כל המחברים תרמו להקמת והאימות של assay הציג ולטיוטה של ​​כתב היד.

כל הליכי הניסוי בבעלי החיים בפרוטוקול לעקוב אחר הנחיות הטיפול בבעלי החיים של Technische Universität München, גרמניה. 1. מדיה / חלץ ההכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המגון רקמה האיכות של הומוגניזציה הרקמה היא קריטית לאיתור הבא של שינויי neuroplastic בנוירונים בתרבית. הנה, homogenizer מומלץ המאפשר ניתוק רקמות ללא עלייה משמעותית בטמפרטורת הרקמות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 5 מ&quot;מ x 5 מ&quot;מ x 5 מ&quot;מ קוביות של רקמת לבלב ישירות מ-80 מעלות צלזיוס לחנקן נוזלי ומקום בשלב מוצק בhomogenator הרקמות. Homogenator האידיאלי יהיה לנתק את הרקמה מספיק מהר, מבלי שמאפשרים לו defreeze. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר ניתוק, resuspend homogenate המוצק, כמו האבקה ב300-500 μl של פוספט שנאגרו מלוח 0.1x (PBS). הנה, לא להשתמש בכל מאגר תמוגה (כגון ריפה) שכן דבר עלול lyse הנוירונים.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה homogenates לפחות 15 דקות במהירות מקסימלית של צנטריפוגות הספסל (למשל 21,130 XG). לאסוף את supernatant ברור המייצג את תמצית הרקמות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatants שורת התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו התאים של עניין להגיע לפחות 70-80 מפגש% במדיום גידול רגיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדרך כלל, תקשורת אלה מכיל מרכיבי סרום ויכולה להפעיל את השפעה בלתי נשלטת על צמיחה עצבית. לכן, לאחר שהגיע לצפיפות התאים הרצוי, לשטוף התאים שלך לפחות 3x עם הכיתה תרבית תאי PBS ולמקם אותם במדיום סרום ללא (SFM) עד 48 שעה. הערה: הנה, קח בחשבון שחלק מתאים (כמו תאי stellate לבלב) ייתכן שיהיו צורך בסרום בתקשורת הצמיחה שלהם על מנת לשמור על המצב הרגיל שלהם ומבנה. במקרים כאלה, לבצע דילולים סידוריים סרום במדיום של התא של עניין כדי למצוא התוכן הנמוך ביותר אפשרי הסרום הדרוש לfunctio תא ללא פגעn. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את ריכוז החלבון של homogenate הרקמה או supernatants תא באמצעות assay החלבון ברדפורד. בעוד ערכים אלה משתנים בהתאם לסוג הרקמות ותאים, לתמציות רקמת לבלב, הייתי מצפה טווח ריכוז בין 5-12 מיקרוגרם / μl, ולsupernatants שורת תאים בין 3-8 מיקרוגרם / μl. </li></ol></li></ol> 2. תמציות Aliquot וSupernatants הסלולרי בהתאם לריכוז לשימוש בassay, הריכוז הסופי של התמצית או supernatant במדיום העצבי צריך להיות 100 מיקרוגרם / מיליליטר 5,8. הערה: לקבלת assay עם הנוירונים גדל ב500 בינוני μl בבאר כל צלחת 24 גם, צריך 50 מיקרוגרם של חלבון מתמצית או supernatant לכל טוב. בריכוז תמצית אופייני של כ 10 מיקרוגרם / μl, אחד היה צריך 5 μl של התמצית / supernatant לכל אחד. בכל settinגרם שבוצע כשלושה עותקים, זה היה מתאימות ל15 μl של התמצית / supernatant. לסוגים שונים של רקמות או תאים, לבצע דילולים סדרתי של התמצית הסופית או ריכוז supernatant ולהשוות את השפעות נוירוטרופי שנצפו בין ריכוזי התמצית / supernatant השונים. 3. בידוד של נוירונים ברגע שאוסף התמצית / supernatant הוא סיים, להמשיך עם בידוד של נוירונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנוירונים DRG, לאסוף את צוואר הרחם להמותני DRG של חולדות שזה עתה נולדו בין יום לידה (P) 2-12 לאחר (איור 1 א) עריפת הראש ונתיחת stereomicroscopic של DRG. על מנת לקבל נוירונים DRG מספיק לצלחת 24 גם, לאסוף את כל צוואר הרחם להמותני DRG של עכברוש יילוד אחד (שווה 52 DRG) לכל צלחת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור מהפריפריה (עצבי) ותחזיות מרכזיות (שורשים) של DRG באמצעות microscissors. עוזב את התחזיות במקום פוגע בטחינה דקה ומגביר tהוא זיהום סיכון של תרבות על ידי fibroblasts. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנוירונים מגה פיקסל, לחתוך את לפדר מהמעי הדק וידני ולפשוט בזהירות את שכבת seromuscular של המעי דק (לפרוטוקול מפורט על בידוד MP, עיין שפר et al. 9, איור 1). לחבר פרלמנט, לאסוף מקלעת משתי חולדות ל24 גם צלחת. הערה: נסה להיות עדין ככל האפשר על מנת למנוע קרעים בשכבת seromuscular שכן הם פוגעים הפרדה המוצלחת שלה מהמעי הדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את DRG ושכבת seromuscular במדיום חיוני מינימאלי קר כקרח (MEM) מסופק עם גנטמיצין (20mg במדיום 500ml) וmetronidazol (2.5 מ&quot;ג ב500 בינוני מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות אוסף של DRG, דגירתם בתמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) מסופקת עם סוג collagenase השני של 20-30 דקות. לבידוד MP, דגירה בסוג collagenase בין 1-3 HR, בהתאם לגילושל בעל החיים (איור 1 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחבר פרלמנט, לאסוף את חלקי MP דמוי רשת תחת סטראו ולהעביר לממ קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז triturate DRG ו MP באמצעות מזרקים עם ירידה בקוטר. הערה: טחינה דקה מוגזמת יכולה להרוס את תאי העצב, אבל פחות תאי גליה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעם אחת הבינוני מכיל DRG או MP הפכה מעונן, צנטריפוגה את ההשעיה ב93.9 XG במשך 5 דקות, להשליך בינוני ו resuspend במדיום Neurobasal (בתוספת 100 U / ml פניצילין, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, L-גלוטמין 0.5mm ו -2% ב-27). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את המספר הכולל של תאים (כלומר תאי עצב וגליה) באמצעות hemocytometer. שים לב: מספר התאים הדרושים תלוי בפרמטר המדידה. לכימות של צפיפות neurite, צריך תרבויות צפופות יותר ולכן מספר גדול יותר של תאים מאשר למדידת תולדת neurite, גודל perikaryonalוהסתעפות דפוס של נוירונים בודדים. עבור מדידות צפיפות neurite, השתמש למשל 10,000 תאים (תא עצב + גליה) / טוב או 1,500 תאי עצב / כן. לmorphometry על נוירונים בודדים, trypsination קצר (באורך דקה-1) של תאים וזריעה של 2,500 תאים / טוב או 400 נוירונים / גם מומלץ. התשואה האופיינית לתאים המתקבלים מעכברוש אחד לא בסביבה 300,000-500,000 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי התאים ביום 13 בcoverslips מ&quot;מ אשר היו מצופים בלילה שלפני ולמעלה בארות עם מדיום Neurobasal (בתוספת 100 U / ml פניצילין, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, 0.5 מ&quot;מ L-גלוטמין ו -2% ב-27) (איור 1D). הערה: השימוש בפולי-D-ליזין (40 מ&quot;ג / מ 2) או ornithine-ומכסה מחליק (1 מ&quot;ג / מיליליטר כל אחד) מצופה מצופה laminin. תאים לצרף לפולי-D-ליזין מאוד מהר, ובכך הופכים אותו מתאים לניסויים שבהם יש צורך בתאים רבים (מדידות צפיפות neurite כלומר). קובץ מצורף לlaminin הוא בחלק כללימה חלש יותר, אבל laminin הוא אמרגן חזק של תולדת neurite. לכן, מדידות על הסתעפות עצבית ואורך neurite, מעדיף ornithine / laminin ציפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר התאים לצרף לבארות לילה. ביום למחרת, להכין את מדיה בתוספת התמצית (בריכוז התמצית / supernatant סופי של 100 מיקרוגרם / מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את מדיום הזריעה, ולבצע שטיפה אופציונלית, מאוד עדינה עם PBS, ולאחר מכן פיפטה התמצית / מדיה בתוספת supernatant (איור 1E) באיטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו התאים לגדול במשך 48 שעות. לשאוב את התקשורת ולתקן paraformaldehyde 4% לimmunostaining (איור 1F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מכתים כפול immunofluorescence באמצעות נוירון ספציפי (למשל בטא III-טובולין) וגליה ספציפית (לדוגמא: גליה fibriallary חלבון חומצי / GFAP) סמנים (איור 1G). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לmorphometry, השתמש מיקרוסקופ אור הפוכה מצוידת במצלמת CCD בwi שילובה תוכנה אוטומטית המאפשרת מדידה של צפיפות neurite (ראה טבלה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפיפות neurite של תרבויות עצביות נמדדת על 4-5 photomicrographs הנציג ב200x הגדלה מ4 אזורים שונים של הצמיחה הצפופה ביותר על כל coverslip ידי שכיסה 50 מיקרומטר x 50 רשת מיקרומטר וסופר את צפיפות סיבים לכל מ&quot;ר שנמדדה בסיבים מצטלבים. התוצאה neurite, אומר מספר סניפים לכל נוירון, אורך הסניף הממוצע וגודל perikaryonal ניתן למדוד מ30 נוירונים בודדים שנבחרו באקראי מכל coverslip על ידי סימון neurites וperikarya (איור 1H). </li></ol>

