימום הדגימה ל30 דקות ב56 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו RBCs טופלו ברומלין שלוש פעמים בVBG - (5 מ&quot;מ ורונל, 150 mM NaCl, 0.05% pH ג&#39;לטין 7.4) ו resuspend אותם בVBG + + (VBG - + 2 מ&quot;מ MgCl 2 + 10 מ&quot;מ CaCl 2) לתת פתרון 0.5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה את המרכיבים הבאים לתוך צלחת מסביב לתחתית עם פנינת זכוכית (ואו ערבוב נכון): 25 μl RBCs 0.5%, 37.5 סרום μl טרי AB (מקור משלים) ו37.5 μl אנטי C5 200 מיקרוגרם / מיליליטר. Anti-C5 הוא יקר ועלול להיות קשה להשגה. אפשר לשקול שימוש בסרום C5-/C6-/C7- או C8 לקוי במקום סרום AB ואנטי-C5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף סרום מטופל בכל טוב לריכוז סופי של 0.1-33%. נכון להבדלים בריכוז בסרום לכל גם בשל שימוש בסרום AB חום מומת. הוספת VBG + + כדי לקבל נפח סופי של 150 μl / טוב. צלחת לסגור בנייר ELISA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 1.5-2 שעות על 37 מעלות צלזיוס בזמן טלטולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף פעמים RBCs שלוש עם PBS + BSA 0.5% (צנטריפוגה ב664 XG במשך 2 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת כותרתו fluorescently אנטי C3 ונוגדנים חד שבטיים אנטי C4 או שברי Fab שלהם (כדי להפחית את התלכדות) בארגון ה-BSA + 0.5% PBS לריכוז סופי של מיקרוגרם / מיליליטר 1. כאן התפתח מנהג אנטי C3-Alexa פלואוריד 488 ו647 נוגדנים חד שבטיים אנטי C4-Alexa פלואוריד משמשים; הבחירה של thesדואר תוויות ניאון מאפשרת זיהוי בו זמני של C3 ו-C4 על ידי FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 30-45 דקות בטמפרטורת חדר עם רעד עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RBCs 3x לשטוף עם BSA + 0.5% PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend RBCs 150 μl בBSA +0.5% PBS ו פיפטה אותם לצלחת חדשה (להיפטר מפניני הזכוכית לפני ניתוח FACS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוח FACS. תאים בודדים נפרדים מכפילויות בFSC-זומם פיזור; להגדיר את השער על פני כדוריות הדם האדום אחת; בחר את הערוץ המתאים לזיהוי אותות הקרינה (למשל FITC וAPC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת תוצאות שימוש בעוצמת הקרינה החציונית. </li></ol> הערה: אפשר להשתמש בשליטת אלוטיפ (שכותרת למשל fluorescently אנטי IL6 העכבר IgG1). עם זאת, מומלץ לכלול ביקורת שלילית אמיתית למשל על ידי דוגרים RBCs ללא סרום מטופל (רק בסרום א.ב.) או ללא מקור משלים (סרום AB חום מומת וסרום חולה חום מומת),ד אז כתם אלה עם אותו אנטי-C3-Alexa פלואוריד 488 ואנטי C4-Alexa פלואוריד 647 נוגדנים. זה נותן שליטה תקפה יותר מאשר שליטת אלוטיפ במקרה של תאי דם אדומים 12, למרות פקדים השונים אלה בדרך כלל לתת את אותה תוצאה, שלילית. 3. Assay המוליטית כמותיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חום להשבית את הכמות הנדרשת של סרה מטופל (או במקור נוגדן אנטי RBC אחר) על ידי חימום דקות המדגם 30 ב56 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RBCs 3x לשטוף עם VBG - ופעם אחת עם VBG + +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה את המרכיבים הבאים לתוך צלחת מסביב לתחתית עם פנינת זכוכית (לערבוב נכון): תאי דם אדום 35 μl 3%, 25 μl סרום טרי AB (מקור משלים) ו1-50% בסרום חולה. נכון להבדלים בריכוז בסרום באמצעות סרום AB חום מומת. הוספת VBG + + כדי לקבל נפח סופי של 150 μl / טוב. צלחת לסגור בנייר ELISA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.5-2 עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cצלחת entrifuge ב664 XG במשך 5 דקות עם האטה מופחתת (למשל האטה לעצירה מלאה ב2-3 דק &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות פיפטה 90 supernatant μl בצלחת microtiter חדש. חשוב בשלב זה כדי למנוע בועות אוויר ולמניעת לקחת יחד תאים שלמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד A414/690 בספקטרופוטומטר מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביע תמוגה כאחוז מתמוגה של RBCs מדגם עם מים טהורים. </li></ol>

