אנו מודים לאנג&#39;ליקה ברג לסיוע מעבדה. עבודה זו נתמכה ומומנה על ידי אגודת מקס פלנק ובית הספר ליינה למיקרוביאלית תקשורת (JSMC).

<ol>
	<li>Pais, R., Lohs, C., Wu, Y. N., Wang, J. W., Aksoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+obligate+mutualist+Wigglesworthia+glossinidia+influences+reproduction,+digestion,+and+immunity+processes+of+its+host,+the+tsetse+fly.">The obligate mutualist Wigglesworthia glossinidia influences reproduction, digestion, and immunity processes of its host, the tsetse fly.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 5965-5974 (2008).</li><li>Freitak, D., Heckel, D. G., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary-dependent+trans-generational+immune+priming+in+an+insect+herbivore.">Dietary-dependent trans-generational immune priming in an insect herbivore.</a> Proc. Biol. Sci. 276, 2617-2624 (2009).</li><li>Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Note:+Gut+bacteria+produce+components+of+a+locust+cohesion+pheromone.">A Note: Gut bacteria produce components of a locust cohesion pheromone.</a> J. Appl. Microbiol. 92, 759-763 (2002).</li><li>Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+interactions+in+insect-microbial+symbioses:+Aphids+and+their+symbiotic+bacteria+Buchnera.">Nutritional interactions in insect-microbial symbioses: Aphids and their symbiotic bacteria Buchnera.</a> Annu. Rev. Entomol. 43, 17-37 (1998).</li><li>Reichardt, N., Barclay, A. R., Weaver, L. T., Morrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+stable+isotopes+to+measure+the+metabolic+activity+of+the+human+intestinal+microbiota.">Use of stable isotopes to measure the metabolic activity of the human intestinal microbiota.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 8009-8014 (2011).</li><li>Dumont, M. G., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+probing+-+linking+microbial+identity+to+function.">Stable isotope probing - linking microbial identity to function.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).</li><li>Gil, R., Latorre, A., Moya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+endosymbionts+of+insects:+insights+from+comparative+genomics.">Bacterial endosymbionts of insects: insights from comparative genomics.</a> Environ. Microbiol. 6, 1109-1122 (2004).</li><li>Brune, A., VH, R. e. s. h., Card&#233;, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encyclopedia of Insects. , 1132 (2005).</li><li>Breznak, J. A., Brune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microorganisms+in+the+digestion+of+lignocellulose+by+termites.">Role of microorganisms in the digestion of lignocellulose by termites.</a> Annu. Rev. Entomol. 39, 453-487 (1994).</li><li>Broderick, N. A., Raffa, K. F., Goodman, R. M., Handelsman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Census+of+the+bacterial+community+of+the+gypsy+moth+larval+midgut+by+using+culturing+and+culture-independent+methods.">Census of the bacterial community of the gypsy moth larval midgut by using culturing and culture-independent methods.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 293-300 (2004).</li><li>Funke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+hydrolysis+of+quorum-sensing+molecules+in+the+gut+of+lepidopteran+larvae.">Rapid hydrolysis of quorum-sensing molecules in the gut of lepidopteran larvae.</a> Chembiochem. 9, 1953-1959 (2008).</li><li>Tang, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexity+and+variability+of+gut+commensal+microbiota+in+polyphagous+lepidopteran+larvae.">Complexity and variability of gut commensal microbiota in polyphagous lepidopteran larvae.</a> PloS One. 7, (2012).</li><li>Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+identification+and+in-situ+detection+of+individual+microbial-cells+without+cultivation.">Phylogenetic identification and in-situ detection of individual microbial-cells without cultivation.</a> Microbiol. Rev. 59, 143-169 (1995).</li><li>Olsen, G. J., Lane, D. J., Giovannoni, S. J., Pace, N. R., Stahl, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+ecology+and+evolution+-+a+ribosomal-rna+approach.">Microbial ecology and evolution - a ribosomal-rna approach.</a> Annu. Rev. Microbiol. 40, 337-365 (1986).</li><li>Pilloni, G., von Netzer, F., Engel, M., Lueders, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+acceptor-dependent+identification+of+key+anaerobic+toluene+degraders+at+a+tar-oil-contaminated+aquifer+by+Pyro-SIP.">Electron acceptor-dependent identification of key anaerobic toluene degraders at a tar-oil-contaminated aquifer by Pyro-SIP.