אנו מודים מעומק הלב לקרן וייטהול על תמיכתם במימון וקרנות הסטארט-אפ ממכון המחקר סקריפס על ביצוע עבודה זו.

1. הכנת גנגליה בטן, מדידות אלקטרופיזיולוגיות, ובידוד של נוירונים בודדים שזוהו מגנגליון הבטן של Aplysia californica
<ol><li>שמור על Aplysia באקווריום המעבדה עם מי ים מלאכותיים במחזור (ASW) ב 16 °C (60 °F) תחת 12:12 אור:תנאים כהים.</li>
	<li>בידוד של גנגליון בטן.<ol>
<li>הרדמה בעלי חיים על ידי הזרקת 380 mM MgCl2 פתרון במשך 5-10 דקות (שווה ערך 30-35% ממשקל הגוף של החיה).</li>
		<li>זהה את גנגליון הבטן בהתבסס על מיקומו במערכת העצבים המרכזית24,28.</li>
		<li>הסר את הגרעינים על ידי פעולה כירורגית ולאחסן מיד במי ים מלאכותיים המורכבים 450 מ"מ NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2, 55 mM MgCl2, 2.5 מ"מ NaHCO3, ו 10 mM HEPES (pH 7.4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>טיפול פרוטאז.<ol>
<li>דגירה גנגליון בטן במשך 30 דקות ב 34 °C±0.5 בצלחת פטרי עם 0.1% פרוטאז (dispase) מדולל ASW המתואר לעיל. הערה: כמות הפרוטאז המשמש צריך להיות סטנדרטי עם הגיל והמשקל של בעלי החיים. באופן כללי, בעלי חיים מבוגרים וגדולים יותר ידרשו יותר פרוטאז.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הסרת נדן גרעיני.<ol>
<li>לאחר הטיפול באנזים, הצמד את הגרעינים לבסיס סיליקון סילגרד של תא תא (Ø = 1 ס"מ; vol. = 0.3 מיליליטר) ולחלחל עם ASW (קצב זרימה: 150 μl / min) בטמפרטורת החדר (18 °C (18 °F±2). הערה: על מנת להגביר את הראות של נוירונים מזוהים, הנח את הגנגליון על החלק העליון של גליל זכוכית פוליקרבונט (איור 1) (קוטר Ø = תא תא שונה 2 מ"מ) שניתן להאיר בקלות מלמטה באמצעות סטריאומיקרוסקופ משקפת עם הגדלה של פי 20 ו- 40.</li>
		<li>הסר בזהירות את הנדן מהגנגליון באמצעות מלקחיים ומיקרוסיסורים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הקלטה אלקטרופיזיולוגית בו זמנית משני נוירונים.<ol>
<li>לזהות נוירון של עניין.</li>
		<li>לשפד את הנוירון עם מיקרואלקטרודה חדה תאית אחת עם התנגדות 10-15 MΩ מלא פתרון 3 M KCl.</li>
		<li>הקלט פעילות עצבית (מעבר רצועה של 10 kHz) באמצעות מערכת הקלטה תאית.</li>
		<li>עבד את נתוני ההקלטה באמצעות תוכנת אלקטרופיזיולוגיה כגון אקסוגרף. הערה: ניתן לבצע בקלות הקלטה מתאי עצב מרובים. נוירונים L7, L11 או R15 ו R2 מזוהים בקלות על סמך מיקומם. שני מגברים ושני מיקרו-מניפולטורים נדרשים להקלטה בו זמנית משני נוירונים L7 ו-R15(איור 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>יישום סמים.<ol>
<li>החל תרופה של בחירה לתוך תא התא על ידי pipetting עדין או להזריק ישירות לתוך נוירונים.</li>
		<li>בצע מדידות אלקטרופיזיולוגיות. הערה: בהתאם למטרה הניסיונית, ניתן למדוד פרמטרים אלקטרופיזיולוגיים שונים של נוירונים כגון השינויים בפוטנציאל הממברנה (MP) או פוטנציאל הפעולה (AP) לפני, במהלך ואחרי יישום התרופה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בידוד של נוירונים בודדים.<ol>
<li>בסיום הניסויים האלקטרופיזיולוגיים, לעצור את הזחילה של ASW ולשטוף את הגנגליון עם 100% אתנול.  חשיפה לאתנול תפחיד את הנוירונים, ובאמצעות מלקחיים עדינים, תקל על הסרת נוירונים בודדים מבלי לפגוע בנוירונים אחרים מהגנגליון.</li>
		<li>הסר נוירונים בודדים תחת סטריאומיקרוסקופ ולהעביר צינור קטן Eppendorf המכיל קר כקרח 500 μl מיצוי RNA מגיב. נוירונים בודדים מבודדים ניתן לאחסן ריאגנט מיצוי RNA ב -80 מעלות צלזיוס לניתוח עתידי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. בידוד RNA מתאי עצב בודדים וניתוח ביטוי גנים על ידי PCR כמותי בזמן אמת (qPCR)
<ol><li>אמצעי זהירות כדי למזער את השפלת RNA: ריבונוקלאאזות (RNases) משפילות RNA והן אנזימים יציבים ופעילים מאוד. בצע את השלבים הבאים במהלך הטיפול ב- RNAs.<ol>
<li>נקה את אזור העבודה ואת המכשירים עם סוכני השבתת RNase.</li>
		<li>ללבוש כפפות בכל עת בעת טיפול RNA ולהחליף כפפות לעתים קרובות.</li>
