המחברים תודה להכיר ד&quot;ר סילי Gurchenkov (מכון קירי) לרכישה ועיבוד תמונה באיור 3 ומתקן ההדמיה PICT-IBISA (מכון קירי). עבודה זו נתמכה על ידי ANR-09-JCJC0023-01, ARC SFI20111203863 וPIC 3D - קומפלקס בדגמים סלולריים חוץ גופית.

1. טמרה-קולגן אני תיוג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון טמרה מ&quot;ל 10 מ&quot;ג / 2.5 מ&quot;ל על ידי הוספת DMSO ל25 מ&quot;ג האבקה סיפקה טמרה. לפזר אותו על ידי vortexing עד לפירוק מוחלט. חנות ב -20 מעלות צלזיוס, ולהגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין 2 ליטר של הצפת תיוג (0.25 מ &#39;3 NaHCO, 0.4 מ&#39; NaCl). כדי להתאים את pH 9.5 באמצעות פתרון M 10 של NaOH. לשמור על 4 מעלות צלסיוס מנקודה זו, כל הפעולות מתבצעות ב4 º C, אלא אם כן חומר האמור וניאון אחרת הוא מוגן מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מזרק חד פעמי 1 מ&quot;ל עם 1 מ&quot;ל של קולגן עכברוש זנב המרוכז מאוד פתרון. פתרונות קולגן ריכוז גבוהים ניתנים בדרך כלל בריכוזים סביב 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​והם מאוד צמיג. הקפד לתפעל אותו לאט, כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט 21 G מזרק, להזריק קולגן לקלטת presoaked 3 מיליליטר דיאליזה של 10,000 MWCO נותק. השתמש בזהירות כדי להימנע מDamaגינג הקרום עם המחט. הסר את כל האוויר מקלטת הדיאליזה על ידי משיכת הבוכנה המזרק. Dialyze אותו הלילה נגד 1 ליטר של הצפת תיוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 100 μl של פתרון טמרה מ&quot;ל 10 מ&quot;ג / 900 עם μl של הצפת תיוג. הערה: זה צריך להיעשות עם שני פתרון טמרה והצפת תיוג בטמפרטורת חדר מאז DMSO קופא על 4 מעלות צלסיוס לאחר ערבוב, להביא את פתרון טמרה המדולל בחזרה עד 4 מעלות צלסיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את קולגן מקלטת הדיאליזה באמצעות מזרק חד פעמי 2 מ&quot;ל עם מחט 21 G מזרק. מערבבים 1 מ&quot;ל של פתרון קולגן dialyzed עם 1 מ&quot;ל של תמיסה מדוללת טמרה ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר קולגן / תמהיל טמרה לתוך צינור microcentrifuge 2 מ&quot;ל ו דגירה לילה עם רוטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 2 מ&quot;ל של קולגן טמרה שכותרתו לתוך קלטת presoaked 3 מיליליטר דיאליזה וdialyze הלילה נגד 1 ליטר של תיוג הצפת כדי להסיר את העודפים של צבע ללא תשלום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשחזר במעבדת טמרהקולגן eLED לפתרון המקורי קולגן, הצב את קלטת הדיאליזה לתוך 1 ליטר של 0.2% (V / V) פתרון חומצה אצטית, pH 4, וdialyze בן לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הנפח הסופי של קולגן טמרה שכותרתו ולחשב הריכוז הסופי שלו, בהתחשב בהיקף הראשוני והריכוז של פתרון קולגן בשימוש. חנות ב 4 המעלות צלסיוס </li></ol> 2. מטריצות 3D טמרה-קולגן עם תאים בודדים משובצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב הנפח של 2-Mix טמרה קולגן מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ההכרחי לניסוי. תמיד להכין 20% יותר לחשבון עבור pipetting הפסדים בשל צמיגות הגבוהה קולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות של PBS 10x ו1 N NaOH. מסנן לעקר ולשמור על 4 מעלות צלסיוס מנקודה זו, כל הפעולות מתבצעות על קרח אלא אם צוין אחרת ובתנאים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים PBS 10x ו1 N NaOH בכמויות מתאימות כדי להשיג את הריכוז הרצוי וקולגן pH 7.4. לדוגמה, עבור נפח סופי של 1 מ&quot;למיקס של טמרה-קולגן ב-pH 7.4, לשלב μl 100 של PBS 10x עם 5 μl של 1N NaOH. מערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הנפחים המתאימים של שניהם קולגן טמרה שכותרתו וקולגן ללא תווית ביחס 01:06 להשיג ריכוז קולגן כולל סופי של 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל. לדוגמה, עבור נפח סופי של 1 מ&quot;ל של 2 מיקס טמרה-קולגן מ&quot;ג / מ&quot;ל, להוסיף 90.48 μl של קולגן טמרה שכותרת מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​3.68 ו415.71 μl של 4.01 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של קולגן ללא תווית. מערבבים היטב ולאט לאט על ידי pipetting, הימנעות היווצרות של בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף תאים תלויים בנפח המתאים של מדיום סלולרי צונן ללא FBS לתערובת טמרה-קולגן כדי להשיג צפיפות תאים סופית של 10 5 תאים / מ&quot;ל וריכוז קולגן סופי של 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל. לדוגמה, עבור 1 מ&quot;ל של 2 מיקס טמרה-קולגן מ&quot;ג / מ&quot;ל, להוסיף 388.81 μl של מדיה המכיל 10 5 תאים. מערבבים היטב ולאט לאט על ידי pipetting, הימנעות היווצרות של בועות אוויר. לאשר את החומציות על ידי בדיקת 10 μl של התמהיל במבחן ה-pH שלטיול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 טיפות μl פיפטה של ​​מיקס טמרה-קולגן על מנות תחתיות זכוכית ולאפשר לו לפלמר בטמפרטורת חדר למשך 30-45 דקות. יש 100 טיפות קולגן μl קוטר טיפוסי של 7 מ&quot;מ והם 2 מ&quot;מ. כאשר polymerized, קולגן הופך לג&#39;ל איש לבן. שים לב: מתן האפשרות לקולגן לפלמר מבלי לסגור את המנה תהיה למנוע היווצרות של סרט מים סביב ירידת קולגן, הפחתת ניתוק מהזכוכית. כדי להגדיל את הדבקות, יכולות להיות מצופים מנות זכוכית עם פולי-L-ליזין ב100 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף בזהירות מדיום התרבות מספיק כדי לכסות את טיפות קולגן / תא. הימנע מנתיבים גבוהים של תקשורת או תנועות פתאומיות מאז טיפות קולגן יכולות בקלות לנתק. שמור על C º 37 10% באוויר humidified CO 2 למשך מספיק זמן לתאים לנדוד במטריצה ​​(בדרך כלל 1-3 ימים). </li></ol> 3. מטריצות 3D טמרה-קולגן עם spheroids הסלולרי משובץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב הנפח של 2 מ&quot;ג / מיליליטר טמרה-M קולגןIX ההכרחי לניסוי. תמיד להכין 20% יותר לחשבון עבור pipetting הפסדים בשל צמיגות הגבוהה קולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות של PBS 10x ו1 N NaOH. מסנן לעקר ולשמור על 4 מעלות צלסיוס מנקודה זו, כל הפעולות מתבצעות על קרח אלא אם צוין אחרת ובתנאים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים PBS 10x, 1 N NaOH ותקשורת סלולרי ללא FBS בכמויות מתאימות כדי להשיג את ריכוז קולגן הרצוי וpH 7.4. לדוגמה, עבור נפח סופי של 1 מ&quot;ל של מיקס טמרה-קולגן ב-pH 7.4, לשלב μl 100 של PBS 10x, 5 μl של 1 N NaOH ו388.81 μl של תקשורת. מערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הנפחים