המחברים מבקשים להודות לAdriane מוזלי וLibuse ג&#39;רבק (סטנפורד) לקבלת סיוע בטכניקה הניתוחית.

כל המחקרים בבעלי החיים בוצעו בהתאם להנחיות של ועדת הטיפול בבעלי החיים ושימוש של UCLA והמכונים הלאומיים לבריאות מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה. משך הזמן של ההליך המתואר להלן הוא כ 45-60 דקות מהתחלה ועד הסוף. 1. הכנה של שדה כירורגי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הליך בחדר ניתוח של בעלי החיים נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציוד: מאדה isoflurane, Gaymer T משאבה עם כרית חימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלים סטריליים: שני מלקחיים מעוקלים, מספריים בסדר, בעל מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפפות סטריליות יש להשתמש במהלך ההליך כולו. </li></ol> 2. הכנת בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שני עכברי זכר או נקבה, מאותו הרקע גנטי, של משקל וגודל דומים באותו הכלוב ולפקח לשבועות לפחות, כדי להבטיח חיים משותפים והרמוניים. נקבות עכברים הם העדיפו בשל ההתנהגות פחות האגרסיבית שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים בעלי חיים על ידיבאמצעות אידוי isoflurane. מקום עכברים בPOSI-חותם אינדוקציה הלשכה מחוברים לאידוי isoflurane (4-5% V / V). לאחר ההרדמה מושרה, להעביר את בעלי החיים לאזור גילוח הפרווה ולשמור על ההרדמה בכל ההליך באמצעות חרטומו מחובר לisoflurane (1.5-2% V / V). החל משחת עיניים עם Q-טיפ כדי למנוע יובש בעיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה במצב שכיבה. יסודיות לגלח את צד השמאל של העכבר ממוקם בצד השמאל וצד ימין של העכבר ממוקם בצד הימין מתחיל בכ 1 סנטימטר מעל המרפק עד 1 סנטימטר מתחת לברך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סביבה נקיה מחיידקים להכין את האזורים המגולחים ידי ניגוב יסודי (2-3x) עם מגבונים ספוגים פולידין ואחרי מגבוני אלכוהול. מניחים את העכברים על משטח מחומם המכוסה במשטח סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשיכוך כאבים, לנהל Carprofen ועצירות intraperitoneally או תת עורית במינון של 10 מ&quot;ג / קילוגרם ו0.1 מ&quot;ג / קילוגרם בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח בעלי חיים בצד שלהם, גב אל גב, עםdjacent אזורים מגולחים פונים כלפי מעלה. כדי להימנע מכל זיהום של אזור הניתוח, לכסות את העכברים עם וילון סטרילי חושף רק את אזור הניתוח. ליצור פתח וילון קטן להישאר סטרילי בעת ביצוע הניתוח. אנחנו עשינו את חלון הווילון גדול שתהיינה לי צפייה טובה יותר בצילום וידאו. </li></ol> 3. Parabiosis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מספריים חדים, לבצע חתכים בעור אורך לצדדים המגולחים של כל התחלה של בעלי חיים ב0.5 סנטימטר מעל המרפק כל הדרך ל0.5 סנטימטר מתחת למפרק הברך (איור 1). בעקבות החתך, בעדינות לנתק את העור מfascia תת עורית על ידי מחזיק את העור עם זוג מלקחיים מעוקלים ולהפריד את fascia עם זוג שני כדי ליצור 0.5 סנטימטר של עור בחינם. לבצע הפרדה זו לכל אורך החתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין הצטרפותו על ידי הצמדת olecranon השמאלית של חיה אחת לolecranon זכותו של האחר. olecranons ומפרקי הברך שניהם בצורה ברורה ה הבאה להבחיןחתך בעור דואר. כדי להקל על הצטרפותו, לכופף את המרפק של העכבר הראשון ולהעביר את המחט של 3-0 התפר שאינו נספג מתחת olecranon. בדומה לכך, לכופף את המרפק של העכבר השני ולהעביר את אותו התפר מתחתיה. צרף מפרקים בחוזקה על ידי קשר כפול כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את מפרקי הברך בעקבות אותו ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות החיבור של המפרקים, לחבר את העור של שתי חיות עם תפר נספג רציף 5-0 Vicryl מתחיל ventrally מהמרפק לכיוון הברך. כדי למנוע קרע בעור והפרדה לבצע סגירת תפר הדוקה של העור באזור שסביב המרפקים והברכיים האזור. ברגע שהקובץ מצורף עור הגחון הושלם, לבצע קשר כפול כירורגית. מקם את העכברים במצב המועדים ולהמשיך dorsally התפר שהסתיימה עם קשר כפול כירורגית. בדוק את ההמשכיות של התפר ולאשר את חוסר פתחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל 0.5 מיליליטר של .0.9% NaCl תת עורי לכל עכבר כדי למנוע dehydration. </li></ol> 4. החלמה לאחר ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על חיות על משטח מחומם עד להחלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות התאוששות, לספק carprofen משככי כאבים ועצירות. חזור intraperitoneally או תת עורי כל שעה 24 ו12, בהתאמה, עבור 48 שעות באותו המינון שתואר לעיל (שלב 2.5). לפקח על בעלי חיים לסימנים של כאב ומצוקה, כגון טלטול, עייפות, לעיסה של זנב, קימר את גבה, חוסר הטיפוח, וכו &#39;ביום למשך שבועיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prophylactically, טיפול בעכברים עם השעיה אוראלית sulfamethoxazole / Trimethoprim בבקבוק המים שלהם 2 מ&quot;ג סולפה / מיליליטר +0.4 מ&quot;ג לקצץ מיליליטר / ל10 ימים כדי למנוע זיהומים חיידקיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בית כל זוג parabiotic בכלוב נקי עם חומר מונוליטי מצעים (מגבת נייר למשל או משטח סטרילי סופג) כדי למנוע שאיפה של חומר מצעים. להחזיר את בעלי החיים לכלוב מצעים מלאים כאשר הם מסוגלים לשמור על עינת חזה עם הראש שלהם למעלה. כדי למזער את המתחלהגיע למזון, תוך התאמה לקיום parabiotic, הנח את כדורי מזון הרטיב על רצפת הכלוב. לספק חומר קינון. ב1-2 שבועות יש עכברים parabiotic יכולת ambulate בדרך כלל על קדמיים ואחורי-גפיים לזווג בניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> chimerism הדם מתרחש 10-14 ימים שלאחר הניתוח. </li></ol> 5. אישור והליך הפוך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שבועיים להקיז דם מורידי הזנב של כל עכבר לניתוח הזרימה cytometric כדי לאשר chimerism דם (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיבוד דם לצורך ניתוח התזרים cytometric: לדלל 2-3 טיפות של דם ב500 μl של 10 mM EDTA. הוסף 500 μl של דקסטראן 2% (בדילול מלא PBS), ומערבב היטב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. מעביר את supernatant בצינור חדש, ספין על 1,200 סל&quot;ד במשך 5 דקות ו resuspend תאי pelleted ב PBS (או חיץ אחר) לניתוח התזרים cytometric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לתכנון ניסוי, ניתן להפריד את זוג parabiotict נקודות זמן מאוחר יותר. מניסיוננו, יש לנו לשמור זוגות parabiosed לתקופה של עד 9 חודשים ללא כל סיבוכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הליך הפוך על משטח כירורגי סטרילי. הרדימי עכברים ידי הצבת אותם בחדר אינדוקציה המחובר לאידוי isoflurane (4-5%) ולשמור על הרדמה עם isoflurane 1.5-2%, כפי שתואר לעיל (שלב 2.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר שיער מהאזור המקיף את התפר הראשוני וסביבה נקיה מחיידקים להכין את האזורים המגולחים כפי שתואר לעיל (שלבים 2.3, 2.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשיכוך כאבים, לנהל Carprofen ועצירות intraperitoneally או תת עורית במינון של 10 מ&quot;ג / קילוגרם ו0.1 מ&quot;ג / קילוגרם, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה אזור ניתוח עם וילון סטרילי כפי שתואר לעיל (שלב 2.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים חדים, להפריד את העכברים דרך חתך אורכים עם התפר לרוחב ועדינות לנתק את fascia שהוקם בין שני העכברים עם זוג מלקחיים מעוקלים. כדי להפריד את המפרקים, לחתוך את קשרים של התפרהקושר אותם. חתוך את העור לאורך החתך כדי להשיג קצוות חלקים ולצרף עור עם תפר נספג רציף 5-0 מצופה Vicryl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת למנוע התייבשות, לנהל 0.5 מיליליטר של .0.9% מתחת לעור NaCl לכל עכבר. לשמור על חיות על משטח מחומם עד להחלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התאוששות, חוזר ממשל משכך כאבים, כל (0.1 מ&quot;ג / קילוגרם) 24 שעות ועצירות carprofen (10 מ&quot;ג / קילוגרם) בכל שעות 12 ל48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע זיהומים חיידקיים טיפול בעכברים עם ההשעיה sulfamethoxazole / Trimethoprim אוראלי (2 סולפה מ&quot;ג / מיליליטר +0.4 מ&quot;ג לקצץ / מיליליטר) בבקבוק המים שלהם ל10 ימים. </li></ol>