<ol>
	<li>Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+plasticity+in+the+gastrointestinal+tract:+chronic+inflammation,+neurotrophic+signals,+and+hypersensitivity.">Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity.</a> Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).</li><li>Vasina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+neuroplasticity+evoked+by+inflammation.">Enteric neuroplasticity evoked by inflammation.</a> Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).</li><li>Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+enteric+nervous+system+during+intestinal+inflammation.">Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation.</a> Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microenvironment+in+chronic+pancreatitis+and+pancreatic+cancer+induces+neuronal+plasticity.">The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity.</a> Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).</li><li>Schafer, K. H., Mestres, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GDNF-induced+neurite+outgrowth+and+neuronal+survival+in+dissociated+myenteric+plexus+cultures+of+the+rat+small+intestine+decreases+postnatally.">The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally.</a> Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).</li><li>Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+neural+stem+cells+in+the+enteric+nervous+system.">Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system.</a> Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).</li><li>Liebl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+severity+of+neural+invasion+is+associated+with+shortened+survival+in+colon+cancer.">The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer.</a> Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).</li><li>Sch&#228;fer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+isolation+of+myenteric+plexus+from+the+newborn+rat+gastrointestinal+tract.">A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).</li><li>Ceyhan, G. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+and+artemin+are+paracrine+mediators+of+pancreatic+neuropathy+in+pancreatic+adenocarcinoma.">Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma.</a> Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+in+chronic+pancreatitis+is+mediated+via+the+neurturin/GFRalpha2+axis.">Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).</li><li>Joseph, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut.">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li></ol>

יש המחברים אין אינטרסים מתחרים ואין גילויים פיננסיים.

