המחברים מודים על העזרה הניסיונית בפיתוח שיטת חיסון intralymphatic בעכברים מאיריס ארדמן, ברברה פון בויסט, וג&#39;וליה מריה מרטינז-גומז. תודה גם לMaggy אראס וניקולה Cesarovic ומאפשרות לנו להשתמש בתיאטרון כירורגית שלהם לייצור בסרטון זה.

1. בהרדמה של עכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חומרי ההרדמה על ידי ערבוב של קטמין (הרדמה דיסוציאטיבית) וxylazine (הרגעה ושיכוך כאבים) שבנאגר מלוח. הריכוזים של קטמין ו xylazine בפתרון הסופי הם 12.5 ו2 מ&quot;ג / מיליליטר, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק חומרי ההרדמה לעכברים על ידי ממשל intraperitoneal באמצעות מזרק עם מחט G 25-30. השתמש 0.1 ml/10 גרם של משקל גוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל משחת עיניים לעיניים של העכברים על מנת למנוע התייבשות של הקרניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבטיח שהעכבר הוא הרדים מספיק על ידי צובט את הרגל או הבוהן שלה עם המלקחיים. אם העכבר אינו מגיב עם רפלקסים לקורט, המשך לניתוח. אם העכבר מגיב לצביטה עם רפלקסים או התכווצויות שרירים, חכה 1-2 דקות ולחזור על בדיקת הצביטה. אם העכבר עדיין מגיב, להחליף את העכבר עם בעלי חיים חדשים ולחזור על ההליכים מהשלב 1.2 ואילך. </li></ol> 2. אני כירורגיncision של אזור מפשעתי של העכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר על הגב שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרטב אזור אחד מפשעתי עם אתנול חיטוי (70%). כדי לספק חיטוי טוב יותר, באזור המפשעה עשוי להיות מגולח כדי להסיר חיטוי לפני פרווה עם אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את רגלו האחורית ולכופף את מפרק הירך כדי לייצר זווית כ 90 ° של מפרק הירך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים microdissecting מעוקלים, לקחת את העור של העכבר באזור המפשעה שבו מפרק הירך הוא כפוף ולמשוך את העור הרטוב מעט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד מחזיק את העור עם המלקחיים, לחתוך חתך קטן (&lt;5 מ&quot;מ) דרך העור באמצעות מספריים כירורגיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הקצה של המספריים הסגורים לתוך החתך ועוד יותר לפתוח את החתך על ידי פתיחת המספריים כשהוא אוחז אותו בתוך החתך. זה יגרום לעור לקרוע וצריך לייצר בקוטר של פחות מ -10 מ&quot;מ. הערה: מקור אור קר עם מדריכי אור גמישים יכול לשמש כדי לשפר את הנראות. במבוגרעכברים, בעיקר זכרים, זיהוי של הבלוטות לימפה עלול להיות קשה בשל הרבה יותר רקמת שומן באזור המפשעה. </li></ol> 3. הזרקת Intralymphatic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מזרק (0.5 מיליליטר או פחות) עם מחט מזרק G 28-30; פוע קצר עשוי להיות עדיף לפוע ארוך. לשאוב 10 μl של החיסון להיות מוזרק ולהבטיח שהמזרק הוא חופשי של אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למקם את הצומת לימפה מפשעתי עם עזרה של המלקחיים המעוקלים והקצה של המספריים הסגורים. הבלוטות לימפה תופיע אפרפרות בתוך רקמת השומן לבנבן יותר וניתן לזהות עוד דרך נימים מביא efferent וכניסה וביציאה לימפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשתק את הבלוטות לימפה על ידי מחזיק אותו בין זרועות המלקחיים המעוקלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את המזרק ולהכניס את המחט לתוך הבלוטה לימפה עם השיפוע כלפי מעלה; מוודא השלם שפוע נכנס לימפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את החיסון (10 μl). אם ההנהון לימפהדואר הוא נפיחות (פיצוץ), ההזרקה ניתן להניח מוצלחת. אם המחט אינה ממוקמת עמוק מספיק לבלוטות לימפה, כל החיסון מסוים או עלול לדלוף החוצה ולא להיכנס לימפה. אם המחט מוחדרת עמוקה מדי, החיסון המוזרק ישוחרר תת עורי מתחת לימפה. במקרה של האחרון, לחזור על ההזרקה או להחליף את העכבר עם עכבר מטופל חדש. </li></ol> 4. סגירת החתך על ידי תפירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח חפיסת תפר כירורגי סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחוז במחט התפר עם בעל מחט בחלק הדיסטלי של גוף המחט. הדק את בעל המחט באמצעות אחיזתו עד שתופס את מחגר הראשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחוז בעור בצד אחד של החתך באמצעות מלקחיים (בהתאם להעדפותיו של המנתח, שיניים או בלתי שיני מלקחיים או ווי עור עשוי לשמש). הכנס את ca המחט. 2-3 מ&quot;מ מהקצה של החתך, שנכנס מהצד החיצוני של העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוסen האחיזה של העור עם המלקחיים ולהבין את הצד השני של החתך עם המלקחיים. הכנס את ca המחט. 2-3 מ&quot;מ מהקצה של החתך, שנכנס מהפנימי של העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את בעל המחט ולתפוס את קצה מחט עם המלקחיים. משוך את המחט עם לדרוך דרך העור, משאיר את אורך נוח של לדרוך מחוץ לנקודת מחט ההכנסה הראשונה (אם כמה עכברים יטופלו, להשאיר סוף קצר יותר; 5-10 עכברים יכולים להיות מופעלים על עם מחט תפר אחד / לדרוך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הקשר המועדף על פי פרוטוקולי מנתח סטנדרטיים. תפר אחד די אם החתך אינו גדול מ10 מ&quot;מ. לחתכים גדולים יותר, להפוך את התפר שני. </li></ol> 5. טיפול שלאחר תפעולי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר בכלוב ולכסות עם רקמות כדי להתחמם. כאשר מטפלים עכברים מרובים, למקם אותם קרוב אחד לשני כדי להתחמם. לחלופין, למקם את העכברים על משטח חם עד שהם התעוררועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לעכברים עד שהם מתעוררים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לעכברים יומיים בכל הקשור לריפוי פצע, כמו גם סימפטומים קליניים אחרים, כגון זיהומים בפצע. הפצע הוא בדרך כלל סגור במידה מספקת בתוך יומיים ורפאו בתוך שבעה ימים של ההליך. </li></ol>