<ol><li>Bert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exp%C3%A9riences+et+consid%C3%A9rations+sur+la+greffe+animale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+de+l%27Anatomie+et+de+la+Physiologie%22%5BJournal%5D)">Expériences et considérations sur la greffe animale.</a> Journal de l'Anatomie et de la Physiologie. 1, 69-87 Forthcoming.</li>
<li>Bunster, E., Meyer, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+of+parabiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Improved methods of parabiosis.</a> Anat. Rec. 57, 339-380 (1933).</li>
<li>Waskow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+parabiotic+mice+for+the+study+of+DC+and+DC+precursor+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of parabiotic mice for the study of DC and DC precursor circulation.</a> Methods Mol. Biol. 595, 413-428 (2010).</li>
<li>Finerty, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parabiosis+in+physiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Parabiosis in physiological studies.</a> Physiol. Rev. 32, 277-302 (1952).</li>
<li>Aicher, A., Heeschen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonbone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cells%3A+what+is+their+exact+location%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Nonbone marrow-derived endothelial progenitor cells: what is their exact location.</a> Circ. Res. 101, e102(2007).</li>
<li>Abe, S., Boyer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+derived+from+the+circulation+contribute+to+the+repair+of+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Cells derived from the circulation contribute to the repair of lung injury.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 170, 1158-1163 (2004).</li>
<li>Donskoy, E., Goldschneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymocytopoiesis+is+maintained+by+blood-borne+precursors+throughout+postnatal+life.+A+study+in+parabiotic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymocytopoiesis is maintained by blood-borne precursors throughout postnatal life. A study in parabiotic mice.</a> J. Immunol. 148, 1604-1612 (1992).</li>
<li>Powell, A. E., Anderson, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+between+Intestinal+epithelial+cells+and+macrophages+in+a+cancer+context+results+in+nuclear+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fusion between Intestinal epithelial cells and macrophages in a cancer context results in nuclear reprogramming.</a> Cancer Res. 71, 1497-1505 (2011).</li>
<li>Duyverman, A. M., Kohno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+parabiosis+skin+transplantation+model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A transient parabiosis skin transplantation model in mice.</a> Nat. Protoc. 7, 763-770 (2012).</li>
<li>Ajami, B., Bennett, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+self-renewal+can+sustain+CNS+microglia+maintenance+and+function+throughout+adult+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life.</a> Nat. Neurosci. 10, 1538-1543 (2007).</li>
<li>Weissman, I. L., Jerabek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+and+the+H-Y+antigen%3A+Requirement+for+male+T+cells%2C+but+not+B+cells%2C+to+induce+tolerance+in+neonatal+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Tolerance and the H-Y antigen: Requirement for male T cells, but not B cells, to induce tolerance in neonatal female mice.</a> Transplantation. 37, 3-6 (1984).</li>
</ol>

