תאים משורת תאי כונדרוסרקומה SW1353 נמסרו באדיבותו של פרופ &#39;ד&quot;ר PCW Hogendoorn ופרופ&#39; ד&quot;ר י בובי של אוניברסיטת ליידן, הולנד. אנו מודים לג&#39; וג&#39; Mestach Wagemans לקבלת סיוע טכני מעולה, וג&#39; דה Bruyne לציור המקצועי של הסקירה של הפרוטוקול שלנו.

<ol>
	<li>Mankin, H. J., Hornicek, F. I., Rosenberg, A. E., Harmon, D. C., Gebhardt, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+data+for+648+patients+with+osteosarcoma+treated+at+one+institution.">Survival data for 648 patients with osteosarcoma treated at one institution.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 429, 286-291 (2004).</li><li>Hoffmann, J., Schmidt-Peter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticancer+drug+sensitivity+and+expression+of+multidrug+resistance+markers+in+early+passage+human+sarcomas.">Anticancer drug sensitivity and expression of multidrug resistance markers in early passage human sarcomas.</a> Clinical Cancer Research. 5, 2198-2204 (1999).</li><li>Greenlee, R. T., Hill-Harmon, M. B., Murray, T., Thun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2001.">Cancer statistics, 2001.</a> CA A Cancer Journal for Clinicians. 51, 15-36 (2001).</li><li>Gil-Benso, R., Lopez-Gines, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterisation+of+a+continuous+human+chondrosarcoma+cell+line,+ch-2879:+Comparative+histologic+and+genetic+studies+with+its+tumor+of+origin.">Establishment and characterisation of a continuous human chondrosarcoma cell line, ch-2879: Comparative histologic and genetic studies with its tumor of origin.</a> Laboratory Investigations. 83, 877-887 (2003).</li><li>Taylor, B. S., Barretina, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+sarcoma+genomics+and+new+therpeutic+targets.">Advances in sarcoma genomics and new therpeutic targets.</a> Nature Reviews Cancer. 11, 541-557 (2011).</li><li>Skubitz, K. M., D'Adamo, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sarcoma.">Sarcoma.</a> Mayo Clinic Proceedings. 82, 1409-1432 (2007).</li><li>Nielsen, T. O., West, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+gene+expression+into+clinical+cara:+sarcomas+as+a+paradigm.">Translating gene expression into clinical cara: sarcomas as a paradigm.</a> Journal of Clinical Oncology. 28, 1796-1805 (2010).</li><li>Vaira, V., Fedele, G., Pyne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors.">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 107, 8352-8356 (2010).</li><li>DeRose, Y. S., Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology,+growth,+metastasis+and+disease+outcomes.">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).</li><li>Tentler, J. J., Tan, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+tumour+xenografts+as+models+for+oncology+drug+development.">Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).</li><li>Bertotti, A., Migliardi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecularly+annotated+platform+of+patient-derived+xenografts+("xenopatients")+identifies+HER2+as+an+effective+therapeutic+target+in+cetuximab-resistant+colorectal+cancer.">A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer.</a> Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).</li><li>Decaudin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+human+tumor+xenografted+models+('tumorgrafts')+for+good+management+of+patients+with+cancer.">Primary human tumor xenografted models ('tumorgrafts') for good management of patients with cancer.</a> Anticancer Drugs. 22, 827-841 (2011).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+The+next+generation.">Hallmarks of cancer: The next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li><li>Sys, G., Van Bockstal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+grafts+derived+from+sarcoma+patients+tumor+morphology,+viability,+and+invasion+potential+and+indicate+disease+outcomes+in+the+chick+chorioallantoic+membrane+model.">Tumor grafts derived from sarcoma patients tumor morphology, viability, and invasion potential and indicate disease outcomes in the chick chorioallantoic membrane model.</a> Cancer Letters. 326, 69-78 (2012).</li><li>Armstrong, P. B., Quigley, J. P., Sidebottom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transepithelial+invasion+and+intramesenchymal+infiltration+of+the+chick+embryo+chorioallantois+by+tumor+cell+lines.">Transepithelial invasion and intramesenchymal infiltration of the chick embryo chorioallantois by tumor cell lines.</a> Cancer Research. 42, 1826-1837 (1982).</li><li>Deryugina, E., Quigly, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+model+systems+to+study+and+visualize+human+tumor+cell+metastasis.">Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130, 1119-1130 (2008).</li><li>Knighton, D., Ausprunk, D., Tapper, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avascular+and+vascular+phases+of+tumor+growth+in+the+chick+embryo.">Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo.</a> British Journal of Cancer. 35, 347-356 (1977).</li><li>Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., D&#252;nker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+ex+ovo+culture+and+ex+ovo+CAM+assay:+how+it+really+works.">Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works.</a> J. Vis. Exp. (33), e1620 (2009).</li><li>Balke, M., Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+characterization+of+osteosarcoma+growth+on+the+chick+chorioallantoic+membrane.">Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane.</a> BMC Research Notes. 3, 58 (2010).</li><li>Hendrix, A., Maynard, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+secretory+small+GTPase+Rab27B+on+breast+cancer+growth,+invasion,+and+metastasis.">Effect of the secretory small GTPase Rab27B on breast cancer growth, invasion, and metastasis.</a> Journal of the National Cancer Institute. 102, 866-880 (2010).</li><li>Ausprunk, D., Knighton, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+of+normal+and+neoplastic+tissues+grafted+to+the+chick+chorioallantois:+role+of+host+and+preexisting+graft+vessels.">Vascularization of normal and neoplastic tissues grafted to the chick chorioallantois: role of host and preexisting graft vessels.</a> American Journal of Pathology. 79, 597-618 (1975).</li><li>Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Riciardelli, C., Oehler, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+Chorioallantoic+membrane+(CAM)+Assay+as+an+in+vivo+model+to+study+the+effect+of+newly+identified+molecules+on+ovarian+cancer+invasion+and+metastasis.">Chick Chorioallantoic membrane (CAM) Assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 13, 9959-9970 (2012).</li><li>Vargas, A., Zeisser-Labou&#232;be, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chick+embryo+and+its+chorioallantoic+membrane+(CAM)+for+the+in+vivo+evaluation+of+drug+delivery+systems.">The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 59, 1162-1176 (2007).</li><li>Hagedorn, M., Javerzat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessing+key+steps+of+human+tumor+progression+in+vivo+by+using+an+avian+embryo+model.">Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102, 1643-1648 (2005).</li><li>De Wever, O., Hendrix, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+and+quantification+of+cancer+cell+invasion+through+collagen+type+I+matrices.">Modeling and quantification of cancer cell invasion through collagen type I matrices.</a> International Journal of Developmental Biology. 54, 887-896 (2010).</li><li>Albini, A., Benelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemoinvasion+assay:+A+method+to+assess+tumor+and+endothelial+cell+invasion+and+its+modulation.">The chemoinvasion assay: A method to assess tumor and endothelial cell invasion and its modulation.</a> Nature Protocols. 2, 504-511 (2007).</li><li>Hanahan, D., Coussens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessories+to+the+crime:+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment.">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).</li></ol>