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 78, 165-175 (2011).</li><li>Lu, Y. H., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+stable+isotope+probing+of+methanogenic+archaea+in+the+rice+rhizosphere.">In situ stable isotope probing of methanogenic archaea in the rice rhizosphere.</a> Science. 309, 1088-1090 (2005).</li><li>Radajewski, S., Ineson, P., Parekh, N. R., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable-isotope+probing+as+a+tool+in+microbial+ecology.">Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology.</a> Nature. 403, 646-649 (2000).</li><li>Lueders, T., Pommerenke, B., Friedrich, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable-isotope+probing+of+microorganisms+thriving+at+thermodynamic+limits:+Syntrophic+propionate+oxidation+in+flooded+soil.">Stable-isotope probing of microorganisms thriving at thermodynamic limits: Syntrophic propionate oxidation in flooded soil.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 5778-5786 (2004).</li><li>Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+stable+isotope+probing+to+identify+key+iron-reducing+microorganisms+involved+in+anaerobic+benzene+degradation.">The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation.</a> ISME J. 1, 643-653 (2007).</li><li>Fuhrer, T., Fischer, E., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+identification+and+quantification+of+glucose+metabolism+in+seven+bacterial+species.">Experimental identification and quantification of glucose metabolism in seven bacterial species.</a> J. Bacteriol. 187, 1581-1590 (2005).</li><li>Dunford, E. A., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Stable-Isotope+Probing+(DNA-SIP).">DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP).</a> J. Vis. Exp. (42), (2010).</li><li>Yamasaki, S., Nomura, N., Nakajima, T., Uchiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation-independent+identification+of+candidate+dehalorespiring+bacteria+in+tetrachloroethylene+degradation.">Cultivation-independent identification of candidate dehalorespiring bacteria in tetrachloroethylene degradation.</a> Environ. Sci. Technol. 46, 7709-7716 (2012).</li><li>Lueders, T., Manefield, M., Friedrich, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sensitivity+of+DNA-+and+rRNA-based+stable+isotope+probing+by+fractionation+and+quantitative+analysis+of+isopycnic+centrifugation+gradients.">Enhanced sensitivity of DNA- and rRNA-based stable isotope probing by fractionation and quantitative analysis of isopycnic centrifugation gradients.</a> Environ. Microbiol. 6, 73-78 (2004).</li><li>Ishak, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+diversity+in+Solenopsis+invicta+and+Solenopsis+geminata+ant+colonies+characterized+by+16S+amplicon+454+pyrosequencing.">Bacterial diversity in Solenopsis invicta and Solenopsis geminata ant colonies characterized by 16S amplicon 454 pyrosequencing.</a> Microb. Ecol. 61, 821-831 (2011).</li><li>Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tag-encoded+FLX+amplicon+pyrosequencing+for+the+elucidation+of+microbial+and+functional+gene+diversity+in+any+environment.">Tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing for the elucidation of microbial and functional gene diversity in any environment.</a> Methods Mol. Biol. 733, 129-141 (2011).</li><li>Kuczynski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+QIIME+to+Analyze+16S+rRNA+Gene+sequences+from+microbial+communities.">Using QIIME to Analyze 16S rRNA Gene sequences from microbial communities.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 1, Unit1E 5 (2012).</li><li>Dillon, R. J., Dillon, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+bacteria+of+insects:+nonpathogenic+interactions.">The gut bacteria of insects: nonpathogenic interactions.</a> Annu. Rev. Entomol. 49, 71-92 (2004).</li><li>Neufeld, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+stable-isotope+probing.">DNA stable-isotope probing.</a> Nat. Protoc. 2, 860-866 (2007).</li><li>Dumont, M. G., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+probing+-+linking+microbial+identity+to+function.">Stable isotope probing - linking microbial identity to function.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).</li></ol>