המתאימים של שניהם קולגן טמרה שכותרתו וקולגן ללא תווית ביחס 01:06 להשיג ריכוז קולגן כולל סופי של 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל. לדוגמה, עבור נפח סופי של 1 מ&quot;ל של 2 מיקס טמרה-קולגן מ&quot;ג / מ&quot;ל, להוסיף 90.48 μl של קולגן טמרה שכותרתו 3.68 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו 415.71 μl של 4.01 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של unlaקולגן beled. מערבבים היטב ולאט לאט על ידי pipetting, הימנעות היווצרות של בועות אוויר. לאשר את החומציות על ידי בדיקת 10 μl של התמהיל על רצועת בדיקת חומציות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 טיפות μl פיפטה של ​​מיקס טמרה-קולגן על מנות תחתיות זכוכית ולאפשר לו ליזום פילמור במשך 2-5 דקות. זה יעזור כדי למנוע טביעתה של spheroids ידי מעט מגביר את צמיגות הג&#39;ל. יש 100 טיפות קולגן μl קוטר טיפוסי של 7 מ&quot;מ והם 2 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף אליפטית תא ולמקם אותו על צלחת פטרי נקי. הסר את כל עודף של נוזל וresuspend זה ב10 μl של מיקס טמרה-קולגן. זה חשוב כדי למנוע דילול של קולגן עם תקשורת סלולרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה P20, לאסוף קולגן המושעה אליפטית ולמקם אותו בחלק העליון של מרכז ירידת מיקס טמרה-קולגן μl 100. הערה: אין יותר ממקום אחד לכל טיפת אליפטית קולגן, כיוון שהם יכולים להשפיע על כל קיבולת אחרת לפלוש ו / או להעביר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר מיקס טמרה-קולגן לפוליmerize בטמפרטורת חדר למשך 30-45 דקות. כאשר polymerized, קולגן הופך לג&#39;ל איש לבן. שים לב: מתן האפשרות לקולגן לפלמר מבלי לסגור את המנה תהיה למנוע היווצרות של סרט מים סביב ירידת קולגן, הפחתת ניתוק מהזכוכית. כדי להגדיל את הדבקות, יכולות להיות מצופים מנות זכוכית עם פולי-L-ליזין ב100 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף בזהירות מדיום התרבות מספיק כדי לכסות את טיפות spheroids קולגן /. הימנע מנתיבים גבוהים של תקשורת או תנועות פתאומיות מאז טיפות קולגן יכולות בקלות לנתק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על C º 37 10% באוויר humidified CO 2 למשך מספיק זמן לתאים לפלוש / להעביר במטריצה ​​(בדרך כלל 1-3 ימים). </li></ol> 4. מכתים immunofluorescence 3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את התקשורת הסלולרי ולשטוף את מטריצות קולגן המכילות תאים / spheroids עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל לתקן ולחלץ תאים על ידי דוגרים עם חיץ חילוץ / קיבעון (PFA 4%,, סוכרוז 0.3% טריטון X-100 של 5% בPBS) למשך 5 דקות. להשלים עם חיץ Phalloidin מיקרומטר 2 ו 2 מיקרומטר טקסול להדמיה של שלד תא או חלבונים הקשורים cytoskeleton. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתר על כן לתקן את התאים עם PFA 4%, 5% סוכרוז ב-PBS למשך 30 דקות. לשטוף עם 0.05% Tween-20 ב-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות נוגדנים עיקריים להכין PBS. דגירה תאים עם נוגדנים ראשוניים במשך שעה לפחות 1 בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 המעלות צלסיוס הקפד להוסיף מספיק פתרון כדי לכסות את ירידת קולגן כולו. לצלחת תחתית זכוכית 35 מ&quot;מ, 1.5-2 מ&quot;ל של תמיסה יהיה צורך בכך. הערה: כדי להפחית את עוצמת הקול של פתרון נוגדן, מכשול בלתי מסיס מים, כגון קו מעגל גריז סיליקון או טבעת PDMS, ניתן להציב סביב ירידת קולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף 30 דקות 3x עם 0.05% Tween-20 ב-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את נוגדנים משני אלקסה-מצומדות, phalloidin אלקסה מצומדות ופתרונות DAPI PBS. דגירה תאים עם הנוגדנים משני המתאימים עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3x 30 דקות עם 0.05% Tween-20 ב-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר עודפים של נוזל, להוסיף מספיק הרכבה תקשורת כדי למלא את תחתית צלחת תחתית הזכוכית (μl כ 500) ומניח על גבי coverslip 24 מ&quot;מ כדי לאטום. אל תלחץ כלפי מטה את coverslip כדי למנוע דחיסת טיפת קולגן ופגיעה בארגון 3D. </li></ol> 5. הדמיה לדוגמה ניתן להשתמש במיקרוסקופי confocal דיסק קלאסי או ספינינג. מעדיף מערכת הפוכה יש להשתמש כדי לקבוע את המרחק של התאים צלמו מתחתית הכוס. המערכת המשמשת לעבודה זו היא דיסק מסתובב confocal הפוכה מצויד במטרות נפט הטבילה 60X/1.4NA (עובד מרחקים 200 מיקרומטר ו130 מיקרומטר, בהתאמה) ו40X/1.3NA, מצלמה Photometrics CoolSNAP HQ2, 1392 x 1040 מערך הדמיה, 6.45 6.45 x מיקרומטר פיקסלים ונשלט על ידי תוכנת ההדמיה Metamorph. 405 ננומטר, 491 ננומטר, 561 ננומטר, ו633 ננומטר לייזרים משמשים בדרך כלל 30-50% בצריכת החשמל, ולקבל 1 binning של 2X 2 כדי להפחית את זמני חשיפה. מיקרוסקופ מצויד גם עם מנורה כספית וקוביות לסנן DAPI (400-418 ננומטר EXC; em 450-465), FITC (exc 478-495; 510-555) וטקסס אדומה (exc 560-580; 600 -650) להשתמש בעינית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מנורת הניאון, הצב את מטרת 40X באמצע טיפת קולגן. קבל סקירה כללית של המדגם, הן בציר XY וציר z. הקפד לא לסטות יותר מ -100 מיקרומטר מקצה ג&#39;ל על ציר XY בעת רכישה את התמונות, כדי למנוע השפעות קצה. כאשר spheroids הדמיה, לוודא שהם מתחת למרחק העבודה האובייקטיבי. שינוי אובייקטיבי אם מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור למצב ההדמיה לחיות confocal. על ידי שימוש בלייזר ננומטר 561 לדמיין קולגן טמרה שכותרתו, החל מתחתית הכוס לקבוע את ערך Z שבו סיבי קולגן להתחיל להופיע. זהו המצע התחתון וZ = 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות כפתור הפוקוס, ללכת עד 100 מיקרומטר מZ = 0. תאים רק ב z = 100 מיקרומטראו לעיל צריך להיות צילמו כדי למנוע תופעות מתח מתחתית הזכוכית הנוקשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את התאים לתמונה. לייעל את זמני חשיפת מצלמה וכוח לייזר לכל אורך גל. זמני חשיפה אופייניים עבור DAPI וAlexa-488 Phalloidin הם בין 100-200 אלפיות שני. זמני חשיפה למכתים נוגדן עשויים להשתנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במצב חי confocal באמצעות לייזר המתאים כדי להמחיש את phalloidin מכתים ובאמצעות כפתור הפוקוס, להגדיר את מרווח סדרת Z על ידי קביעת ערכי z עליונים ותחתונים לנוכחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את גודל Z-הצעד. למטרות 40X, השתמש 1 מיקרומטר. ל60x, השתמש 0.5 מיקרומטר. התחל רכישה. </li></ol>