יש מחברים אין לחשוף.

זמן של חיסון וקציר תזמון היום של חיסון בוצע באמצעות SAOS2 בECM ג&#39;ל (36 מצלמות) ונע בין יום התפתחות העוברי 5 ו -10. לפני הדגירה יום 9, CAM לא באופן עקבי היה גדול מספיק כדי לתמוך ג&#39;ל ECM אנחנו מוחלים. בקציר, תאים סרטניים לפעמים היינו צריכים להישלף מCAM העמוק יותר, וכמה דוגמאות ג&#39;ל ECM שכבו רופפת בחלבון או ברמ&quot;א. בימי 5 ו -6, היה קשה להימנע מלהכניס את התאים הסרטניים בעובר האפרוח, וכתוצאה ממומי חומוס או מוות. מהיום 9, רמ&quot;א כיסה לחלוטין את פני השטח מתחת לחלון ברוב הביצים, ולוחות ג&#39;ל ECM הוכיחו חסיד לרמ&quot;א ברגע של קציר. לכן, מצאנו זמן האידיאלי לחיסון להיות יום 9 של התפתחות עוברית. לקביעת הזמן האידיאלי של קצירת, וSAOS2 SW1353 נקצרו לאחר respectivelY 1, 2 (SAOS2-GFP בלבד), 4, 5, 6, 7 ו -8 ימים לאחר חיסון, או בין יום התפתחות עוברי 10 ו -17. בעקבות שינויים אלה, הבדל באורך של יישום ברמ&quot;א צוין 1-12 ימים. Knighton פורסם הבדלים ניכרים בצמיחת גידול וגידול revascularization לפי יום ההתפתחות העוברי ברגע של יישום לדוגמא גידול 17. תא ספירה של תאי Ki67 חיוביים ושליליים Ki67 הראה עלייה מתמדת במספר הכולל של תאים מהיום 4 לשני קווים סלולריים. זו שתואמת את הממצא של Ausprunk et al. בן 21, שקבעו כי התקופה הדרושה לrevascularisation לוקחת 72 שעות. לאחר ספירת מספר התאים ואופן חישובו של המדד של שגשוג, אנו יכולים להניח כי התאים הפזורים בג&#39;ל ECM באופן פעיל הם מתרבים מיום 4 עד 6 ימים לאחר חיסון. בהתבסס על הקוטר של השלט, המספר הכולל של תאים ומדדשגשוג, אנו מציעים שהזמן האידיאלי לקציר הוא יום 16 של התפתחות עוברית, או שבעה ימים לאחר חיסון. מסגרת הזמן הציע חוקרים משאירה חלון של שישה ימים ליישום של סוכנים בעוד התאים מתרבים באופן פעיל, או פעם אחת ביום 4 לאחר חיסון או יומי במהלך כל מסגרת הזמן. לממשל מקומי, המתחם מוחל על פני השטח CAM. מסלול זה הוא אחד נפוץ ביותר, בשל הנגישות לCAM פשוט על ידי פתיחת קליפת הביצה / סרט 22,23 הדבקה. למרות IV הממשל אינו ריאלי, הקושי להכניס מחטים לתוך כלי CAM הוא מגבלה קריטית. מעכבי קינאז מיושמים על בסיס יומי 24; כימותרפיה פעם אחת במהלך הניסוי. אנו משערים כי הוספת מתחם פעם אחת היא מקבילה של הטיפול הקליני עם ציטוטוקסית של סוכני cytostatic, המנוהלים באופן קלאסי כל 3 שבועות, תוך הוספההתרכובת על בסיס יומי תשקף את המנה היומית של מעכבי קינאז בסביבה הקלינית. עם זאת, עלינו לזכור כי ממשל מקומי יציג קינטיקה / חילוף חומרים שונים בהשוואה לפה או IV ממשל בחולים. משמעות של הטכניקה ויישומים עתידיים אפשריים שמירה על המורפולוגיה של תאים היא בעלת חשיבות עליונה כאשר תרביות תאים נמצאות בשימוש במודלים פרה. השימוש במטריצות הומוגניות תאיים כגון קולגן סוג I 25 או ECM ג&#39;ל 26 משחזר את סביבת התאים סרטנית, ומאפשרים דפוס גדילה טבעי יותר. בניגוד למבחני vivo, במבחני חוץ גופית אינו מכיל תאי סטרומה כגון תאי כלי דם angiogenic, הסתננות תאי מערכת חיסון או תאי fibroblastic הסרטן הקשורים הדרושים כדי לשקם את microenvironment tumorigenic 27. כאשר CAM-assay משמש לevaluatיון של tumorgrafts, שתארנו &quot;קונוס פלישה &#39;טיפוסי מCAM כלפי tumorgrafts, המשקף גיוס של תאי סטרומה מהחומוס ידי Tumorgraft 14. CAM-assay מספק שילוב של שיקום על ידי מטריקס ECM ג&#39;ל ומתן תאי מארח לכינונה מחדש של microenvironment הסרטני. כרמ&quot;א וTumorgraft / פלאק הוא נגישים, הממשל של תרכובות קל. בדרך זו, CAM-assay פותח אופקים חדשים להערכה קלינית של סוגים נדירים סרטניים כגון סרקומות.