<ol>
	<li>Zeerleder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+haemolytic+anaemia+-+a+practical+guide+to+cope+with+a+diagnostic+and+therapeutic+challenge.">Autoimmune haemolytic anaemia - a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge.</a> Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).</li><li>Reardon, J. E., Marques, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+evaluation+and+transfusion+support+of+patients+with+autoimmune+hemolytic+anemia.">Laboratory evaluation and transfusion support of patients with autoimmune hemolytic anemia.</a> Am. J. Clin. Pathol. 125, 71-77 (2006).</li><li>Lai, M., Leone, G., Landolfi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+hemolytic+anemia+with+gel-based+immunohematology+tests.">Autoimmune hemolytic anemia with gel-based immunohematology tests.</a> Am. J. Clin. Pathol. 139 (4), 457-463 (2013).</li><li>Zantek, N. D., Koepsell, S. A., Tharp Jr, ., R, D., Cohn, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+direct+antiglobulin+test:+A+critical+step+in+the+evaluation+of+hemolysis.">The direct antiglobulin test: A critical step in the evaluation of hemolysis.</a> Am. J. Hematol. 87 (7), 707-709 (2012).</li><li>Natukunda, B., Brand, A., Schonewille, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cell+alloimmunization+from+an+African+perspective.">Red blood cell alloimmunization from an African perspective.</a> Curr. Opin. Hematol. 17 (6), 565-570 (2010).</li><li>Packman, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemolytic+anemia+due+to+warm+autoantibodies.">Hemolytic anemia due to warm autoantibodies.</a> Blood Rev. 22 (1), 17-31 (2008).</li><li>Berentsen, S., Tj&#248;nnfjord, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+treatment+of+cold+agglutinin+mediated+autoimmune+hemolytic+anemia.">Diagnosis and treatment of cold agglutinin mediated autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood Rev. 26 (3), 107-115 (2012).</li><li>Petz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+antibody+autoimmune+hemolytic+anemia.">Cold antibody autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood Rev. 22 (1), 1-15 (2008).</li><li>Barros, M. M. O., Blajchman, M. A., Bordin, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Warm+autoimmune+hemolytic+anemia:+recent+progress+in+understanding+the+immunobiology+and+the+treatment.">Warm autoimmune hemolytic anemia: recent progress in understanding the immunobiology and the treatment.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (3), 195-210 (2010).</li><li>Endoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+prewarming+conditions+for+Rh+antibody+testing.">Optimal prewarming conditions for Rh antibody testing.</a> Transfusion. 46 (9), 1521-1525 (2006).</li><li>Wouters, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C1-esterase+inhibitor+concentrate+rescues+erythrocytes+from+complement-mediated+destruction+in+autoimmune+hemolytic+anemia.">C1-esterase inhibitor concentrate rescues erythrocytes from complement-mediated destruction in autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood. 121 (7), 1242-1244 (2013).</li><li>Arndt, P. A., Garratty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Review+of+Published+Methods+for+Analysis+of+Red+Cell+Antigen-Antibody+Reactions+by+Flow+Cytometry,+and+Approaches+for+Resolving+Problems+with+Red+Cell+Agglutination.">A Critical Review of Published Methods for Analysis of Red Cell Antigen-Antibody Reactions by Flow Cytometry, and Approaches for Resolving Problems with Red Cell Agglutination.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (3), 172-194 (2010).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