		<li>השתמש רק בפלסטיק ללא RNase לטיפול ב- RNAs.</li>
	</ol></li>
	<li>בידוד סה"כ RNA מתאי עצב בודדים:<ol>
<li>פרוטוקול טריזול סטנדרטי לבידוד RNA יכול לשמש לבידוד RNAs מתאי עצב בודדים. בקצרה להוסיף 20% v / v של כלורופורם כדי Trizol, לערבב היטב על ידי מערבולת קצרה.</li>
		<li>מניחים את הצינורות על מסובב במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. סובבו את תערובת טריזול-כלורופורם ב-12,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>לאסוף את השלב מימית ולהעביר צינור טרי.</li>
		<li>הוסף פתרון אצטט נתרן (pH 5.5) לריכוז הסופי של 0.3 M, 100 ng/ml של גליקובלו coprecipitant, ו 2.5 כרכים של 100% אתנול כדי לזרז RNA.</li>
		<li>מערבבים היטב את הדגימות ומדגירה ב -80 מעלות צלזיוס לילה.</li>
		<li>סובב את הדגימות ב 12,000 x g במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס גלולה כחולה קטנה יהיה גלוי בתחתית הצינור.</li>
		<li>הסר את supernatant ולשטוף את גלולה עם 850 μl של 75% אתנול קר כקרח ב 12,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>הסר את supernatant בזהירות אוויר לייבש את גלולת RNA במשך 7-10 דקות, מקסימום. הערה: ודא כי RNA לא נשאר זמן רב להתייבש כמו מעל-ייבוש גלולה RNA עושה solubilization קשה מאוד. 
</li>
		<li>לאחר התייבשות, resuspend גלולת RNA ב 10 μl של מים RNAse חינם ולקבוע ריכוז RNA. הערה: לקבוע ריכוז RNA באמצעות ספקטרופוטומטר. כאשר לא משתמשים מיד, לאחסן RNA ב -80 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol></li>
	<li>סינתזת ארנ"א מתאי עצב בודדים:<ol>
<li>הגבר את ה-RNA (סיבוב אחד או שניים בהתאם למטרה הניסיונית) באמצעות מערכת הגברה ליניארית RNA זמינה מסחרית. הערה: סך ה-RNA של נוירונים בודדים נע בין ~ 10-60 ng. התשואה הצפויה של הסיבוב הראשון של הגברה היא ~ 100-300 ng ואת הסיבוב השני של הגברה הוא ~ 0.8-1.5 מיקרוגרם של RNA.</li>
	</ol></li>
	<li>שעתוק הפוך של RNA:<ol>
<li>כדי ליצור cDNA מ- aRNA, השתמש 1.0 מיקרוגרם של aRNA ב 20 μl של תגובת שעתוק הפוכה. מספר ערכות זמינות מסחרית למטרה זו. הערה: cDNA סונתז על פי פרוטוקול היצרן באמצעות ההגדרות הבאות על מחזור תרמי. 5 דקות ב 25 מעלות צלזיוס 30 דקות ב 42 מעלות צלזיוס 5 דקות ב 85 מעלות צלזיוס להחזיק ב 4 °C (69 °F)</li>
		<li>לאחר שלב התמלול ההפוך, אחסן את ה- cDNA ב- -20 °C (70 °F) לאחסון לטווח ארוך.</li>
	</ol></li>
	<li>עיצוב ותקינה של פריימר: מספר תוכנות מצוינות זמינות, ללא תשלום, עבור עיצוב פריימרים עבור הגברות בזמן אמת.<ol>
<li>בחר 18-24 מר אוליגונוקלאוטידים המייצרים 70-110 bp amplicons ולסנתז את פריימרים באמצעות מקורות מסחריים. הערה: שניים עד שלושה זוגות פריימר צריך להיות מתוכנן עבור כל גן של עניין. כל ערכת פריימר צריכה להיות מתוקננת לפי qPCR. זוגות פריימר קדימה והפוך ששימשו עבור הגן CREB1 (איור 4) הם להלן: ערכת פריימר 1 קדימה: 5'-TGATTCTGACGAAGAAAAGA-3' הפוך: 5'-ACCGGAGACAGTCAGTTGTAGA-3' ערכת פריימר 2 קדימה: 5'-אגאטגאטגאטגאגאגהאגה-3' הפוך: 5'-GACACACAGGAAGTATGCCAAA-3'</li>
		<li>כדי לבחור את פריימר הטוב ביותר שישמש לניתוחים במורד הזרם, לפקח על ערך Ct ואת הצורה של עקומת הגברה ב qPCR. הערה: פריימרים המעניקים ערכי Ct (סף מחזור) בין 10-35 בהגברה העגולה 40 ועקומות חלקות במהלך השלב המעריכי של PCR ואחריו רמה חלקה הם אופטימליים לניתוח ביטוי גנים.</li>
	</ol></li>
	<li>PCR כמותי בזמן אמת (qPCR): הערה: השתמש בצינורות או בלוחות המתאימים התואמים למכונת qPCR.<ol>
<li>לדלל cDNA ל 5x עם מים ללא גרעין.</li>
		<li>כדי 2 μl של cDNA מדולל, להוסיף 8 μl של תערובת הורים qPCR המכיל 2 μl של H2O, 5 μl של 2x SYBR גרין מאסטר לערבב, ו 1.0 μl של 10 מיקרומטר (כל) פריימר קדימה והפוך.</li>
		<li>סגור את הצינורות ולאטום את הצלחת לאחר pipetting cDNA ותערובת הורים. ערבבו את התוכן על ידי הקשה עדינה וסיבוב כלפי מטה במהירות של 1,500 סל"ד למשך 30 שניות.</li>
		<li>המשך בהגדרת מחשב ה- qPCR.</li>
	</ol></li>
</ol>