<ol>
	<li>Johansen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+intralymphatic+injection+of+peptide+vaccines+enhances+immunogenicity.">Direct intralymphatic injection of peptide vaccines enhances immunogenicity.</a> Eur. J. Immunol. 35, 568-574 (2005).</li><li>Maloy, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intralymphatic+immunization+enhances+DNA+vaccination.">Intralymphatic immunization enhances DNA vaccination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3299-3303 (2001).</li><li>Smith, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+DNA+vaccination+by+sequential+injection+of+lymph+nodes+with+plasmid+vectors+and+peptides.">Enhancing DNA vaccination by sequential injection of lymph nodes with plasmid vectors and peptides.</a> Vaccine. 27, 2603-2615 (2009).</li><li>Kreiter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranodal+vaccination+with+naked+antigen-encoding+RNA+elicits+potent+prophylactic+and+therapeutic+antitumoral+immunity.">Intranodal vaccination with naked antigen-encoding RNA elicits potent prophylactic and therapeutic antitumoral immunity.</a> Cancer Res. 70, 9031-9040 (2010).</li><li>Johansen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+kinetics+determines+immune+reactivity.">Antigen kinetics determines immune reactivity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5189-5194 (2008).</li><li>Smith, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node-targeted+immunotherapy+mediates+potent+immunity+resulting+in+regression+of+isolated+or+metastatic+human+papillomavirus-transformed+tumors.">Lymph node-targeted immunotherapy mediates potent immunity resulting in regression of isolated or metastatic human papillomavirus-transformed tumors.</a> Clin. Cancer Res. 15, 6167-6176 (2009).</li><li>Johansen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+ligands+as+adjuvants+in+allergen-specific+immunotherapy.">Toll-like receptor ligands as adjuvants in allergen-specific immunotherapy.</a> Clin. Exp. Allergy. 35, 1591-1598 (2005).</li><li>Johansen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+denaturation,+a+simple+method+to+improve+the+immunotherapeutic+potential+of+allergens.">Heat denaturation, a simple method to improve the immunotherapeutic potential of allergens.</a> Eur. J. Immunol. 35, 3591-3598 (2005).</li><li>Martinez-Gomez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intralymphatic+injections+as+a+new+administration+route+for+allergen-specific+immunotherapy.">Intralymphatic injections as a new administration route for allergen-specific immunotherapy.</a> Int. Arch. Allergy Immunol. 150, 59-65 (2009).</li><li>Martinez-Gomez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+MHC+class+II+pathway+of+antigen+presentation+enhances+immunogenicity+and+safety+of+allergen+immunotherapy.">Targeting the MHC class II pathway of antigen presentation enhances immunogenicity and safety of allergen immunotherapy.</a> Allergy. 64, 172-178 (2009).</li><li>Mohanan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+routes+affect+the+quality+of+immune+responses:+A+cross-sectional+evaluation+of+particulate+antigen-delivery+systems.">Administration routes affect the quality of immune responses: A cross-sectional evaluation of particulate antigen-delivery systems.</a> J. Control Release. 147, 342-349 (2010).</li><li>Waeckerle-Men, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+targeting+of+BCG+vaccines+amplifies+CD4+and+CD8+T-cell+responses+and+protection+against+Mycobacterium+tuberculosis.">Lymph node targeting of BCG vaccines amplifies CD4 and CD8 T-cell responses and protection against Mycobacterium tuberculosis.</a> Vaccine. 31, 1057-1064 (2013).</li><li>von Beust, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+therapeutic+index+of+CpG+oligodeoxynucleotides+by+intralymphatic+administration.">Improving the therapeutic index of CpG oligodeoxynucleotides by intralymphatic administration.</a> Eur. J. Immunol. 35, 1869-1876 (2005).</li><li>Senti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intralymphatic+immunotherapy+for+cat+allergy+induces+tolerance+after+only+3+injections.">Intralymphatic immunotherapy for cat allergy induces tolerance after only 3 injections.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 129, 1290-1296 (2012).</li><li>Senti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intralymphatic+allergen+administration+renders+specific+immunotherapy+faster+and+safer:+a+randomized+controlled+trial.">Intralymphatic allergen administration renders specific immunotherapy faster and safer: a randomized controlled trial.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 17908-17912 (2008).</li><li>Lesterhuis, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Route+of+administration+modulates+the+induction+of+dendritic+cell+vaccine-induced+antigen-specific+T+cells+in+advanced+melanoma+patients.">Route of administration modulates the induction of dendritic cell vaccine-induced antigen-specific T cells in advanced melanoma patients.</a> Clin. Cancer Res. 17, 5725-5735 (2011).</li><li>Fadul, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+in+patients+with+newly+diagnosed+glioblastoma+multiforme+treated+with+intranodal+autologous+tumor+lysate-dendritic+cell+vaccination+after+radiation+chemotherapy.">Immune response in patients with newly diagnosed glioblastoma multiforme treated with intranodal autologous tumor lysate-dendritic cell vaccination after radiation chemotherapy.</a> J. Immunother. 34, 382-389 (2011).</li><li>Eizenberg, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceptance+of+Intanza(R)+9+mug+intradermal+influenza+vaccine+in+routine+clinical+practice+in+Australia+and+Argentina.">Acceptance of Intanza(R) 9 mug intradermal influenza vaccine in routine clinical practice in Australia and Argentina.</a> Adv. Ther. 28, 640-649 (2011).</li><li>Durando, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjuvants+and+alternative+routes+of+administration+towards+the+development+of+the+ideal+influenza+vaccine.">Adjuvants and alternative routes of administration towards the development of the ideal influenza vaccine.</a> Hum. Vaccin. 7, 29-40 (2011).</li><li>Barth, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized+trial+of+ex+vivo+CD40L+activation+of+a+dendritic+cell+vaccine+in+colorectal+cancer+patients:+tumor-specific+immune+responses+are+associated+with+improved+survival.">A randomized trial of ex vivo CD40L activation of a dendritic cell vaccine in colorectal cancer patients: tumor-specific immune responses are associated with improved survival.</a> Clin. Cancer Res. 16, 5548-5556 (2010).</li><li>Schwaab, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+immunologic+effects+of+intranodal+autologous+tumor+lysate-dendritic+cell+vaccine+with+Aldesleukin+(Interleukin+2)+and+IFN-{alpha}2a+therapy+in+metastatic+renal+cell+carcinoma+patients.">Clinical and immunologic effects of intranodal autologous tumor lysate-dendritic cell vaccine with Aldesleukin (Interleukin 2) and IFN-{alpha}2a therapy in metastatic renal cell carcinoma patients.</a> Clin. Cancer Res. 15, 4986-4992 (2009).</li><li>Senti, G., Johansen, P., Kundig, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intralymphatic+immunotherapy.">Intralymphatic immunotherapy.</a> Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 9, 537-543 (2009).</li><li>Catron, D. M., Itano, A. A., Pape, K. A., Mueller, D. L., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+first+50+hr+of+the+primary+immune+response+to+a+soluble+antigen.">Visualizing the first 50 hr of the primary immune response to a soluble antigen.</a> Immunity. 21, 341-347 (2004).</li><li>Itano, A. A., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+presentation+to+naive+CD4+T+cells+in+the+lymph+node.">Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node.</a> Nat. Immunol. 4, 733-739 (2003).</li><li>Johansen, P., Mohanan, D., Martinez-Gomez, J. M., Kundig, T. M., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lympho-geographical+concepts+in+vaccine+delivery.">Lympho-geographical concepts in vaccine delivery.</a> J. Control Release. 148, 56-62 (2010).</li><li>Johansen, P., von Moos, S., Mohanan, D., Kundig, T. M., Senti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+routes+for+allergen+immunotherapy.">New routes for allergen immunotherapy.</a> Hum. Vacc. Immunother. 8, 1525-1533 (2012).</li><li>Senti, G., Johansen, P., Kundig, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intralymphatic+immunotherapy:+from+the+rationale+to+human+applications.">Intralymphatic immunotherapy: from the rationale to human applications.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 352, 71-84 (2011).</li><li>Duthie, M. S., Windish, H. P., Fox, C. B., Reed, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+defined+TLR+ligands+as+adjuvants+within+human+vaccines.">Use of defined TLR ligands as adjuvants within human vaccines.</a> Immunol. Rev. 239, 178-196 (2011).</li><li>Ribas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-lymph+node+prime-boost+vaccination+against+Melan+A+and+tyrosinase+for+the+treatment+of+metastatic+melanoma:+results+of+a+phase+1+clinical+trial.">Intra-lymph node prime-boost vaccination against Melan A and tyrosinase for the treatment of metastatic melanoma: results of a phase 1 clinical trial.</a> Clin. Cancer Res. 17, 2987-2996 (2011).</li><li>Bedrosian, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranodal+administration+of+peptide-pulsed+mature+dendritic+cell+vaccines+results+in+superior+CD8++T-cell+function+in+melanoma+patients.">Intranodal administration of peptide-pulsed mature dendritic cell vaccines results in superior CD8+ T-cell function in melanoma patients.</a> J. Clin. Oncol. 21, 3826-3835 (2003).</li><li>Lesimple, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+by+various+routes+of+melanoma+antigen-associated+macrophages:+biodistribution+and+clinical+effects.">Injection by various routes of melanoma antigen-associated macrophages: biodistribution and clinical effects.</a> Cancer Immunol. Immunother. 52, 438-444 (2003).</li><li>Brown, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-transduced+dendritic+cells+injected+into+skin+or+lymph+node+prime+potent+simian+immunodeficiency+virus-specific+T+cell+immunity+in+monkeys.">Adenovirus-transduced dendritic cells injected into skin or lymph node prime potent simian immunodeficiency virus-specific T cell immunity in monkeys.</a> J. Immunol. 171, 6875-6882 (2003).</li><li>Fong, L., Brockstedt, D., Benike, C., Wu, L., Engleman, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+injected+via+different+routes+induce+immunity+in+cancer+patients.">Dendritic cells injected via different routes induce immunity in cancer patients.</a> J. Immunol. 166, 4254-4259 (2001).</li></ol>