יש המחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

שיטת parabiosis דנה כאן מציגה קשיים מינימאליים טכניים ותוצאות בשיעורי תמותה נמוכות. הקובץ המצורף של מפרקי הברך ומרפק הוא שיפור משמעותי של Bunster והטכניקה מאייר. עם זאת, ההליך נותר פולשני ובכך שמירה על תנאים סטריליים לאורך כל הניתוח היא הכרחית. כדי למנוע זיהום של האתר כירורגית נוסף, חשוב שבעלי החיים parabiosed יקבלו שילוב של אנטיביוטיקה ולעקוב באופן קבוע. כדי להבטיח את תמיכת משרד ולמנוע כאב, את התפר שמחבר את המרפקים וברכיים צריך להקיף את המפרקים ולא עובר דרך הרקמות. כחלופה לשאיפת isoflurane, הרדמה עלולה להיגרם עם השימוש בזריקת intraperitoneal של קטמין / xylazine או סמים הרדמה אחרים שאושרו על ידי ועדות מוסדיות. היתרון של שימוש isoflurane הוא שזה במהירות יכול לגרום להרדמה ולהפחית באופן משמעותי recovery זמן. יתר על כן, ברמה של הרדמה ניתן לשלוט באופן מדויק. Parabiosis, המאפשר למערכות דם משני בעלי חיים כדי להתמזג ולאזן, הוא הליך ניסיוני רב עוצמה למחקרים פיסיולוגיים. הוא מציג מספר יתרונות טכניקות נפוצות אחרות, כגון השתלת מח עצם או הזרקת תא. נהלי משלוח תא, לעתים, לספק חלון קצר כדי לבחון את ההשפעה של תאים מושתלים. בנוסף, החיסון מגביר את הסיכון לזיהום ותחלואה ותמותה שלאחר מכן. עם זאת, עם parabiosis אחד לא יכול לשמור על זרימת chimeric לתקופות ארוכות של זמן ומחקר במחזור גורמים (תאים, ציטוקינים, וכו &#39;) ללא תלות במוצאם. מערכת זו יכולה לשמש כדי לקבוע את התפקיד של מחזורי תאים בריפוי פצעים, היווצרות גידול, הזדקנות, התחדשות, ותגובה דלקתית, בין רבים אחרים.

Parabiosis, כירורגית הצטרפותו של שני אורגניזמים, תואר לראשונה בשנת 1864 ידי פול ברט כדרך לפתח מודל ללמוד מערכות מחזור הדם משותפות וכללה את הצטרפותו של העור וקירות שריריים של שתי חולדות 1. Parabiosis מקדם היווצרות של נימי דם באתר של דלקת 3 ויש לו כמה יישומים במחקרים פיסיולוגיים, כגון תקשורת הורמונלית בין בלוטת יותרת המוח ובלוטות המין, כמו גם את תפקידו של כליות יתר לחץ דם 4. זה כבר מועסק נוסף כדי לחקור את הגיוס ושילוב של תאי אב בneovascularization 5, הגירה של תאי גזע hematopoietic 6, וסחר הלימפוציטים 7, כמו גם את התפקיד וקינטיקה של מחזורי תאים דלקתיים או תאי גזע בגרורות סרטניים 8,9, ומחלות ניווניות 10. יתרון משמעותי אחד משקרי parabiosisשבחי השותפות לשתף אנטיגנים במחזור משותפים, המאפשרים נדידת תאים וneovascularization בלי לעורר תגובה חיסונית. חשוב לציין, וייסמן ואח&#39;. הראו parabiosis שבין עכברי זכרים ונקבה אינו מביא להיווצרות של ח.י. אנטי נוגדני 11. בפרוטוקול המקורי שתואר על ידי פול ברט שני בעלי החיים חוברו יחדיו באמצעות חיבור של העור ושרירים קירות 1. שיטה זו לעומת זאת, גרמה למתח משמעותי לבעלי החיים וגרמה לתמותה גבוהה עקב זיהום של הפצע. מאז טכניקת parabiosis תוקן על ידי מספר קבוצות עם השולט ביותר להיות הפרוטוקול שהוצע על ידי Bunster ומאייר ב -1933 2. השיטה שלהם כללה הצטרפות של מפרקי עצם השכם, חללים בגוף, ועור, ומאפשר תמיכה טובה יותר ופחות כאב לבעלי החיים. במקביל, השיטה החדשה הביאה לטיפול שלאחר ניתוח מינימאלי ומובהקcantly ירידה בשיעורי תמותה. הפרוטוקול המתואר כאן הוא שינוי של טכניקת Bunster והמאיירת שהיא פחות פולשני ומאפשרת הצטרפות מוצקה יותר. כלומר, מחוברים עכברים דרך מפרקי מרפק והברך, כמו גם את העור. הרחבה זו מצטרפת מונעת מהעור ולכן גורמת פחות כאבים וסיבוכים. כאן אנו מתארים את הצטרפותו של סוג בר עכבר בוגר (ט &#39;) לGFP מכונן המבטא עכבר. אנו מראים כי שבועיים לאחר ניתוח אנחנו יכולים להשיג 50% מchimerism הדם הממחישים את היעילות של פרוצדורה כירורגית זו כדי ליצור מערכת דם משותפת.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane-Phoenix</td><td>Clipper</td><td>NDC 57319-559-06</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Seal Induction Chamber</td><td>Molecular Imaging Products</td><td>AS-01-0530-SM</td><td></td></tr><tr><td>Portable Anesthesia System</td><td>Molecular Imaging Products</td><td>AS-01-0007</td><td></td></tr><tr><td>Gaymer T Pump</td><td>Gaymar Industries, Inc</td><td>TP650</td><td></td></tr><tr><td>Warming Blanket (Heating pad)</td><td>Kent Scientific Corp</td><td>TP-22G</td><td></td></tr><tr><td>Curved forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5101</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>FST 14063-09</td><td></td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>FST</td><td>FST 12501-13</td><td></td></tr><tr><td>Electrical shaver</td><td>Oster</td><td>Golden A5</td><td></td></tr></tbody></table>