לסופרים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

הנוירון R15 מעורב בוויסות מערכות לב וכלי דם, עיכול, נשימה ורבייה30. פעילות מתפוצצת קצבית באופן קבוע של AP היא תכונה של R15. כפי שמוצג בסעיף התוצאות, הקלטה מזווגת של R15 ו- L7 מראה כי הכנת הגרעינים שמרה על פעילות של נוירונים R15. נוירונים R15 ו- L7 הגיבו כראוי לאח. הכנה גרעינית זו יכולה להישמר עד 8-10 שעות ופעילות אלקטרופיזיולוגית יכולה להיות במעקב רציף. לכן, אפשר לחקור את ההשפעות האלקטרופיזיולוגיות של חשיפה נוירוטרנסמיטר קצר (נחשף באופן מקומי לנוירון מסוים או לאמבטיה) במשך תקופה ארוכה של זמן. יתר על כן, אפשר לחקור את ההשפעות של חשיפה נוירוטרנסמיטורים מרובים (בו זמנית או במשולב) על אותו נוירון על תכונות ירי של עצמו או נוירון חסיד או שניהם.
דוגמה למדידות ביטוי גנים לפי qPCR מוצגת באיור 4. מאז התוכן RNA של נוירון יחיד הוא נמוך, הגברה במבחנה יש צורך להשיג כמות מספקת של RNA עבור ביטוי כמותי של גנים מרובים. ערכות מסחריות זמינות עבור תהליך שעתוק במבחנה. ההגברה של תעתיק CREB1 כומתה ישירות על ידי מספר המחזורים הדרושים להשגת אות פלואורסצנטי מתוקננת, Ct-method31. RNA מוגברת של נוירון יחיד מספיק למחקרים כדי לקבוע שינויים ביטוי גנים במספר רב של גנים באמצעות microarray32 ועל התמלול כולו על ידי ניתוחים RNAseq33.
מגבלה של טכניקה זו היא כי הכנה זו לא יכול לשמר את כל הקשרים הסינפטיים של הנוירונים של הגרעינים הבטן. כמה נוירונים טופס סינפסות עם נוירונים גרעינים אחרים ובהכנת הגרעינים אלה קשרים למרחקים ארוכים יחסרו. עם זאת, המתודולוגיה המתוארת כאן ניתן לשנות בקלות כדי לכלול את מערכת העצבים המרכזית כולה או יכול להיות משולב בקלות הכנה שלם למחצה13,14,16 שתואר לחקור שינויים הסלולר electrophysiological רפלקס נסיגה גיל ו siphon.
ההתקדמות האחרונה בטכניקות גנומיות מאפשרת לנו כעת לקבל תובנה עמוקה על הדינמיקה של ביטוי של קידוד ו- RNAs34ללא קידוד . ההכנה המופחתת המתוארת כאן היא אידיאלית לחקר שינויים זמניים של ביטוי גנים בשילוב עם מדידות אלקטרופיזיולוגיות. לדוגמה, ניתן ליישם סוכנים תרופתיים ולמדוד את השפעתם על תכונות חשמליות של נוירונים בודדים או נוירונים מרובים שהם חלק מאותם מעגלים עצביים ולבודד נוירונים בודדים בזמנים שונים לבידוד RNA. ההשפעה של מניפולציה של נוירון יחיד (כגון גירוי חשמלי, או חשיפות לסוכנים תרופתיים) על המעגלים המזוהים כולו ניתן ללמוד ברמה של שינויים בביטוי של גנים ספציפיים נוירונים בודדים. לכן מתודולוגיה זו מאפשרת שילוב מוצלח של מתודולוגיות אלקטרופיזיולוגיות וגנומיות לחקר מעגלים עצביים ב Aplysia.
גישה זו יכולה להתרחב בקלות לחקר מודלים חסרי חוליות אחרים כגון רכיכה nudibranch טריטוניה, חילזון בריכה Lymnaea, סליל חילזון יבשתי שמערכות העצבים שלו מכילות מספר נוירונים מזוהים35-57. מודלים אלה משמשים גם בהרחבה לחקר השליטה העצבית בהתנהגויות כגון שחייה בבריחה, אוריינטציה של שדה מגנטי, היווצרות סינפסה, למידה ואחסון זיכרון. המתודולוגיה שתיארנו היא שילוב פשוט של ניתוח גנומיקה עם מדידות פיזיולוגיות של פעילות עצבית ברמת התא הבודד. תובנה עמוקה יותר על בסיס מולקולרי ופיזיולוגי של שליטה עצבית בהתנהגות יכולה להתקבל ממחקרים כאלה.