TMK נקרא על שמו כממציא פטנטים העוסקים בטיפול החיסוני intralymphatic באדם. TMK היה יועץ מדעי וקיבל הוצאות נסיעה מImVisioN GmbH, Cytos ביוטכנולוגיה, חברת MannKind, ויש לי XBiotech ארה&quot;ב בע&quot;מ PJ שום עניין סכסוך לחשוף.

חיסונים וטיפול חיסוני Intralymphatic הוכחו כמתאימים לגירוי של שני תגובות נוגדנים ותגובות תאי T. כפי שמודגם במאמר וידאו זה, הליך intralymphatic של חיסון הוא שיטה מהירה וקלה להמרצת תגובה חיסונית חזקה בעכברים. מנתח מיומן יכול לבצע את ההליך ב3-4 דקות. המפגש יכול גם להיות משותף בין שני מנתחים שבו הוא בדרך כלל עושים הרדמה והתפירה והמנתח השני הוא עושה חתך וההזרקה. היעילות של ההליך היא יותר מפעיל תלוי מאשר שיטת חיסונים אחרת, במיוחד אם המנתח עדיין לא מאומן היטב. עם זאת, מפעיל מנוסה הוא מסוגל לשחזר תוצאות ניסוי גם כמותית כפיקוח על ידי ניתוח חיסונית תגובה. שינוי של השיטה הוא להזריק את החיסון ל1,2 הטחול. ההכנה דומה לזה של הזרקת intralymphatic, אבל הגודל דואר של החתך הוא בדרך כלל גדול יותר ושני תפרים נעשים כדי לסגור אותו. יתרונותיו העיקריים של חיסון intrasplenic כאלה שהטחול הוא קל יותר למצוא ולפגוע מאשר בלוטות לימפה, יכולים להיות מיושמים כרכי זריקות גדולים וזריקות תכופות יותר, ובזמן שכל נזק של בלוטות לימפה שנגרמה על ידי החדרת מחט או הזרקה יהיה כרוך אזור מרכזי של הבלוטות לימפה, הנזק של הטחול יהיה כרוך יחסית פחות של האיבר ולהיות יותר בטבע מקומי. ההליך של חיסון intralymphatic בעכברים ניתן לחזור (למשל חיסון לחיזוק זריקות) לאחר פרק זמן התאוששות של 3-4 שבועות לפני הזריקה שנייה באותה הצומת לימפה נעשה. אם זריקות תכופות יותר מתוכננות, יש להשתמש בשתי בלוטות לימפה מפשעתי שמאלה וימינה. לפחות שתי זריקות לבלוטות לימפה יכולות להתבצע, אך מחקרים נוספים נדרשים כדי להגדיר הגבלת פוטנציאל זה באופן מדויק יותר. זריקות נוספות עשויות להיות ד הקשהUE להיווצרות צלקת הן בבלוטות לימפה ובעור, כמו גם היווצרות גרנולומה פוטנציאלית הנגרמת על ידי אדג&#39;ובנטים. מצד השני, חיסון יהיה לגרום לדלקת בלוטה לימפה חולפת, ואת גודל הלימפה הצומת המוגברת יפשט לוקליזציה וזריקות הבאות. ואכן, הלוקליזציה של הבלוטות לימפה היא מגבלה העיקרית של השיטה. בעוד עכברים צעירים (פחות מ -5 שבועות) עשויים להיות בלוטות לימפה קטנות מאוד, מבוגרת ובמיוחד עכברי זכרים מבוגרים יכולים להיות כל כך הרבה שומן תת עורי, לוקליזציה, כי הוא קשה. תנאים אופטימליים מתקבלים עם נקבות עכברים של 6-12 שבועות. ואכן, אחד השלבים הקריטיים ביותר של ההליך הוא ההזרקה לבלוטות לימפה עצמו. הזרקה לאזור הסמוך של הצומת תהיה שווה ערך להזרקה תת עורית עם מפעילה חלשה בהרבה מתגובה החיסונית מאשר לאחר הזרקת intralymphatic ישירה. הסיבה לכך היא שהכמוסה ולא מוצקה שמקיפה את הצומת היא לא חדירה למולקולות גדולות.לאנטיגן כדי להיכנס לבלוטות לימפה, יש לו לרוקן עם הלימפה. המסע הזה מתחיל בדרך כלל בכלי הלימפה הראשוני בעור, ממשיך בצינורות גדולים יותר בשכבה העמוקה יותר של העור, המנקזת את הלימפה לאיסוף כלי ברקמה התת עורית, ומשם לימפה היא מונעת על ידי תנועה פריסטלטית כלפי הניקוז הבא בלוטות הלימפה 23,24. במורד הזרם אנטיגן נוסף מופקד בדרך זו, פחות מזה יקבל גישה לימפה מביא. השיטה של ​​חיסון intralymphatic היא מעניינת במיוחד עבור ממשל של נוגדנים הנמצאים בחולשה immunogenic כאשר מנוהלים על ידי שיטות קונבנציונליות כגון מסלולים תוך שרירית או תת עורית. חיסון Intralymphatic שבוצע עם ה-mRNA, ה-DNA פלסמיד, פפטידים, חלבונים, וירוסים וחיידקים 22,25-27. אמנם יש לי פפטידים וחלבונים לא אדג&#39;ובנטים ב- לבנות, וירוס ה-mRNA פלסמיד דנ&quot;א וחיידקים להפעיל effe adjuvant הפנימיCTS על ידי מתן אותות סכנה (משכפלים את הווירוס וחיידקים) או על ידי גירוי קולטני Toll-כמו (TLRs) שיכול לחוש דפוסים מולקולריים הפתוגן משויך (PAMPs) כגון RNA חד גדילים (TLR7 