הפרוטוקול הנוכחי נועד כדי להמחיש את המתודולוגיה מאחורי assay neuroplasticity הלבלב במבחנה אשר פותח לאחרונה על ידי הקבוצה שלנו כדי ללמוד את המכניזם של neuroplasticity בPCA וCP 5. הפרוטוקול כרוך בהליך של שלושה ימים אשר יכול בקלות להיות מיושם ברגע שהשחקן צבר מספיק ניסיון בבידוד והתרבות של נוירונים DRG וחבר הפרלמנט. יתר על כן, הוא מייצג כלי רב ערך ללימוד התגובה הקשורה של enteric וגליה קשור-DRG לרכיבי microenvironmental לבלב. לדעתנו, אחת התכונות מעניינות ביותר של assay זה הוא יכולתה לזהות ולדמות את השינויים המתרחשים במהלך PCA וCP (הנבטה עצבית כלומר והיפרטרופיה) בהגדרה פשוטה במבחנה. ואכן, יישום של תמציות רקמה או תוצאות supernatants תא בשינויים במורפולוגיה עצבית which ניתן לאתרם ברגישות מספקת באמצעות ניתוח morphometric השיטתי. לאחרונה, אנחנו יכולים גם להוכיח כי assay זה הוא גם רגיש כדי לזהות את ההבדלים בפוטנציאל נוירוטרופי של כמה גופים בסרטן בהשוואה בו זמנית: כאשר תכונות נוירוטרופי של שורות תאי PCA הושוו לשורות תאים מסרטן מעי גס, שורות תאי PCA מושרה באופן משמעותי צפיפויות neurite יותר בקרב נוירונים DRG מ קווי סרטן מעי גס 8. גם בהשוואה של פי הטבעת לעומת שורות תאי סרטן מעי גס, שורות תאי סרטן המעי הגס היו נחותות לתאי סרטן פי הטבעת במונחים של 8 פוטנציאל neuroplastic. אחד היתרונות המרכזיים של assay זה הוא הנגישות קלה שלה לmorphometric לא רק, אלא גם ניתוחי אלקטרו. בניגוד לתאי עצב באתרו בהכנות פרוסה, הקלטות מתא העצב בassay שלנו בתקשורת מוגדרת או בbsence / על הנוכחות של גורמים מוגדרים מבחינה טכנית אינה דורשות ויכולה לספק מידע רב ערך על התפקיד של מולקולות שנבחרו במייקר אלה על פעילות עצבית. אין ספק, assay הציג לא צריך להיחשב להיות מוגבל אך ורק למחקר של שאלות הקשורות לneuroplasticity לבלב. Neuroplasticity הוא מאפיין בולט של כל מערכת העיכול במצבים פתולוגיים, כגון נוירופתיה enteric דלקתית 1-3. כל התנאים הללו דווחו ללהיות קשורים לשינויים במורפולוגיה עצבוב ופעילות עצבית שינתה 1-3. לפיכך, אין זה מתקבל על הדעת להחליף תמציות רקמת לבלב או שורות תאים על ידי אלה הנגזרים מהרקמות המתאימות וללמוד את השפעתם הספציפית על תאי עצב וגליה נלווית. הניתוח האחרון שלנו על ההשוואה של רקמות סרטן לבלב ומעי גס לתמוך ברעיון זה 8. עם זאת, זה גם מתקבל על הדעת לassumדואר שרכיבים של microenvironments רקמות שונה עשויים שלא לגרום לשינויים רגישים ונציג כמו שאנו רואים באופן שיגרתי במרכיבי רקמת לבלב. לכן, אנו ממליצים על ההערכה המקיפה הקודמת של מורפולוגיה עצבית הנגרמת על ידי רקמות &quot;חיוביות&quot; שליטה (כלומר רקמות עם היפרטרופיה עצבית למשל הפגינה בהיסטולוגיה) לעומת רקמות &quot;שליליות&quot; שליטה (כלומר ללא עדות היסטולוגית להיפרטרופיה עצבית). הניתוחים הקודמים שלנו על התגובה של גליה בassay זה היו מוגבלים לקביעת ספירת תאי גלייה במייקר לבלב שונה. תאי גליה בעלי חשיבות המתעוררות בנוירוביולוגיה מאז ההכרה בפוטנציאל העצבי שלהם והתעניינות הגוברת בזרמי סידן לאורך קרום גליה 12. לכן, תאי גליה בassay זה נגישים גם לניתוחים פונקציונליים נוספיםעל ידי גישות חדשות. עם זאת, גישות חדשניות נוספות כגון צריכה אימות נרחבת קודמת לפני היישום שלהם למחקרים נוספים. כמו כל assay ניסיוני אחר, גם assay neuroplasticity הציג דובים כמה השוואה מוגבלת של דגימות רקמה אנושיות המתקבלות ממטופלים שונים שעברו ניתוח. זה הכרחי לרקמות אלה שייגזרו מאזורי רקמות זהים (למשל ראש הלבלב, ממסת הגידול העיקרית) עבור ניתוחים אמינים 1. יתר על כן, גם כאשר תנאי זה מתקיים, לא ניתן לשלול הבדלים נוספים ברקמה או בביולוגיה של גידול בהתחשב בשונות הגדולות בדפוס התגובה הביולוגי של אנשים שונים 1. כדי לעקוף את הבדלי רקמה הבודדים אלה, אנו ממליצים ביצועים של assay עם רקמות המתקבלות מחולים רבים ככל האפשר, כלומר עם לפחות 5 - 10 חולים שונים לכל ישות. כהיבט טכני מפתח, ברצוננו להפנות את תשומת לב לתפקידם של חומרי ציפוי על צמיחה עצבית. גם כפי שהוזכר לעיל, אנו מעדיפים פולי-D-ליזין למדידות בצפיפות neurite, וציפוי ornithine / laminin עבור אלה על דפוס הסתעפות / תולדה עצבית בודד. בידיים שלנו, בעוד שמדידה של תולדה עצבית יכולה גם להתבצע ב- מכוסה יזין D פולי משטחים, אנו מוצאים כי גישה זו נוטה להקטין את הרגישות של assay להבדלים בפועל. לכן, חוקרים פונים assay זה צריכים להבטיח את השימוש בחומר הציפוי האופטימלי לשאלתם של עניין. לסיכום, אנו מאמינים כי assay neuroplasticity הציג מייצג כלי רב ערך כדי לקבל מידע מהיר ושחזור בנוירו מורפולוגיה ונוירו פונקציה במייקר רקמות שונה, כפי שמודגם בדוגמא שלרקמת לבלב. זיהוי רגיש של הבדלים בנוירו מורפולוגיה הכנגרמים על ידי תוכן רקמת לבלב שונה מדגיש את שחזור במבחנה של neuroplasticity הלבלב בPCA וCP אדם. מאמצים עתידיים יהיו לכוון להקרנת preassay מותאמת של supernatants מיושם ותמציות כדי להשיג את המדיה המוגדרת הטוב ביותר ללימוד-הקשורים למחלות במערכת העיכול neuroplasticity.