המוח האנושי מורכב בצורה יוצאת דופן עם כמעט 100 מיליארד נוירונים וטריליוני קשרים סינפטיים. ישנם מספר כמעט שווה של תאים nonneuronal כי אינטראקציה עם נוירונים לווסת את תפקידם במוח. נוירונים מאורגנים במעגלים המווסתים התנהגויות ספציפיות. למרות ההתקדמות בהבנתנו את תפקודי המוח והמעגלים העצביים, מעט מאוד ידוע על זהותם של מרכיבי מעגלים השולטים בהתנהגות מסוימת. ידע בזהויות של מרכיבים שונים של מעגלים יקל מאוד על הבנתנו הן של הבסיס התאי והן של הבסיס המולקולרי של התנהגות וסיוע בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות להפרעות נוירופסיכיאטריות.
חילזון ימי Aplysia californica כבר סוס עבודה לקביעת מעגלים עצביים ביסוד התנהגויות ספציפיות1-14. מערכת העצבים Aplysia מכיל כ 20,000 נוירונים המאורגנים לתוך 9 גרעינים שונים. הנוירונים של Aplysia הם גדולים וניתן לזהות בקלות על סמך גודלם, תכונות חשמליות, ואת המיקום הגרעיני. Aplysia יש רפרטואר עשיר של התנהגויות שניתן ללמוד. אחת ההתנהגויות הנחקרות היטב היא רפלקס משיכת הזימים (GWR). המרכיבים העיקריים של רפלקס זה ממוקמים גרעיני בטן. רכיבים של מעגלי GWR מופו ותרומות של רכיבים שונים נקבעו. חשוב לציין, מעגלי GWR עוברים למידה אסוציאטיבית ולא אסוציאטיבית5,6,15-19. עשרות שנים של מחקר על רפלקס זה זיהו גם כמה מסלולי איתות שיש להם תפקיד מפתח בלמידה וזיכרון20-24.
מספר תכשירים שונים של Aplysia שימשו כדי ללמוד בסיס תאי ומולקולרי של אחסון זיכרון. אלה כוללים את החיה שלם2,3, הכנה שלם למחצה1,7,13,14,16 ו reconstitution של מרכיבים עיקריים של מעגלים עצביים25-29. הכנה מופחתת לחקר הגרעינים Aplysia עבור ניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של מעגלים עצביים מזוהים מתואר כאן. ארבעת הנוירונים הבאים שזוהו נחקרו. R15, נוירון מתפרץ, L7 ו L11, שני נוירונים מוטוריים שונים R2, נוירון שימוש נחקרו. R2 הוא הנוירון הגדול ביותר המתואר במערכת העצבים חסרי החוליות. בקצרה, מתודולוגיה זו כוללת טיפול פרוטאז של גרעינים, מדידות אלקטרופיזיולוגיות לפני ואחרי טיפולים תרופתיים, ובידוד של נוירונים בודדים לניתוח כמותי של ביטוי גנים. מתודולוגיה זו מאפשרת לנו לשלב ניתוחים מולקולריים עם הקלטה בו זמנית של נוירונים מרובים. מתודולוגיה זו שימשה בהצלחה כדי ללמוד את התגובות של נוירונים R15 ו L7 אצטילכולין (Ach) על ידי זיווג הקלטות תאיים. בעקבות מדידות אלקטרופיזיולוגיות R15 ו- L7 ותאי עצב מזוהים אחרים כגון L11 ו- R2 בודדו לניתוח תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR) של ביטוי CREB1, גורם שעתוק חשוב לאחסון זיכרון.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="372">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:120px;">Aplysia</td>
			<td style="width:123px;">National Aplysia Resource Facility, University of Miami</td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">NaCl</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">S 3014-1KG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">KCl</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">P 9333-500G</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">CaCl2&#8226;2H2O</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">C5080- 500G</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">MgCl2&#8226;6H2O</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">BP 214-501</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">NaHCO4</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">S 6297-250G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">H 3375-500G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Protease</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:129px;">17105-042</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Trizol</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">15596-026</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Chloroform</td>
			<td style="width:123px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:129px;">2194002</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">ACROS</td>
			<td style="width:129px;">64-17-5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">GlycoBlue</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9515</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">3 M NaOAc, pH 5.5</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9740</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9737</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:120px;">MessageAmp II aRNA Amplification Kit</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM1751</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">qScript cDNA SuperMix</td>
			<td style="width:123px;">Quanta Biosciences</td>
			<td style="width:129px;">95048-100</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">Power SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">4367659</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Forceps</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">11252-20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Scissors</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">15000-08</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:120px;">Stainless Steel Minutien Pins&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">26002-10 or</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:129px;">26002-20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Veriti Thermal Cycler</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">Veriti Thermal Cycler</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">5430R Centrifuge</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:129px;">5430R Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">7900HT Fast Real-Time PCR</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">7900HT Fast Real-Time PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:120px;">Amplifier</td>
			<td>BRAMP-01R</td>
			<td style="width:129px;">NPI Electronics</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:120px;">Digidata Converter</td>
			<td style="width:123px;">Instrutech ITC-18</td>
			<td style="width:129px;">HEKA ELEKTRONIK</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:120px;">Micro Manipulator</td>
			<td style="width:123px;">Patch Star</td>
			<td style="width:129px;">Scientifica</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aplysia ganglia preparation for electrophysiological and molecular analyses of single neurons