מבחני לעיל הם שחזור וחזקים. הם קלים לביצוע וניתן לבצע אותם עם דגימות רבות באותו הזמן (בצלחת 96 היטב). לפיכך, גישה זו תהיה גם מתאימה למערכת אוטומטית לחלוטין, כגון: מערכת רובוט ELISA. בניגוד לטכניקות המשמשות כיום, מבחני האלה הם כמוני וזה יעזור לדוגמא: במחקר של ההשפע?...

נוגדנים כנגד תאי דם אדומים (RBCs) יכולים להיגרם על ידי עירוי של תאי דם אדומים מבטאים אנטיגן שאינו נמצא בתאי דם אדומים נמען. הלו, נוגדנים אלו יכולים לגרום לתגובות קשות חריפות המוליטית עירוי עקב להשלים הפעלה על העירוי 5 הבא. באנמיה המוליטית אוטואימונית (AIHA), חולים נוגדנים עצמיים כנגד תאי הדם האדום שלהם. זה מוביל לאישור מואץ של התאים באמצעות האינטראקציה של IgG חייבת RBCs עם Fcγ-קולטנים על phagocytes בטחול ו / או במקרה של נוגדנים עצמיים מסוגלים להפעיל משלימים באמצעות קולטנים משלימים בכבד 6,7. הפעלת השלמה המוחלטת של תפקוד וכתוצאה מכך המוליזה intravascular היא נדירה אך לעתים קרובות קטלנית. מואץ, משלים הרס RBC בתיווך הנגרם על ידי או תוצאותיו הלו או נוגדנים עצמיים באנמיה חריפה וחוסר חמצן ברקמות ומכאן שעלול להיות קטלני. הנוגדנים העצמיים בAIHA מסווגים בנוגדנים חמים וקרים, תלויg על הטמפרטורה האופטימלית הם נקשרים לתאי דם אדומים (37 מעלות צלזיוס או נמוכה, בהתאמה). הנוגדנים הם בדרך כלל החמים של אלוטיפ IgG והנוגדנים הקרים של IgM אלוטיפ 8,9. AIHA יכולה להיות משנית לדוגמא lymphoprolyferative הפרעות, מחלות רקמת חיבור, גידולים מוצקים, זיהומים או סמים, אבל ב50% מהמקרים AIHA היא אידיופטית 9. איתור של gammaglobulins (למשל. IgG או IgM) ומשלים כבול לRBCs של המטופל מתבצע באמצעות antiglobulin הישיר semiquantitative מבחן (קומבס) (DAT). בDAT RBCs מטופל מודגרת עם אנטי IgG או אנטי C3d. מופע של התלכדות RBC מדגים את נוכחותם של רכיבים משלימים מצורפים או IgG מחייב. זיהוי שלו הלו או נוגדנים עצמיים בסרום של המטופל מתבצע באמצעות הבדיקה העקיפה antiglobulin (IAT). בIAT, RBCs המבחן טופלו ברומלין מודגרת עם סרום מטופל, נשטף ולאחר מכן הודגרו עם אנטי-hאומן IgG. במקרה RBCs כבר רגיש עם הווה נגד RBC IgG בהתלכדות סרום המטופל יתרחש. נוגדני IgM לRBCs ישירות יובילו להתלכדות על דגירה של RBCs מבחן טופלו ברומלין עם סרום מטופל. התלכדות RBC בבדיקת קומבס הישירה או בIAT מוערך מבחינה ויזואלית או על ידי העין במבחנה או על ידי טעינת המדגם על עמודת Sephadex קטנה מפרידה RBCs agglutinated ואחת לפי גודל 1. טכניקה משמשת לעתים קרובות אחרת למדוד הפעלה משלים על פני כדוריות דם אדום היא assay המוליטית 1, שבו היכולת של סרום מטופל כדי לגרום להמוליזה (משלים בתיווך) של תאי דם אדומים שטופלה ברומלין 10 מוערכת. המבחן הוא כאמור חיובי כאשר את supernatant לאחר צנטריפוגה מוכתם אדום בשל המוגלובין שוחרר ונחשב לשלילי אם הוא נשאר חסר צבע. שתי מבחן antiglobulin וassay המוליטית הם semiquantitative, מאז Seru הגבוה ביותרהדילול מ &#39;הוא כונה שבמבחן הוא עדיין חיובי. מבחן antiglobulin וassay המוליטית הם מבחני חזקים המשמשים באופן שיגרתי באבחון. מאז מבחני אלה הם semiquantitative ותלויים בניסיונו של טכנאי ביצוע assay הם אינם מתאימים ללמוד להבדלים של הפעלת משלים על פני כדוריות דם אדומים, במידת צורך בעת הערכת היעילות של מעכבי משלים. לכן, פיתחנו שני מבחני כמותיים כדי לקבוע הפעלת ההשלמה על ידי נוגדנים (אוטומטי) לתאי דם אדומים, שנתאר במאמר זה. ראשית, פיתחנו assay כדי למדוד את התצהיר של שברי הפעלה של משלים C3 ו-C4 על פני כדוריות דם אדומים (איור 1 א). ב assay זה, מסוג 0 RBCs טופלו