parabiosis in mice: a detailed protocol

Parabiosis הוא איחוד כירורגית של שני אורגניזמים המאפשרים שיתוף של זרימת הדם. מצרף את העור של שתי חיות מקדם היווצרות של נימי דם באתר של דלקת. שותפי Parabiotic לשתף אנטיגנים במחזור שלהם ולכן הם חופשיים של תגובה חיסונית שלילית. תואר לראשונה על ידי פול ברט בשנת 1864 1, ניתוח parabiosis היה מעודן על ידי Bunster ומאייר ב -1933 כדי לשפר את ההישרדות של בעלי החיים 2. בפרוטוקול הנוכחי, שני עכברים בניתוח הצטרפו הבא שינוי של Bunster והטכניקה מאייר. בעלי חיים מחוברים באמצעות מפרקי המרפק והברך ואחרי חיבור של העור ומאפשר תמיכה איתנה המונעת עומס על העור נתפר. בזאת, אנו מתארים בפירוט את parabiotic הצטרפותו של ה-GFP בכל מקום להביע את העכבר לסוג בר עכבר (WT). שבועיים לאחר ההליך, הזוג מופרד וניתן לאתר תאי GFP החיוביים על ידי ניתוח התזרים cytometric בcirculat הדםיון של עכבר WT. Chimerism הדם מאפשר לבחון את תרומתם של התאים במחזור מחיה אחת בשנייה.

התוצאה הצפויה של parabiosis של שני אורגניזמים היא התרומה שווה של מערכת הדם של כל חיה לזרימת דם נפוצה (איור 2). אפשר בקלות לאמת את האיזון המוצלח של דמם של העכברים החיוביים parabiosed WT וה-GFP על ידי ניתוח התזרים cytometric. הנה, דם ורידים הושג מהזנבות של שני parabionts ב2 שבועות לאחר הניתוח והיה מופרד לתאי דם היקפיים (להוציא אריתרוציטים). שבריר התא שמקורם hematopoietic המופרד נותח לאחר מכן על ידי cytometry זרימה לנוכחות של תאי GFP החיובי וWT. עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים, דם מעכבר WT גילה נוכחות של chimerism, כפי שצוין על ידי תאי ה-GFP כמחצית חיוביים ומחצית WT דם (תאי WT 53% ותאי ה-GFP 47%) (איור 3). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50556/50556fig1.jpg" /> איור 1. Parabioניתוח sis:. אתר חתך הצדדים לרוחב של חיות הרדימו מגולחים וחתכים בעור אורך מבוצעים (אזור פנק) מ0.5 סנטימטר מעל המרפק ל0.5 סנטימטר מתחת למפרק הברך. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50556/50556fig2.jpg" /> איור 2. ייצוג סכמטי של שיטת parabiosis.) הצטרפותו של עכבר WT (משמאל) לעכבר ה-GFP חיובי (מימין). ב &#39;) כשבועות לאחר התקשרות כירורגית, נימי דם חדשים נוצר במיקום שבו שני העכברים מחוברים מאפשרים הצטרפות של זרימת הדם. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50556/50556fig3.jpg" /> איור 3. chimerism הדם של שותפי parabiotic. ניתוח תזרים cytometric של דגימת דם שנאסף משותף parabiotic WT שבועיים הבא מצטרף כירורגית.