אתגר מרכזי בנוירוביולוגיה הוא להבין את היסודות המולקולריים של מעגלים עצביים השולטים בהתנהגות מסוימת. לאחר זיהוי המנגנונים המולקולריים הספציפיים, ניתן לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לטיפול במומים בהתנהגויות ספציפיות הנגרמות על ידי מחלות ניווניות או הזדקנות מערכת העצבים. חילזון ימי Aplysia californica מתאים היטב לחקירות של בסיס תאי ומולקולרי של התנהגות כי מעגלים עצביים שבבסיס התנהגות מסוימת ניתן לקבוע בקלות את המרכיבים הבודדים של המעגלים יכולים להיות מניפולציה בקלות. יתרונות אלה של Aplysia הובילו למספר תגליות בסיסיות של נוירוביולוגיה של למידה וזיכרון. כאן אנו מתארים הכנה של מערכת העצבים Aplysia לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של נוירונים בודדים. בקצרה, גנגליון מנותח ממערכת העצבים נחשף פרוטאז כדי להסיר את נדן גנגליון כך נוירונים נחשפים אבל לשמור על פעילות עצבית כמו החיה שלם. הכנה זו משמשת לביצוע מדידות אלקטרופיזיולוגיות של נוירונים בודדים או מרובים. חשוב לציין, בעקבות ההקלטה באמצעות מתודולוגיה פשוטה, הנוירונים יכולים להיות מבודדים ישירות מן הגרעינים לניתוח ביטוי גנים. פרוטוקולים אלה שימשו לביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בו זמנית של נוירונים L7 ו- R15, ללמוד את תגובתם אצטילכולין וביטוי כמותי של גן CREB1 מבודד יחיד L7, L11, R15, ו R2 נוירונים של Aplysia.