סרקומה היא גידול נדיר של רקמות החיבור עם תמותה גבוהה בשל התנגדות 1,2 הטיפול. התקדמות בהישרדות חולה הקשתה על ידי שכיחותם הנמוכה השנתית, הגיוון הרחב שלהם, ואת העובדה שתאי סרקומה הם דיווחו להיות קשים לתרבות במבחנה 3,4. השימוש בתאים בתרבית להערכת טיפול קליני גילו כי מולקולות חדשות, ככל הנראה פעילה במבחנה לא תמיד משקפות את התוצאות בסביבה הקלינית. יתר על כן, סטיות הגנום מתגלים על ידי מערכי ביטוי גנים הן לא תמיד קשורות למאפייני התנהגות סרטניים בחולה בודדת 5-7. על מנת לנסות ולפתור את הבעיות הללו, רפואה מותאמת אישית צברה בחשיבותו, אשר באה לידי ביטוי בחיפוש המוגבר לדגמי xenograft 8-12. ב assay vivo יש את היתרון של המשקף הגומלין המורכב בין גתאי ancer וסביבת רקמת המארח בגידולים מוצקים, הנדרשים להתפשטות הסרטן והפלישה 13. נכון לעכשיו אנחנו לומדים את השימוש של assay ממברנה Chorio-allantoic (CAM-assay) כמודל לשחזור xenograft סרקומה 14,15. assay זה נעשה שימוש נרחב למחקר של אנגיוגנזה גידול 16,17. בספרות, לעומת זאת, מצאנו פרוטוקולים שונים עבור assay זה, בעוד שמחקרים אחרים שנצפו הבדל משמעותי בצמיחה או אנגיוגנזה על פי פרוטוקולים שונים 18,19. במאמר זה אנו לחקור את ההשפעה של משתנה תנאים של CAM-assay על התנהגות תא סרטניים, באמצעות שתלי השעיות תא בודדות שמקורם בגידול בתרביות תאי סרקומה ומבוססות.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Line Nucleofector Kit V</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>VCA-1003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965-039</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11811031</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1270</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse primary monoclonal antibody Ki67</td>
			<td>Dako Denmark</td>
			<td>MIB-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>D76240</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>20012019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBSD</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14040083</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peGFP-C1 vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632470</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140163</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22409-015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant cell-labeling DiI</td>
			<td>Lifetechnologies</td>
			<td>22885</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10227</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital color camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC 340 FX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Egg Incubator</td>
			<td>Auto Elex Co</td>
			<td>R-COM 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSAriaIII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentlemacs C-Tube</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-237</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentlemacs Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>semipermeable adhesive film (Suprasorb F)</td>
			<td>Lohmann&amp;Rauscher</td>
			<td>20468</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereo fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205 FA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Film automated Coverslipper</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>6400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultraView Universal DAB Detection Kit</td>
			<td>Ventana Medical Systems Inc</td>
			<td>760-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ventana Automated Slide Stainer</td>
			<td>Ventana Medical Systems</td>
			<td>Benchmark XT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the in ovo cam-assay as a xenograft model for sarcoma

