ס Lusvarghi, ג&#39;Sztuba-סולינסקי, KJ Purzycka, ג&quot;ו ראוש וSFJ Le גרייס נתמך על ידי תכנית המחקר העירונית של המכון הלאומי לסרטן, המכונים הלאומי לבריאות, ארה&quot;ב.

<ol>
	<li>Scott, W. G., Martick, M., Chi, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+regulatory+RNA+elements:+ribozymes+that+regulate+gene+expression.">Structure and function of regulatory RNA elements: ribozymes that regulate gene expression.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1789, 634-641 (2009).</li><li>Moore, P. B., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+RNA+in+the+synthesis+of+protein.">The roles of RNA in the synthesis of protein.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 3, a003780 (2011).</li><li>Wilkinson, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+SHAPE+analysis+reveals+structures+in+HIV-1+genomic+RNA+strongly+conserved+across+distinct+biological+states.">High-throughput SHAPE analysis reveals structures in HIV-1 genomic RNA strongly conserved across distinct biological states.</a> Plos Biol. 6, 883-899 (2008).</li><li>Merino, E. J., Wilkinson, K. A., Coughlan, J. L., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution+by+selective+2+'-hydroxyl+acylation+and+primer+extension+(SHAPE).">RNA structure analysis at single nucleotide resolution by selective 2 '-hydroxyl acylation and primer extension (SHAPE).</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 4223-4231 (2005).</li><li>Watts, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+secondary+structure+of+an+entire+HIV-1+RNA+genome.">Architecture and secondary structure of an entire HIV-1 RNA genome.</a> Nature. 460, 711-716 (2009).</li><li>Xu, W., Bolduc, F., Hong, N., Perreault, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+combination+of+computer-assisted+structure+prediction+and+SHAPE+probing+to+elucidate+the+secondary+structures+of+five+viroids.">The use of a combination of computer-assisted structure prediction and SHAPE probing to elucidate the secondary structures of five viroids.</a> Mol. Plant Pathol. , (2012).</li><li>Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+architecture+of+the+human+long+non-coding+RNA,+steroid+receptor+RNA+activator.">Structural architecture of the human long non-coding RNA, steroid receptor RNA activator.</a> Nucleic Acids Res. 40, 5034-5051 (2012).</li><li>Leshin, J. A., Heselpoth, R., Belew, A. T., Dinman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+structural+analysis+of+yeast+ribosomes+using+hSHAPE.">High-throughput structural analysis of yeast ribosomes using hSHAPE.</a> RNA Biol. 8, 478-487 (2011).</li><li>Souliere, M. F., Haller, A., Rieder, R., Micura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+powerful+approach+for+the+selection+of+2-aminopurine+substitution+sites+to+investigate+RNA+folding.">A powerful approach for the selection of 2-aminopurine substitution sites to investigate RNA folding.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, 16161-16167 (2011).</li><li>Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2+'-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+(SHAPE):+quantitative+RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution.">Selective 2 '-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution.</a> Nat. Protoc. 1, 1610-1616 (2006).</li><li>McGinnis, J. L., Duncan, C. D. S., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Shape+and+Hydroxyl+Radical+Analysis+of+Rna+Structure+and+Ribonucleoprotein+Assembly.">High-Throughput Shape and Hydroxyl Radical Analysis of Rna Structure and Ribonucleoprotein Assembly.</a> Method Enzymol. 468, 67-89 (2009).</li><li>Low, J. T., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHAPE-directed+RNA+secondary+structure+prediction.">SHAPE-directed RNA secondary structure prediction.</a> Methods. 52, 150-158 (2010).</li><li>Das, R., Laederach, A., Pearlman, S. M., Herschlag, D., Altman, R. B. S. A. F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-automated+footprinting+analysis+software+for+high-throughput+quantification+of+nucleic+acid+footprinting+experiments.">Semi-automated footprinting analysis software for high-throughput quantification of nucleic acid footprinting experiments.</a> Rna-a Publication of the Rna Society. 11, 344-354 (2005).</li><li>Kertesz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+measurement+of+RNA+secondary+structure+in+yeast.">Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast.</a> Nature. 467, 103-107 (2010).</li><li>Underwood, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FragSeq:+transcriptome-wide+RNA+structure+probing+using+high-throughput+sequencing.">FragSeq: transcriptome-wide RNA structure probing using high-throughput sequencing.</a> Nat. Methods. 7, 995-1001 (2010).</li><li>Mauger, D. M., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+global+RNA+structure+analysis.">Toward global RNA structure analysis.</a> Nat. Biotechnol. 28, 1178-1179 (2010).</li><li>Lucks, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+RNA+structure+characterization+with+selective+2'-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+(SHAPE-Seq).">Multiplexed RNA structure characterization with selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 11063-11068 (2011).</li><li>Vasa, S. M., Guex, N., Wilkinson, K. A., Weeks, K. M., Giddings, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ShapeFinder:+a+software+system+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+nucleic+acid+reactivity+information+resolved+by+capillary+electrophoresis.">ShapeFinder: a software system for high-throughput quantitative analysis of nucleic acid reactivity information resolved by capillary electrophoresis.</a> RNA. 14, 1979-1990 (2008).</li><li>Reuter, J. S., Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAstructure:+software+for+RNA+secondary+structure+prediction+and+analysis.">RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis.</a> BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).</li><li>Pang, P. S., Elazar, M., Pham, E. A., Glenn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+RNA+secondary+structure+mapping+by+automation+of+SHAPE+data+analysis.">Simplified RNA secondary structure mapping by automation of SHAPE data analysis.</a> Nucleic Acids Res. 39, e151 (2011).</li><li>Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+SHAPE-directed+RNA+structure+determination.">Accurate SHAPE-directed RNA structure determination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 97-102 (2009).</li><li>Darty, K., Denise, A., Ponty, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VARNA:+Interactive+drawing+and+editing+of+the+RNA+secondary+structure.">VARNA: Interactive drawing and editing of the RNA secondary structure.</a> Bioinformatics. 25, 1974-1975 (2009).</li><li>Byun, Y., Han, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PseudoViewer:+web+application+and+web+service+for+visualizing+RNA+pseudoknots+and+secondary+structures.">PseudoViewer: web application and web service for visualizing RNA pseudoknots and secondary structures.</a> Nucleic Acids Res. 34, 416-422 (2006).</li><li>Brown, T., Brown, D. J. S., Eckstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach. , 20 (1990).</li><li>Legiewicz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+Transport+Element+of+the+Murine+musD+Retrotransposon+Requires+Long-range+Intramolecular+Interactions+for+Function.">The RNA Transport Element of the Murine musD Retrotransposon Requires Long-range Intramolecular Interactions for Function.</a> J. Biol. Chem. 285, 42097-42104 (2010).</li><li>Steen, K., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syntheis+of+1-methyl-8-nitroisatoic+anhydride+(1M7).">Syntheis of 1-methyl-8-nitroisatoic anhydride (1M7).</a> Protocol Exchange. , (2011).</li><li>Mortimer, S. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast-acting+reagent+for+accurate+analysis+of+RNA+secondary+and+tertiary+structure+by+SHAPE+chemistry.">A fast-acting reagent for accurate analysis of RNA secondary and tertiary structure by SHAPE chemistry.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 4144-4145 (2007).</li><li>Mitra, S., Shcherbakova, I. V., Altman, R. B., Brenowitz, M., Laederach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-nucleotide+structural+mapping+by+capillary+automated+footprinting+analysis.">High-throughput single-nucleotide structural mapping by capillary automated footprinting analysis.</a> Nucleic Acids Res. 36, e63 (2008).</li><li>Giddings, M. C., Severin, J., Westphall, M., Wu, J., Smith, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+software+system+for+data+analysis+in+automated+DNA+sequencing.">A software system for data analysis in automated DNA sequencing.</a> Genome Res. 8, 644-665 (1998).</li><li>Aviran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+and+automation+of+sequencing-based+characterization+of+RNA+structure.">Modeling and automation of sequencing-based characterization of RNA structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 11069-11074 (2011).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