ברומלין אדם מודגרת עם סרום חום מומת מטופל (מקור נוגדן אנטי RBC), סרום טרי AB (מקור משלים) ונוגדנים חד שבטיים אנטי C5 (Eculizumab). במהלך inc זהubation, בתצהיר C3 ו-C4 יתרחש אם הסרום מכיל המטופל להשלים הפעלת נוגדנים נגד RBC. על מנת למנוע תמוגה RBC על ידי הפעלת משלים במורד הזרם נוגדן חד שבטי אנטי C5 חסימה הוא הוסיף. בשלב בא, בתצהיר C3 ו-C4 על פני כדוריות הדם האדום הוא זוהה על ידי FACS באמצעות נוגדנים חד שבטיים או שכותרתו fluorescently Fab-ברים מגיבים עם C3 ו-C4, בהתאמה. Gating על פני כדוריות דם אדום בודדות הוא חשוב כדי להבטיח את אמינות התוצאות. יתרונות של שיטה זו כוללים שנפח קטן של חומר מטופל נדרש, תשלים את ההפעלה בשלב מוקדם של המפל מוערך והשיטה לשחזור וכמותיים. יתרון נוסף של התבוננות בשני C3 ו-C4 הוא שניתן להבחין בין ההפעלה הקלסית וקטיני המסלול (גם C3 ו-C4 בתצהיר) וההפעלה החלופית מסלול (רק בתצהיר C3). השימוש בתאי הדם אדום שטופלה ברומלין במקום RBCs מטופל מגביר את הרגישות של כאומר. Assay השני מתבסס על assay משמש כיום המוליטית (איור 1). סוג-0 RBCs טופלו ברומלין אדם מודגרת עם סרום חום מומת מטופל (מקור נוגדן אנטי RBC) וסרום טרי AB (מקור משלים). אם משלימים מופעל על ידי נוגדנים נגד RBC מטופל, תמוגה RBC תלויה המינון תתרחש, מה שמוביל לשחרור של המוגלובין. כמות ההמוגלובין שפורסם היא לכימות על ידי מדידת הספיגה שלה ב414 ננומטר בsupernatant לאחר שצנח RBCs השלמה ומקוטע. הספיגה בקורלציה עם הכמות של המוליזה התרחשה. בניגוד לassay משמש כיום, פרוטוקול זה מאפשר לאובייקטיבי, ערכם הכמותי של המוליזה כי הוא מאוד לשחזור ואינו תלוי באדם לפרש את assay. יישום של שיטות אלה תואר ב11, שבם השימוש הפוטנציאלי של C1-מעכב כמעכב משלים בAIHA היה שלtudied.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>B-4287</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Barbital</td><td>Fagron</td><td>0261</td><td>This chemical is subject to drug regulation.</td></tr><tr><td>Sodium Barbital</td><td>Fagron</td><td>0263</td><td>This chemical is subject to drug regulation.</td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Merck</td><td>1.0470.0500</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck</td><td>1.06404.1000</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Merck</td><td>1.05833.0250</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Merck</td><td>1.0238.0500</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dylight 488 amine reactive dye</td><td>Pierce</td><td>46402</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dylight 650 amine reactive dye</td><td>Pierce</td><td>62265</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;alpha;C5 (Eculizumab)</td><td>Alexion Pharmaceuticals</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FACS (Canto)</td><td>BD</td><td></td><td>Any FACS can be used that has the appropiate lasers.</td></tr><tr><td>Spectrophotometer (e.g. Multiskan spectrum)&amp;nbsp;</td><td>Thermo Labsystems</td><td>1500-193</td><td>Any spectrophotometer with the right wavelength range can be used</td></tr><tr><td>BD FACSDiva software v 6.1.2</td><td>BD</td><td>643629</td><td>Any compatible FACS analysis software can be used</td></tr><tr><td>Bromelain&amp;nbsp;</td><td>Sanquin</td><td>K1121</td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