סרקומה היא מחלה מאוד נדירה שהיא הטרוגנית בטבע, כל פוגעות פיתוח הטיפולים חדשים. חולי סרקומה הם מועמדים אידיאליים לרפואה אישית לאחר ריבוד, המסבירים את הריבית הנוכחית בפיתוח מודל xenotransplant לשעתק ועלות נמוכה למחלה זו. קרום chorioallantoic החומוס הוא מארח immunodeficient טבעי מסוגלים לקיים רקמות ותאים מורכבים ללא הגבלות מינים ספציפיות. בנוסף, ניתן לגשת בקלות, מניפולציות וצלם באמצעות stereomicroscopy אופטי וקרינה. היסטולוגיה נוספת מאפשרת ניתוח מפורט של אינטראקציות הסלולר heterotypic. פרוטוקול זה מתאר בפירוט באובו השתלה של קרום chorioallantoic עם רקמות טריות סרקומה הנגזרות סרטניים, השעיות התא בודדות שלהם, וקווים קבועים וארעיים שכותרתו fluorescently הוקמו סרקומה סלולרי (Saos-2 וSW1353). עכברוש הישרדות החומוסes הוא עד 75%. המודל משמש ללמוד שתל (כדאיות, Ki67 מדד התפשטות, נמק, חדירה) ומארח (חדירה פיברובלסטים, ingrowth כלי דם) התנהגות. להשתלה מקומית של השעיות תא בודדות, ECM ג&#39;ל מספק יתרונות משמעותיים על פני חומרי בלימה אינרטי. מדד ההתפשטות Ki67 קשור למרחק של התאים מפני שטח של CAM ואת משך הזמן של יישום ברמ&quot;א, שהאחרון קביעת מסגרת זמן לתוספת של מוצרים טיפוליים.