אנו מציגים כאן פרוטוקול מפורט עבור צורה של תפוקה גבוהה, טכניקה המאפשרת קביעת מבנה משנית לרזולוצית נוקלאוטיד יחידה לRNAs בכל גודל. יתר על כן, צימוד נתוני צורה ניסיונית עם אלגוריתמים לחיזוי מבנה משניים מאפשר יצירת המודלים 2D RNA עם רמה גבוהה יותר של דיוק מאשר אפשרי עם כל אחת מהשיטות לבד. שילוב של פריימרים fluorescently שכותרת ואוטומטי CE מספק יתרונות משמעותיים על פני הצורה מבוססת ג&#39;ל המסורתית, המאפשר את הרזולוציה של רצפי הרנ&quot;א ארוכים בניסוי אחד, כמו גם מהירות גבוהה יותר באופן משמעותי ותפוקה לניסויים מרובים. התועלתנות של שיטה זו וזמינות של כלי ניתוח נתונים המתאימים באופן אידיאלי לעשות SHAPE-מתאימה לניתוח מבני של שליח ויראלי, ללא פגע סורר בעבר, וRNAs noncoding. כמבני 2D של RNAs המסקרן אלה הופכים ברורים יותר, השימוש ברדיקלי הידרוקסיל חיטוט, דרך הספאמתודולוגיות מחשוף לספירה והדמיה מולקולרית צריכים לעזור להבהיר אינטראקציות שיישונים מורכבות וסופו של דבר לאפשר לחוקרים לקבוע את המבנה של RNAs אלה בשלושה ממדים.