<ol>
	<li>Schiro, J. A., Chan, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alpha+2+beta+1+(VLA-2)+mediates+reorganization+and+contraction+of+collagen+matrices+by+human+cells.">Integrin alpha 2 beta 1 (VLA-2) mediates reorganization and contraction of collagen matrices by human cells.</a> Cell. 67 (2), 403-410 (1991).</li><li>Klein, C. E., Dressel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alpha+2+beta+1+is+upregulated+in+fibroblasts+and+highly+aggressive+melanoma+cells+in+three-dimensional+collagen+lattices+and+mediates+the+reorganization+of+collagen+I+fibrils.">Integrin alpha 2 beta 1 is upregulated in fibroblasts and highly aggressive melanoma cells in three-dimensional collagen lattices and mediates the reorganization of collagen I fibrils.</a> J. Cell Biol. 115 (5), 1427-1436 (1991).</li><li>Friedl, P., Maaser, K., Klein, C. E., Niggemann, B., Krohne, G., Z&#228;nker, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+highly+aggressive+MV3+melanoma+cells+in+3-dimensional+collagen+lattices+results+in+local+matrix+reorganization+and+shedding+of+alpha2+and+beta1+integrins+and+CD44.">Migration of highly aggressive MV3 melanoma cells in 3-dimensional collagen lattices results in local matrix reorganization and shedding of alpha2 and beta1 integrins and CD44.</a> Cancer Res. 57 (10), 2061-2070 (1997).</li><li>Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physics+of+cancer:+the+role+of+physical+interactions+and+mechanical+forces+in+metastasis.">The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis.</a> Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).</li><li>Zaman, M. H., Trapani, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+tumor+cells+in+3D+matrices+is+governed+by+matrix+stiffness+along+with+cell-matrix+adhesion+and+proteolysis.">Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (29), 10889-10894 (2006).</li><li>Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-dimensional+topography+underlies+three-dimensional+fibrillar+cell+migration.">One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration.</a> J. Cell Biol. 184 (4), 481-490 (2009).</li><li>Fraley, S. I., Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinctive+role+for+focal+adhesion+proteins+in+three-dimensional+cell+motility.">A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility.</a> Nat. Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).</li><li>Harunaga, J. S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-matrix+adhesions+in+3D.">Cell-matrix adhesions in 3D.</a> Matrix Biol. 30 (7-8), 363-368 (2011).</li><li>Raub, C. B., Suresh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+assessment+of+collagen+gel+microstructure+and+mechanics+using+multiphoton+microscopy.">Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy.</a> Biophys. J. 92 (6), 2212-2222 (2007).</li><li>Geraldo, S., Simon, A., Elkhatib, N., Louvard, D., Fetler, L., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+cancer+cells+have+distinct+adhesions+in+3D+collagen+matrices+and+in+vivo?.">Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo?.</a> Eur. J. Cell Biol. 91 (11-12), 930-937 (2012).</li><li>Geraldo, S., Gordon-Weeks, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+dynamics+in+growth-cone+steering.">Cytoskeletal dynamics in growth-cone steering.</a> J. Cell Sci. 122 (Pt 20), 3595-3604 (2009).</li><li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types.">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol. Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), (2011).</li><li>Haji-Karim, M., Carlsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+viability+in+cellular+spheroids+of+human+origin.">Proliferation and viability in cellular spheroids of human origin.</a> Cancer Res. 38 (5), 1457-1464 (1978).</li><li>Eyre, D. R., Paz, M. A., Gallop, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-linking+in+collagen+and+elastin.">Cross-linking in collagen and elastin.</a> Ann. Rev. Biochem. 53, 717-748 (1984).</li><li>Baici, A., Cohen, G., Fehr, K., B&#246;ni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+handy+assay+for+collagenase+using+reconstituted+fluorescein-labeled+collagen+fibrils.">A handy assay for collagenase using reconstituted fluorescein-labeled collagen fibrils.</a> Anal. Biochem. 108 (2), 230-232 (1980).</li><li>Stein, A. M., Vader, D. A., Jawerth, L. M., Weitz, D. A., Sander, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+algorithm+for+extracting+the+network+geometry+of+three-dimensional+collagen+gels.">An algorithm for extracting the network geometry of three-dimensional collagen gels.</a> J. Microsc. 232 (3), 463-475 (2008).