יש לנו מה למסור.

הבטן של רוב החרקים נמלי קהילת חיידקים עשירה ומורכבת, בדרך כלל 10 7 -10 9 תאים פרוקריוטים להגיש שם, מספרם עולים בתאים של המארח ברוב המקרים. לכן, תחושת הבטן של החרק היא &quot;נקודה חמה&quot; לפעילות של חיידקים מגוונים, המייצגים היבטים שונים של מערכות יחסים של חיידקים, מפתוגנזה לחייב הדדיות 27. למרות שמחקרים רבים תארו מגוון מדהים של קהילות חיידקי מעי חרק, אפיון של פעילות חילוף חומרים של חיידקים במעיים הוא נדיר. גישות איזוטופ חיטוט יציבים מציעות כעת אפשרות להבחנה החברים הפעילים מרקע חיידקים מורכב עצמאי של טיפוח ואפילו in vivo. אנחנו מוחלים זה כלי רב ערך כדי ללמוד את החיידקים במעיים במערכת מודל חרק, תולעת עלה כותנה (Spodoptera littoralis). מאז גלוקוז הוא הסוכר הדומיננטי במעיים של leafworm כותנה, בהפגנה זו האכלנו larVAE עם דיאטה מלאכותית מהול במנה נוספת, אבל פיזיולוגית של 13 C-גלוקוז כדי לעקוב אחר החיידקים הפעילים מטבולית בפלורת המעיים. דגירה זהה הוקמה עם גלוקוז האם סיפקה שליטה קריטית להשוואה שלאחר מכן על מנת להבטיח שכל תיוג לכאורה של חומצות גרעין לא היה תוצר של השיטה עצמה, כגון תוכן C הגבוה G + ב-DNA תורם להפרדה. ליד בריכוז באתרו של גלוקוז בנוסף מופחת הטיה ניסיונית. שיקולים אחרים הקשורים להתקנה ניסיונית קפדני של מחקר DNA-SIP כבר דנו במקום אחר 28,29. חיידקי המעיים בדרך כלל הם מטבולית פעילים מאוד ויש לי זמן דור קצר בהשוואה למיקרואורגניזמים מרוב הסביבות יבשתיים וימיות. לפיכך שעה 24 רציפות ההאכלה גרמה כבר תיוג משמעותי. שים לב שכמות גדולה של הדנ&quot;א הגנומי מארח גם coextracted מרקמות המעי, שאמור להיות תוךחשבון בעת ​​דיון בתוצאות. אפיון שבריר שיפוע הטיפוסי מסתמך על שיטות טביעת אצבע ברזולוציה הנמוכה, כגון פולימורפיזם מסוף בר הגבלת אורך (T-RFLP), ובניית ספריית שיבוט זמן רב כדי לקשר את הנתונים. זה רק לאחרונה כי כניסתו של טכניקת רצף דור שני תפוקה גבוהה מאפשרת ניתוח של קהילות חיידקים מורכבות מהיר, יעילה וחסכונית, ומפורט. כאן אנו מיושמים טכנולוגיה חדשה זו לסקור באופן ישיר את ההרכב הגנטי של שברים שיפוע צפיפות ולזהות חיידקים פעילים מטבולית, אשר נתנו רגישות משופרת בהשוואה לשיטות המבוססת על ג&#39;ל אלקטרופורזה, ואפשרו סיווג phylogenic שלאחר מכן. על ידי השוואת שברים כבדים שווי ערך משני שכותרתו C 13 ו12 דגימות C-שליטה, אנו מוצאים כי Pantoea ואנטרוקוקוס הפכו כותרת על איזוטופ חיטוט. ברגע שmetabחיידקי olically פעילים זוהו, ניתן לבצע ניתוח אחר כגון הקרינה הכלאה באתרו (FISH) באמצעות בדיקות ספציפיות וניתוח metagenomic של ה-DNA שכותרתו התאושש מחברי הקהילה פעילים כדי לספק תובנה מקיפה לתוך הסימביוזה האמיתית הקשורים למארח . בהתבסס על המערכת שהוקמה כאן, מקורות פחמן שכותרת-C 13 אחרים יכולים גם להיות מוזנים לתוך המארח לנתח את החיידקים מעורבים במסלול מטבולי הבטן הממוקד, למשל, תיוג תאית כדי לזהות חיידקים פעילים מעורבים בתהליך העיכול המארח. עם התפתחותה של גישות חדשות, כגון, את תפקידו של חיידקים במעיים חרקים יהפוך ברור יותר מאשר כיום. באופן קולקטיבי, הפרוטוקול המתואר כאן מייצג שיטה פשוטה, מהירה, ויעילה לקביעת פעילות המטבולית של החיידקים במעיים, אשר עוד יכול להיות מיושמים על מנת להעריך את התפקיד הספציפי של bacteסימביוזה עם ריאל בתזונת המארח, סילוק רעלים, והגנה.