משקלם של בעלי החיים ששימשו במחקר זה נע בין 100-200 גרם. בעקבות הפרוטוקולים המתוארים, ערכנו מדידות אלקטרופיזיולוגיות וניתוח מולקולרי של נוירונים של גרעיני בטן מבודדים מבעלי חיים הנעים בין 2-5 גרם ל -200-300 גרם.
סטנדרטיזציה של טיפול פרוטאז חשוב למדידות אלקטרופיזיולוגיות מוצלחות של נוירונים בגרעינים. בתחילה, ריכוזים מרובים פרוטאז (Dispase) משכי זמן שימשו פוטנציאל פעולה מתפרץ מ R15 נוירון נרשמו26,31. מדידות אלה הושוו להקלטה ישירה (ללא טיפול פרוטאז) מהגרעונים שלמים. ריכוז הפרוטאז (0.1% פרוטאז, ראו שלב 1.3) שיצר פוטנציאל מתפרץ שהיה דומה לאלה שהתקבלו מגנגליון חשוף ללא פרוטאז שימשו בניסויים הבאים.
באמצעות הפרוטוקול המתואר, פוטנציאל פעולה (AP) בתגובה לחשיפה Ach R15, נוירון שימוש L7, נוירון מוטורי שאינו מגיב Ach נרשמו. כצפוי, הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בו זמנית מראות כי Ach לגרום depolarization ב R15 ואילו לא היה שינוי בירי של L7. איור 2 מציג את היישום של אצטילכולין (Ach) ישירות לתוך תא התא. 1 M Ach (נפח 0.3 μl) הוחל ישירות לתוך התא באמצעות micropipette על מנת להשיג ריכוז סופי 1 מ"מ בתוך התא.
Ach נשטף מהאמבטיה על ידי זלוף ונרשם שוב מתאי עצב R15. איור 3 מציג צורות גל המצביעות על כך שאפקט Ach הפיך. ניתוח הפרמטרים AP בשליטה, במהלך depolarization ואחרי לשטוף מוצג. במהלך דפולריזציה משרעת הוא ירד ומשך AP גדל באופן משמעותי.
בעקבות מדידות אלקטרופיזיולוגיות, נוירונים R15 ו- L7 היו מבודדים ו- RNAs הוכנו לניתוחי qPCR. פולימראז T7 RNA ליניארי – שעתוק מונע באמצעות ערכת הגברה של MessageAmp II aRNA מ- Ambion שימש להגברת RNAs מתאי עצב בודדים. לשם השוואה, נוירונים מזוהים R2 ו L11 ואת כל הגרעינים הבטן ממבוגר (6-9 חודשים) ובעלי חיים צעירים (1-2 חודשים) נחקרו גם. הגברה qPCR בוצעו במערכת PCR מהירה בזמן אמת 7900HT בתנאים הבאים: 95 °C (75 °F) במשך 10 דקות, ואחריו 40 מחזורים של 95 °C (65 °F) במשך 15 שניות, 60 °C (60 °F) במשך 1 דקות. היו ארבעה משכפלים ביולוגיים בניסוי. לכל שכפול ביולוגי היו ארבעה משכפלים טכניים בהגדרת qPCR. ערכי Ct מארבעה שכפולים היו ממוצעים ו- 1/Ct חושב כדי למצוא את רמת הביטוי המוחלטת של CREB1 בכל מדגם (איור 4). הערכה של רמות הביטוי המוחלטות של גן CREB1 בגרמיות Aplysia צעירות ובוגרות, ובארבעה נוירונים בודדים שזוהו נוטרה על ידי ערך ה- Ct המתקבל ממדידות qPCR.
ריכוז ה-mRNA ההתחלתי היה זהה בגנונים צעירים ובוגרים כאחד. אותה ערכת פריימרים של CREB1 קדימה והפוך שימשו בכל qPCRs, הן במחקרים באמצעות גרעינים והן בנוירונים בודדים. ערכי ה-Ct דומים מאוד בין גרעיני בטן צעירים למבוגרים. באופן דומה, ערכי Ct נמדדו במקרה של נוירונים בודדים שבהם ריכוזי ה- mRNA הכוללים ההתחלתיים היו נמוכים ושני סבבי הגברה הניבו כמות טובה של RNAs לסינתזת cDNA. ערכי ה- Ct של הגברה CREB1 הראו כי ביטוי CREB1 בנוירונים R15 ו- L7 דומים ואילו R2 ו- L11 הראו הבדלים משמעותיים בביטוי בהשוואה ל- L7 או R15 (מבחן T של סטודנט, p<0.05) (איור 4).
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51075/51075fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51075/51075fig1.jpg"> איור 1. שלב מיקרוסקופ ומערכת זלוף לאלקטרופיזיולוגיה גרעינית. מערכת זלוף ושלב נעשו באמצעות פרספקס והם שקופים. התקנה זו נטענת על בלוק מתכת (לא מוצג) כדי להחזיק מיקום. בלוק המתכת מתוכנן כך שניתן להאיר דגימות מלמטה. דוגמה דפוס פיצוץ אלקטרופיזיולוגי נרשם נוירון R15 מוצג.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51075/51075fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51075/51075fig2.jpg"> איור 2. הקלטה בו זמנית מ L7 ו R15 נוירון של גרעיני בטן. ( A )קריקטורהשל גרעיני בטן המציגים את המיקום של נוירונים L7 ו- R15 (שונה מקנדל 2001, הודפס מחדש באישור AAAS). כמו כן מוצגים התנוחות של R2 ו- L11 בג הגרעינים הבטן. (ב)הקלטות תאיות מייצגות מ-L7 ו-R15. החץ מציין את השעה של יישום Ach. אפשר להמשיך את המדידות האלה במשך 8-10 שעות.
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51075/51075fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51075/51075fig3.jpg"> איור 3. Ach גרם לשינויים בפוטנציאל הפעולה (AP) של R15. צורות גל AP נותחו לפני, במהלך ואחרי החשיפה Ach. צורות גל מייצגות מוצגות. ms: אלפית השנייה, mV: מילי וולט.
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51075/51075fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51075/51075fig4.jpg"> איור 4. qPCR ניתוח של ביטוי של CREB1 גרעיני בטן נוירונים בודדים מזוהים. (A)כימות מוחלט של תעתיק CREB1 בג הגרעינים הבטן הצעירים והמבוגרים של Aplysia. סה"כ RNA בודד באמצעות פרוטוקול Trizol סטנדרטי כמתואר בשיטות. 1 מיקרוגרם של RNA הכולל שימש לסנתז cDNA, ואחריו הגברה PCR בזמן אמת באמצעות פריימרים CREB1. (B)כימות מוחלט של תעתיק CREB1 בנוירונים בודדים שזוהו של Aplysiaהישן . סה"כ RNA היה נתון לשני סבבים של הגברה במבחנה לפני סינתזת cDNA. 1 מיקרוגרם של aRNA שימש לסנתז cDNA, ואחריו הגברה PCR בזמן אמת באמצעות פריימרים CREB1.

Watch this Scientific Journal Video about Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons at JoVE.com

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

חילזון ימי Aplysia californica כבר בשימוש נרחב כמודל נוירוביולוגיה למחקרים על בסיס תאי ומולקולרי של התנהגות. כאן מתוארת מתודולוגיה לחקר מערכת העצבים של Aplysia לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של נוירונים בודדים של מעגלים עצביים מזוהים.