</li><li>Sabeh, F., Ota, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+traffic+through+the+extracellular+matrix+is+controlled+by+the+membrane-anchored+collagenase+MT1-MMP.">Tumor cell traffic through the extracellular matrix is controlled by the membrane-anchored collagenase MT1-MMP.</a> J. Cell Biol. 167 (4), 769-781 (2004).</li><li>Artym, V. V., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+in+three-dimensional+collagen+matrix.">Imaging cells in three-dimensional collagen matrix.</a> Curr. Prot. Cell Biol. Chapter 10, Unit 10.18.1-Unit 10.18.20 (2010).</li><li>Jawerth, L. M., M&#252;nster, S., Vader, D. A., Fabry, B., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blind+spot+in+confocal+reflection+microscopy:+the+dependence+of+fiber+brightness+on+fiber+orientation+in+imaging+biopolymer+networks.">A blind spot in confocal reflection microscopy: the dependence of fiber brightness on fiber orientation in imaging biopolymer networks.</a> Biophys. J. 98 (3), L1-L3 (2010).</li><li>Cicchi, R., Vogler, N., Kapsokalyvas, D., Dietzek, B., Popp, J., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+molecular+structure+to+tissue+architecture:+collagen+organization+probed+by+SHG+microscopy.">From molecular structure to tissue architecture: collagen organization probed by SHG microscopy.</a> J. Biophotonics. 6 (2), 129-142 (2013).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הפרוטוקול מתואר כאן לתייג קולגן fluorescently אני משתמש בטמרה מספקת שיטה מצוינת כדי לאפשר הדמיה קלה של ארגון רשת קולגן, באמצעות מיקרוסקופ confocal סטנדרטי מצוידים בליזר ננומטר 561. יתרון של שיטה זו בהשוואה למיקרוסקופיה confocal ההחזרה הוא יכולת סיבי קולגן תמונה עמוקות יותר לתוך מטריצת 3D. העצמה והחדות של השתקפות הסיבים מפחיתים באופן משמעותי עם עומק בשל ספיגת אור לייזר ופיזור. כמו כן, הכיוון של סיבי קולגן יכול להיות מכשול עיקרי בעת שימוש במיקרוסקופיה confocal החזרה, שכן סיבים מיושרים סביב 50 מעלות מהמטוס מבלי שיבחינו בם ההדמיה לחלוטין. סיבי fluorescently שכותרתו מזוהים עם בהירות דומה, ללא תלות באורינטציה שלהם 20. שיטה נוספת שהיה בשימוש יותר ויותר לדמיין צרורות קולגן, הן במבחנת in vivo, היא על ידי דור ההרמוני שניeration (SHG). תהליך זה מבוסס על הפליטה של SHG אות על ידי מבני noncentrosymmetric, כגון קולגן 21. עם זאת, SHG דורש מיקרוסקופ multiphoton, וזה לא חלק מציוד ההדמיה המעבדה הסטנדרטי. השימוש בטמרה כfluorophore אינו בלעדית. fluorophores אחר, כגון Cy2, Cy5 או משפחת פלואוריד אלקסה, זמין מסחרי בערכות תיוג חלבון, ניתן להשתמש בו לקולגן התווית בצבע הנוח ביותר למשתמש. יתרון נוסף של שימוש בקולגן ניאון הוא הפוטנציאל להיות משולב עם תאי transfected עם חלבוני fluorescently שמתויגים לזמן לשגות הדמיה, כדי לעקוב מקרוב אינטראקציות תא מטריקס או פגמי מטריקס-Induced תא. זה גם יכול לשמש לcoverslips ציפוי קולגן דקה בניסויים 2D. הטבעה של תאים במטריצות 3D היא הליך עדין, במיוחד בעת השימוש בspheroids הגדול, שכן יש להם נטייה לשקוע בשל כוח הכבידה. כמו כן,<html> תאים נמשכים בדרך כלל לסביבות נוקשה וכאשר מוטבעים באזורים של מטריקס 3D הקרוב מספיק לcoverslip הזכוכית להרגיש העלייה במתח הנגרמת על ידי הזכוכית, הם עוברים לכיוון מצע 2D הנוקשה. טריק טכני כדי לסייע במניעת טביעתה של spheroids הגדול הוא לאפשר לפלמר קולגן בקצרה (2-5 דקות) לפני ביצוע אליפטית על גבי טיפת המטריצה. זה מעט יגדיל את הצמיגות של ג&#39;ל, הגדלת הזמן השוקע. עם זאת, זה תרגול טוב כדי להכין כמה חזרות כדי להגדיל את סיכויי הצלחה. מצד השני, חשוב לשמור על התאים תחת מרחק העבודה האובייקטיבי. בדרך כלל יש מטרות הגדלה נמוכות מרחקי עבודה גדולים יותר, ויכולות לשמש לתמונות שדה הכוללות, למשל, להשוות את הפלישה של תאים מסוגים שונים מאליפטית. כאשר תמונות ברזולוציה גבוהות יותר נדרשות, מים טבילה מטרות, עם מרחקי עבודה גדולים יותר, הם מאוד מומלץ. ילדה = &quot;jove_content&quot;&gt; רוב העבודה שפורסמה מסתכלת על חלבונים תאיים של תאים במטריצות 3D נעשה על ידי ביטוי יתר של חלבונים מתויגים fluorescently, ככל הנראה בשל חוסר פרוטוקול מכתים immunofluorescence אמין בקנה האחד עם טבע 3D של התשתית . בעיות כגון נגישות נוגדן לתאים המוטבעים עמוק או מכתים רקע גבוה של מטריקס (מאז נוגדנים רבים unspecifically יכולים לקשט את סיבי קולגן) יכולות להיות סיבה. פרוטוקול זה מתאר גם immunostaining במטריצות קולגן 3D. למרות שפרוטוקול זה כבר מותאם לשלד תא או חלבונים הקשורים cytoskeleton, יש לו גם שימש בהצלחה לתייג סמני מוקדי הידבקות, כגון paxilin, vinculin וzyxin, בשורות תאים שונות 10. אנחנו לא מנסים ליצור פרוטוקול immunostaining 3D בכלל. כמו ב2D, כל נוגדן עשוי לדרוש הליך קיבוע שונה ועיצוב של פרוטוקול ספציפי לכל נוגדן יכול להיות דורשד. פרוטוקול זה מוצג כנקודת התחלה, והוא הציע שמשתמשים כולל phalloidin ניאון מכתים כדי לתת מושג על צורת התא והלוקליזציה בתוך המטריצה. מטריצות קולגן עבות הן פשוט טוב במערכת במבחנה ללמוד נדידת תאים בECM פיסיולוגי. למרות שהיא חסרה את כימית ופיזית מורכבות של רקמת חיה, מערכת זו מאפשרת מניפולציה של נכסי ECM ספציפיים, כגון נקבובית גודל, גמישות וcrosslinking. אנו מקווים פרוטוקולים אלה יתרמו לתיאור טוב יותר של ההרכב המולקולרי, לוקליזציה ופונקציות של מבנים הסלולר במשך שנים רבות נותחו ב2D וכדי לשפר את הידע של התנהגות תא ב3D שלנו.