וTLR8), RNA גדילים הכפול (TLR3), אשכולות ציטוזין המפוגל בלתי oligonucleotide וגואנין (TLR9), flaggelin חיידקים (TLR5), lipopolysaccharide (TLR2 ו4) מולקולות כמו גם נגיפיות וחיידקיים אחרים 28. לפיכך, במיוחד פפטיד וחיסונים מבוססי חלבון ירוויחו potentiation החיסונית של הזרקת החיסון ישירות לתוך הבלוטה לימפה. ואכן, זה כבר הוכיח כי תגובות B-ו-T-תא מוגברים לאחר חיסון פפטיד והחלבונים intralymphatic בעכברי 1,8,9. יתר על כן, חיסונים גנטיים, במיוחד חיסונים מבוססי ה-mRNA, הם מאוד לא יציבים שלסיבה שהם בוודאי להרוויח משיטת ממשל שאפשרו פעמים קטע קצרות ברקמות תאית. ואכן, חיסון intralymphatic עם אנטיגן-enRNA קידוד הושר חסינות מניעתי וטיפולית חזקה במודלי גידול עכבר 4. בדומה לכך, ממשל intralymphatic של אדג&#39;ובנטים כגון CPG אפשר הפחתת הרעילות בשל המינון נמוך יותר הנדרש, והשפעת adjuvant מוגברת נצפתה עקב ההשפעה הישירה וחייה בתאים חיסוניים 13. גם הביצועים של אדג&#39;ובנטים אחרים או מערכות אספקת אנטיגן כגון ננו וmicroparticles פולימריים כמו גם ליפוזומים יכולים להיות משופרים על ידי ממשל intralymphatic 11. עוד יתרון גדול של intralymphatic על מסלולי חיסון מקובלים הוא כי במינונים נמוכים בהרבה נדרשים בדרך כלל. לחלבונים ולגירוי של תגובות נוגדן, המינון יכול להיות מופחת על ידי 100-1,000 פי 9, בעוד שהמינון של ה-DNA לגירוי של תגובות תא T ציטוטוקסי CD8 יכול להיות מופחת עם כ. 10,000 פי 2. בניגוד לאנטיגנים למקטע או חיסונים מתים, לחיות virאל וחיסונים חיידקים בדרך כלל לא צפויים ליהנות מממשלי intralymphatic. הסיבה לכך היא בחלקו שגר חיידקים בדרך כלל לנקז גם לבלוטות הלימפה ללא כל עזרה adjuvant. יתר על כן, חיידקים מדבקים יכולים להתמודד עם תופעות דילול אנטיגן ברקמות היקפית על ידי שכפול. לפיכך, את מינון האנטיגן לכת במערכת הלימפה המשנית יהיה בדרך כלל מספיק כדי לייצר את חסינות. עם זאת, שבו חיסוני חיים הקיימים מייצרים חסינות מספיקה, ממשל intralymphatic יכול לספק את התיקון הדרוש כדי להפוך את החיסון יעיל. זה לאחרונה הודגם כי חסינות לאחר חיסון עם חיסון שחפת זמין כרגע רק מ &#39; בוביס BCG אפשר לשפר באופן משמעותי על ידי הזרקה ישירה של BCG לבלוטות לימפה מפשעתי של עכברים 12. ממשל Intralymphatic גם אפשר את הקטנת הסכום מחוסן של BCG ידי 100-1,000 פי השוואה למנהל תת עוריתטיפול במשפחה. זה מייצג יתרון בטיחות של חיסון intralymphatic, במיוחד באנשים נפגעים מערכת החיסון. חיסון Intralymphatic וטיפול חיסוני בבני אדם עד כה חלו על חולי סרטן וחולי אלרגיה. השיטה בבני אדם היא לא פולשנית, אך התוצאות הטובות ביותר ובקרת איכות מתקבלת על ידי השימוש באולטרסאונד כדי להנחות את ההזרקה, אשר עלול להגביל את היישום לבתי חולים או ביחידות לטיפול גדולות יותר. במחקרי סרטן, חיסון בפריים להגביר עם פלסמיד דנ&quot;א ופפטיד לטיפול במלנומה גרורתית חשף immunogenicity וראיה לשליטה במחלה באוכלוסיות חולות מוגדרות 29. גם חיסון עצמי intralymphatic עם תאים דנדריטים שבוצע בחולי סרטן. בעוד שחלק מניסויים משופרים תגובות חיסוניים 30,31, ניסויים אחרים לא הצליחו להוכיח את התועלת של הממשלים intralymphatic 32,33. ההליך של ממשל intralymphatic הוכיח להיות בייחודcially לטובה בטיפול החיסוני של חולי אלרגיה. על ידי שינוי שיטת intralymphatic, מספר הזריקות לטיפול החיסוני שלם ומוצלח יכול להיות מופחת מ50 כ זריקות תת עורית על פני 3 שנים רק 3 זריקות מעל 2 חודשים 14,15. מכיוון ששני מספרי הזרקת מינונים יכולים להיות מופחתים במידה רבה על ידי עושה אימונותרפיה intralymphatic אלרגן הספציפי, ומכיוון שבלוטות הלימפה אינן מכילות תאי פיטום משחרר היסטמין, השיטות מייצגים יתרון בטיחות, ועם משך טיפול הקצר, תאימות חולה משופרת. במהלך השנים הבאות, אלרגיה היא אולי הסימן לכך שהייתי רואה את התועלת המיידית ביותר של שיטה חדשה זו של חיסון וחיסוני.