Watch this Scientific Journal Video about Parabiosis in Mice: A Detailed Protocol at JoVE.com

Parabiosis in Mice: A Detailed Protocol

Parabiotic הצטרפותו של שני אורגניזמים מוביל להתפתחותה של מערכת דם משותפת. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הצעדים כירורגית כדי ליצור חיבור בין parabiotic עכבר wild-type ועכבר-GFP-לבטא מכונן.

Parabiosis בעכברים: פרוטוקול מפורט

Parabiosis is a surgical union of two organisms allowing sharing of the blood circulation. Attaching the skin of two animals promotes formation of ...

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

74.4K Views.  University of California, Los Angeles.  Parabiotic הצטרפותו של שני אורגניזמים מוביל להתפתחותה של מערכת דם משותפת. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הצעדים כירורגית כדי ליצור חיבור בין parabiotic עכבר wild-type ועכבר-GFP-לבטא מכונן. 

Video: Parabiosis in Mice: A Detailed Protocol

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a routine procedure is widely utilized throughout the world and its main limitation resides in the poor efficacy of transgene integration, resulting in a low yield of founder animals. Only few percent of animals born after implantation of injected fertilized oocytes have integrated the transgene. In contrast, lentiviral vectors are powerful tools for integrative gene transfer and their use to transduce fertilized oocytes allows highly efficient production of founder transgenic mice with an average yield above 70%. Furthermore, any mouse strain can be used to produce transgenic animal and the penetrance of transgene expression is extremely high, above 80% with lentiviral mediated transgenesis compared to DNA microinjection. The size of the DNA fragment that can be cargo by the lentiviral vector is restricted to 10 kb and represents the major limitation of this method. Using a simple and easy to perform injection procedure beneath the zona pellucida of fertilized oocytes, more than 50 founder animals can be produced in a single session of microinjection. Such a method is highly adapted to perform, directly in founder animals, rapid gain and loss of function studies or to screen genomic DNA regions for their ability to control and regulate gene expression in vivo.

Here, we present a protocol to promote transgene integration and production of founder transgenic mice with high efficacy by a simple injection of a lentiviral vector in the perivitelline space of a fertilized oocyte.

Lentiviral מתווכת הייצור של העכברים הטרנסגניים: שיטה פשוטה ויעילה מאוד עבור לימוד ישיר של המייסדים

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Genetics

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for candidate genes of interest, migratory behaviors of cells, and secreted signals in distinct genetic settings. Because parabiotic animals share a common circulation, any blood or blood-borne factor from one animal will be exchanged with its partner and vice versa. Thus, cells and molecular factors derived from one genetic background can be studied in the context of a second genetic background. Parabiosis of adult mice has been &#160;used extensively to research aging, cancer, diabetes, obesity, and brain development. More recently, parabiosis of zebrafish embryos has been used to study the developmental biology of hematopoiesis. In contrast to mice, the transparent nature of zebrafish embryos permits the direct visualization of cells in the parabiotic context, making it a uniquely powerful method for investigating fundamental cellular and molecular mechanisms. The utility of this technique, however, is limited by a steep learning curve for generating the parabiotic zebrafish embryos. This protocol provides a step-by-step method on how to surgically fuse the blastulae of two zebrafish embryos of different genetic backgrounds to investigate the role of candidate genes of interest. In addition, the parabiotic zebrafish embryos are tolerant to heat shock, making temporal control of gene expression possible. This method does not require a sophisticated set-up and has broad applications for studying cell migration, fate specification, and differentiation in vivo during embryonic development.

This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.

הדור של Parabiotic דג הזברה עוברים ידי Fusion כירורגי של פיתוח Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Developmental Biology

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called liquefaction. In this study, we show how to collect the post-ejaculated semen from the female reproductive tract in a mouse model. First, adult female mice in the estrus stage were housed in a male&#39;s cage overnight. The next morning, copulation was confirmed by the presence of copulatory plug at the vaginal opening. Female mice with copulatory plugs were euthanized, and each reproductive tract was collected as a whole (vagina, uterus, oviducts, ovaries), ensuring a closed system to contain the semen. The reproductive tract was placed in a 1.5 mL microcentrifuge tube, and the vagina was cut off to release the semen into the tube. To ensure maximum semen volume for analysis, toothless forceps were used to squeeze the uterine horns from ovarian end to vaginal end expelling remaining semen. The whole reproductive tract was then discarded. The semen-containing tube was briefly spun down. A 25 &#956;L capillary pipette was placed into the tube at a 180&#176; angle (parallel to the tube wall). The amount of time used to fill the capillary tube to the 25 &#956;L line was recorded. Semen from a proven male breeder usually takes approximately 60-180 s to fill a 25 &#956;L capillary tube. This semen collection technique can also be used in other downstream applications such as sperm imaging and motility analysis.