התחום של נדידת תאים כבר braving אל עולם הממד השלישי החדש. זה אינטואיטיבי ללמוד נדידת תאים בסביבה הדומה ביותר הפיזיולוגי אחת, ולכן, תלת ממדי (3D). עם זאת, בשל מגבלות טכניות, מחקרי נדידת התאים ביותר נעשו ניתוח תנועת תא על פני מצעים דו ממד (2D) נוקשים, או ללא טיפול או מצופה עם מטריקס (ECM) חלבונים תאיים מתאימים. המחקרים הראשונים המוקדשים לנדידת תאים בשלושה סריגי קולגן ממדיים לחזור מעל 20 שנים 1-3. עם זאת, רק ב -5 השנים האחרונות זה הפך להיות ברור כי תאים נודדים באופן מהותי יכולים שיהיו שונים במורפולוגיה ובמצב של הגירה בהתאם ממדי של המצע שלהם. ב 2D, תאים פנו מצע עם פני השטח הגחון שלהם באמצעות הידבקויות מוקד בלבד, וכתוצאה מכך היווצרות של בליטות שטוחות רחבות (lamellipodia) עםבליטות דמויות אצבע מוטבעות (filopodia) בקצה המוביל שלהם. מבנים אלה, יחד עם סיבי מתח המחברים את התא הקדמי לקצה הנגרר, הם האמינו להיות מכריע עבור תנועת תא ב2D. במטריצות 3D, תאים הם בדרך כלל מוארכים יותר, עם תא השטח כולו יצירת קשר עם ECM, גורמים לשינויים ניכרים במבנה ואת הרלוונטיות של פעילות של רבים ממבנים אלה. לעומת זאת, תכונות סלולריות אחרות להשיג רלוונטיות בהגירת 3D, כגון עיוות גרעינית ומבנים מעורבים בECM שיפוץ 4. למרות שינויים אלה ידועים מורפולוגיים, כמו גם הבדלים במצבי הגירת 5-7, אשר יכול להשתנות בהתאם לECM וסוגי תאים, ניתוח מבני ותפקודי של תאים מוטבעים בתוך מטריצות 3D עדיין יוצא דופן. עבודה עם מטריצות 3D עבות וצפופות נושא קשיים טכניים, כגון הדמיה מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה, וחוסר תאימות עם מרבית staפרוטוקולי ndard מותאמים לתרבויות 2D, כמו תיוג immunofluorescent של חלבונים אנדוגניים. כמו כן, משום שהשימוש במטריצות 3D הוא גישה חדשה יחסית, חוקרים עדיין בודקים את התנאים הטובים ביותר לדומים למצבים ספציפיים בvivo, כגון ארכיטקטורת סטרומה נורמלית של איברים או רקמות שונות בארגון ECM סביב גידול. הבדלים בתוצאות על ידי קבוצות שונות הנוגעות, למשל, מצבי סרטן תאים של הגירה או קיומן של הידבקויות מוקד, יצרו מחלוקת 8. הרבה מאמץ הוקדשה לאחרונה כדי להגיע להסכמה במונחים של ECM אופי כימי, גודל נקבובית, עובי סיבים, ומטריצת קשיחות. סוגים רבים ושונים של ECMS 3D משמשים כיום, שונים ממטריצות נגזרות סלולריים לmatrigel זמין מסחרי, קולגן שור pepsinized אני, או קולגן זנב החולדה nonpepsinized י כל אחד מהמטריצות האלה יש תכונות פיסיקליות וכימיות ספציפיות ואחד צריך רלהte המטריצה ​​של בחירה לתהליך הפיזיולוגי הנלמד. בנוסף, עובי וגודל נקבובית סיבים יכול להיות תלוי בתנאים פילמור, כגון pH וטמפרטורה 9,10. קשירה ולמרחק ממצעים קשיחים כגון זכוכית, ניתן גם לשנות את תכונות האלסטיות של המטריצה ​​10,11. מאמר זה מתאר שיטות להכנה והדמיה של תרביות תאים סרטניים 3D, או כתאים או spheroids בודדים. שיטות להכנת spheroids תאים סרטניים בעבר תאר, את אלה הפופולריים ביותר להיות שיטת טיפה התלויה 12,13 ושיטת צלחת agarose המצופה 14. כמצע ECM מתאים לנדידת תאי סרטן, קולגן זנב החולדה nonpepsinized אני polymerized בטמפרטורת חדר, הוא משמש ב2 מ&quot;ג / מ&quot;ל. קולגן חומצת החילוץ Nonpepsinized אני מזנב חולדה שומר שני טרמינל C-N-וtelopeptides, חלקי nonhelical של מולקולת הקולגן אחראי להאם של קולגן intermoleccrosslinking תואר בלבד ויציבות fibrilar 15. יחד, בתנאים אלה יאפשר היווצרות של רשתות קולגן שדומים באופן הדוק ביותר את אלה שנצפו בvivo 10. כדי לאפשר הדמיה של סיבי קולגן, הן בתרבויות קבועות וחיים, פרוטוקול מפורט מסופק לתייג הקולגן במבחנה 10 באמצעות 5 fluorescently - (ו- 6)-carboxytetramethylrhodamine (טמרה), אסתר succinimidyl. פרוטוקול זה הותאם מBaici et al. 16,17, בי isothiocyanate ההעמסה משמש לתייג מולקולות מסיסים קולגן. וכהעמסה, טמרה היא צבע פלואורסצנטי אמינו-reactive שמגיב עם קבוצות nonprotonated aliphatic אמינו של חלבונים, כגון קבוצת אמינו החופשית בN-הסופית, וחשוב יותר, קבוצה אמינית הצד של lysines. תגובה זו מתרחשת רק ב-pH הבסיסי, כאשר קבוצת אמינו ליזין היא בצורת nonprotonated. בנוסף לטמרה להיות יציבה יותר מהעמסה עלזמן, ספקטרום הפליטה שלה נופל על מגוון הכתום / אדום (= 555/518 ננומטר לשעבר / EM), אשר יכול להיות משולב מועילה להדמית תא חי של חלבוני ה-GFP-מתויגים. שימוש במולקולות מסיסים קולגן שכותרתו עם צבעי אמינו תגובתי אינו משפיעה על תהליך פילמור ולא הצפיפות, הגודל נקבובית ומעמד crosslinking של מטריצת הקולגן 10,16,18,19. פרוטוקול זה כולל גם את שיטה לתיוג immunofluorescent 3D של חלבונים אנדוגניים, אשר עבר אופטימיזציה נוספת לתייג את שלד התא או חלבונים הקשורים cytoskeleton. המיקוד הסופי של פרוטוקול זה הוא על שיטות לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהה של תרבויות 3D באמצעות מיקרוסקופיה confocal עם תרומה מופחתת מcoverslips הזכוכית הנוקשים על מתח מטריצת הקולגן.