עמותות סימביוטיים חרקים בקטריאלי ידועים מספר רב של מיני חרקים 7. בעמותות סימביוטיים אלה, מיקרואורגניזמים ממלאים תפקידים חשובים בצמיחה וההתפתחות של חרקים. חיידקים הוכחו לתרום לרביית חרקים 1, פרומון ביוסינתזה 3, תזונה, כוללים הסינתזה של חומצות אמינו חיוניות 4, ועיכול של מזון שאינו נגיש למארח. למרות המגוון העצום של עמותות בטן בקטריאלי, הרבה פחות ידוע על התפקיד הפונקציונלי שהם משחקים לטובתו של החרק. רק במקרה של הטרמיטים, העיכול הסימביוטי של lignocellulose בוצע על ידי פרוקריוטים, פרוטוזואה, ופטריות, נחקר באופן נרחב 8,9. בניגוד לכך, מעט מאוד ידוע על הקשר הסימביוטי ההווה במעיים של חרקים generalist כלומר leafworm הכותנה, Spodoptera littoralis. יתר על כן, בשל השינוי התכוף שלהם של מארחים צמח, כלליהחרקים ist וקהילות הבטן הקשורות החיידקים שלהם באופן קבוע חשופים לאתגרים חדשים הקשורים להרגלי האכילה שלהם לצרוך צמחים עם שפע של פיטוכימיקלים. לצד זה, את סביבת המעי בlepidopterans, מייצגת כשלעצמה סביבה קשה לצמיחה של חיידקים בגלל החומציות במעיים הגבוהה 10. במיוחד במקרה של ס &#39; littoralis, זה נע בין 10.5 במעי הקדמי, CA. 9 בmidgut לPH כמעט 7 ב11 המעי האחורי. מצד השני, קהילת החיידקים הקשורים לבטנו של ס &#39; littoralis הוא פשוט. טאנג, Freitak, et al 12. דיווח מרבי של 36 phylotypes השייך לסך של 7 מיני חיידקים שונים כמו רק לחברי קהילת חיידקים הקשורים לחרק הזה. חוץ מזה, אין הליך גידול מסובך דרוש להתפתחות החרקים במעבדה. יתר על כן, זה ומחזור החיים הקצר של החרק להקל רב גרםמחקרי enerational, הופך מין זה למערכת מודל אידיאלית לחקר אינטראקציות בטן חיידק. עם כניסתו של טכנולוגיות רצף המבוססות על ה-PCR, מספר מחקרים העוסקים בהביוטה בטן של כמה אורגניזמים (בני אדם כלומר, חרקים, או יצורים ימיים) גדל. יתר על כן, התוצאות הן עצמאיות מבידוד והטיפוח של חיידקי המעיים טיפחו כמו בעבר. כמעט 99% מחיידקים אינם ראויים לעיבוד חקלאיים והסימולציה של התנאים הסביבתיים ששררו במעיים קשה 12. באמצעות PCR, שברי גן 16S rRNA (סמן בשימוש נרחב פילוגנטי גנים בין חיידקים) יכולים להיות מוגבר באופן סלקטיבי מתבנית ה-DNA מעורבת של קהילות חיידקי מעיים, רצף, ומשובט. בעזרת מידע זה, המשתמש יכול לזהות את מיני חיידקים לאחר אחזור מידע רצף ממאגרי מידע ציבורי 13,14. עם זאת, רצף מתקרב לתאר חיידקיםקהילות יישארו מספיק בשל חוסר המידע על תרומת חילוף חומרים הפנימית של המינים הבודדים בתוך הקהילה. היציב-איזוטופ חיטוט (SIP) הוא טכניקה נטולת תרבות מבטיחה. הוא משמש לעתים קרובות במיקרוביולוגיה סביבתית לנתח phylogenies חיידקים קשורים לפעילות חילוף חומרים מסוימת. זו מושגת על ידי מעקב אטומים ממצעים יציבים, איזוטופ שכותרתו לתוך סמנים ביולוגיים של חיידקים, כגון חומצות המופקים מפוספוליפידים שומן, DNA, RNA ו5. כאשר שוקלים חומצות גרעין, מתודולוגיה מבוססת על הפרדת 13 DNA שכותרת-C או RNA מ-DNA ללא תווית ידי ultracentrifugation צפיפות שיפוע 6. בשל קשר ישיר זה בין תווית ה-DNA ואת פעילות חילוף חומרים, ניתוח מולקולרי במורד הזרם של חומצות הגרעין מזהה את המינים ומספק מידע על פעילות המטבולית. יתר על כן, שילוב של ה-DNA-SIP וpyrosequencing כפי שיושם על ידיPilloni, פון נצר, et al. 15, מאפשר זיהוי פשוט ורגיש במיוחד של מיני חיידקים המצויים בחלק ה-DNA הכבד 13 כותרת C. עד עכשיו, בטכניקה זו יושמה כדי לתאר את קהילות חיידקים מעורבות בתהליכי biogeochemical בקרקע בתנאים אנאירוביים ואירוביים 16,17 18,19. חוץ מזה של השימוש במדעי הסביבה, הטכניקה יושמה במדעי רפואה כפי שדווחה על ידי רייכרט, et al. 5, שתיאר את הפעילות המטבולית של קבוצות פילוגנטי שונות של חיידקי מעיים האנושיים בתגובה לפחמימות nondigestible. כאן אנו משתמשים 13 C-גלוקוז ל&#39;תווית &#39;את ה-DNA של מיני חיידקים הפעילים מטבולית במעיים. גלוקוז הוא סוכר מנוצל על ידי רוב מיני חיידקים לאורך השביל הנרחב Entner-Doudoroff (ED), אם כי ידועים חריגים 20. זהמצדיק את השימוש ב13 C-גלוקוז כמו בדיקה חילוף חומרים אמינה המספקת קשר בין מטבוליטים של עניין ומקור פחמן לאורך מסלולים הוקמו. בהתאם לשאלה המדעית, מצעים אחרים, כלומר 13 C-מתאן, 13 CO 2, או צמחים שהועלו תחת אווירת 13 CO 2, ניתן להשתמש בם כדי לטפל בפעילות המטבולית. בשלב זה, אנו מציגים הפרוטוקול מיושם באפיון מטבולים של קהילת חיידקי המעיים של חרקים generalist, כלומר ס littoralis (פרפרים, Noctuidae). יתר על כן, הטכניקה הייתה מצמידים את pyrosequencing, אשר בתורו מאפשר זיהוי של קהילת חיידקי מעי חרק עם רזולוציה גבוהה ודיוק. כמצע העיקרי, 13 גלוקוז שכותרת-C נוצל במהלך הניסויים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="872"> 
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Dumont #5 Mirror Finish Forceps</td>
			<td style="width:203px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:135px;">11251-23</td>
			<td style="width:151px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Speed Vacuum Concentrator 5301</td>
			<td>Eppendorf Germany</td>
			<td>5305 000.304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic pestle</td>
			<td>Carl Roth GmbH Co. Germany</td>
			<td>P986.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoVue spectrophotometer</td>
			<td>GE HealthCare, UK</td>
			<td>28-9569-58</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mastercycler pro/thermocycler</td>
			<td>Eppendorf Germany</td>
			<td>6321 000.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber</td>
			<td>Biometra</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge (Optima L-90K)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>A20684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge rotor (NVT 90)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>362752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC pump</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quick-Seal, Polyallomer tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transilluminator UVstar 15 </td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of metabolically active bacteria in the gut of the generalist spodoptera littoralis via dna stable isotope probing using 13c-glucose