כדי להבין את הפונקציות של RNAs קטליטיים וללא קידוד מעורב בויסות של שחבור, תרגום, שכפול נגיף וסרטן, ידע מפורט של מבנה RNA נדרש 1,2. לרוע המזל, חיזוי מדויק של רנ&quot;א מתקפל מציג אתגר עצום. סוכני חיטוט הקלסיים סובלים מחסרונות רבים כגון רעילות, כיסוי חלקי נוקליאוטידים ו / או תפוקה מוגבלת ל100-150 נוקלאוטידים לכל ניסוי. אלגוריתמים לחיזוי מבנה משניים בכוחות עצמו הם דומה נחות, בשל אי דיוקים הנובעים מחוסר היכולת שלהם להבחין ביעילות בין מבנים אנרגטי דומים. RNAs גדול בפרט הם לעתים קרובות גם עקשן לשיטות של קביעת מבנה 3D כגון קריסטלוגרפיה רנטגן ותהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה, בשל הגמישות שלהם קונפורמציה וכמויות גדולות של דגימות טהורות ביותר הנדרשות לטכניקות אלה. HSHAPE igh תפוקה פותר רבים מהבעיות הללו על ידי מתן גישה יעילה, פשוטה לחיטוט המבנים של RNAs גדול ברזולוציה נוקלאוטיד יחידה. יתר על כן, את חומרים כימיים המשמשים עבור צורה בטוח, קל לטפל ו, בניגוד לרוב כימי אחרות חיטוט ריאגנטים, מגיבים עם כל ארבע ribonucleotides. ריאגנטים אלה יכולים גם לחדור ממברנות תאים, מה שמאפשר לחקור RNAs בהם בהקשר vivo (ים) 3. פותח במקור בשבועות המעבדה 4, צורה נעשתה שימוש כדי לנתח מגוון רחב של RNAs, הדוגמא הבולטת ביותר היא קביעת המבנה המשני המלא של ~ 9 KB HIV-1 RNA הגנום 5. הישגים בולטים אחרים בשימוש בצורה כוללים הבהרה של המבנים של viroids זיהומיות 6, RNAs אדם הארוך ללא קידוד 7, שמרי ריבוזומים 8, וriboswitches 9, כמו גם לזהות אתרי קישור בחלבון virion הקשורים RNA HIV-1 3. מה עלי לעשותאיל הווריאציות המקוריות ותפוקה גבוהה של פרוטוקול SHAPE כבר פורסם במקומות אחרים 10-12, העבודה הנוכחית מספקת תיאור מפורט של קביעת מבנה המשנית RNA על ידי צורת תפוקה גבוהה באמצעות oligonucleotides ניאון, מנתח Beckman Coulter CEQ 8000 הגנטי, ו SHAPEfinder וRNAStructure תוכנה (V5.3). פרטים טכניים שלא פורסמו בעבר ועצות לפתרון בעיות כלולות גם. וריאציות של צורה המהות של צורה והווריאציות שלה היא חשיפה של רנ&quot;א בתמיסה מימית לפטאליק electrophilic כי סלקטיבי acylate קבוצות (2&#39;-OH) 2&#39;-הידרוקסיל ריבוז, ייצור adducts המגושם באתרים של שינוי. תגובה כימית זו משמשת כאמצעי לחקירת דינמיקה מבנית מקומית RNA, נוקלאוטידים כיחידים תקועים נוטים יותר לאמץ תצורות תורמות להתקפת electrophilic על ידי חומרים כימיים האלה, ואילו בסיס לזווג או ארכיטקטוני constrנוקלאוטידים ained הם פחות או unreactive 10. אתרים של היווצרות adduct מזוהים על ידי שעתוק לאחור ייזום מfluorescently או radiolabeled פריימרים הכלאה לאתר מסוים ברנ&quot;א השונה (&quot;(+)&quot; תגובת ההארכה תחל). כאשר רברס טרנסקריפטאז (RT) לא מצליח לחצות את ribonucleotides acylated, בריכת של מוצרים מיוצרת cDNA שאורכי קנה אחד עם אתרים של שינוי. שליטה, &quot;(-)&quot; פריימר סיומת תגובת ניצול RNA שלא נחשף למגיב מבוצעת גם כדי שהסיום המוקדם של סינתזת דנ&quot;א (&quot;תחנות&quot;, כלומר) בשל מבנה RNA, שבר ספציפי RNA גדיל, וכו &#39;, במאי. להבדיל ממשתהה מיוצר על ידי שינוי כימי. לבסוף, שתי תגובות dideoxy-רצף ייזום מאותם פריימרים משמשות כסמנים כדי לקשר בין נוקלאוטידים תגובתי עם רצף הרנ&quot;א הראשוני בעקבות אלקטרופורזה. ביישום המקורי של ShapE, אותו 32-P-שכותרתו סוף פריימר מנוצל ל( +), - ושתי תגובות רצף (). מוצרים של תגובות אלה נטענים לתוך בארות סמוכות בג&#39;ל לוח polyacrylamide 5-8%, ומופרדים על ידי denaturing ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide (דף; איור 1). ניתוח כמותי של דימויי ג&#39;ל מיוצרים על ידי צורה קונבנציונלית יכול להתבצע באמצעות סאפא, תוכנת ניתוח footprinting חצי אוטומטית 13. לעומת זאת, צורת תפוקה גבוהה מעסיקה פריימרים שכותרתו fluorescently ואלקטרופורזה נימים אוטומטיות. באופן ספציפי, לכל אזור של רנ&quot;א תחת חקירה, סט של ארבעה פריימרים DNA בעלי רצף משותף אך שונה 5 &#39;תוויות ניאון חייבת להיות מסונתזים או נרכשו. oligonucleotides שונה שכותרתו אלה משמשים לשתי תגובות SHAPE הממשלה ושתי תגובות רצף, את המוצרים של אשר אספו ומופרד / זוהו על ידי אלקטרופורזה נימים אוטומטית (CE). WherEAS ניתן להשיג את פרופיל תגובתיות של 100-150 NT של רנ&quot;א מתוך סדרה של ארבע תגובות המשתמשות