אקליפסיה (1991) הכנת גנגליה לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של נוירונים בודדים

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

aplysia-ganglia-preparation-for-electrophysiological-molecular

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

9.0K Views.  The Scripps Research Institute, Florida. חילזון ימי Aplysia californica כבר בשימוש נרחב כמודל נוירוביולוגיה למחקרים על בסיס תאי ומולקולרי של התנהגות. כאן מתוארת מתודולוגיה לחקר מערכת העצבים של Aplysia לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של נוירונים בודדים של מעגלים עצביים מזוהים.

Video: Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science. Methods for particle trapping based on optical, magnetic, electrokinetic, and acoustic techniques have led to major advancements in physics and biology ranging from the molecular to cellular level. In this article, we introduce a new microfluidic-based technique for particle trapping and manipulation based solely on hydrodynamic fluid flow. Using this method, we demonstrate trapping of micro- and nano-scale particles in aqueous solutions for long time scales. The hydrodynamic trap consists of an integrated microfluidic device with a cross-slot channel geometry where two opposing laminar streams converge, thereby generating a planar extensional flow with a fluid stagnation point (zero-velocity point). In this device, particles are confined at the trap center by active control of the flow field to maintain particle position at the fluid stagnation point. In this manner, particles are effectively trapped in free solution using a feedback control algorithm implemented with a custom-built LabVIEW code. The control algorithm consists of image acquisition for a particle in the microfluidic device, followed by particle tracking, determination of particle centroid position, and active adjustment of fluid flow by regulating the pressure applied to an on-chip pneumatic valve using a pressure regulator. In this way, the on-chip dynamic metering valve functions to regulate the relative flow rates in the outlet channels, thereby enabling fine-scale control of stagnation point position and particle trapping. The microfluidic-based hydrodynamic trap exhibits several advantages as a method for particle trapping. Hydrodynamic trapping is possible for any arbitrary particle without specific requirements on the physical or chemical properties of the trapped object. In addition, hydrodynamic trapping enables confinement of a "single" target object in concentrated or crowded particle suspensions, which is difficult using alternative force field-based trapping methods. The hydrodynamic trap is user-friendly, straightforward to implement and may be added to existing microfluidic devices to facilitate trapping and long-time analysis of particles. Overall, the hydrodynamic trap is a new platform for confinement, micromanipulation, and observation of particles without surface immobilization and eliminates the need for potentially perturbative optical, magnetic, and electric fields in the free-solution trapping of small particles.

In this article, we present a microfluidic-based method for particle confinement based on hydrodynamic flow. We demonstrate stable particle trapping at a fluid stagnation point using a feedback control mechanism, thereby enabling confinement and micromanipulation of arbitrary particles in an integrated microdevice.

Microfluidic מבוססי הידרודינמית מלכודת חלקיקים יחיד

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

Evaluation of Biomaterials for Bladder Augmentation using Cystometric Analyses in Various Rodent Models

Renal function and continence of urine are critically dependent on the proper function of the urinary bladder, which stores urine at low pressure and expels it with a precisely orchestrated contraction. A number of congenital and acquired urological anomalies including posterior urethral valves, benign prostatic hyperplasia, and neurogenic bladder secondary to spina bifida/spinal cord injury can result in pathologic tissue remodeling leading to impaired compliance and reduced capacity1. Functional or anatomical obstruction of the urinary tract is frequently associated with these conditions, and can lead to urinary incontinence and kidney damage from increased storage and voiding pressures2. Surgical implantation of gastrointestinal segments to expand organ capacity and reduce intravesical pressures represents the primary surgical treatment option for these disorders when medical management fails3. However, this approach is hampered by the limitation of available donor tissue, and is associated with significant complications including chronic urinary tract infection, metabolic perturbation, urinary stone formation, and secondary malignancy4,5.
Current research in bladder tissue engineering is heavily focused on identifying biomaterial configurations which can support regeneration of tissues at defect sites. Conventional 3-D scaffolds derived from natural and synthetic polymers such as small intestinal submucosa and poly-glycolic acid have shown some short-term success in supporting urothelial and smooth muscle regeneration as well as facilitating increased organ storage capacity in both animal models and in the clinic6,7. However, deficiencies in scaffold mechanical integrity and biocompatibility often result in deleterious fibrosis8, graft contracture9, and calcification10, thus increasing the risk of implant failure and need for secondary surgical procedures. In addition, restoration of normal voiding characteristics utilizing standard biomaterial constructs for augmentation cystoplasty has yet to be achieved, and therefore research and development of novel matrices which can fulfill this role is needed.
In order to successfully develop and evaluate optimal biomaterials for clinical bladder augmentation, efficacy research must first be performed in standardized animal models using detailed surgical methods and functional outcome assessments. We have previously reported the use of a bladder augmentation model in mice to determine the potential of silk fibroin-based scaffolds to mediate tissue regeneration and functional voiding characteristics.11,12 Cystometric analyses of this model have shown that variations in structural and mechanical implant properties can influence the resulting urodynamic features of the tissue engineered bladders11,12. Positive correlations between the degree of matrix-mediated tissue regeneration determined histologically and functional compliance and capacity evaluated by cystometry were demonstrated in this model11,12. These results therefore suggest that functional evaluations of biomaterial configurations in rodent bladder augmentation systems may be a useful format for assessing scaffold properties and establishing in vivo feasibility prior to large animal studies and clinical deployment. In the current study, we will present various surgical stages of bladder augmentation in both mice and rats using silk scaffolds and demonstrate techniques for awake and anesthetized cystometry.