שינויים במורפולוגיה במערכת העיכול (GI) עצב וצפיפות תפסו את תשומת הלב של גסטרואנטרולוגים ופתולוגים במשך זמן רב, אבל הרלוונטיות שלהם להפתופיזיולוגיה של מחלות במערכת העיכול אינן ידועות 1-3. ואכן, כמה הפרעות במערכת העיכול נפוצות מאוד כגון דלקת קיבה, ושט ריפלוקס, דלקת המעי הגס, דלקת, ודלקת תוספתן קשורות עם צפיפות עצבוב מוגברת באזורי רקמה דלקתיים 1. עם זאת, לא שמו לב אמיתי עד כה שילם למנגנונים והמשמעות של neuroplasticity במערכת העיכול. האם עצבים במערכת העיכול מורפולוגית שינו שונים מעצבים במערכת העיכול נורמלים, כלומר המצב הנורמלי של מערכת העצבים enteric, במונחים של תפקידם? מהן ההשלכות של תוכן נוירופפטידים / הנוירוטרנסמיטר שינו בעצבי enteric פלסטיק? האם neuroplasticity ההיקפי תמיד כרוך איתות שינתה למערכת העצבים המרכזית? ואיפה התחזיות של extri פלסטיק המרכזיותמסלולים עצביים במערכת העיכול NSIC? סדרה ארוכה של שאלות מפתח כגון בקלות יכולה להיות שנוצרה כשמסתכלת על המחסור בידע שלנו על ההיבטים הפונקציונליים של neuroplasticity במערכת העיכול. המחקר של neuroplasticity GI ברמה תפקודית דורש מודלים ניסיוניים בתוקף, לשחזור ועדיין ישימים בקלות. בעידן של הגדלת פופולריות וקבלה של מודלים מהונדסים גנטי מותנים עכבר (GECoMM), כגון בהגדרות vivo לשאת את הפוטנציאל להבהיר היבטים ידועים קודם לכן של neuroplasticity GI בצורה מציאותית 1. עם זאת, העיצוב והייצור של GECoMM נשאר יקרים, עתיר עבודה, ובמיוחד בזמן אכילה. יתר על כן, הם דורשים בחירה מראש של היעד להיות מווסת על תנאי בעכבר עבר שינוי הגנטי (ביטוי יתר למשל מהונדס של גורם גדילה העצבי / NGF בתאי האפיתל enteric). לפיכך, עבור desIGN של GECoMM מוצלח, חוקרים צריכים כמה אינדיקטורים (למשל נתוני ניסוי קודמים) של יעד כדאי, כלומר, שהמולקולה של עניין (כאן NGF) יכולה לפחות להיות צפויה להפעיל לכמה תופעות רלוונטיות מבחינה ביולוגית על עצבים במערכת העיכול. בקלות ניתן לגזור אינדיקטורים כגון מנאותים במודלים של מבחנה שבה תת תא מבודד מmicroenvironment המורכב של מערכת vivo בניתן cocultured סלקטיבי באופן heterotypic 4-7. האפנון של מטרות מולקולריות בהגדרת תרבות heterotypic כזה הוא בממוצע מבחינה טכנית מסורבל פחות, מהיר יותר, ולכן יכול לסייע בprefiltering מטרות כדאיות עבור אימות במחקרי vivo. לאחרונה, הצגנו במבחנה assay neuroplasticity שנועד לדמות את הצפיפות המוגברת עצבית והיפרטרופיה של ne intrapancreaticrves בסרטן לבלב אנושי (PCA) ודלקת לבלב כרוני רקמות (CP). הנה, הנוירונים הנגזרים מגרעיני יילוד הגבי חולדה שורש (DRG) או מקלעת myenteric (MP) נחשפו לתמציות רקמה מPCA כריתה בניתוח או CP דגימות רקמות והשוואה לאלה בתרבית בלבלב אנושי נורמלי (NP) תמציות רקמה 5. במקום תמציות רקמה, אפשר גם להשתמש supernatants שורת התאים לחקור את ההשפעה של סוגי תאים שנבחרו על neuroplasticity. בשילוב עם מדידת morphometric סטנדרטית, assay neuroplasticity הציג מאפשר הערכה תקפה ושחזור של פלסטיות עצבית בתגובה לmicroenvironments לבלב שונה. במיוחד, היא מאפשרת הסימולציה של 1) neuroplasticity מורפולוגי, כלומר השינויים בתולדת neurite, הסתעפות דפוס וגודל עצבי, ו2) neuroplasticity הפונקציונלי, כלומר שינויים ברגישות של תאי עצב היקפיים. יתר על כן, לא רק פריפריה (כלומר </em&gt; Enteric), אלא גם מרכזי (כגון: DRG או בעמוד השדרה צו שני) יכולים להיכלל הנוירונים בassay ההווה כדי לבחון את התגובה מורפולוגיים ופונקציונלית שלהם לתכני רקמות במערכת העיכול שונים. בוידאו של מורה בהווה, אנחנו מדגימים את הפרוטוקול הטכני לביצוע assay זה ולדון ביתרונות והחסרונות שלה. יתר על כן, אנו מפנים את תשומת לב לתחולתו של הרעיון הבסיסי של assay זה ללימוד neuroplasticity בכל איבר במערכת העיכול.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="817">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">P1149</td>
			<td style="width:328px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ornithine/laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2533/L4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">13mm coverslips</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>For use in 24-well plates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dismembranator S</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Beta-III-tubulin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1637</td>
			<td>1:200 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-GFAP-antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0761</td>
			<td>1:400 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RIPA buffer + protease inhibitor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B-27 supplement</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Quality of B-27 is known to depend on the lot number</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin/Metronidazol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Minimal essential medium</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>31095-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>24020133</td>
			<td>Improves collagenase activity when containing Ca/Mg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase type II</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>CLS-2</td>
			<td>Obtain lots with at least 200U/mg activity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA 0,25%</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">analySIS docu software</td>
			<td style="width:149px;">Olympus</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simulating pancreatic neuroplasticity: in vitro dual-neuron plasticity assay