בגישה המקורית, צורת תפוקה גבוהה מאפשרת רזולוציה של 300-600 NT ממדגם 3 חד נקווה. עד 8 קבוצות של תגובות עשויים להיות מופרד בו זמנית, ואילו רבים כמו 96 דגימות יכולות מוכנות לחלוקה במהלך 12 ריצות לספירה רצופות (איור 2). יתר על כן, תוכנת SHAPEfinder, שפותחה כדי לעבד ולנתח נתונים העולים מתוך CEQ ומנתחים גנטיים אחרים, היא אוטומטית יותר ודורשת התערבות משתמש הרבה פחות מסאפא 13 או חבילות ג&#39;ל ניתוח אחרות. מתודולוגיות תפוקה גבוהה יותר מתקדמות שהתפתחו לאחרונה כגון PARS (ניתוח מקביל של מבנה RNA) 14 ו-Frag Seq (שבר-רצף) 15, המשתמש באנזימי מבנה ספציפיים ולא מגיבים לאלקילציה בשיתוף עם הדור הבא רצף טכניקות כדי להשיג information על מבנה RNA. למרות האטרקטיביות של טכניקות אלה, המגבלות רבות הגלומות לnuclease חיטוט עדיין יישארו 16. בעיות אלה ניתן לעקוף ברצף הצורה (SHAPE-Seq) 17 פרוטוקול, שבו הרצף של הדור הבא הוא קדמה שינוי כימי ושעתוק לאחור של RNAs באופן דומה לזה שבוצע בצורה קונבנציונלית. בעוד שיטות אלה עשויות לייצג את העתיד של קביעת מבנה RNA, חשוב לזכור שהרצף של הדור הבא הוא יקר מאוד, ונשאר זמין למעבדות רבות. ניתוח נתוני צורה נתונים שהופקו במנתח הגנטי מוצגים בצורה של electropherogram, שבו עוצמת הקרינה של הדוגמא (ו) זורמת דרך גלאי הנימים זממו נגד מדד של זמן הגירה. עלילה זו לובשת הצורה של עקבות חופפות המקבילה לערוץ הקרינה ארבעהים משמש כדי לזהות את fluorophores השונים, ובו כל עקבות מורכבת מפסגות מתאימות למוצרי cDNA או רצף בודדים. נתוני electropherogram מיוצאים מהמנתח הגנטי כקובץ טקסט מופרד באמצעות טאבים ויובאו לשינוי ShapeFinder וניתוח תוכנה 18. ShapeFinder משמש בתחילה לבצע סדרה של טרנספורמציות מתמטיות על הנתונים כדי לוודא שפעמי הגירה והיקפי שיא משקפים במדויק את זהותם וכמויות של מוצרי התגובה, בהתאמה. פסגות הן אז מיושרות ומשולבים, ואת התוצאות נספרו יחד עם רצף הרנ&quot;א הראשוני. &quot;פרופיל תגובתיות&quot; למקטע הרלוונטי של רנ&quot;א מתקבל על ידי החסרת ערכי בקרה מ( +) ערכים הקשורים לכל רנ&quot;א נוקלאוטיד, ונרמול הנתונים כפי שיתואר להלן. פרופיל זה מיובא לRNAstructure (V5.3) 19,20 תוכנה, אשר ממירה val תגובתיות המנורמלues תוך אילוצים פסאודו אנרגיה שמשולבים באלגוריתם קיפול המבנה המשני RNA. שילוב כימי חיטוט וקיפול אלגוריתמים בדרך זו משפר באופן משמעותי את הדיוק של חיזוי מבנה בהשוואה לכל אחת מהשיטות לבד 12,21. הפלט של RNAstructure (V5.3) כולל תמונות של האנרגיה הנמוכה ביותר RNA מבנים משניים בצבעים עם צורת פרופיל תגובתיות (ים), כמו גם את אותם מבנים בסימון הדוט סוגר טקסטואלי. זו האחרונה עשויה להיות מיוצאות לתוכנה המיועדת לתצוגה הגרפית של מבנה המשני RNA כגון רנה 22 וPseudoViewer 23. <img alt="איור 1" fo:content-width="4.8in" fo:src="/files/ftp_upload/50243/50243fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50243/50243fig1.jpg" /> איור 1. תרשים זרימה של קביעת מבנה RNA באמצעות SHAPE 4,10. () RNA מ &#39;איי יתקבלו מדגימות ביולוגיות או על ידי שעתוק במבחנה. (ב) בהתאם למקור, RNA הוא מקופל או מעובד בדרך אחרת ושונים עם מגיב SHAPE. (ג) שעתוק הפוך באמצעות פריימרים שכותרתו fluorescently או רדיואקטיבית. (D) מוצרי cDNA הם מופרדים באמצעות שתי אלקטרופורזה מבוססת ג&#39;ל נימים או לוח. (ה) ניתוח שבר. (F) ניבוי מבנה RNA. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50243/50243fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50243/50243fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50243/50243fig2.jpg" /> איור 2. אופי התפוקה גבוהה של צורה מבוססת CE מאפשר ניתוח מהיר של RNAs מרובים, ו / או מקטעים מרובים של אותם רנ&quot;א. () </stרונג&gt; מייצג כיצד ניתן לחלק RNA לסעיפי 300-600 NT (מקודד לפי צבע בירוק, כחול ואדום) (ב) חלקים של RNA הם חקרו באופן עצמאי באמצעות סטים שונים של פריימרים ניאון (חיצים שחורים) (ג) סטים תגובות הם אספו והעמיסו לתוך בארות A1, B1, C1, וכו &#39;, בהתאמה, ומספקות כיסוי מלא ל~ 3 KB RNA1. תוצרי תגובה מRNAs 2, 3, 4, וכו &#39;יכול להיות מוכן באופן דומה לחלוקה בריצות electrophoretic רצופות. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50243/50243fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a>