אומץ של רוב החרקים הם מיושבים על ידי קהילות מורכבות של חיידקי nonpathogenic סימביוטיים. בתוך קהילות של חיידקים כאלה ניתן לזהות מיני commensal או חיידקי mutualistic. אלה האחרונים, נצפו לשרת פונקציות רבות לחרקים, כלומר מסייעים ברבייה חרקים 1, לחיזוק התגובה החיסונית 2, ייצור פרומון 3, כמו גם תזונה, כוללים הסינתזה של חומצות אמינו חיוניות 4, בין יתר. בשל החשיבות של עמותות אלה, מאמצים רבים נעשו כדי לאפיין את הקהילות עד לחברים הבודדים. עם זאת, רוב המאמצים אלה היו מבוססים גם על שיטות גידול או הסתמך על הדור של שברי גני 16S rRNA שהיו רצף לזיהוי סופי. למרבה הצער, גישות אלה זוהו רק מיני חיידקים הנמצאים במעי ולא סיפקו informatיון על הפעילות המטבולית של מיקרואורגניזמים. כדי לאפיין את מיני חיידקים הפעילים מטבולית במעיים של חרקים, השתמשנו איזוטופ היציב חיטוט (SIP) in vivo העסקת 13 C-גלוקוז כמצע אוניברסלי. זוהי טכניקה נטולת תרבות מבטיחה המאפשרת ההצמדה של phylogenies חיידקים לפעילות המטבולית שלהם בפרט. זה אפשרי על ידי מעקב אטומים ממצעים יציבים, איזוטופ שכותרתו לתוך סמנים ביולוגיים של חיידקים, כגון DNA ו-RNA 5. שילוב של 13 C איזוטופים לתוך ה-DNA מגביר את הצפיפות של ה-DNA שכותרתו בהשוואה לללא תווית (12 C) אחד. בסופו של הדבר, ה-DNA שהכותרת-C 13 או RNA הוא מופרדת על ידי ultracentrifugation צפיפות שיפוע מאחד 6 דומים 12 C-ללא התווית. הניתוח מולקולרי הבא של isotopomers חומצות הגרעין המופרד מספק את הקשר בין פעילות וזהות המטבולית של המינים. כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול המשמש כדי לאפיין את החיידקים הפעילים מטבולית במעיים של חרקים generalist (מערכת המודל שלנו), littoralis Spodoptera (פרפרים, Noctuidae). הניתוח פילוגנטי של ה-DNA נעשה באמצעות pyrosequencing, אשר אפשר ברזולוציה גבוהה ודיוק בזיהוי של קהילת חיידקי מעי חרק. כמצע עיקרי, 13 גלוקוז שכותרת-C שימש בניסויים. המצע היה נמאס לחרקים באמצעות תזונה מלאכותית.