Semen liquefaction is required for sperm to be liberated from the seminal gel. This study provides the procedures for collecting semen from the female reproductive tract post-coitus, and measuring semen liquefaction time.

אוסף של שלאחר ההזדווגות זרע באיברי הרבייה הנקביים, מדידה של זרע ניזול בעכברים

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

<meta charset="utf8"></head><body>הליך הזרקת זרע עגול Murine לחקר התפתחות עוברית

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>הזרקת זרע עגולה לעכבר

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

הזרקת זרע עגולה לעכבר

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Cardiopulmonary Bypass in a Mouse Model: A Novel Approach

As prolonged cardiopulmonary bypass becomes more essential during cardiac interventions, an increasing clinical demand arises for procedure optimization and for minimizing organ damage resulting from prolonged extracorporal circulation. The goal of this paper was to demonstrate a fully functional and clinically relevant model of cardiopulmonary bypass in a mouse. We report on the device design, perfusion circuit optimization, and microsurgical techniques. This model is an acute model, which is not compatible with survival due to the need for multiple blood drawings. Because of the range of tools available for mice (e.g., markers, knockouts, etc.), this model will facilitate investigation into the molecular mechanisms of organ damage and the effect of cardiopulmonary bypass in relation to other comorbidities.

This paper describes how to perform cardiopulmonary bypass in mice. This novel model will facilitate the investigation of the molecular mechanisms involved in organ damage.

לב-ריאה במודל של עכברים: גישה מוזרה

As prolonged cardiopulmonary bypass becomes more essential during cardiac interventions, an increasing clinical demand arises for procedure optimization ...

A Mouse Model of Orthopedic Surgery to Study Postoperative Cognitive Dysfunction and Tissue Regeneration

Surgery is commonly used to improve and maintain quality of life. Unfortunately, in vulnerable patients such as the elderly, complications may occur and significantly diminish the outcome. Indeed, after routine orthopedic surgery to repair a fracture, as many as 50% of elderly patients suffer from neurologic complications like delirium. Also, the capacity to heal and regenerate tissue after surgery decreases with age, and can impact the quality of fracture repair and even osseous integration of implants. Thus, a better understanding of mechanisms that drive these age-dependent changes could provide strategic targets to minimize risk for such complications and optimize outcomes. Here, we introduce a clinically relevant mouse model of tibial fracture. The postoperative changes in these mice mimic some of the cognitive impairments commonly observed after routine orthopedic surgery in humans. Briefly, an incision is performed in the right hind limb under strictly aseptic conditions. Muscles are disassociated, and a 0.38-mm stainless steel pin is inserted into the upper crest of the tibia, inside the intramedullary canal. Osteotomy is then performed, and the wound is stapled. We have used this model to investigate the effects of surgical trauma on postoperative neuroinflammation and behavioral changes. By applying this fracture model in combination with parabiosis, a surgical model in which 2 mice are anastomosed, we have studied cells and secreted factors that systemically rejuvenate organ function and tissue regeneration after injury. By following our step-by-step protocol, these models can be reproduced with high fidelity, and can be adapted to interrogate many biologic pathways that are altered by surgical trauma.

This protocol describes a mouse model of orthopedic surgery that has been used to study mechanisms of postoperative neuroinflammation and behavioral changes, and when combined with parabiosis, to study tissue regeneration during aging.

דגם העכבר של כירורגיה אורתופדית ללמוד לאחר הניתוח בתפקוד הקוגניטיבי ו התחדשות רקמות

Surgery is commonly used to improve and maintain quality of life. Unfortunately, in vulnerable patients such as the elderly, complications may occur and ...