הערכה של רמ&quot;א שתלי גידול הפכו חסיד לרמ&quot;א (איור 2 א). השעיות תא בודדות מחומר שהמטופל להציג שלט מיובש, מוגבה מעט (איור 2 ד) לעתים קרובות. לאחר הכריתה של רמ&quot;א, סימן קימוט של הקרום מתרחש (איורים 2E ו2F). לשורות התאים המסחריות פלאק הופך אטום יותר בזמן, מה שמעיד שגשוג תאים. שורות תאים שונות בECM ג&#39;ל יש דפוס צמיחה מובהק ברמ&quot;א. SAOS2 יוצר פלאק מתפשט, עם עלייה מובהקת של פני השטח מהיום 7 לאחר חיסון, בעוד שאות ה-GFP נותרת חזקה, המעיד על תאי קיימא. הגירה של תאי SAOS2 יכולה להיות מקבילה דמיינו לכלי השיט של CAM (איור 3). כאשר נצפה דרך stereomicroscope, ניתן לראות כאשר לא נעשה שימוש במסנן כלי דם. לא ניתן להבחין בתאים סרטניים, כאשר אף Filter משמש. לא ניתן לדמיין את כלי הדם כאשר מסנן ה-GFP מוכנס. על ידי סיבוב המסנן לסירוגין, ניתן לראות את הקשר ההדוק בין התאים הנודדים וכלי הדם. דימום Punctiform ניתן לצפות באמצעות השלט (איור 4, שורות 1 ו -2). את הפלאק המכיל תאי SW1353 להראות ירידה במשטח ונוטה להתכווץ רמ&quot;א, וכתוצאה מכך קרום מקומט לאחר קצירתו (איור 4, שורות 5 ו -6). אות DSR פוחתת ככל שבדיקת הניאון הופכת להיות מדוללת לאחר חלוקות תא רבות. מיום 7, דימום הוא ציין בתדירות גבוהה. אם דימום מתרחש, אות DSR גם פוחתת. תגובת כלי דם יכולה להיות דמיינו לאחר כריתה של CAM בתצוגה הנמוכה, מראה כלי מפותלים המקיפים את השתל או פלאק (איור 2). תגובת כלי דם של CAM הוא ציין בקבוצת Tumorgraft, קבוצת ההשעיה התא בודדת (&lt;חזק&gt; איור 2 ג ו2F) וקבוצת ECM ג&#39;ל השליטה (איור 2G), אך לא בקבוצות ביקורת פתרון תא (איור 2H). ניתן לראות כלי מפותלים חדשים שנכנסו למדגם, הסתעפות (איור 2I, ראשי חץ) וanastomosing (איור 2I, כוכביות) אחד עם השני; גם אזורים קטנים של דימום מתרחשים (איור 2I, חיצים). Neovascularization של הגידול ניתן לכמת בשקופיות H &amp; E באזורים של פלאק הגידול / גידול השונים. ראיות היסטולוגית מראה כי תאי SAOS2 לשמור על מראה תא בודד לאורך היקף ECM ג&#39;ל השלם, וגרמו עובי וקוטר של פלאק מוגבר. הם פולשים לשכבת mesodermal של CAM (איור 5 א, חץ), ובכך להגדיל את המרחק בין שכבות ectodermal של CAM endodermal וכמו רוכסן פתיחה (איור 5 א </strאונג&gt;, חץ כפול). דפוס הגדילה של תאים וSW1353 של השעיה תא בודד של כונדרוסרקומה של מטופל יותר באשכולות, עם איים של תאים במרחב של ECM ג&#39;ל (איור 5, חץ). מספר התאים ואשכולות סלולריים לעלות בהתמדה בזמן, ומספר תאים שאינם מגביר את שגשוג מיום 7, בעיקר על פני השטח של השלט. לSW1353, ההתכווצות של CAM יכולה גם להיות מוערכת על שקופיות H &amp; E בהשוואה לשקופיות H &amp; E של SAOS2. על אף אתר חוץ רחמיהם של צמיחה, מצאנו כי תכונות חיוניות ומאפייני immunohistochemical של גידולי סרקומה המקוריים נשמרו ברמ&quot;א. בנוסף את השתלים הסרטניים הפכו revascularized כפי שמעידים על ידי הופעתו של אריתרוציטים חומוס nucleated, את השתלים הסרטניים הופכים הסתננו fibroblasts החומוס ותאים סרטניים מהשתל חדר את רקמת מארח רמ&quot;א, הממחיש את האמינות וRobustness של assay רמ&quot;א (איור 6, הבלעה שמאלית תחתון). למידע מפורט נוסף שאנחנו מתייחסים לציוד התקשורת ואח&#39;. 14. זמן קציר ספירת תאים של תאי Ki67 חיוביים ושליליים Ki67 מציגה עלייה מתמדת במספר הכולל של תאים מהיום 4 לשני קווים סלולריים. אחרי היום הזה במספר הכולל של תאים נשאר יציב. שבעה ימים לאחר חיסון, מספר התאים Ki67 החיוביים והמספר הכולל של תאים מתחיל לרדת. בנוגע למספר של תאים, קיים קשר מובהק בין שלושת האזורים. עם זאת, שיעור גבוה יותר של תאים Ki67 חיוביים קרובים לרמ&quot;א, ושיעור גבוה יותר של תאי Ki67 שליליים על פני השטח של השלט הם נצפו (איור 4, 3 שורות, 4, 7 ו -8). המדד של התפשטות נשאר יציב יחסית עד שבעה ימים לאחר חיסון, whereafter זה גם מתחיל לרדת. Proliferatioמדד n של שורת תאי SW1353 הוא נמוך באופן משמעותי (p &lt;0.05) בהשוואה לשורת תאי SAOS2. למרות שיש קשר מובהק בין שלושת האזורים, זה חיוני לספור שדות בכל שלושת האזורים בשלט ג&#39;ל ECM, כפי שאנו רואים חלק גדול יותר של תאי Ki67 חיוביים קרובים לרמ&quot;א ושיעור גבוה יותר של Ki67 שלילי תאים על פני השטח של השלט (איור 7). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50522/50522fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50522/50522fig1.jpg" /> איור 1. סקירה כללית של הפרוטוקול. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50522/50522fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50522/50522fig2.jpg" fo:content-widtH = &quot;6in&quot; עבור: src = &quot;/ files/ftp_upload/50522/50522fig2highres.jpg&quot; /&gt; איור 2. תמונות צולמו במהלך מסיק חששות שורה העליונה של קצירת Tumorgraft מכונדרוסרקומה:. = באתרו, B = תצוגה עליונה בצלחת פטרי, C = תצוגה נמוכה יותר בצלחת פטרי. חששות בשורה אמצעיים קצירת של השעיה תא בודד בECM ג&#39;ל: D = באתר = תצוגה עליונה בצלחת פטרי, F = E תצוגה נמוכה. שורה תחתונה G = matrigel שליטה, H = שליטת תא פתרון, אני = תצוגה תחתונה מציגה כלים ודימום הסתעפות. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50522/50522fig2large.jpg" target="_bank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50522/50522fig3.jpg" /> איור 3. תמונה של ה-GFP SAOS2 <eמ &#39;&gt; באתרו. <img alt="איור 4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50522/50522fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50522/50522fig4.jpg" /> איור 4. נתון זה מראה תמונות של שניהם SAOS2 (4 שורות העליונות) וSW1353 (תחתונה 4 שורות) ביום 1 עד 8 ​​לאחר חיסון. השורה 1 (שורת 2 מ&quot;מ בקנה מידה) מציגה את התמונות של CAM באתר באמצעות stereomicroscope עם GFP מסנן. השורה 2 (מ&quot;מ בקנה מידה בר 2) מציגה את אותן דגימות באמצעות stereomicroscope תוך מוארת על ידי נוריות מלמעלה. שורת 3 ו -4 להראות H &amp; E (3 רציפות, סרגל קנה מידה 200 מיקרומטר) וKi67 מוכתם (שורת 4, סרגל קנה מידה 200 או 500 מיקרומטר) תמונות היסטולוגית מדגימות אותו. השורה 5 (מ&quot;מ בקנה מידה בר 2) מציגה את התמונות של CAM באתר דרך stereomicroscope עם DSR מסנן. שורת 6 (יםקייל הבר 2 מ&quot;מ) מציג את אותן דגימות באמצעות stereomicroscope תוך מוארת על ידי נוריות מלמעלה. שורת 7 ו -8 להראות H &amp; E (שורת 7, סרגל קנה מידה 200 מיקרומטר) וKi67 מוכתם (השורה 8, סרגל קנה מידה 200 ו 500 מיקרומטר) תמונות היסטולוגית מהדגימות אותו. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50522/50522fig4highres.jpg">לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/50522/50522fig5.jpg" /> איור 5. השוואה של התפשטות תאי גידול של SAOS2 וSW1353. צמיחה של SAOS2 = B = צמיחה של SW1353. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/50522/50522fig6.jpg" /> איור 6. ניתן לצפות אריתרוציטים חומוס nucleated בנימים לאורך Tumorgraft liposarcoma ציון גבוה (הוא, 100X), שיבוץ נמוךעזב. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/50522/50522fig7.jpg" /> איור 7. גרף מראה Ki67 + וKi67-תאים לאורך זמן בהתאם למרחק מCAM עבור שתי שורות התאים. אזור = נגד רמ&quot;א, אזור C = פני השטח של השלט, אזור B = שבין אזור A ו-C.