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methylisatoic anhydride (NMIA)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>M25</td>
			<td>Dissolve in anhydrous DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-methyl-t-nitroisatoic anhydride (1M7)</td>
			<td>see ref. 22</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>18080044</td>
			<td>10,000 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo sequenase cycle sequencing kit</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>78500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Materials provided by the user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA of interest</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>6 pmol per reaction (the limit of detection will be determined by the instrument)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sets of four 5' labeled primers (Cy5, Cy5.5, WellRed D2 and WellRed D1/Licor IR800)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Primers are complementary to the RNA and are used in reverse transcription and sequencing reactions. The listed fluorophores are optimal for the Beckman Coulter 8000 CEQ. Primers may be purchased or synthesized in house.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA template</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>DNA is used for sequencing reactions, and must contain the sequence of the RNA being studied - including any 3'terminal extension, if present. Where applicable, it is often convenient to use the RNA transcription template.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x RNA renaturation buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 M KCl, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X RNA folding buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>200 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM MgCl2, 2.5 mM EDTA, 650 mM KCl. (This buffer might be changed depending on the case (e.g. pH, EDTA, Mg, RNase inhibitor)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5X RT mix</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4 &mu;l 5X buffer, 1 &mu;l 100 mM DTT, 1.5 &mu;l water,1 &mu;l 10 mM dNTPs, 0.5 &mu;l SuperScript III. Note that the 5X buffer and 100 mM DTT are provided with purchase of SuperScript III (Invitrogen).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Sample Loading Solution (Beckman Coulter)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Attention: Avoid multiple freeze-thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary electrophoresis</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>CEQ8000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>varies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna secondary structure prediction using high-throughput shape