A Modified Murine Heterotopic Heart Transplant Protocol Matching Contemporary Standards of Aseptic Technique, Anesthesia, and Analgesia

The development of experimental models of cardiac transplantation in animals has contributed to many advances in the fields of immunology and solid organ transplantation. While the heterotopic vascularized murine cardiac transplantation model was initially utilized in studies of graft rejection using combinations of mismatched inbred mouse strains, access to genetically modified strains and therapeutic modalities can provide powerful new preclinical insights. Fundamentally, the surgical methodology for this technique has not changed since its development, especially with respect to important factors such as aseptic technique, anesthesia, and analgesia, which make material impacts on postsurgical morbidity and mortality. Additionally, improvements in perioperative management are expected to provide improvements in both animal welfare and experimental outcomes. This paper reports upon a protocol developed in collaboration with a subject matter expert in veterinary anesthesia and describes the surgical technique with an emphasis on perioperative management. Additionally, we discuss the implications of these refinements and provide details on troubleshooting critical surgical steps for this procedure.

The present paper describes a modified technique for heterotopic vascularized cardiac transplantation with updated aseptic technique, analgesia, and anesthesia.

פרוטוקול השתלת לב הטרוטופי מורין מותאם לסטנדרטים עכשוויים של טכניקה אספטית, הרדמה ושיכוך כאבים

The development of experimental models of cardiac transplantation in animals has contributed to many advances in the fields of immunology and solid organ ...

Immunology and Infection

<meta charset="utf8"></head><body>פרוטוקולים תפעוליים לטיפול בעכברים פראיים במתקני מחקר

Operating and Biocontainment Procedures of a Facility for Laboratory Mice with a Natural Microbiome: Immunophenotyping Procedure

The use of laboratory mice with a natural microbiome, such as &#34;Wildling mice&#34;, offers a promising research tool for both basic and applied science due to their close resemblance to the human superorganism. However, the breeding and maintenance of these mice, which harbor a diverse microbiome&#160;including bacteria, viruses, and parasites, pose significant challenges for animal husbandry facilities at research institutions. To address these challenges, a specialized facility concept was developed for housing &#34;Wildling mice&#34; at Charit&#233; - Universit&#228;tsmedizin Berlin. This approach involved designing a facility with specific structural features and operational protocols to effectively contain the natural microbiome, thereby protecting areas with higher hygiene standards.
A methodology for blood sampling from both specified pathogen-free (SPF) and &#34;Wildling mice&#34; for immunophenotyping is demonstrated, highlighting the workflow and biocontainment measures implemented in the facility. Remarkable results reveal that &#34;Wildling mice&#34; exposed to a natural microbiome develop distinct immune cell populations, which are significantly reduced in mice bred and maintained under stringent hygiene conditions.
The significance of this study lies in its potential to provide researchers with access to mice that possess a natural microbiome and a mature immune system similar to that of human adults. This approach could enhance the translatability of preclinical findings into clinical practice, thereby advancing the field of biomedical research.

<meta charset="utf8"></head><body>נהלי הפעלה והכלה ביולוגית של מתקן לעכברי מעבדה עם מיקרוביום טבעי: נוהל אימונופנוטיפ

Here, we describe the structure and operating procedures, including microbial containment measures of a facility for "Wilding mice" using blood sampling for immunophenotyping as an example.

נהלי הפעלה והכלה ביולוגית של מתקן לעכברי מעבדה עם מיקרוביום טבעי: נוהל אימונופנוטיפ

The use of laboratory mice with a natural microbiome, such as &#34;Wildling mice&#34;, offers a promising research tool for both basic and applied science ...

Parabiosis בעכברים: פרוטוקול מפורט

Summary

Explore More Videos

Lentiviral מתווכת הייצור של העכברים הטרנסגניים: שיטה פשוטה ויעילה מאוד עבור לימוד ישיר של המייסדים

הדור של Parabiotic דג הזברה עוברים ידי Fusion כירורגי של פיתוח Blastulae

אוסף של שלאחר ההזדווגות זרע באיברי הרבייה הנקביים, מדידה של זרע ניזול בעכברים

הזרקת זרע עגולה לעכבר

הזרקת זרע עגולה לעכבר

הזרקת זרע עגולה לעכבר

לב-ריאה במודל של עכברים: גישה מוזרה

דגם העכבר של כירורגיה אורתופדית ללמוד לאחר הניתוח בתפקוד הקוגניטיבי ו התחדשות רקמות

פרוטוקול השתלת לב הטרוטופי מורין מותאם לסטנדרטים עכשוויים של טכניקה אספטית, הרדמה ושיכוך כאבים

נהלי הפעלה והכלה ביולוגית של מתקן לעכברי מעבדה עם מיקרוביום טבעי: נוהל אימונופנוטיפ