methods for quantitative detection of antibody-induced complement activation on red blood cells

נוגדנים כנגד תאי דם אדומים (RBCs) יכולים להוביל להשלמת הפעלה וכתוצאה מכך אישור מואץ באמצעות קולטנים משלימים בכבד (המוליזה extravascular) או מוביל לתמוגה intravascular של RBCs. Alloantibodies (למשל ABO) או נוגדנים עצמיים לאנטיגנים RBC (כפי שניתן לראות באנמיה המוליטית אוטואימונית, AIHA) המוביל כדי להשלים את ההפעלה הם מזיקים ויכול להיות - במיוחד כאשר מובילים לתמוגה intravascular - 1 קטלני. נכון לעכשיו, להשלים את ההפעלה בשל (אוטומטי)-נוגדנים על פני כדוריות דם אדום נבחנת במבחנה על ידי שימוש בבדיקת קומבס משקפת בתצהיר משלים בRBC או על ידי assay המוליטית nonquantitative משקף RBC תמוגה 1-4. עם זאת, כדי להעריך את היעילות של מעכבי משלים, הוא חובה שיש טכניקות כמותיות. כאן אנו מתארים שתי טכניקות כאלה. ראשית, assay כדי לזהות C3 ו-C4 בתצהיר על תאי דם אדומים הנגרמים על ידי נוגדנים בסרום חולה מראשsented. לשם כך, ניתוח FACS משמש עם נוגדנים נגד C3 או אנטי-C4 שכותרתו fluorescently. בשלב הבא, assay המוליטית כמותית מתואר. המוליזה ב assay זה, להשלים בתיווך הנגרמת על ידי סרום מטופל נמדדת שימוש ביצוע של זיהוי spectrophotometric של המוגלובין שפורסם. שני מבחני האלה הם מאוד לשחזור וכמותיים, בהנחיית מחקרים של הפעלת משלים-Induced נוגדן.

איור 2 א מראה עלילת פיזור נציג לRBCs. gating המתאים לRBCs היחיד שניתן לראות בדה FSC-W - FSC-עלילה (P1). בדרך כלל סביב 95% מתאי הדם האדומים ליפול בתוך השער הזה P1 (תאים בודדים), אבל כאשר אחוז גבוה של סרום חולה משמש, זה יכול לרדת ל 70-80%, במיוחד כאשר אנטי RBC IgM נמצא בסרום החולה. <p class="...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells at JoVE.com

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

כאן אנו מתארים שני מבחני למדידת הפעלת משלימים הנגרמת על ידי נוגדנים כנגד תאי דם אדומים. היתרון הגדול על פני מבחני הנוכחיים הוא מטבעם כמוני וקל לפרש.