הבנת תפקידו של רנ&quot;א המעורב בתהליכים ביולוגיים דורשת ידע מעמיק של מבנה RNA. לשם כך, את המתודולוגיה המכונה &quot;acylation הידרוקסיל 2 סלקטיבית תפוקה גבוהה &#39;נותח על ידי הארכה תחל&quot;, או צורה, מאפשרת חיזוי של מבנה המשני RNA עם רזולוציה נוקלאוטיד יחידה. גישה זו מנצלת סוכני חיטוט כימיים שמעדיפים acylate אזורים תקועים או גמישים בודדות של רנ&quot;א בתמיסה מימית. אתרים של שינוי כימי מזוהים על ידי שעתוק הפוך של RNA השונה, ואת המוצרים של התגובה הזו הם מופרדים על ידי אלקטרופורזה נימים אוטומטית (CE). מאז רברס טרנסקריפטאז הפסקות באותם נוקלאוטידים RNA שונה על ידי חומרים כימיים צורה, ספריית cDNA כתוצאה בעקיפין ממפה האלה ribonucleotides שהם תקועים אחת בהקשר של RNA המקופל. באמצעות תוכנת ShapeFinder, המיוצר על ידי את electropherograms האוטומטית לספירה מעובד והוסב לנושולחנות תגובתיות cleotide שהם עצמם הפכו לאילוצים פסאודו אנרגיה בשימוש באלגוריתם חיזוי RNAStructure (V5.3). את מבני RNA דו ממדים המתקבלים על ידי שילוב של SHAPE חיטוט עם בחיזוי מבנה המשני סיליקון ורנ&quot;א כבר נמצא להיות הרבה יותר מדויק מאשר מבנים המתקבלים בשני שיטות לבד.