Watch this Scientific Journal Video about The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma at JoVE.com

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

<em&gt; באוב</em&gt; Chorioallantoic קרום (רמ&quot;א) הוא מורכב עם רקמות טריות סרקומה הנגזרות סרטניים, השעיות התא בודדות שלהם, ושורות תאי סרקומה הוקמו כותרתו fluorescently קבועות וארעיות. המודל משמש ללמוד שתל (כדאיות, Ki67 מדד התפשטות, נמק, חדירה) ומארח (חדירה פיברובלסטים, ingrowth כלי דם) התנהגות.

<em&gt; באוב</em&gt; CAM-assay כXenograftmodel לסרקומה

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

the-in-ovo-cam-assay-as-a-xenograft-model-for-sarcoma

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

25.3K Views.  Ghent University Hospital.  באוב Chorioallantoic קרום (רמ"א) הוא מורכב עם רקמות טריות סרקומה הנגזרות סרטניים, השעיות התא בודדות שלהם, ושורות תאי סרקומה הוקמו כותרתו fluorescently קבועות וארעיות. המודל משמש ללמוד שתל (כדאיות, Ki67 מדד התפשטות, נמק, חדירה) ומארח (חדירה פיברובלסטים, ingrowth כלי דם) התנה?...

Video: The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, the de novo mutation rate in humans is relatively high, so new mutations are generated at a high frequency in the population. However, de novo mutations have not been reported in most common diseases. Mutations in genes leading to severe diseases where there is a strong negative selection against the phenotype, such as lethality in embryonic stages or reduced reproductive fitness, will not be transmitted to multiple family members, and therefore will not be detected by linkage gene mapping or association studies. The observation of very high concordance in monozygotic twins and very low concordance in dizygotic twins also strongly supports the hypothesis that a significant fraction of cases may result from new mutations. Such is the case for diseases such as autism and schizophrenia. Second, despite reduced reproductive fitness1 and extremely variable environmental factors, the incidence of some diseases is maintained worldwide at a relatively high and constant rate. This is the case for autism and schizophrenia, with an incidence of approximately 1% worldwide. Mutational load can be thought of as a balance between selection for or against a deleterious mutation and its production by de novo mutation. Lower rates of reproduction constitute a negative selection factor that should reduce the number of mutant alleles in the population, ultimately leading to decreased disease prevalence. These selective pressures tend to be of different intensity in different environments. Nonetheless, these severe mental disorders have been maintained at a constant relatively high prevalence in the worldwide population across a wide range of cultures and countries despite a strong negative selection against them2. This is not what one would predict in diseases with reduced reproductive fitness, unless there was a high new mutation rate. Finally, the effects of paternal age: there is a significantly increased risk of the disease with increasing paternal age, which could result from the age related increase in paternal de novo mutations. This is the case for autism and schizophrenia3. The male-to-female ratio of mutation rate is estimated at about 4&#x2013;6:1, presumably due to a higher number of germ-cell divisions with age in males. Therefore, one would predict that de novo mutations would more frequently come from males, particularly older males4. A high rate of new mutations may in part explain why genetic studies have so far failed to identify many genes predisposing to complexes diseases genes, such as autism and schizophrenia, and why diseases have been identified for a mere 3% of genes in the human genome. Identification for de novo mutations as a cause of a disease requires a targeted molecular approach, which includes studying parents and affected subjects. The process for determining if the genetic basis of a disease may result in part from de novo mutations and the molecular approach to establish this link will be illustrated, using autism and schizophrenia as examples.