שיטות כמותיות לאיתור של הפעלת משלים-Induced נוגדן בתאי דם אדומים

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

methods-for-quantitative-detection-antibody-induced-complement

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

30.4K Views.  University of Amsterdam.  כאן אנו מתארים שני מבחני למדידת הפעלת משלימים הנגרמת על ידי נוגדנים כנגד תאי דם אדומים. היתרון הגדול על פני מבחני הנוכחיים הוא מטבעם כמוני וקל לפרש. 

Video: Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Measuring the 50% Haemolytic Complement (CH50) Activity of Serum

The complement system is a group of proteins that when activated lead to target cell lysis and facilitates phagocytosis through opsonisation. Individual complement components can be quantified however this does not provide any information as to the activity of the pathway. The CH50 is a screening assay for the activation of the classical complement pathway (Fig 1) and it is sensitive to the reduction, absence and/or inactivity of any component of the pathway. The CH50 tests the functional capability of serum complement components of the classical pathway to lyse sheep red blood cells (SRBC) pre-coated with rabbit anti-sheep red blood cell antibody (haemolysin). When antibody-coated SRBC are incubated with test serum, the classical pathway of complement is activated and haemolysis results. If a complement component is absent, the CH50 level will be zero; if one or more components of the classical pathway are decreased, the CH50 will be decreased. A fixed volume of optimally sensitised SRBC is added to each serum dilution. After incubation, the mixture is centrifuged and the degree of haemolysis is quantified by measuring the absorbance of the haemoglobin released into the supernatant at 540nm. The amount of complement activity is determined by examining the capacity of various dilutions of test serum to lyse antibody coated SRBC. This video outlines the experimental steps involved in analysing the level of complement activity of the classical complement pathway.

Measuring the 50% Haemolytic Complement CH50 Activity of Serum

The classical pathway is activated by antibody and culminates in target cell lysis. The CH50 assay provides a measure of the complement activity of a serum sample. This video demonstrates the steps involved in determining the CH50 of a serum sample, the calculations and interpreting of results.

מדידת משלים Haemolytic 50% (CH 50) פעילות של סרום

The complement system is a group of proteins that when activated lead to target cell lysis and facilitates phagocytosis through opsonisation. Individual ...

Immunostaining-Based Detection of Dynamic Alterations in Red Blood Cell Proteins

Antibody labeling of red blood cell (RBC) proteins is a commonly used, semi-quantitative method to detect changes in overall protein content or acute alterations in protein activation states. It facilitates the assessment of RBC treatments, characterization of differences in certain disease states, and description of cellular coherencies. The detection of acutely altered protein activation (e.g., through mechanotransduction) requires adequate sample preparation to preserve otherwise temporary protein modifications. The basic principle includes immobilizing the target binding sites of the desired RBC proteins to enable the initial binding of specific primary antibodies. The sample is further processed to guarantee optimal conditions for the binding of the secondary antibody to the corresponding primary antibody. The selection of non-fluorescent secondary antibodies requires additional treatment, including biotin-avidin coupling and the application of 3,3-diaminobenzidine-tetrahydrochloride (DAB) to develop the staining, which needs to be controlled in real-time under a microscope in order to stop the oxidation, and thus staining intensity, on time. For staining intensity detection, images are taken using a standard light microscope. In a modification of this protocol, a fluorescein-conjugated secondary antibody can be applied instead, which has the advantage that no further development step is necessary. This procedure, however, requires a fluorescence objective attached to a microscope for staining detection. Given the semi-quantitative nature of these methods, it is imperative to provide several control stains to account for non-specific antibody reactions and background signals. Here, we present both staining protocols and the corresponding analytical processes to compare and discuss the respective results and advantages of the different staining techniques.