RNA המכיל את רכיב ה-HIV-1 rev התגובה (RRE) ו&#39;3 קלטת מבנה טרמינל 4 הוכנה מפלסמיד לינארית ידי שעתוק במבחנה, אחרי שהיא הייתה מקופלת על ידי חימום, קירור, ודגירה על 37 מעלות צלזיוס בנוכחות של MgCl 2. RNA נחשף לNMIA ולאחר מכן להפוך עיבד מ פריימר 5&#39;-DNA הסוף שכותרתו הכלאה לקלטת מבנה טרמינל 3 &#39;. ספריית cDNA SHAPE כתוצאה מכך, יחד עם תגובות בקרה ורצף, ואז הייתה מופרד באמצעות מערכת Beckman Coulter CEQ 8000 אוטומטי נימי אלקטרופורזה לייצר electropherogram מתואר באיור 4. ארבע החופפים, עקבות קידוד הצבע מיוצרות על ידי הגירה מארבעת הסטים של מוצרי תגובה דרך הנימים, כדלקמן: כחול (מוצרי RT Cy5 שכותרת שנוצרו משעתוק לאחור של RNAs-modified NMIA), ירוק (Cy5.5 שכותרתו מוצרי RT ממקופלים, אבל חוץ מunmodifiRNAs ED), שחור (סולם WellRed D2 שכותרתו רצפי DNA שנוצר באמצעות DDG) ואדום (Lycor800 שכותרתו סולם רצף, DDT). את עקבות CE הגלם הופרדו, מעובד מיושר ומשולב באמצעות תוכנת ShapeFinder 18. האזור של העקבות (ים) המקבילה לאזור SLII RRE מתואר באיור 5, הנתונים שעובדו עד לנקודה בסמוך לשילוב שיא (כלומר, עקבות כבר מיושרות, נתון רקע החיסור, תיקון לדעיכת אות , וכו &#39;.). ערכי תגובתיות לכל נוקלאוטיד מחושבים על ידי שילוב של הפסגות המקבילות בNMIA (+) וNMIA (-) תגובות (בסימנים הכחולים וירוקים, בהתאמה), וההפחתה של האחרון מהראשון. ערכים אלה מצביעים על תגובתיות המידה שבי RT מסתיים בכל נוקלאוטיד במהלך שעתוק לאחור, שהוא השתקפות של המידה שבה כל נוקלאוטיד כבר שונה על ידי NMIAולכן הנטייה שלו להיות תקועה אחד בפתרון. הפרופיל של HIV-1 RRE SHAPE תגובתיות שנוצר בShapeFinder היה מנורמל והוסב למסמך הטקסט מתאים ליבוא לRNAStructure (V5.3) 19. בתוכנה האחרונה, ערכי תגובתיות שולבו אלגוריתם חיזוי מבנה המשני כאילוצים פסאודו אנרגיה, ובכך להשפיע על מבנים שהם חזו לי האנרגיה החופשית הנמוכה ביותר. פלט תכנית מורכב משתי מפות מבנה התל ממדי RNA משניים המתארות את מבני האנרגיה הנמוכים ביותר שנוצרו על ידי האלגוריתם, כמו גם קבצי טקסט המכיל את המבנים האלה באים לידי ביטוי בסימון הדוט סוגר. השנייה של יציאות אלה עשויות להיות מיוצאות לתוך תוכנת ההדמיה RNA כגון VARNA 22. איור 6 מציג את מבנה 2D של אזור HIV RRE SLII נוצר בRNAStructure (V5.3) באמצעות פרופילי תגובתיות SHAPE הנגזרות ודמיין באמצעות ורנה.<html> ערכי תגובתיות SHAPE מקודדים צבע על גבי זו. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50243/50243fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50243/50243fig4.jpg" /> איור 4. . Electropherogram נציג מדגם RNA שנצפו בניתוח מערכות CEQ 8000 גנטיות (Beckman) התוכנה מציגה עקבות שבו כל אחד מערוצים מוצגים כקו צבעוני: ערוצים כחולים וירוקים מייצגים את המגיב (+) ו (-) ניסויים מגיב, ושחור ואדום מייצגים סולמות רצף. ה-X ו-Y-צירים נסמן זמן רזולוציה ועוצמת הקרינה, בהתאמה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50243/50243fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> files/ftp_upload/50243/50243fig5.jpg &quot;/&gt; איור 5. Electropherogram ניתוח באמצעות כלים ShapeFinder 18. חלון תצוגת נתונים (במרכז) מספק משוב גרפי בכל שלב עיבוד הנתונים. חלון מפקח הכלי (למטה משמאל) מציג פרמטרים לכלי שנבחר במפקח Scripting. מפקח Scripting (למעלה מימין) מציג את אותם כלים שהוחלו על הנתונים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50243/50243fig5large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 6" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50243/50243fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50243/50243fig6.jpg" /> איור 6. צבע מבנה RNA דו ממדים מקודדים לתגובתיות SHAPE נוצרה באמצעות יישומון ההדמיה VARNA 22. נוקלאוטידים מסומנים בצבעים כדי לציין את התואר (ים) של תגובתיות SHAPE. בתוךהספקטרום הראה, עיגולים כחולים ואדומים מצביעים נוקלאוטידים בעלי תגובתיות נמוכה וגבוהה, בהתאמה.