Neuroplasticity הוא תכונה טבועה בעצבוב המערכת ומערכת עיכול (GI) העצבים enteric תחת מצבים פתולוגיים. עם זאת, תפקיד pathophysiological של neuroplasticity בהפרעות במערכת העיכול נותר עלום. מודלים ניסיוניים חדשניים המאפשרים סימולציה ואפנון של neuroplasticity GI עשויים לאפשר הערכה משופרת של התרומה של neuroplasticity במחלות במערכת העיכול מסוימים, כגון סרטן לבלב (PCA) ודלקת לבלב כרוני (CP). כאן, אנו מציגים פרוטוקול לסימולציה של neuroplasticity לבלב תחת במבחנה תנאי שימוש בגרעיני יילוד הגבי חולדה שורש (DRG) ומקלעת myenteric הנוירונים (MP). גישה הכפולה נוירון זה מאפשר לא רק ניטור של שני neuroplasticity האיברים פנימיים וחיצוניים, אלא גם מהווה כלי רב ערך כדי להעריך עצבי ומורפולוגיה ואלקטרופיזיולוגיה גליה. יתר על כן, היא מאפשרת אפנון תפקודי של תוכן microenvironmental סיפק ללימוד Impacלא על neuroplasticity. ברגע שהוקם, assay neuroplasticity הנוכחי נושא את הפוטנציאל להיות ישים לחקר neuroplasticity בכל איבר במערכת העיכול.