חיסונים בדרך כלל מוזרקים מתחת לעור או לשריר לגירוי של מערכת החיסונית. ההצלחה של הליך זה דורשת ניקוז יעיל של חיסון לבלוטות הלימפה שבו תאי המציגים אנטיגנים יכולים לקיים אינטראקציה עם לימפוציטים לדור של T-ותגובות B-cell. בנוסף, הכוח והסוג של תגובה החיסונית המושרית תלוי גם בצפיפות או התדירות של אינטראקציות כאלה, כמו גם את המיקרו עצמו, במיוחד את התוכן של ציטוקינים. כחלק קטן בלבד של חיסון המוזרק לרקמה היקפית מגיע לבלוטות לימפה, חיסונים של עכברים ובני אדם על ידי הזרקה ישירה של החיסון לבלוטות הלימפה, האתר היו תגובה חיסונית נוצרות, כבר בוצע. באדם, ההליך מונחה על ידי אולטרסאונד, הליך משמש גם לניהול סוכני הדמיה להדמיה ואבחון במערכת הלימפה. בעכברים, ההליך הוא פולשני. כאן, incisio קטן (5-10 מ&quot;מ)n מורכב באזור המפשעה של חיות הרדים 1, הבלוטות לימפה היא מקומית ומשותק עם מלקחיים, ונפח של 10-20 μl של החיסון מוזרק תחת שליטה חזותית; 10 μl משמש לזריקות הראשונות ובעכברים צעירים עם בלוטות לימפה קטנות, בעוד שניתן להזריק 20 μl לבלוטות הלימפה של מבוגר או עכברים כבר דרוכים, שיש לי בלוטות לימפה גדולות יותר. החתך יכול להיות סגור עם תפר אחד באמצעות תפרים כירורגית. לפי שיטה זו, עכברים שחוסנו עם פלסמיד דנ&quot;א 2,3, RNA שליח 4, פפטיד 1,3,5,6, חלבון 7-10, חלקיקי 11, חיידקי 12 כמו גם אדג&#39;ובנטים 7,13, ושיפור חזק של חיסון תגובות נגד כל הסוג של חיסונים כבר נצפו. שיטת intralymphatic של החיסון מתאימה במיוחד במקרים בהם חיסון קונבנציונלי מייצר חסינות בלתי מספיקה או שבו הסכום של חיסון זמין הוא מוגבל או very יקר. באדם, בשיטת intralymphatic של חיסון הוחל חולי אלרגיה 14,15 או לחולים עם הסרטן 16-21. למרות שהרעיון הנוכחי הוא ששיטת intralymphatic היא יותר פולשניים יותר מאשר בשיטות אחרות, כגון זריקות זריקות תוך שרירית ותת עורית, לתפיסת הכאב היא לא גבוהה יותר מאשר לאחר ניקור ורידי 15. צפוי כי חיסון intralymphatic יהפוך חלופי או משלימים לשיטות אחרות של חיסונים מניעתי וטיפוליים במיוחד. מאמר זה מתאר בפרטים כיצד ההליך של חיסון intralymphatic מבוצע בעכברים. כל ההליכים שתוארו, אושרו על ידי וטרינרית סוכנות Cantonal ציריך ומבוצעים על פי הנחיות פדרליות שוויצריים והנחיות על ההגנה על בעלי החיים המשמשים למטרות מדעיות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="653">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Ketamine (Ketasol-100)</td>
			<td style="width:135px;">Graeub AG, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Anesthetics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Xylazine (Rompun)</td>
			<td style="width:135px;">Bayer, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Anesthetics</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Viscotears Eye-Gel</td>
			<td style="width:135px;">Novartis, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>To keep eyes from drying out during anesthesia.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">BD Micro-Fine 0.5 ml</td>
			<td style="width:135px;">BD Medical, France</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>29 G Insulin syringes with permanently attached needles</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">6-0 Dermalon Monofilament nylon</td>
			<td style="width:135px;">Covidien, MA, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For sutures (0.7 metric, 18G, 45 cm, Blue)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Curved forceps, 4.5 inch</td>
			<td style="width:135px;">Polymed, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For incision and holding of lymph node</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Straight surgical scissors, 4.5 inch</td>
			<td style="width:135px;">Polymed, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For incision</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Needle holder, 5.5 inch</td>
			<td style="width:135px;">Polymed, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>To close incision with suture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intralymphatic immunotherapy and vaccination in mice