Molecular genetic strategy for finding de novo mutations causing common disorders such as autism and schizophrenia.

אסטרטגיה לזהות מוטציות דה נובו בהפרעות נפוצות כגון אוטיזם וסכיזופרניה

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma (glioma) and medulloblastoma. The widely used stereotactic approach only allows for the injection of a single animal at a time, is labor intensive and requires highly specialized equipment. The guide screw method, initially developed by Lal et al.,1 was developed to eliminate cumbersome stereotactic procedures. We now describe a modified guide screw approach that is rapid and exceptionally safe; both of which are critical ethical considerations. Notably, our procedure now incorporates an infusion pump that allows up to 10 animals to be simultaneously injected with tumor cells.
To demonstrate the utility of this procedure, we established human U87MG glioma cells as intracranial xenografts in mice, which were then treated with AMG102; a fully human antibody directed to HGF/scatter factor currently undergoing clinical evaluation2-5. Systemic injection of AMG102 significantly prolonged the survival of all mice with intracranial U87MG xenografts and resulted in a number of complete cures. 
This study demonstrates that the guide screw method is an inexpensive, highly reproducible approach for establishing intracranial xenografts. Furthermore, it provides a relevant physiological model for validating novel therapeutic strategies for the treatment of brain cancers.

In order to evaluate novel therapeutic paradigms for the treatment of glioma, physiological relevant models are essential. We utilize an implantable guide screw procedure for establishment of intracranial xenograft models that is more rapid and safer than stereotactic approaches.

מדריך פשוט בורג שיטה ללימודי xenograft תוך גולגולתי של עכברים

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

הפעלת יתר רעיל גירוי של המוח כMicroslices<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של שבץ

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Glutamate and Hypoxia as a Stress Model for the Isolated Perfused Vertebrate Retina

Neuroprotection has been a strong field of investigation in ophthalmological research in the past decades and affects diseases such as glaucoma, retinal vascular occlusion, retinal detachment, and diabetic retinopathy. It was the object of this study to introduce a standardized stress model for future preclinical therapeutic testing.
Bovine retinas were prepared and perfused with an oxygen saturated standard solution, and the ERG was recorded. After recording stable b-waves, hypoxia (pure N2) or glutamate stress (250 &#181;m glutamate) was exerted for 45 min. To investigate the effects on photoreceptor function alone, 1 mM aspartate was added to obtain a-waves. ERG-recovery was monitored for 75 min.
For hypoxia, a decrease in a-wave amplitude of 87.0% was noted (p &#60;0.01) after an exposition time of 45 min (decrease of 36.5% after the end of the washout p = 0.03). Additionally, an initial decrease in b-wave amplitudes of 87.23% was recorded, that reached statistical significance (p &#60;0.01, decrease of 25.5% at the end of the washout, p = 0.03).
For 250 &#181;m glutamate, an initial 7.8% reduction of a-wave amplitudes (p &#62;0.05) followed by a reduction of 1.9% (p &#62;0.05). A reduction of 83.7% of b-wave amplitudes (p &#60;0.01) was noted; after a washout of 75 min the reduction was 2.3% (p = 0.62). In this study, a standardized stress model is presented that may be useful to identify possible neuroprotective effects in the future.

With this study, we introduce a standardized stress model for the isolated superfused bovine retina for future preclinical therapeutic testing. The effect of either hypoxia (pure N2) or glutamate stress (250 &#181;M glutamate) on retinal function represented by a- and b-wave amplitudes was evaluated.

גלוטמט והיפוקסיה כמודל מתח לperfused חוליות הרשתית מבודדת

Neuroprotection has been a strong field of investigation in ophthalmological research in the past decades and affects diseases such as glaucoma, retinal ...

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and highly vascularized, making it an ideal system for tumor implantation. Furthermore, the CAM contains extracellular matrix proteins such as fibronectin, laminin, collagen, integrin alpha(v)beta3, and MMP-2, making it an attractive model to study tumor invasion and metastasis. Scientists have long taken advantage of the physiology of the CAM by using it as a model of angiogenesis. More recently, the CAM assay has been modified to work as an in vivo xenograft model system for various cancers that bridges the gap between basic in vitro work and more complex animal cancer models. The CAM assay allows for the study of tumor growth, anti-tumor therapies, and pro-tumor molecular pathways in a biologically relevant system that is both cost- and time-effective. Here, we describe the development of CAM xenograft model of hepatocellular carcinoma (HCC) with embryonic survival rates of up to 93% and reliable tumor take leading to growth of three-dimensional, vascularized tumors.