Capturing dynamic changes in the protein activation of enucleated red blood cells poses methodological challenges, like the preservation of dynamic changes to acute stimuli for later assessment. The presented protocol describes sample preparation and staining techniques that enable preservation and analysis of relevant protein changes and subsequent detection.

זיהוי מבוסס חיסונים של שינויים דינמיים בחלבוני תאי דם אדומים

Antibody labeling of red blood cell (RBC) proteins is a commonly used, semi-quantitative method to detect changes in overall protein content or acute ...

Biochemistry

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

שימוש Assay מונוציטים חד שכבתי להערכת Fcγ קולטן בתיווך Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

זמן לשגות הדמיה תלת-ממדית של Phagocytosis על ידי העכבר מקרופאגים

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, transports immune complexes, and participates in humoral and cellular immune responses. CR1 is present on the surface of many cell types, including erythrocytes, and exhibits polymorphisms in length, structure (Knops, or KN, blood group), and density. The average density of CR1 per erythrocyte (CR1/E) is 500 molecules per erythrocyte. This density varies from one individual to another (100&#8211;1,200 CR1/E) and from one erythrocyte to another in the same individual. We present here a robust flow cytometry method to measure the density of CR1/E, including in subjects expressing a low density, with the help of an amplifying immunostaining system. This method has enabled us to show the lowering of CR1 erythrocyte expression in diseases such as Alzheimer&#39;s disease (AD), systemic lupus erythematosus (SLE), AIDS, or malaria.

The aim of this method is to determine the CR1 density in the erythrocytes of any subject by comparing with three subjects whose erythrocyte CR1 density is known. The method uses flow cytometry after immunostaining of the subjects&#39; erythrocytes by an anti-CR1 monoclonal antibody coupled to an amplified system using phycoerythrin (PE).

מדידת קולטן אריתרופוציט 1 באמצעות שימוש בשיטת זרימה

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...

Prediction of Red Blood Cell Antibody Significance Using the Monocyte-Macrophage Assay

Derived from monocytes in the bone marrow, macrophages are large, innate immune cells that play a major role in clearing dead cells, debris, tumor cells, and foreign pathogens. The phagocytic capacity of monocytes versus macrophages is a concept that is not well understood. Here, we aim to examine a difference in the phagocytosis of monocytes versus macrophages, specifically M1/M2 macrophages, against various opsonized red cells using a modified and updated version of the established monocyte monolayer assay (MMA). Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from donor buffy coats. Using purified monocytes, inflammatory M1 and anti-inflammatory M2 macrophages were produced by in vitro culture and polarization. M1/M2 cells were harvested and used in an MMA-like assay, which we refer to as the M-MA, to decipher clinically significant phagocytosis of various red cell antibodies. A phagocytic index (PI) &#62; 5 was deemed clinically significant phagocytosis with the use of monocytes. A phagocytic index (PI) &#62; 12 was deemed clinically significant phagocytosis with the use of M1/M2 macrophages. M2 macrophages demonstrate an increased ability to phagocytose opsonized RBCs compared to monocytes and M1s. The same weak antibody (anti-S) yields significant phagocytosis with only M2 macrophages (PI=43) but not M1s (PI=2) or monocytes (PI=0), and this was demonstrated repeatedly using various antibodies. The use of M2 macrophages instead of monocytes may allow for more accurate results as these cells are more phagocytic, offering further clinical relevance to the assay. Further studies with different antibodies to red blood cells, including validation of the monocyte-macrophage assay (M-MA) with antibodies having known clinical significance, may show the M-MA&#160;more useful to help predict clinically significant red cell alloantibodies and transfusion reactions. This method will advance the field of transfusion medicine and immunology.

We have developed enhancements and updated methods for the existing monocyte-monolayer assay (MMA), in which macrophages are used to help better predict the clinical relevance of red cell alloantibodies in transfusion medicine and immunology. This assay is named the monocyte-macrophage assay (M-MA).