חיסונים בדרך כלל מוזרקים מתחת לעור או לשריר לגירוי של תגובות חיסון. ההצלחה של זה דורשת ניקוז יעיל של חיסון לבלוטות הלימפה שבו תאי המציגים אנטיגנים יכולים לקיים אינטראקציה עם לימפוציטים לדור של התגובות החיסונית רצתה. הכוח והסוג של תגובה החיסונית המושרית תלוי גם בצפיפות או התדירות של אינטראקציות, כמו גם את המיקרו, במיוחד התוכן של ציטוקינים. כמו שרק שבריר זעיר של חיסונים מוזרקים שולי מגיע לבלוטות הלימפה, חיסונים של עכברים ובני אדם שבוצעו על ידי הזרקה ישירה של חיסון לבלוטות לימפה מפשעתי, כלומר הזרקת intralymphatic. באדם, ההליך מונחה על ידי אולטרסאונד. בעכברים, חתך קטן (5-10 מ&quot;מ) הוא עשה באזור המפשעה של חיות מורדמות, הבלוטות לימפה היא מקומיות ומשותקת עם מלקחיים, ונפח של 10-20 μl של החיסון מוזרק תחת שליטה חזותית.החתך נסגר עם תפר אחד באמצעות תפרים כירורגית. עכברים שחוסנו עם פלסמיד דנ&quot;א, רנ&quot;א, פפטיד, חלבון, חלקיקים, חיידקים, כמו גם אדג&#39;ובנטים, ושיפור חזק של תגובות חיסוניים נגד כל הסוג של חיסונים נצפה. שיטת intralymphatic של החיסון מתאימה במיוחד במצבים שבם חיסון קונבנציונלי מייצר חסינות בלתי מספיקה או שבו הסכום של חיסון זמין מוגבל.

ההליך של זריקות intralymphatic בעכברים, למרות האופי כירורגית, הוא ישר קדימה ומהיר יחסית. אדם מאומן יכול לבצע את ההליך ב3-4 דקות. החתך שנסגר עם תפר אחד בדרך כלל מרפא בתוך יומיים (איור 1) חיסון או חיסון Intralymphatic שבוצע עם ה-mRNA, ה-DNA פלסמיד, פפטידים, חלבונים, וירוסים וחיידקים. איור 2 ממחיש את ייצור הנוגדנים לאחר חיסון עם החלבון A2 פוספוליפאז (PLA2), אלרגן ארס דבורה הגדול. עכברי CBA היו שחוסנו בימים 0, 14, ו28 עם 0.01, 0.1, או 10 מיקרוגרם PLA2 adsorbed על אלומיניום הידרוקסיד על ידי תת עורית (SC) או זריקות intralymphatic (iln). נוגדני PLA2 ספציפי (IgG2a) נמדדו בדם לאחר 8 שבועות, והתוצאות הראה כי 0.01 מיקרוגרם PLA2 הייתה מספיק כדי לעורר תגובת נוגדנים חזקה, בזמן שהיה נדרש 10 מיקרוגרם PLA2 כאשר Uלשיר את המסלול תת עורית 9. חיסון Intralymphatic שימש גם כדי לעורר תגובות תא T ציטוטוקסיים, למשל gp33 פפטיד (KAVYNFATM) מגליקופרוטאין LCMV, המחייב MHC-ברמה שאני בהקשר של H-2DB לגירוי של תאי CD8 T. בעוד הזרקה תת עורית בודדת של עכברי TCR318 עם gp33 גררה תגובות תא T ציטוטוקסי CD8, ההשפעה הייתה כ. שישה סדרי גודל חזק יותר לאחר הזרקת intralymphatic (איור 3 א); עכברי TCR318 הם מהונדסים לקולטן תא T CD8 הספציפי לgp33 1. פונקציות מסוג CD4 T-cell נבדקו גם בassay אתגר גידול. שוב C57BL / 6 עכברים שחוסנו מתחת לעור או intralymphatically עם np52 פפטיד (SDLRGYVYQGLKSG) מnucleoprotein VSV, המחייב MHC-ברמה השנייה לגירוי של תאי T מסוג CD4, ופפטיד היה מעורב עם ODN CPG 1826. כאשר העכברים היו תיגר הווריד עם<html> np52-להביע תאים סרטניים EL4 syngeneic, העכברים פיתחו לימפומה המערכתית (איור 3 ב). עכברים שחוסנו על ידי תוואי intralymphatic הראו פעמים הרבה יותר זמן הישרדות (&gt; 75 ימים) מאשר עכברים שחוסנו על ידי תוואי תת עורית (&lt;22 ימים). השיטה של ​​חיסון intralymphatic גם שבוצעה בגבר, במיוחד לטיפול באלרגיות כגון קדחת שחת. השיטה ידועה כיום כעילי (Intra הלימפה חיסון תרפיה). במחקר אחד על 165 חולים עם קדחת שחת, 3 מפגשים עיליים מעל 2 חודשים עם אלרגנים אבקת הדשא היו לא פחות יעילים כמו טיפול קונבנציונלי עם 54 זריקות תת עורית על פני 3 שנים 15. יתר על כן, המינון יכול להיות מופחת על ידי יותר מ -1,000 פי. באופן דומה, במחקר על 20 חולים עם אלרגיה לפרוות חתול, 3 מפגשים עם האלרגן פרוות חתול מנוהל intralymphatically היה מספיק כדי לגרום לסובלנות משופרת לחשיפה לאלרגן לאחר מכן 14. jove_content &quot;&gt; אחד הסברים ליעילות המשופרת של חיסון intralymphatic בהשוואה לחיסון תת עורי יכולים להיות מתוארים באדם. שימוש בחלבון שכותרתו עם 99mTc רדיואקטיביים וכפי שמודגם באיור 4, זריקות תת עורית נצפו לניקוז גרוע לבלוטות הלימפה בזמן כמובן משלוח הזרקת intralymphatic ישיר כל תוכן החיסון למערכת הלימפה, ולכן, מה שהופך אותו לזמין לתאי מערכת החיסון ולגירוי תגובה חיסונית 22. תוצאות דומות התקבלו בעכברים שהוזרקו עם חלבונים רדיואקטיביים 9. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51031/51031fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51031/51031fig1.jpg" /> איור 1. ריפוי של פצע ניתוח לאחר הזרקת intralymphatic. עכברי נקבה BALB / ג היו שחוסנו בזריקת intralymphatic. Incis<html> יון נסגר עם תפר תפר אחד. יומיים לאחר מכן, באתר של ניתוח והזרקה הצטלמו לניהול של ריפוי הפצע. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51031/51031fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51031/51031fig2.jpg" /> איור 2. חיסון Intralymphatic עם חלבון לתגובות נוגדן גירוי. נקבות עכברי CBA היו שחוסנו בימים 0, 14, ו28 עם המינון המצוין חלבון A2 פוספוליפאז adsorbed על אלומיניום הידרוקסיד של. החיסון היה מנוהל תת עורי (sc) על ידי הזרקה של 50 μl בעורף או 10 μl בבלוטות לימפה מפשעתי: הצומת עזבה לימפה בימים 0 ו -28 ובלוטות לימפה תקין ביום 14. <html> &quot;Src =&quot; / files/ftp_upload/51031/51031fig3.jpg &quot;/&gt; איור 3. חיסון Intralymphatic עם פפטיד לתגובות תא T ציטוטוקסי הגירוי CD8. () עכברי נקבה TCR318 הוזרקו פפטיד gp33 לצומת לימפה מפשעתי (iln) או תת עורית (SC) לתוך שודד האחורי. לאחר 24 שעות, בלוטות הלימפה לנקז נקצרו ונותחו לgp33-ספציפי פעילות CTL ביחס תא (E / T) effector/target- של 30:1. (ב) נקבה C57BL / 6 עכברים שחוסנו בימים 0, 2, ו -4 עם 10 מיקרוגרם np52 ידי תת עורית (SC) או intralymphatic (iln) מסלולים של ממשל. עכברים אז היו תיגר עם תא לימפומה syngeneic (EL-4) להביע VSVnp52, ואת ההישרדות של עכברים שהומחש עם עקומות קפלן-מאייר. &quot;/&gt; Tp_upload/51031/51031fig4.jpg איור 4. ממשל חיסון Intralymphatic בבני אדם. ממשל חיסון Intralymphatic בבני האדם נעשה על ידי הקצאת בלוטות לימפה תת עורי בעזרת אולטרסאונד. מחט hypodermal מוכנסת לתוך paracortex של הבלוטות לימפה, וההזרקה יכולה להיות נשלטה על ידי תצפית של בלוטות לימפה באופן מיידי נפיחות בתמונה אולטרסאונד. () הזרקת intralymphatic מונחה על ידי אולטרסאונד. (ב) תמונת אולטראסאונד מראה מחט (קו ישר לבנבן) מוכנס לתוך paracortex של הבלוטות לימפה. (C) Biodistribution לאחר ההזרקה של חלבון שכותרתו רדיואקטיבית לתוך צומת מפשעתי לימפה (&quot;Injekt im LK&quot;; קדמי מימין) ומתחת לעור (&quot;subkutan Injekt&quot;; קדמי משמאל). באדם <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51031/51031fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Intralymphatic Immunotherapy and Vaccination in Mice at JoVE.com