כדי להשיג תיוג מספק של החיידקים הפעילים מטבולית הווה בבטן החרק, החרקים צריכים להיות חשופים למצע C עשיר ב13 לתקופה מותאמת בעבר מספיק כדי לאפשר את ההפרדה של חלק קטן יותר כבד שכותרתו בקלות מללא תווית בהירה אחד. במקרה שלנו, 13 C-גלוקוז נוספו בתזונה המלאכותית בריכוז סופי של 10 מ&quot;מ ליום 1 (איור 1 א). אותה הכמות של גלוקוז הנורמלי (איור 1 ב) סופקה בתזונה המלאכותית של החרקים השליטה. כפי שהוזכר קודם, הפרדה שברי ה-DNA (כבדה יותר מקל) היא הבסיס לכל התהליך. לכן, הצעד הראשון שיש לבצע הוא המיצוי של דנ&quot;א מהרקמות של עניין, במקרה זה, לקהילת החיידקים הקשורים בבטן החרק. כדי לאשר את איכותו חשוב להפעיל ג&#39;ל אלקטרופורזה כדי לקבוע אם כל ה-DNA בכלל התקבל מanalyרקמת zed. באיור 1 ג, זה הנצפה להקה חזקה של הדנ&quot;א הגנומי בחלק העליון של התמונה המאשרת את מיצוי DNA החיובי. בנוסף, יש צורך לבצע PCR לאבחון, תוך שימוש בצבעים יסוד אוניברסלי בקטריאלי, כדי לקבוע את נוכחותו של ה-DNA בקטריאלי (1D איור). תוצאה חיובית זה חשוב כדי להחליט אם להמשיך עוד יותר עם ההפרדה של ה-DNA metagenomic חילוץ. לאחר ultracentrifugation, ברגע שהכמות של ה-DNA בכל חלק מופרד הוא אישר, וכן המדידה של הצפיפות נעשה, להתוות את הצפיפות הממוצעת בחלק ג&#39;/ מיליליטר על פני מספר שבריר כדי לאשר את המבנה הנכון שיפוע בצינורות, אשר בדרך כלל מכסה טווח צפיפות מ1.690 (לשבריר 12 או 11) גרם / מיליליטר 1.760 גר &#39;/ מיליליטר (לחלק 1). pyrosequencing כמותיים מבוצע ישירות על הדרגות SIP נציג לחשוף את שושלת מינים ושפע יחסי (איור 2 </strong&gt;). כאן אנו רצף השברים כבדים משני המדגם המתוקן 13 C-גלוקוז והשליטה ללא תווית, ששימשה לאפיון אוכלוסיות פעילים בקהילה. לאחר רצף, סך של 120,045 באיכות גבוהה קורא עם אורך ממוצע של 404 נוקלאוטידים נוצרו. פרופיל pyrosequencing הראה שפע מוגבר של מינים מסוימים הכוללים אנטרוקוקוס וPantoea במדגם שכותרתו (13 DNA שכותרתו C, איור 3) בהשוואה לזה בקבוצת הבקרה (Control 12 C-DNA, איור 3). לכן חיידקים אלה נחשבים פעילים מטבולית, וכשרון מחקר נוסף. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50734/50734fig1.jpg" width="500px" /> ניסוי איור 1. 13 האכלת C-גלוקוז, מיצוי DNA והגברת PCR של 16S rRNA gen החיידקים<html> דואר. גלוקוז ילידים () 13 C-גלוקוז תוקן תזונה מלאכותית הנצרכת על ידי Spodoptera littoralis זחלים. (ב) (12 C-גלוקוז) תוקן תזונה מלאכותית הנצרכת על ידי זחלים מאותה הקבוצה של חרקים המשמשים ב(), המשמשת כשליטה . (C) תמצית אופיינית metagenomic DNA מרקמת המעי של זחלים בקבוצת טיפול C-גלוקוז 13 ובקבוצת ביקורת 12 C-גלוקוז. שלושה משכפל ביולוגי (מסלול 1, 2 ו -3) כלולים בכל קבוצה. M עומד על סמן ה-DNA kb 1. ההגברה PCR (ד &#39;) עם סט פריימר חיידקים אוניברסלי מייצר מוצרי גן 1.5 kb 16S rRNA הנכונים באמצעות DNA metagenomic חולץ כתבנית. מסלולי 1 הוא הבקרה החיובית PCR. ליין 2 ו -3 מייצגים את מדגם 13 C-גלוקוז טופל ושליטת 12 C-גלוקוז, בהתאמה.<html> &quot;Target =&quot; _blank jpg &quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50734/50734fig2.jpg" width="600px" /> איור 2. קווי המתאר של ניסוי Pyro-SIP מעורב ultracentrifugation צפיפות CsCl שיפוע ואפיון שבריר עם pyrosequencing של ה-DNA המופרד. H = שפע גבוה יותר, L = שפע נמוך. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50734/50734fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50734/50734fig3.jpg" width="500px" /> איור 3. גיוון חיידקים ושפע יחסי בשברים הכבדים של הזחלים האם של גלוקוז האכיל (12 DNA C-שליטה) ו13 הזחלים האכילו C-גלוקוז (ה-DNA שכותרת-C 13)./ &quot;= היעד&quot; _blank www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50734/50734fig3highres.jpg &quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose at JoVE.co

Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose

קהילת החיידקים הפעילה הקשורים לבטן של littoralis Spodoptera, נקבעה על ידי יציב-חיטוט-איזוטופ (SIP) מצמידים את pyrosequencing. השימוש במתודולוגיה זו, זיהוי של מיני חיידקים הפעילים מטבולית בתוך הקהילה נעשה ברזולוציה גבוהה ודיוק.

זיהוי של חיידקים פעילים מטבולית במעיים של Generalist<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; באמצעות איזוטופ יציב DNA גשוש שימוש<sup&gt; 13</sup&gt; C-גלוקוז

Guts of most insects are inhabited by complex communities of symbiotic nonpathogenic bacteria. Within such microbial communities it is possible to ...

identification-metabolically-active-bacteria-gut-generalist

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose

15.3K Views.  Max Planck Institute for Chemical Ecology.  קהילת החיידקים הפעילה הקשורים לבטן של littoralis Spodoptera, נקבעה על ידי יציב-חיטוט-איזוטופ (SIP) מצמידים את pyrosequencing. השימוש במתודולוגיה זו, זיהוי של מיני חיידקים הפעילים מטבולית בתוך הקהילה נעשה ברזולוציה גבוהה ודיוק. 

Video: Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and species-rich microbial population that assists in the degradation of lignocellulose predominantly into acetate, the key nutrient fueling termite metabolism (Odelson &amp; Breznak, 1983).  Within these microbial populations are bacteria, methanogenic archaea and, in some ("lower") termites, eukaryotic protozoa. Thus, termites are excellent research subjects for studying the interactions among microbial species and the numerous biochemical functions they perform to the benefit of their host.  The species composition of microbial populations in termite guts as well as key genes involved in various biochemical processes has been explored using molecular techniques (Kudo et al., 1998; Schmit-Wagner et al., 2003; Salmassi &amp; Leadbetter, 2003). These techniques depend on the extraction and purification of high-quality nucleic acids from the termite gut environment.  The extraction technique described in this video is a modified compilation of protocols developed for extraction and purification of nucleic acids from environmental samples (Mor  et al., 1994; Berthelet et al., 1996; Purdy et al., 1996; Salmassi &amp; Leadbetter, 2003; Ottesen et al. 2006) and it produces DNA from termite hindgut material suitable for use as template for polymerase chain reaction (PCR).

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite Zootermopsis Angusticollis and Visualizing Gut Microbes

This video illustrates the technique for extracting DNA from the species of microbes resident in the termite hindgut. The preparation of a wet mount slide, which is useful for visualizing the gut microbial community is also illustrated, and a tour through the species-rich gut environment is given.

חילוץ ה-DNA של חיידקים במעיים של טרמיטים (Zootermopsis Angusticollis) באופן חזותי חיידקים גוט

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and ...

DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and nutrients into cellular biomass. As such, this cultivation-independent technique has been an important methodology for assigning metabolic function to the diverse communities inhabiting a wide range of terrestrial and aquatic environments. Following the incubation of an environmental sample with stable-isotope labelled compounds, extracted nucleic acid is subjected to density gradient ultracentrifugation and subsequent gradient fractionation to separate nucleic acids of differing densities. Purification of DNA from cesium chloride retrieves labelled and unlabelled DNA for subsequent molecular characterization (e.g. fingerprinting, microarrays, clone libraries, metagenomics). This JoVE video protocol provides visual step-by-step explanations of the protocol for density gradient ultracentrifugation, gradient fractionation and recovery of labelled DNA. The protocol also includes sample SIP data and highlights important tips and cautions that must be considered to ensure a successful DNA-SIP analysis.

DNA Stable-Isotope Probing DNA-SIP

DNA stable-isotope probing is a cultivation-independent method to identify and characterize active communities of microorganisms that are capable of utilizing specific substrates. Assimilation of substrate enriched in heavy isotope leads to incorporation of labelled atoms into microbial biomass. Density gradient ultracentrifugation retrieves labelled DNA for downstream molecular analyses.

DNA-איזוטופ יציב גשוש (ה-DNA SIP)

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and ...