<table><tbody><tr><td>TAMRA, SE</td><td>Invitrogen</td><td>C-1171</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rat tail Collagen High Concentration</td><td>BD Biosciences</td><td>354249</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rat tail Collagen</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Sigma</td><td>P2141</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Taxol (Paxitel)</td><td>Sigma</td><td>T7402</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mouse anti-alpha Tubulin antibody</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A21052</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mounting media</td><td>Fisher Scientific</td><td>106 226 89</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dialysis Cassette</td><td>Pierce</td><td>66380</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glass bottom dishes</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MetaMorph Microscopy Automation &amp;amp; Image Analysis Software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Imaris 7.2.3</td><td>Bitplane</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3d

נדידת תאים באופן מסורתי נחקרה במצעי 2D. עם זאת, זה הפך להיות ברור יותר ויותר שיש צורך ללמוד את נדידת תאים בסביבות 3D מתאימות יותר, שדומים יותר טוב הממדיות של התהליכים הפיסיולוגיים בשאלה. תאים נודדים באופן משמעותי יכולים להיות שונה במורפולוגיה ובמצב של הגירה שלהם, תלוי אם הם נעים על מצעי 2D או 3D. בשל קשיים טכניים ותאימויות עם פרוטוקולים הסטנדרטיים ביותר, ניתוח מבני ותפקודי של תאים מוטבעים בתוך מטריצות 3D עדיין נדיר. מאמר זה מתאר שיטות להכנה והדמיה של תרביות תאים סרטניים 3D, או כתאים או spheroids בודדים. כמצע ECM מתאים לנדידת תאי סרטן, אנחנו משתמשים בקולגן זנב חולדת nonpepsinized אני polymerized בטמפרטורת חדר, ושכותרתו fluorescently כדי להקל הדמיה באמצעות מיקרוסקופים confocal סטנדרטיים. עבודה זו כוללת גם protocol תיוג immunofluorescent 3D של שלד תא תא אנדוגני. שימוש בפרוטוקולים אלה אנו מקווים לתרום לתיאור טוב יותר של ההרכב המולקולרי, לוקליזציה, ופונקציות של מבנים הסלולר ב-3D.