Intralymphatic Immunotherapy and Vaccination in Mice

חיסון המניעה והטיפולי לעתים קרובות לא מצליח לעורר תגובה חיסונית חזקה בשל ניקוז שבוע של החיסון לבלוטות הלימפה ומעורבות עניות וכתוצאה מכך של תאים חיסוניים. על ידי הזרקה ישירה של חיסון לבלוטות הלימפה, הזרקת intralymphatic כביכול, יעילות חיסון ניתן לשפר מאוד וניתן להפחית מינוני חיסון.

Intralymphatic חיסוני וחיסון בעכברים

Vaccines are typically injected subcutaneously or intramuscularly for stimulation of immune responses. The success of this requires efficient drainage of ...

intralymphatic-immunotherapy-and-vaccination-in-mice

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.0K Views.  University Hospital Zurich.  חיסון המניעה והטיפולי לעתים קרובות לא מצליח לעורר תגובה חיסונית חזקה בשל ניקוז שבוע של החיסון לבלוטות הלימפה ומעורבות עניות וכתוצאה מכך של תאים חיסוניים. על ידי הזרקה ישירה של חיסון לבלוטות הלימפה, הזרקת intralymphatic כביכול, יעילות חיסון ניתן ?...

Video: Intralymphatic Immunotherapy and Vaccination in Mice

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

גרורה ניסויית חיסוני CTL המאמצת העברת דגם עכבר

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide variety of pathogens 1-3. Since the mammalian cell system is capable of post-translational modification, thus forming properly folded and glycosylated proteins, recombinant proteins expressed in mammalian cells have shown the greatest potential to maintain high antigenicity and immunogenicity 4-6.
Although no new cases of SARS have been reported since 2004, future outbreaks are a constant threat; therefore, the development of vaccines against SARS-CoV is a prudent preventive step and should be carried out. The RBD of SARS-CoV S protein plays important roles in receptor binding and induction of specific neutralizing antibodies against virus infection 7-9. Therefore, in this protocol, we describe novel methods for developing a RBD-based subunit vaccine against SARS. Briefly, the recombinant RBD protein (rRBD) was expressed in culture supernatant of mammalian 293T cells to obtain a correctly folded protein with proper conformation and high immunogenicity 6. The transfection of the recombinant plasmid encoding RBD to the cells was then performed using a calcium phosphate transfection method 6,10 with some modifications. Compared with the lipid transfection method 11,12, this modified calcium phosphate transfection method is cheaper, easier to handle, and has the potential to reach high efficacy once a transfection complex with suitable size and shape is formed 13,14. Finally, a SARS pseudovirus neutralization assay was introduced in the protocol and used to detect the neutralizing activity of sera of mice vaccinated with rRBD protein. This assay is relatively safe, does not involve an infectious SARS-CoV, and can be performed without the requirement of a biosafety-3 laboratory 15.
The protocol described here can also be used to design and study recombinant subunit vaccines against other viruses with class I fusion proteins, for example, HIV, respiratory syncytial virus (RSV), Ebola virus, influenza virus, as well as Nipah and Handra viruses. In addition, the methods for generating a pseudovirus and subsequently establishing a pseudovirus neutralization assay can be applied to all these viruses.