neuroplasticity מורפולוגיים בטווח הגילים שצוין של חולדות שזה עתה נולדו (P2-12) וצפיפות הזריעה, הנוירונים MP וDRG כבר לבנות רשתות עצביות צפופות לאחר 48 שעה (איור 2 א). השוואה של צפיפות neurite בין הנוירונים טיפחו בPCA, CP, ותמציות NP מגלה צפיפות גדולה יותר neurite של נוירונים DRG בPCA או תמציות CP מאשר בתמציות NP (איור 2 א) 5. אנחנו בעיקר מעדיפים נוירונים MP עבור מדידות על נוירונים בודדים, שכן הנוירונים MP נוטים לנתק בקלות רבה יותר מתאי גליה שמסביב מאשר נוירונים DRG. הנה, הנוירונים MP גדלו בתמציות PCA או CP גם לבנות neurites ארוכה יותר ומפגינים דפוס מורכב יותר מאשר הסתעפות תאי עצב MP גדל במדיום NP-תמצית המכילה (איור 2) 5. העדרו של הבדל זה במורפולוגיה עצבית הנגרם על ידי NP, CP, וPCA תמציות מצביע על בעיה טכנית בssay. ברוב המקרים, זה יכול להיות בגלל 1) איכות ירודה של התמצית מוכנה בשל זמן עיבוד ארוך או 2) בשל נזק לתאי עצב שהתרחשו במהלך תהליך הבידוד. מחקרים פונקציונליים Assay neuroplasticity נושא מספיק רגישות גבוהה לגילוי שינויים הנגרמים על ידי הנוכחות או עדר של מולקולות מטרה מסוימות של עניין בתמציות או supernatants להשלימו. למשל, המצור על גורם נוירוטרופי Artemin גורם או עצב הצמיחה מתא PCA supernatants (PCC) על ידי הוספת נוגדנים ספציפיים לחסימת NGF או על ידי דלדול-Induced dynabead של תוצאות Artemin בהנחתה של היווצרות רשת עצבית (איור 2C) 10. במחקר שנערך לאחרונה, אנו יכולים להראות השפעה דומה מאוד לתרומה של גורם נוירוטרופי Neurturin לneuroplasticity בCP בהשוואה בו זמנית עם גורמי נוירוטרופי אחרים כגון NGF, גליה תאי אונליין-deriv<html> ed גורם נוירוטרופי (GDNF) או גורם בטא הפיכת צמיחה (TGF-beta) 11. גליה אותה הגישה יכולה להיות מיושמת גם על מנת להעריך את התגובה של תאים הקשורים DRG לווין גליה או גליה enteric לתוכן microenvironmental הלבלב. ואכן, אחת ההשפעות חזקות ביותר של תמציות רקמת PCA על גליה קשורה-MP-DRG או היא עלייה בולטת בצמיחה של גליה (איור 3) 5. יתר על כן, השפעה זו בולטת יותר בPCA מאשר במפלגה קומוניסטית. הנה, יש לשקול ריבוי זה של גליה לא צריך להישפט על סמך ספירת גליה מוחלטת, אלא על חלקם היחסי של תאי גליה לנוירונים (גליה נוירון מדד) 5. הדבר חשוב במיוחד לשקול מאז מספר תאי גליה בתרבויות אלה הוא קשה יותר לשלוט בשל עוצמת ההתפשטות של גליה בניגוד לתאי עצב. = &quot;תמיד&quot;&gt; בעמודים <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51049/51049fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51049/51049fig1.jpg" /> איור 1. פרוטוקול סכמטי של assay neuroplasticity במבחנה. Assay הנוכחי עושה שימוש בגרעיני יילוד הגבי חולדה שורש (DRG) ומקלעת myenteric הנוירונים (MP) כדי לחקור את ההשפעה של תמציות רקמת לבלב או supernatants תא על מורפולוגיה עצבית וגליה. DRG נאספים לאחר laminectomy הקדמי ושכבת seromuscular MP-המכילה לאחר כריתה והפשטה מכאנית של המעי דק (A, B). לאחר collagenase הסוג השני עיכול, תאי העצב הם זורעים בצפיפות הנדרשת (ראה טקסט לפרטים נוספים) מודעות טיפחו במשך 24 שעות (C, D). לאחר מכן, תמציות הלבלב מוכן הטרי (או מכל איבר במערכת העיכול של עניין) וsupernatants התא מתווספות במדיום הגידול של תאי עצב בריכוזים שהוגדרו קודם לכן (ה &#39;).לאחר 48 שעה, התרבויות קבועות paraformaldehyde 4% וכפולים immunostained נגד סמנים עצביים וגליה (F, G). המורפולוגיה העצבית, כולל צפיפות neurite, דפוס הסתעפות עצבי וגודל perikaryonal נמדדת באמצעות פרוטוקול תוכנה סטנדרטי (H). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51049/51049fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51049/51049fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51049/51049fig2.jpg" /> איור 2. Neuroplasticity הלבלב נגרם על ידי סרטן לבלב אנושי (PCA) ודלקת לבלב כרוני (CP). תמציות רקמת לבלב אנושית הנגזרות מניתוח לבלב נורמלי (NP), CP או רקמות PCA לגרום להבדלים בולטים בצפיפות neurite של ne DRG<html> urons (א) ובדפוס ההסתעפות העצבי של הנוירונים MP (ב &#39;). כאן, תמציות רקמת PCA וCP להפעיל השפעה נוירוטרופי בולטת על נוירונים DRG וחבר פרלמנט. בדומה לתמציות רקמות, גם supernatants של סוגי תאים בודדים (תאי סרטן לבלב כאן / PCC) גם להפליא להגדיל את צפיפות neurite של נוירונים DRG (C). עלייה זו, עם זאת, היא הפיכה כאשר גורמי נוירוטרופי שנבחרו כגון artemin (Artn) או גורם עצב צמיחה (NGF) מתרוקנים או חסום בsupernatants אלה. כל הנוירונים immunostained נגד בטא-III-טובולין. את כל התמונות בהגדלה של 100X. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51049/51049fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 51049fig3.jpg &quot;/&gt; תמציות לבלב רקמה מPCA או רקמות CP יש איור 3. תגובת גלייה לתוכן microenvironmental לבלב. לא רק אפקט נוירוטרופי, אלא גם לשפר את צמיחת גליה וספירת תאי גלייה בתרבויות DRG או MP. תאי גליה immunostained נגד חלבון סמן גליה גליה fibrillary חומצי (GFAP). את כל התמונות בהגדלה של 200X. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51049/51049fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay at JoVE.com

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

פלסטיות עצבית היא תכונה מוכרת יותר ויותר, אבל הבינה מספיק של מערכת העיכול (GI). כאן, בדוגמא של הפרעות לבלב אנושיות, אנו מציגים assay neuroplasticity במבחנה לחקר פלסטיות עצבית במערכת העיכול ברמה שני מורפולוגיים ופונקציונלית.