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in cellular and mammalian models. Here, we describe detailed methods to perform stable isotopic profiling of intermediary metabolism and metabolic flux in the nematode, Caenorhabditis elegans. Methods are described for profiling whole worm free amino acids, labeled carbon dioxide, labeled organic acids, and labeled amino acids in animals exposed to stable isotopes either from early development on nematode growth media agar plates or beginning as young adults while exposed to various pharmacologic treatments in liquid culture. Free amino acids are quantified by high performance liquid chromatography (HPLC) in whole worm aliquots extracted in 4% perchloric acid. Universally labeled 13C-glucose or 1,6-13C2-glucose is utilized as the stable isotopic precursor whose labeled carbon is traced by mass spectrometry in carbon dioxide (both atmospheric and dissolved) as well as in metabolites indicative of flux through glycolysis, pyruvate metabolism, and the tricarboxylic acid cycle. Representative results are included to demonstrate effects of isotope exposure time, various bacterial clearing protocols, and alternative worm disruption methods in wild-type nematodes, as well as the relative extent of isotopic incorporation in mitochondrial complex III mutant worms (isp-1(qm150)) relative to wild-type worms. Application of stable isotopic profiling in living nematodes provides a novel capacity to investigate at the whole animal level real-time metabolic alterations that are caused by individual genetic disorders and/or pharmacologic therapies.

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable isotopic profiling by gas chromatography mass spectrometric analysis of intermediary metabolic flux is described in the nematode, Caenorhabditis elegans. Methods are detailed for assessing isotopic enrichment in carbon dioxide, organic acids, and amino acids following isotope exposure either during development on agar plates or during adulthood in liquid culture.

פרופיל איזוטופים יציבים של שטף מטבולית מתווך בשלב פיתוח למבוגרים Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not only ensure faithful genome duplication in the face of endogenous and exogenous DNA damage but also prevent genomic instability, a recognized causative factor in tumor development.
Here, we describe a simple and cost-effective fluorescence microscopy-based method to visualize DNA replication in the avian B-cell line DT40. This cell line provides a powerful tool to investigate protein function in vivo by reverse genetics in vertebrate cells1. DNA fiber fluorography in DT40 cells lacking a specific gene allows one to elucidate the function of this gene product in DNA replication and genome stability. Traditional methods to analyze replication fork dynamics in vertebrate cells rely on measuring the overall rate of DNA synthesis in a population of pulse-labeled cells. This is a quantitative approach and does not allow for qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis. In contrast, the rate of movement of active forks can be followed directly when using the DNA fiber technique2-4. In this approach, nascent DNA is labeled in vivo by incorporation of halogenated nucleotides (Fig 1A). Subsequently, individual fibers are stretched onto a microscope slide, and the labeled DNA replication tracts are stained with specific antibodies and visualized by fluorescence microscopy (Fig 1B). Initiation of replication as well as fork directionality is determined by the consecutive use of two differently modified analogues. Furthermore, the dual-labeling approach allows for quantitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase, i.e. replication structures such as ongoing and stalled forks, replication origin density as well as fork terminations. Finally, the experimental procedure can be accomplished within a day, and requires only general laboratory equipment and a fluorescence microscope.

DT40, a model vertebrate genetic system, provides a powerful tool to analyze protein function. Here we describe a simple method that allows qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase in DT40 cells at the single molecule level.

ויזואליזציה של שכפול ה-DNA של DT40 דגם מערכת החולייתנים באמצעות טכניקה סיב ה-DNA

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

דגי ה-DNA 3D חזקים באמצעות בדיקות שכותרתו ישירות

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

הכרומטין immunoprecipitation Assay עבור זיהוי של אינטראקציות החלבון-דנ&quot;א ארבידופסיס<em&gt; In vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ecologically-important endpoints, though they are rarely considered in toxicological studies. D. melanogaster is emerging as a toxicology model for the behavioral, neurological, and genetic impacts of toxicants, to name a few. More importantly, species in the genus Drosophila can be utilized as a model system for an integrative framework approach to incorporate emergent properties and answer ecologically-relevant questions in&#160;toxicology research. The aim of this paper is to provide a protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants to be used as a model system for a range of phenotypic outputs and ecologically-relevant questions. More specifically, this protocol can be used to 1) link multiple biological levels of organization and understand the impact of toxicants on both individual- and population-level fitness; 2) test the impact of toxicants at different stages of developmental exposure; 3) test multigenerational and evolutionary implications of pollutants; and 4) test multiple contaminants and stressors simultaneously.

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

In this paper, we provide a detailed protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants with the goal of studying the impact of exposure on a range of phenotypic outputs at different developmental stages and for more than one generation.

זיהוי של חיידקים פעילים מטבולית במעיים של Generalist

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video