This protocol describes a general procedure for studying recombinant receptor-binding domain (RBD)-based subunit vaccines against SARS. It includes methods for transfection and expression of RBD protein in 293T cells, immunization of mice with RBD and detection of neutralization activity of mouse sera using an established SARS pseudovirus neutralization assay.

פרוטוקול רקומביננטי מזוכך מבוססי חיסונים הסארס: הכנת חלבון, חיסון בעלי חיים איתור נטרול

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide ...

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be established. The method described below, prepared in accordance with Good Manufacturing Process (GMP) guidelines, is an optimization of the most common ex vivo preparation method for generating large numbers of DCs for clinical studies 2.
Our method utilizes the synthetic TLR 3 agonist Polyinosinic-Polycytidylic Acid-poly-L-lysine Carboxymethylcellulose (Poly-ICLC) to stimulate the DCs. Our previous study established that Poly-ICLC is the most potent individual maturation stimulus for human DCs as assessed by an upregulation of CD83 and CD86, induction of interleukin-12 (IL-12), tumor necrosis factor (TNF), interferon gamma-induced protein 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1), and type I interferons (IFN), and minimal interleukin 10 (IL-10) production.
DCs are differentiated from frozen peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) obtained by leukapheresis. PBMCs are isolated by Ficoll gradient centrifugation and frozen in aliquots. On Day 1, PBMCs are thawed and plated onto tissue culture flasks to select for monocytes which adhere to the plastic surface after 1-2 hr incubation at 37 &deg;C in the tissue culture incubator. After incubation, the lymphocytes are washed off and the adherent monocytes are cultured for 5 days in the presence of interleukin-4 (IL-4) and granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) to differentiate to immature DCs. On Day 6, immature DCs are pulsed with the keyhole limpet hemocyanin (KLH) protein which serves as a control for the quality of the vaccine and may boost the immunogenicity of the vaccine 3. The DCs are stimulated to mature, loaded with peptide antigens, and incubated overnight. On Day 7, the cells are washed, and frozen in 1 ml aliquots containing 4 - 20 x 106 cells using a controlled-rate freezer. Lot release testing for the batches of DCs is performed and must meet minimum specifications before they are injected into patients.

The most commonly used method for generating large numbers of autologous dendritic cells (DCs) for use in tumor immunotherapy is described. The method uses IL-4 and GM-CSF to differentiate DCs from monocytes. The immature DCs are stimulated to mature and then loaded with antigens before they are injected back into the patient.

הכנת תאים דנדריטים גידול Antigen טעון בוגרים לחיסוניים

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

הקרנת תפוקה גבוהה לספקטרום רחב כימיים מעכבי RNA וירוסים

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. Exposure to an allergen in a sensitized individual can result in clinical symptoms that vary from minor erythema to life threatening anaphylaxis. In the laboratory, various animal models have been developed to understand the mechanisms driving allergic responses. Herein, we describe a detailed method for measuring changes in vascular permeability to quantify localized allergic responses. The local anaphylaxis assay was first reported in the 1920s, and has been adapted from the technique published by Kojima et al. in 20071. In this assay, mice sensitized to OVA are challenged in the left ear with vehicle and in the right ear with OVA. This is followed by an intravenous injection of Evans Blue dye. Ten min after injecting Evans Blue, the animal is euthanized and the dye that has extravasated into the ears is extracted overnight in formamide. The absorbance of the extracted dye is then quantified with a spectrophotometer. This method reliably results in a visual and quantifiable manifestation of a local allergic response.

Allergic responses, characterized by the activation of mast cells and basophils, are driven by the cross-linking of IgE and release of proinflammatory mediators. A quantitative assessment of allergic responses can be achieved by using Evans Blue dye to monitor changes in vascular permeability after allergen challenge.

מדידת אנפילקסיס המקומי בעכברים

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo to express chimeric antigen receptors specific for glioma antigens (CAR T cells). The expansion and function of adoptively transferred CAR T cells can be potentiated by the lymphodepletive and tumoricidal effects of standard of care chemotherapy and radiotherapy. We describe a method for generating CAR T cells targeting EGFRvIII, a glioma-specific antigen, and evaluating their efficacy when combined with a murine model of glioblastoma standard of care. T cells are engineered by transduction with a retroviral vector containing the anti-EGFRvIII CAR gene. Tumor-bearing animals are subjected to host conditioning by a course of temozolomide and whole brain irradiation at dose regimens designed to model clinical standard of care. CAR T cells are then delivered intravenously to primed hosts. This method can be used to evaluate the antitumor efficacy of CAR T cells in the context of standard of care.

The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care.

דור של תאי T CAR למאמצת תרפיה בהקשר של גליובלסטומה טיפול סטנדרטי

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

אין ויוו Assay גילוי של הפונקציה Cytolytic תא T אנטיגן ספציפי באמצעות מודל החיסון

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

דור שמסווגת נוגדנים חד-שבטיים אנושי מתאי B אנטיגן ספציפי נדיר במחזור הדם

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce efficient therapies have been proposed over the last decade. Among the promising candidates for designing novel therapeutic strategies, cellular immunotherapies have been targeted to eliminate highly invasive and chemo-radioresistant tumor cells, likely involved in a rapid and fatal relapse of this cancer. Thus, administration(s) of allogeneic GBM-reactive immune cell effectors, such as human V&#978;9V&#948;2 T lymphocytes, in the vicinity of the tumor would represents a unique opportunity to deliver efficient and highly concentrated therapeutic agents directly into the site of brain malignancies. Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a preclinical proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of these cellular immunotherapies that rely on stereotactic injections of allogeneic human lymphocytes within intrabrain tumor beds.

Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of intrabrain-delivered cellular immunotherapies.

העברת סטיאוטטי המאמצת של תאים חיסוניים ציטוטוקסיות במודלים מאתר של האדם Orthotopic גליובלסטומה Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

אופטימיזציה אינטרפרון-גמא ELISpot Assay מידה תגובות תא T במודל שפן לאחר החיסון

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...