תיוג עכברוש זנב קולגן אני עם טמרה מאפשר הכנה קלה ויזואליזציה של רשתות קולגן 3D. פילמור איטי בטמפרטורת חדר בתוצאות היווצרות של רשתות קולגן עם ארגון דומה לאלה שנמצאו בvivo 10. כאן אנו מציגים פרוטוקול למכתים immunofluorescence של cytoskeleton של CT26 תאים סרטניים, והן כspheroids כתאים בודדים. כדי לשמר טוב יותר שלד התא, מאגרים הם השלימו עם phalloidin ללא תווית וטקסול, תרופות ידועות לייצב F-אקטין וmicrotubules, בהתאמה. בנוסף, תאים שתוקנו בו זמנית והוציאו להסיר הבריכות טובולין cytosolic nonpolymerized שיכול להפריע להדמיה של microtubules הבודדות. טכניקה זו יכולה באותה מידה לשמש כדי לחזות חלבוני שלד תא הקשורים. כאשר ב-3D, CT26 תאים להציג מורפולוגיה mesenchymal טיפוסית מתאפיינת מוארכתגוף תא, הטה עם בליטות סלולריות עשירות F-אקטין הדומות filopodia וlamellipodia (איורים 1 ו -2). מורפולוגיה מוארכת זה בולט עוד יותר בתאים המנסים להימלט spheroids הסלולרי על ידי הפולשים מטריצת הקולגן (איור 2). צביעה של microtubules באמצעות נוגדן אנטי טובולין מציגה רשת microtubule השתמר היטב ומאורגנת (איורים 1 ו -2). צורת תא זה שונה מאוד מזו של CT26 תאים במצעי 2D, שבו בדרך כלל יש להם כמה קצוות מובילים עם lamellipodia השטוח הרחב הגדול ומוגדר היטב filopodia 10. כדי לעבד את התמונות שנרכשו בעבודה זו, Imaris היה בשימוש. תוכנה זו ממירה באופן אוטומטי הגדול רכש Z-ערימות להקרנת 3D של ניווט קל והדמיה בכל המטוסים (XY, XZ וYZ) וזוויות שונות (1 דמויות, 2 ו -3, orthogonaצפיות לליטר). שימוש בפונקציית &quot;חתוך 3D&quot;, ניתן להסיר מטוסי z מיותרים מעל או מתחת לאזור של עניין. כפי שהוא מיוצג באיור 3, חשוב לנתח את ערימות z שנאספו מכל המטוסים של תצוגה על מנת להבטיח הפצת 3D אחידה של התאים. במקרה זה, נראים CT26 תאים שגודלו כspheroids לפלוש למטריצת הקולגן 3D בהרחבה כשדמיינו כהשלכה XY מקסימלי. עם זאת, תצוגת XZ מגלה כי כל התאים הם פולשים מרווח z מוגבל בהשוואה לנפח אליפטית, המצביעים על אזור מועדף של פלישה. אליפטית זהו למעשה קרובה מדי לתחתית הזכוכית של הצלחת והתאים עברו מהר לכיוון ועל מצע 2D הנוקשה. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50763/50763fig1.jpg" width="600px" /> איור 1. שלד תא של תאים סרטניים CT26 תאים מוטבע בטמרה שכותרתו קולגן I. Colעל אדנוקרצינומה CT26 תאים היו מוטבעים כתאים בודדים ב2 מ&quot;ג / מיליליטר טמרה שכותרתו קולגן אני (אדום). תמונות immunofluorescence של תרבויות מוכתמות נוגדן טובולין לmicrotubules התווית (כחול), Alexa-488 phalloidin לדמיין F-אקטין (ירוק) וDAPI עבור מכתים גרעיני (ציאן). תמונת 3D מתאימה להקרנה מקסימלי של XY Z-ערימות של 38 מיקרומטר. XZ אורתוגונלי (חלק תחתון של מיזוג) וYZ (זכותו של מיזוג) למזג תצוגות. בר סולם, 20 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50763/50763fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50763/50763fig2.jpg" width="600px" /> איור 2. Cytoskeleton של CT26 תאי סרטן תאים פולשים תאי CT26 טמרה שכותרת קולגן I. שגודלו כspheroids הסלולרי היו משובץ ב2 מ&quot;ג / מיליליטר טמרה שכותרתו קולגן אני (אדום). לאחר 2 ימים בתרבות, החלו בתאיםvading מטריקס 3D קולגן, מתרחק אליפטית התא. תמונות immunofluorescence של תרבויות מוכתמות נוגדן טובולין לmicrotubules התווית (כחול), Alexa-488 phalloidin לדמיין F-אקטין (ירוק) וDAPI עבור מכתים גרעיני (ציאן). תמונת 3D מתאימה להקרנה מקסימלי של XY Z-ערימות של 66 מיקרומטר. XZ אורתוגונלי (חלק תחתון של מיזוג) וYZ (זכותו של מיזוג) למזג תצוגות. בר סולם, 50 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50763/50763fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50763/50763fig3.jpg" width="600px" /> איור 3. פלישת CT26 תאים בקולגן אני תלוי במרחק הזכוכית. CT26 תאים גדל כspheroids סלולרי ומוטבעת ב2 מ&quot;ג / מיליליטר קולגן אני אחרי 2 ימים בתרבות, תאים עברו באופן משמעותי מהתא אליפטית, ולא על ידי פולשים לאהוא 3D קולגן המטריצה ​​אבל בזחילה על הזכוכית הנוקשה 2D. תמונות הקרינה של תרבויות מוכתמות בAlexa-488 phalloidin לדמיין F-אקטין. תמונת 3D) מתאימה להקרנה מקסימלי של XY Z-ערימות של 200 מיקרומטר. ב) צפייה XZ אורתוגונלית. בר סולם, 150 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50763/50763fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D at JoVE.com

Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

מאמר זה מציג שיטה לתייג קולגן שניתן להשתמש בו גם תיקון נוסף ולהדמית חיה של תרביות תאי 3D fluorescently. כמו כן אנו מספקים פרוטוקול מותאם לדמיין חלבוני cytoskeletal אנדוגניים של תאים בתרבית בסביבות 3D.

חושף את ארגון cytoskeletal של תאי סרטן פולשני ב-3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration ...

revealing-the-cytoskeletal-organization-of-invasive-cancer-cells-in-3d

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

15.6K Views.  Institut Curie.  מאמר זה מציג שיטה לתייג קולגן שניתן להשתמש בו גם תיקון נוסף ולהדמית חיה של תרביות תאי 3D fluorescently. כמו כן אנו מספקים פרוטוקול מותאם לדמיין חלבוני cytoskeletal אנדוגניים של תאים בתרבית בסביבות 3D. 

Video: Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

מידול והדמיה 3-Dimensional Cell קיבוציים Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. While 75% of bladder cancers are non-invasive and unlikely to metastasize, about 25% progress to an invasive growth pattern. Up to half of the patients with invasive cancers will develop lethal metastatic relapse. Thus, understanding the mechanism of invasive progression in bladder cancer is crucial to predict patient outcomes and prevent lethal metastases. In this article, we present a three-dimensional cancer invasion model which allows incorporation of tumor cells and stromal components to mimic in vivo conditions occurring in the bladder tumor microenvironment. This model provides the opportunity to observe the invasive process in real time using time-lapse imaging, interrogate the molecular pathways involved using confocal immunofluorescent imaging and screen compounds with the potential to block invasion. While this protocol focuses on bladder cancer, it is likely that similar methods could be used to examine invasion and motility in other tumor types as well.