הדמיית הלבלב Neuroplasticity:<em&gt; במבחנה</em&gt; Dual-נוירון פלסטיות Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

simulating-pancreatic-neuroplasticity-vitro-dual-neuron-plasticity

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

9.7K Views.  Technische Universität München.  פלסטיות עצבית היא תכונה מוכרת יותר ויותר, אבל הבינה מספיק של מערכת העיכול (GI). כאן, בדוגמא של הפרעות לבלב אנושיות, אנו מציגים assay neuroplasticity במבחנה לחקר פלסטיות עצבית במערכת העיכול ברמה שני מורפולוגיים ופונקציונלית. 

Video: Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Development of an Audio-based Virtual Gaming Environment to Assist with Navigation Skills in the Blind

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind. Using only audio based cues and set within the context of a video game metaphor, users gather relevant spatial information regarding a building's layout. This allows the user to develop an accurate spatial cognitive map of a large-scale three-dimensional space that can be manipulated for the purposes of a real indoor navigation task. After game play, participants are then assessed on their ability to navigate within the target physical building represented in the game. Preliminary results suggest that early blind users were able to acquire relevant information regarding the spatial layout of a previously unfamiliar building as indexed by their performance on a series of navigation tasks. These tasks included path finding through the virtual and physical building, as well as a series of drop off tasks. We find that the immersive and highly interactive nature of the AbES software appears to greatly engage the blind user to actively explore the virtual environment. Applications of this approach may extend to larger populations of visually impaired individuals.

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind.

פיתוח של סביבת משחקים וירטואלית אודיו מבוססות המסייע במיומנויות ניווט בליינד

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind. Using only audio ...

A Murine Model of Cervical Spinal Cord Injury to Study Post-lesional Respiratory Neuroplasticity

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed to improve/ameliorate the respiratory failure following high cervical spinal cord injury (SCI). Here we propose a murine pre-clinical model of high SCI at the cervical 2 (C2) metameric level to study diverse post-lesional respiratory neuroplasticity. The technique consists of a surgical partial injury at the C2 level, which will induce a hemiparalysis of the diaphragm due to a deafferentation of the phrenic motoneurons from the respiratory centers located in the brainstem. The contralateral side of the injury remains intact and allows the animal recovery. Unlike other SCIs which affect the locomotor function (at the thoracic and lumbar level), the respiratory function does not require animal motivation and the quantification of the deficit/recovery can be easily performed (diaphragm and phrenic nerve recordings, whole body ventilation). This pre-clinical C2 SCI model is a powerful, useful, and reliable pre-clinical model to study various respiratory and non-respiratory neuroplasticity events at different levels (molecular to physiology) and to test diverse putative therapeutic strategies which might improve the respiration in SCI patients.

Respiratory failure is the leading cause of death following a cervical spinal cord injury. Having a reproducible, quantifiable, and reliable pre-clinical animal model of respiratory failure induced by a partial cervical injury will help to understand the subsequent respiratory and non-respiratory neuroplasticity and allow testing putative repair strategies.

מודל Murine של חוט השדרה הצווארי פגיעה לחקר פוסט lesional הנשימה Neuroplasticity

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed ...

Tissue-simulating Phantoms for Assessing Potential Near-infrared Fluorescence Imaging Applications in Breast Cancer Surgery

Inaccuracies in intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status result in suboptimal outcome of breast-conserving surgery (BCS). Optical imaging, in particular near-infrared fluorescence (NIRF) imaging, might reduce the frequency of positive surgical margins following BCS by providing the surgeon with a tool for pre- and intraoperative tumor localization in real-time. In the current study, the potential of NIRF-guided BCS is evaluated using tissue-simulating breast phantoms for reasons of standardization and training purposes.
Breast phantoms with optical characteristics comparable to those of normal breast tissue were used to simulate breast conserving surgery. Tumor-simulating inclusions containing the fluorescent dye indocyanine green (ICG) were incorporated in the phantoms at predefined locations and imaged for pre- and intraoperative tumor localization, real-time NIRF-guided tumor resection, NIRF-guided evaluation on the extent of surgery, and postoperative assessment of surgical margins. A customized NIRF camera was used as a clinical prototype for imaging purposes.
Breast phantoms containing tumor-simulating inclusions offer a simple, inexpensive, and versatile tool to simulate and evaluate intraoperative tumor imaging. The gelatinous phantoms have elastic properties similar to human tissue and can be cut using conventional surgical instruments. Moreover, the phantoms contain hemoglobin and intralipid for mimicking absorption and scattering of photons, respectively, creating uniform optical properties similar to human breast tissue. The main drawback of NIRF imaging is the limited penetration depth of photons when propagating through tissue, which hinders (noninvasive) imaging of deep-seated tumors with epi-illumination strategies.

Near-infrared fluorescence (NIRF) imaging may improve therapeutic outcome of breast cancer surgery by enabling intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status. Using tissue-simulating breast phantoms containing fluorescent tumor-simulating inclusions, potential clinical applications of NIRF imaging in breast cancer patients can be assessed for standardization and training purposes.