Surgical stages of bladder augmentation are described using 3-D scaffolds in murine and rat models. To test the efficacy of biomaterial configurations for use in bladder augmentation, techniques for both awake and anesthetized cystometry are presented.

הערכת Biomaterials עבור הגדלת שלפוחית ​​השתן באמצעות ניתוח Cystometric על מודלים מכרסם שונים

Renal function and continence of urine are critically dependent on the proper function of the urinary bladder, which stores urine at low pressure and ...

Molecular Entanglement and Electrospinnability of Biopolymers

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope was found to be an essential prerequisite for successful electrospinning. Rheology is a powerful tool to probe the molecular conformation and interaction of biopolymers. In this report, we demonstrate the protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan, from their dimethyl sulfoxide (DMSO)/water dispersions. Well-formed starch and pullulan fibers with average diameters in the submicron to micron range were obtained. Electrospinnability was evaluated by visual and microscopic observation of the fibers formed. By correlating the rheological properties of the dispersions to their electrospinnability, we demonstrate that molecular conformation, molecular entanglement, and shear viscosity all affect electrospinning. Rheology is not only useful in solvent system selection and process optimization, but also in understanding the mechanism of fiber formation on a molecular level.

Electrospinning is a fascinating technique used to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. Molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope is essential for successful electrospinning. We present a protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan.

מולקולרי הסתבכות וElectrospinnability של Biopolymers

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular ...

Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.

Tissue engineering often includes in vitro expansion in order to create autografts for tissue regeneration. In this study a method for tissue expansion, regeneration, and reconstruction in vivo was developed in order to minimize the processing of cells and biological materials outside the body.

רקמות טחונות ב הדחוס קולגן: A Biotransplant המכיל נייד עבור תיקון Reconstructive המבוים יחיד

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

טכניקה ללא תווית להדמית החלל-הזמן של פרשות תא בודדת

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Preparation of Silicon Nanowire Field-effect Transistor for Chemical and Biosensing Applications

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we describe the preparation of polycrystalline silicon nanowire field-effect transistors (pSNWFETs) that serve as biosensing devices for biomarker detection. A protocol for chemical and biomolecular sensing by using pSNWFETs is presented. The pSNWFET device was demonstrated to be a promising transducer for real-time, label-free, and ultra-high-sensitivity biosensing applications. The source/drain channel conductivity of a pSNWFET is sensitive to changes in the environment around its silicon nanowire (SNW) surface. Thus, by immobilizing probes on the SNW surface, the pSNWFET can be used to detect various biotargets ranging from small molecules (dopamine) to macromolecules (DNA and proteins). Immobilizing a bioprobe on the SNW surface, which is a multistep procedure, is vital for determining the specificity of the biosensor. It is essential that every step of the immobilization procedure is correctly performed. We verified surface modifications by directly observing the shift in the electric properties of the pSNWFET following each modification step. Additionally, X-ray photoelectron spectroscopy was used to examine the surface composition following each modification. Finally, we demonstrated DNA sensing on the pSNWFET. This protocol provides step-by-step procedures for verifying bioprobe immobilization and subsequent DNA biosensing application.

We describe key steps for biosensing by using polysilicon nanowire field-effect transistors, including the preparation of the device and the immobilization and confirmation of a DNA molecular probe on the nanowire surface, as well as conditions for DNA sensing.

הכנת טרנזיסטור הסיליקון Nanowire שדה ותוצאה עבור יישומים כימיים biosensing

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we ...

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.

We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.

הכנת סיבי חלבון תאי מטריקס עבור ספקטרוסקופיה ברילואן

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

הכרה מולקולרית הנדסה עם פולימרים ביו-מימטיים על פחמן Walled יחיד

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Dissection, MicroCT Scanning and Morphometric Analyses of the Baculum

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; however such coordinates must represent homologous structures across specimens. While many biological objects consist of easily identified landmarks to satisfy the assumption of homology, many lack such structures. One potential solution is to mathematically place semi-landmarks on an object that represent the same morphological region across specimens. Here, we illustrate a recently developed pipeline to mathematically define semi-landmarks from the mouse baculum (penis bone). Our methods should be applicable to a wide range of objects.

Many biological structures lack easily definable landmarks, making it difficult to apply modern morphometric methods. Here we illustrate methods to study the mouse baculum (a bone in the penis), including dissection and microCT scanning, followed by computational methods to define semi-landmarks that are used to quantify size and shape variation.

ניתוח Dissection, סריקה microCT ו morphometric של Baculum

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

הכנה, טיהור, השימוש ליפוזומים המכילים חומצת שומן

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...