חיזוי מובהקות נוגדנים של כדוריות דם אדומות באמצעות בדיקת מונוציטים-מקרופאגים

Derived from monocytes in the bone marrow, macrophages are large, innate immune cells that play a major role in clearing dead cells, debris, tumor cells, ...

A Serum Bactericidal Assay for the Complement-Mediated Bactericidal Activity of Antibodies

Source: Weerts, H. P., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/59164">A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates a technique to evaluate the complement-mediated bactericidal activity of antibodies present in serum. This approach combines isolated serum with pathogenic bacteria and exogenous complement proteins. Upon incubation, the bacteria are grown on an agar plate, and the produced colonies are quantified to measure the serum bactericidal titer.

בדיקה חיידקית בסרום לפעילות חיידקית בתיווך משלים של נוגדנים

Source: Weerts, H. P., et al. A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay. J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates a technique to evaluate ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

Detection of Rhesus Factor in Human Blood Samples using Magnetic Levitation

Source: Thompson, L. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/62550">Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2021)
This video demonstrates the detection of the Rhesus (Rh) factor in blood samples using a magnetic levitation instrument. The magnetic field aligns and levitates beads and blood cells based on density. Treating the samples with anti-Rh antibodies results in intermediate-density bead-cell complexes&#39; formation, allowing for the differentiation of Rh-positive and Rh-negative red blood cells.

All procedures involving human participants have been performed in compliance with the institutional, national, and international guidelines for human ...

Cellular Immunodiagnostics

An In Vitro Assay to Measure Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis by Phagocytes

Source: Powell, R. L., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/60149">Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates an assay to measure the antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP) by breast milk phagocytes. Fluorescently labeled microspheres conjugated to an antigen-antibody complex, are combined with a cell suspension isolated from breast milk to induce antibody-dependent cellular phagocytosis by the phagocytic leukocytes. Upon labeling the cells with antibodies against common leukocyte antigen (CD45), flow cytometry is used to measure the fluorescence intensity of microsphere-positive viable phagocytic leukocytes, indicating the level of ADCP activity.

בדיקת מבחנה למדידת פגוציטוזה תאית תלוית נוגדנים על ידי פגוציטים

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Target Microsphere preparation

	...

Antibody-Based Technologies

Characterization and Functional Analysis

The Hemagglutination Inhibition Assay to Detect Serum Antibodies Against a Target Antigen

Begin by labeling 96-well microtiter plates with the appropriate experimental information. Then, turn the plate in the vertical orientation and use a multichannel pipette to add 25 microliters of PBS to every well except the first well of the bottom back titration row. Add 50 microliters of the freshly prepared antigen solution of interest to the first well of the back titration row, followed by the addition of 25 microliters of RDE-treated serum samples to the first wells of the top 10 rows.
Add 25 microliters of the appropriate anti-serum to the first well of the 11th row as a positive control. Then, transfer 25 microliters from the first well of each row to their successive wells to perform serial two-fold dilutions. Pipette up and down 10 to 15 times for each dilution step, discarding the final 25 microliters from the last wells.
Next, add 25 microliters of the antigen solution to each well of rows 1 through 11, and 25 microliters of PBS only to each well of the back titration row. Tap the plate carefully 10 times on all four sides to mix, and cover the plate for 30 minutes at room temperature. At the end of the incubation, add 50 microliters of red blood cell solution to each well, and mix the plate with more tapping. Then, cover the plate again and incubate the red blood cells according to the species used, as outlined in the table.
After adding the red blood cells to the plate, adhere to the appropriate incubation time for the type of blood used in the assay. A too-short or too-long incubation will lead to an incorrect interpretation of the results.
At the end of the incubation, assess the hemagglutination by tilting the plate 90 degrees for 25 seconds, and mark the results for each well while the plate is still tilted on a printed scheme of the 96-well plate.

שיטות כמותיות לאיתור של הפעלת משלים-Induced נוגדן בתאי דם אדומים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מדידת משלים Haemolytic 50% (CH₅₀) פעילות של סרום