Watch this Scientific Journal Video about RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE at JoVE.com

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

acylation הידרוקסיל &#39;2 סלקטיבית תפוקה גבוהה נותח על ידי הארכה תחל (SHAPE) מנצל כימי רומן חיטוט טכנולוגיה, שעתוק לאחור, אלקטרופורזה נימים ותוכנות לחיזוי מבנה משנית כדי לקבוע את המבנים של RNAs מכמה מאה עד כמה אלף נוקלאוטידים ברזולוציה נוקלאוטיד יחידה.

חיזוי מבנה המשני RNA באמצעות SHAPE תפוקה גבוהה

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

rna-secondary-structure-prediction-using-high-throughput-shape

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

31.3K Views.  Frederick National Laboratory for Cancer Research. acylation הידרוקסיל '2 סלקטיבית תפוקה גבוהה נותח על ידי הארכה תחל (SHAPE) מנצל כימי רומן חיטוט טכנולוגיה, שעתוק לאחור, אלקטרופורזה נימים ותוכנות לחיזוי מבנה משנית כדי לקבוע את המבנים של RNAs מכמה מאה עד כמה אלף נוקלאוטידים ברזולוציה נוקלאוטיד יחידה.

Video: RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

A Protocol for Computer-Based Protein Structure and Function Prediction

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the understanding of their biological role. Although experimental methods can provide detailed information for a small fraction of these proteins, computational modeling is needed for the majority of protein molecules which are experimentally uncharacterized. The I-TASSER server is an on-line workbench for high-resolution modeling of protein structure and function. Given a protein sequence, a typical output from the I-TASSER server includes secondary structure prediction, predicted solvent accessibility of each residue, homologous template proteins detected by threading and structure alignments, up to five full-length tertiary structural models, and structure-based functional annotations for enzyme classification, Gene Ontology terms and protein-ligand binding sites. All the predictions are tagged with a confidence score which tells how accurate the predictions are without knowing the experimental data. To facilitate the special requests of end users, the server provides channels to accept user-specified inter-residue distance and contact maps to interactively change the I-TASSER modeling; it also allows users to specify any proteins as template, or to exclude any template proteins during the structure assembly simulations. The structural information could be collected by the users based on experimental evidences or biological insights with the purpose of improving the quality of I-TASSER predictions. The server was evaluated as the best programs for protein structure and function predictions in the recent community-wide CASP experiments. There are currently &gt;20,000 registered scientists from over 100 countries who are using the on-line I-TASSER server.

Guidelines for computer based structural and functional characterization of protein using the I-TASSER pipeline is described. Starting from query protein sequence, 3D models are generated using multiple threading alignments and iterative structural assembly simulations. Functional inferences are thereafter drawn based on matches to proteins with known structure and functions.

פרוטוקול מבנה מחשב מבוסס חלבון חיזוי פונקציה

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

תפוקה גבוהה התגבשות של חלבונים בממברנה שימוש בשיטה Lipidic Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

תפוקה גבוהה מיפוי פיזי של הכרומוזומים באמצעות אוטומטי<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

מסך ידני מולקולה קטנה מתקרב תפוקה גבוהה באמצעות עוברי דג הזברה

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

קשירת יעילה ביותר של RNA קטן מולקולות לMicroRNA Quantitation על ידי רצף תפוקה גבוהה

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

זיהוי של מטרות מירנה בתפוקה גבוהה באמצעות assay 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

חיזוי מבנה המשני RNA באמצעות SHAPE תפוקה גבוהה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video