רקמות המדמים מטוסי פנטום להערכת יישומי דימות פלואורסצנטי קרוב אינפרא אדום פוטנציאליים בכירורגיה סרטן השד

Inaccuracies in intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status result in suboptimal outcome of breast-conserving surgery ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which disrupt normal brain function. Despite treatment with currently available antiepileptic drugs targeting neuronal functions, one third of patients with epilepsy are pharmacoresistant. In this condition, surgical resection of the brain area generating seizures remains the only alternative treatment. Studying human epileptic tissues has contributed to understand new epileptogenic mechanisms during the last 10 years. Indeed, these tissues generate spontaneous interictal epileptic discharges as well as pharmacologically-induced ictal events which can be recorded with classical electrophysiology techniques. Remarkably, multi-electrode arrays (MEAs), which are microfabricated devices embedding an array of spatially arranged microelectrodes, provide the unique opportunity to simultaneously stimulate and record field potentials, as well as action potentials of multiple neurons from different areas of the tissue. Thus MEAs recordings offer an excellent approach to study the spatio-temporal patterns of spontaneous interictal and evoked seizure-like events and the mechanisms underlying seizure onset and propagation. Here we describe how to prepare human cortical slices from surgically resected tissue and to record with MEAs interictal and ictal-like events ex vivo.

We here describe how to perform multi-electrode array recordings of human epileptic cortical tissue. Epileptic tissue resection, slice preparation and multi-electrode array recordings of interictal and ictal events are demonstrated in detail.

הקלטות מערך רב-אלקטרודה של רקמה האנושית אפילפטיים לאחר הניתוח בקליפת המוח

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Critical challenges for the diabetes research field are to understand the molecular mechanisms that regulate islet &#946;-cell replication and to develop methods for stimulating &#946;-cell regeneration. Herein a high-content screening method to identify and assess the &#946;-cell replication-promoting activity of small molecules is presented.

A-תכולה גבוהה<em&gt; במבחנה</em&gt; פלטפורמת Discovery הלבלב איילט β-cell שכפול

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Forskolin-induced נפיחות מעיים Organoids: An<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay עבור הערכת תגובה לתרופה בחולי סיסטיק פיברוזיס

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Application of End-to-end Anastomosis in Robotic Central Pancreatectomy

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of pancreatic body. With technological development, the robotic surgical system has shown its advantage in minimally invasive surgery and been increasingly applied in central pancreatectomy. However, reconstruction of the continuity of pancreas with end-to-end anastomosis after robotic central pancreatectomy has not been applied. In this study, we report surgical techniques for robotic central pancreatectomy with end-to-end anastomosis. The pancreas is reconstructed by duct-to-duct anastomosis of the pancreatic duct with a pancreatic stent inserted in the two stumps of pancreatic duct, and by end-to-end anastomosis of the pancreatic parenchyma. Compared with traditional central pancreatectomy with pancreaticoenteric anastomosis, this approach decreases the operative injury to the patient, and also conserves the integrity and continuity of the digestive duct and pancreatic duct. The robotic surgical system integrated with multiple instruments with flexible and precise movement is particularly suitable for the dissection and reconstruction of the pancreatic duct. We found that robotic central pancreatectomy with end-to-end anastomosis is safe and feasible, and we need more experience to evaluate its best indications and long-term outcomes.

The robotic central pancreatectomy with end-to-end anastomosis is feasible and safe for tumor in the pancreatic neck and proximal portion of pancreatic body. The operative techniques of this operation are presented.

יישום של End-to-end השקה ב Pancreatectomy המרכזית רובוטית

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of ...

Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation site in experimental islet transplantation is the kidney capsule. However, as less is known about the interaction of pancreatic islets with blood constituents, it also makes sense to utilize the portal vein approach in experimental islet transplantation.
This protocol demonstrates an intraportal islet transplantation technique in NMRI nude mice. Streptozotocin (180 mg/kg) is injected intraperitoneally to induce hyperglycemia in recipient mice. They are considered as diabetic at a non-fasting blood glucose level greater than 20 mmol/L. One day prior to transplantation, mouse pancreatic islets are isolated from the donor pancreas by collagenase digestion; a minimum of 350 islets are utilized per diabetic recipient. Depending upon the islet isolation yield, two or more donor mice are utilized per recipient. After overnight culture at 37 &#176;C, islets are administered into the recipient liver via the portal vein. After surgery, the mice are protected in red Makrolon houses and observed until are awake. This protocol maintains glycemic control for 120 days in syngeneic mice and 15 days in allogeneic mice.

Pancreatic islet transplantation is a way to achieve normoglycemia in type 1 diabetes. This article focuses on the transplantation technique through the intraportal route to maintain normal glucose levels in diabetic mice.

השתלת intraportal של לנגרהנס במודל עכבר

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in atherosclerosis development. However, an important factor in early stages of atheroma plaque formation is cholesterol efflux capacity to HDL (the ability of HDL particles to accept cholesterol from macrophages) in order to avoid foam cell formation. This is a key step in avoiding the accumulation of cholesterol in the endothelium and a part of reverse cholesterol transport (RCT) to eliminate cholesterol through the liver. Cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool that can be used as biomarker for atherosclerosis. Traditionally, [3H]-cholesterol has been used in cholesterol efflux assays. In this study, we aim to develop a safer and faster strategy using fluorescent labelled-cholesterol (NBD-cholesterol) in a cellular assay to trace the cholesterol uptake and efflux process in THP-1-derived macrophages. Finally, we optimize and standardize the NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Measurement of in vitro cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool as a biomarker for atherosclerosis. In the present study, we optimize and standardize a fluorescent NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.