The processes governing bladder cancer invasion represent opportunities for biomarker and therapeutic development. Here we present a bladder cancer invasion model which incorporates 3-D culture of tumor spheroids, time-lapse imaging and confocal microscopy. This technique is useful for defining the features of the invasive process and for screening therapeutic agents.

תא תלת-ממדי מערכת תרבות עבור הלומדים הפלישה והערכת הרפוי בסרטן שלפוחית השתן

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

Cancer Research

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

ניטור פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity T-Cell בתרבות 3D

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

שלוש תרבויות ממדים: כלי ללמוד רגיל אדריכלות acinar לעומת שינוי ממאיר של תאי שד

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

כימות של הפולשנות תאי סרטן השד תוך שימוש במודל תלת ממדים (3D)

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

מודלים תלת-ממדיים בביולוגיה של סרטן: דינמיקת פלישה בהטרוספרואידים

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) cultures. Invasion is a cellular outcome of utmost interest in cancer biology. In this protocol, we have devised an alternative strategy for evaluating cancer cell invasion in vitro, employing heterospheroids comprised of oral squamous cell carcinoma (OSCC), cancer-associated fibroblasts (CAF), and monocytes. These heterospheroids aim to mimic the tumor microenvironment (TME), including two relevant non-neoplastic cell types alongside the cancer cells. Each cell type was labeled with vital fluorescent markers emitting in distinct wavelengths before spheroid formation. Once formed, heterospheroids were seeded onto a layer of human leiomyoma-derived extracellular matrix in the upper compartment of a microporous membrane. Invasion was assessed in the z-axis using confocal microscopy. Digital images were obtained in the corresponding fluorescent channels at 10 &#181;m intervals, covering a depth of 90 &#181;m in the z-axis. Analysis was performed using freeware image software by calculating the integrated fluorescence intensity in each image and fluorescence channel. This approach enables a more dynamic analysis of cell invasion patterns in a multilayered context, as well as the examination of spatial co-localization of different cell types during invasion.

מחבר זרקור: פענוח ההצלבה בין סרטן לתאי מערכת החיסון במהלך התקדמות סרטן הראש והצוואר

Invasion is a major biological phenomenon in the development and progression of cancer. This process is influenced by non-neoplastic cells and components of the tumor microenvironment. The purpose of this study is to describe an alternative method for analyzing tumor cell invasion in vitro using three-dimensional (3D) cultures.

אסטרטגיה חלופית לניתוח פלישת תאי מבחנה לתרביות תלת ממדיות

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Heteromulticellular Stromal Cells in Scaffold-free 3D Cultures of Epithelial Cancer Cells to Drive Invasion

Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death among women in the U.S. Organoid models of solid tumors have been shown to faithfully recapitulate aspects of cancer progression such as proliferation and invasion. Although patient-derived organoids and patient-derived xenograft organoids are pathophysiologically relevant, they are costly to propagate, difficult to manipulate, and comprised primarily of the most proliferative cell types within the tumor microenvironment (TME). These limitations prevent their use for elucidating cellular mechanisms of disease progression that depend upon tumor-associated stromal cells which are found within the TME and known to contribute to metastasis and therapy resistance. 
Here, we report on methods for cultivating epithelial-stromal multicellular 3D cultures. The advantages of these methods include a cost-effective system for rapidly generating organoid-like 3D cultures within scaffold-free environments that can be used to track invasion at single-cell resolution within hydrogel scaffolds. Specifically, we demonstrate how to generate these heteromulticellular 3D cultures using BT-474 breast cancer cells in combination with fibroblasts (BJ-5ta), monocyte-like cells (THP-1), and/or endothelial cells (EA.hy926). Additionally, differential fluorescent labeling of cell populations enables time-lapse microscopy to define 3D culture assembly and invasion dynamics. 
Notably, the addition of any two stromal cell combinations to 3D cultures of BT-474 cells significantly reduces circularity of the 3D cultures, consistent with the presence of organoid-like or secondary spheroid structures. In tracker dye experiments, fibroblasts and endothelial cells co-localize in the peripheral organoid-like protrusions and are spatially segregated from the primary BT-474 spheroid. Finally, heteromulticellular 3D cultures of BT-474 cells have increased hydrogel invasion capacity. Since we observed these protrusive structures in heteromulticellular 3D cultures of both non-tumorigenic and tumorigenic breast epithelial cells, this work provides an efficient and reproducible method for generating organoid-like 3D cultures in a scaffold-free environment for subsequent analyses of phenotypes associated with solid tumor progression.

There is a critical need for 3D cancer models that capture heterocellular crosstalk to study cancer metastasis. Our study presents the generation of heteromulticellular stromal-epithelial in a scaffold and scaffold-free environment that can be used to study invasion and cellular spatial distributions.

תאי סטרומה הטרו-תאיים בתרביות תלת מימד ללא פיגומים של תאי סרטן אפיתל כדי להניע פלישה

Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death among women in the U.S. Organoid models of solid tumors have been shown to faithfully ...

חושף את ארגון cytoskeletal של תאי סרטן פולשני ב-3D

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מידול והדמיה 3-Dimensional Cell קיבוציים Invasion

תא תלת-ממדי מערכת תרבות עבור הלומדים הפלישה והערכת הרפוי בסרטן שלפוחית השתן

ניטור פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity T-Cell בתרבות 3D

שלוש תרבויות ממדים: כלי ללמוד רגיל אדריכלות acinar לעומת שינוי ממאיר של תאי שד

כימות של הפולשנות תאי סרטן השד תוך שימוש במודל תלת ממדים (3D)

אסטרטגיה חלופית לניתוח פלישת תאי מבחנה לתרביות תלת ממדיות

אסטרטגיה חלופית לניתוח פלישת תאי מבחנה לתרביות תלת ממדיות

אסטרטגיה חלופית לניתוח פלישת תאי מבחנה לתרביות תלת ממדיות

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

תאי סטרומה הטרו-תאיים בתרביות תלת מימד ללא פיגומים של תאי סרטן אפיתל כדי להניע פלישה