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane CAM Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.

<em&gt; באוב</emAssay&gt; אפרוח chorioallantoic ממברנה (CAM) כמודל xenograft יעיל של Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

הקמת מודל xenograft מיאלומה נפוצה אדם בעוף לחקר צמיחת גידול, פלישה ואנגיוגנזה

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

Oleic Acid-Injection in Pigs As a Model for Acute Respiratory Distress Syndrome

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit patients. Despite treatment advances over the last decades, ARDS patients still suffer mortality rates between 35 and 40%. There is still a need for further research to improve the outcome of patients suffering from ARDS. One problem is that no single animal model can mimic the complex pathomechanism of the acute respiratory distress syndrome, but several models exist to study different parts of it. Oleic acid injection (OAI)-induced lung injury is a well-established model for studying ventilation strategies, lung mechanics and ventilation/perfusion distribution in animals. OAI leads to severely impaired gas exchange, deterioration of lung mechanics and disruption of the alveolo-capillary barrier. The disadvantage of this model is the controversial mechanistic relevance of this model and the necessity for central venous access, which is challenging especially in smaller animal models. In summary, OAI-induced lung injury leads to reproducible results in small and large animals and hence represents a well-suited model for studying ARDS. Nevertheless, further research is necessary to find a model that mimics all parts of ARDS and lacks the problems associated with the different models existing today.

In this article, we present a protocol to induce acute lung injury in pigs by central-venous injection of oleic acid. This is an established animal model for studying the acute respiratory distress syndrome (ARDS).

הזרקת חומצה אולאית חזירים כמודל עבור תסמונת מצוקה נשימתית חריפה

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Contractility איזומטרי מדידה של עורק מצע המעי העליון העכבר באמצעות חוט Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to injury. In fact, the most common type of eye injury found in clinic is a corneal abrasion. Here, we utilize an ocular burr to induce an abrasion resulting in removal of the corneal epithelium in vivo on anesthetized mice. This method allows for targeted and reproducible epithelial disruption, leaving other areas intact. In addition, we describe the visualization of the abraded epithelium with fluorescein staining and provide concrete advice on how to visualize the abraded cornea. Then, we follow the timeline of wound healing 0, 18, and 72 h after abrasion, until the wound is re-epithelialized. The epithelial abrasion model of corneal injury is ideal for studies on epithelial cell proliferation, migration and re-epithelialization of the corneal layers. However, this method is not optimal to study stromal activation during wound healing, because the ocular burr does not penetrate to the stromal cell layers. This method is also suitable for clinical applications, for example, pre-clinical test of drug effectiveness.

This protocol describes a method to inflict an abrasion to the ocular surface of the mouse, and to follow the wound healing process thereafter. The protocol takes advantage of an ocular burr to partially remove the surface epithelium of the eye in anaesthetized mice.

אפיתל שחיקה הקרנית עם עינית Burr כמודל עבור קרנית ריפוי פצעים

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

A Mouse Model of Incompletely Resected Soft Tissue Sarcoma for Testing (Neo)adjuvant Therapies

Surgery is often the first treatment for many solid tumors. However, local relapses frequently occur following primary tumor resection, despite adjuvant or neo-adjuvant therapies. This occurs when surgical margins are insufficiently tumor-free, resulting in residual cancer cells. From a biological and immunological perspective, surgery is not a null event; the wound healing environment is known to induce both pro- and anti-tumorigenic pathways. As a consequence, preclinical models for drug development aimed at preventing local relapse should incorporate surgical resection when testing new (neo)adjuvant therapies, to model the clinical settings in patients treated with surgery.
Here, we describe a mouse model of incomplete surgical resection of WEHI 164 soft tissue sarcoma that allows testing of (neo)adjuvant therapies in the setting of a wound healing response. In this model, 50% or 75% of the tumor is removed, leaving behind some cancer tissue in situ to model gross residual disease after surgery in the clinical setting. This model allows testing therapies in the context of surgery while also considering the wound healing response, which may affect the efficacy of (neo)adjuvant treatments. The incomplete surgical resection results in reproducible regrowth of the tumor in all mice in the absence of adjuvant therapy. Adjuvant treatment with checkpoint blockade results in reduced tumor regrowth. This model is thus appropriate for testing therapies in the context of debulking surgery and its associated wound healing response and can be extended to other types of solid cancer.

A Mouse Model of Incompletely Resected Soft Tissue Sarcoma for Testing Neoadjuvant Therapies

In this protocol, we describe a mouse model of incomplete surgical resection of soft tissue sarcoma for testing (neo)adjuvant therapies.

מודל עכבר של Insected רקמה רכה לחלוטין סרקומה עבור בדיקה (ניאו) שפיטה טיפולים

Surgery is often the first treatment for many solid tumors. However, local relapses frequently occur following primary tumor resection, despite adjuvant ...