אנו מודים RIKEN למימון. P10-Gal4 הייתה מתנה סוג של אלן וינסנט (אוניברסיטת פול סבטייה, טולוז, צרפת).

1. הכנה של ריאגנטים הערות לפני ההתחלה: Dissection ו מכתים immunohistochemical מתבצעת בתא מגנטי הזחל הוא מרותקים באמצעות סיכות בצורת חרקים במיוחד. הוראות מפורטות על בניית חדר מגנטי, והכנת סיכות אלו ניתן למצוא אזכורים הקשורים 14,15. בקיצור, חור מרובע 1x1cm הוא חתך לתוך גיליון מגנטי coverslip מודבקת האחורי של הגיליון כדי להפוך חדר קטן. הדפנות של החדר חתומות עם דבק אפוקסי, דבק אחרי זה יש להגדיר את החדר נשטף מספר פעמים עם אתנול 70% לפני השימוש. חרקים סיכות Dissection מוכנים ידי כיפוף לצורה הנדרשת ולאחר מכן מודבק על גבי הכרטיסייה מתכת 14,15. לחילופין ללשונית מתכת, השתמשנו ציור הפוכה ראש שטוח פינים פלדה עם ידית עשוי לחתוך את קצה צהוב. שימוש בהסדר זה קאמרית המגנטי מאפשר לסגור לשלוט over מיצוב סיכה ורקמת מתיחה במהלך לנתיחה. כדי לנהוג גן ביטוי הכתב תת שונים של נוירונים חוקרים התובע רשאי להשתמש במספר שונה Gal4 קווי (סיכם שימונו על ידי ועמיתיו 16). רבים שורות אלה זמינים ממרכזי מניות לציבור. בפרוטוקול זה נציג, אנחנו לבצע immunostaining קו שבה שני מעמדות מנוגדים של DA נוירון הם שיתוף שכותרתו: הכי פשוט ברמה שאני ורוב מורכבים ברמה IV (P10-Gal4 17,18, כטב&quot;מ-mCD8: Kusabira-Orange (KO)). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן Ca + + ללא HL3.1 מלוחים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במ&quot;מ: 70 NaCl, KCl 5, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 סוכרוז, ו 5 trehalose; pH 7.2 19. מסנן לעקר ולאחסן ב 4 ° C. הערה: Ca + + ללא פתרון המונע התכווצות שרירים במהלך לנתיחה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2x חיץ PHEM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מ&quot;מ: 130 צינורות, 60 HEPES, 20 EGTA, 4 MgSO4; 7.0 pH. מסנן לעקר ולאחסן ב 4 ° C. הערה: חומרים אלה לא מתמוססים עד pH 7.0 הגישות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את טרי מקבע מיד לפני קיבעון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להכין פתרון 25ml, paraformaldehyde first 2g לערבב, 100μl NaOH 1M 10 מ&quot;ל מים בצינור פלקון 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Shake מקבע בתוך אמבטיה 55 מעלות צלזיוס מים עם שייקר עד הפתרון הוא ברור. (סה&quot;כ נפח יהיה כ 11.5 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקבע מגניב על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ 12.5ml 2x PHEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה-pH 7.0 עם 1M HCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את הפתרון עם מים עד נפח הוא 25ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את הפתרון באמצעות נייר Whatman. </li></ol></li></ol> 2. הזחל לנתיחה הערה לפני שמתחילים: רשתות Microtubule, ובמיוחד אלה דנדריטים חושית, פירוט יהיה במהירות לאחר תחילתו של דיסקציה. Achieving לנתיחה מהירה תוך פחות מחמש דקות לאחר מכן קיבוע מיידי הם גורמי מפתח להצלחה של פרוטוקול זה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הזחל במים במהירות להזיז אותם טיפה זה באמצעות לולאה של השיער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המזרח בצד הגבי הזחל מעלה את הצד הגחוני על הזכוכית. הערה: אוריינטציה זו היא לבחון את הנוירונים אשכול הגחון. כדי לבחון נוירונים אשכול הגבי, להפוך את הכיוון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במרכז חרקים פינים להצמיד את הקצה הקדמי ליד ווים הפה. מניחים את הסיכה קרוב לסוף לקבלת התוצאות הטובות ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים טיפת מלח HL3.1 בחדר דיסקציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את קצה אחורי מאוד של הזחל את עם microscissors. הערה: צעד זה פותח צוהר בקצה האחורי של הזחל שיאפשר גישה עבור microscissors (שלב 2.7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס עם מלקחיים את האזור של הבטן כי הוא עכשיו מציץ מתוך הפתח בקצה האחורי של הזחל. משוך בעדינות את הבטן כולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח אתקצה הלהב אחד microscissors דרך הפתח לחתוך לאורך קו האמצע לכיוון הגחון הקדמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סיכות פינה, פינים בפינות חינם עכשיו האחורי הראשונה, ואז הקדמי. במקביל למתוח בעדינות לפתוח את פילה הזחל. </li></ol> 3. קיבוע, חסימת, מכתים, ואת הרכבה של פילה הזחל הערות לפני ההתחלה: כל קיבעון צעדים מכתים מבוצעות בחדר דיסקציה. במהלך תהליך זה, להיזהר לא לדפוק את הפינים חרקים מחזיק את הזחל מכיוון שהדבר עלול לגרום נזק לרקמות. כדי למנוע את הניסוי מהתייבשות, לעשות את כל הצעדים מכתים במיכל פלסטיק קטן מוקף ברקמות לחלח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב + Ca + ללא HL3.1 חיץ באמצעות קצה צהוב. מיד להוסיף את מקבע באמצעות אחר pipetteman. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה בעדינות מעלה ומטה כדי לערבב את מקבע עם שאריות של חיץ HL3.1 Ca + + ללאבחדר. מיד לשאוב אותו ולאחר מכן להוסיף מקבע טרי לתוך החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 10mins 6x ב PBST (0.1% טריטון X-100 ב-PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק עם סרום עיזים 5% PBST במשך 20 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את הפתרון חוסם עם נוגדנים העיקרי בדילול בסרום עיזים 5% PBST. נוגדנים העיקרי בשימוש הם העכבר אנטי-α טובולין (DM1A) לבין חולדה אנטי CD8 (5H10) הן בדילול מלא 1 / 1000. הערה: החוקר מומלץ תחליף העכבר אנטי-α טובולין (DM1A) עם העכבר אנטי Futsch (22C10) 20,21 בדילול מלא 1 / 1000 בנסיבות מסוימות (ראה דיון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לילה (לפחות 16h) בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 10mins 6x ב PBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פתרון נוגדנים משני בדילול בסרום עיזים 5% PBST. נוגדנים הם בשימוש משני אלקסה פלואוריד 488 עיזים אנטי עכבר IgG ו Cy3 חמור נגד חולדה IgG. שמור על מדגם מכוסה כדי למנוע fluorophoreצילום הלבנה 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה או ב RT במשך שעתיים, או לילה ב 4 ° C ואחריו כשעה בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 10mins 6x ב PBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פילה הזחל בשקופית לציפורן בצד למטה, לעלות ב 80% גליצרול ו לאטום את הצדדים של coverslip עם לק על הר &quot;מהיר&quot;. הערה: ניקוי רקמות משופרת מדגם יציב קבע, הר ב DPX כפי שתואר לעיל 23. </li></ol> 4. נציג תוצאות: מכתים פלורסנט נבדק תחת מיקרוסקופ confocal. ב איורים 1-2, סניפים שונים בתוך סוכת דנדריט יש ארגון cytoskeletal שונים. איור 1 מציג אזור של סוכת של IV מעמד התובע נוירון על שלב 1 st הזחל instar. סוכת כולו מסומן mCD8: KO ו זוהה באמצעות נוגדן אנטי CD8 ו פלורסנט משני (Cy3). טובולין הוא זוהה באמצעות נוגדן אנטי-α טובולין ו פלואורידescent משנית (אלקסה פלואוריד 488). הענפים העיקריים הם חיוביים טובולין, כמה ענפים דקים מהצד הם טובולין שלילי. סרט 1 היא סדרה של חתכים דרך מכתים דומה אני בכיתה התובע נוירון. איור 2 מראה אזור של סוכת של IV מעמד התובע נוירון מוכתם נוגדנים כנגד Futsch ו CD8 על שלב 1 st הזחל instar. הענפים העיקריים הם Futsch חיובי, כמה ענפים דקים הם Futsch צד שלילי. באיור 3. Tracheae בקיר גוף הזחל להראות ארגון microtubule מורכבים. סרטים 2 ו -3 להראות קטעים הסידורי של מכתים דרך קיר שרירי הגוף ואת הנשימה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3662/3662fig1.jpg" /> באיור 1. איור. 1 מראה אזור של סוכת של IV מעמד התובע נוירון על שלב 1 st הזחל instar. סוכת כולו מסומן mCD8: KO ו זוהה באמצעות נוגדן אנטי CD8 משני ניאון (Cy3). טובולין מזוהה באמצעות אנטי &amp;-Tubuli<html> n נוגדנים משני ניאון (אלקסה 488). לוחות AC רציפים confocal Z-קטעים (0.5μm), C&#39;-C &quot;, מכתים נוגדן בודד דוגמה ג פאנל של ענפים עם (ראש חץ צהוב) או בלי (חץ סגול) microtubules מודגשים. חצים אדומים להדגיש microtubules בתוך הבסיס תאים אפיתל. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3662/3662fig2.jpg" /> באיור 2. איור. 2 מראה האזור דומה של סוכת של IV בכיתה דה נוירון מוכתם נוגדנים כנגד Futsch ו CD8 על שלב 1 st הזחל instar. סוכת כולו מסומן mCD8: KO ו זוהה באמצעות נוגדן אנטי CD8 משני ניאון (Cy3). Futsch הוא זוהה באמצעות נוגדן אנטי Futsch משני ניאון (אלקסה 488). הענפים העיקריים הם Futsch חיובי, כמה ענפים דקים הם Futsch צד שלילי. דוגמה של ענפים עם (ראש חץ צהוב) או בלי (חץ סגול) Futsch מודגשים. = &quot;Jove_content&quot;&gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3662/3662fig3.jpg" /> באיור 3. קנה הנשימה מוכתמים באמצעות פרוטוקול טובולין אנטי שתוארו לעיל. הזחל זה instar השלישי גזור כפי שתואר קודם לכן 23,24. Movie 3 מראה קטעים סדרתי מוגדל מתחום מסומן ריבוע. סרט 1. סעיפים טורי מעקב מכתים טובולין ברחבי סוכת הדנדריטי של מעמד אני נוירון. סוכת כולו מסומן mCD8: KO (מגנטה) ו זוהה באמצעות נוגדן אנטי CD8 ו פלורסנט משני (Cy3). טובולין (ירוק) הוא זוהה באמצעות נוגדן אנטי-α טובולין ו פלורסנט משנית (אלקסה פלואוריד 488). קנה מידה: צד אחד של תמונת וידאו מתאים 46.88μm בסעיף. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/3662/YalginMooreMovie1.avi">לחץ כאן כדי להציג את הסרט.</a> סרט 2. סעיפים טורי מעקב מכתים טובולין ב BODy קיר השרירים של הזחל instar השלישי. טובולין מזוהה באמצעות אנטי טובולין α-נוגדן ו פלורסנט משנית (אלקסה פלואוריד 488). קנה מידה: צד אחד של תמונת וידאו מתאים 46.88μm בסעיף. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/3662/YalginMooreMovie2.avi">לחץ כאן כדי להציג את הסרט.</a> סרט 3. סעיפים טורי מעקב מכתים טובולין בתוך גוף קיר קנה הנשימה של הזחל instar שלישי, המסומנים בכיכר Figure.3. טובולין מזוהה באמצעות אנטי טובולין α-נוגדן ו פלורסנט משנית (אלקסה פלואוריד 488). קנה מידה: צד אחד של תמונת וידאו מתאים 46.88μm בסעיף. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/3662/YalginMooreMovie3.avi">לחץ כאן כדי להציג את הסרט.</a>

<ol>
	<li>Schottenfeld, J., Song, Y., Ghabrial, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tube+continued:+morphogenesis+of+the+Drosophila+tracheal+system.">Tube continued: morphogenesis of the Drosophila tracheal system.</a> Curr. Opin. Cell. Biol. 22, 633-639 (2010).</li><li>Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+regulating+dendritic+outgrowth,+branching,+and+routing+in+Drosophila.">Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila.</a> Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).</li><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li><li>Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+mechanisms+to+define+neuron+class-specific+dendrite+arbor+morphology.">Intrinsic mechanisms to define neuron class-specific dendrite arbor morphology.</a> Cell. Adh. Migr. 2, 81-82 (2008).</li><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons.">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129, 2867-2878 (2002).</li><li>Nishimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+Behaviors+and+Segmental+Coordination+During+Larval+Locomotion+Is+Disrupted+by+Nuclear+Polyglutamine+Inclusions+in+a+New+Drosophila+Huntington's+Disease-Like+Model.">Selection of Behaviors and Segmental Coordination During Larval Locomotion Is Disrupted by Nuclear Polyglutamine Inclusions in a New Drosophila Huntington's Disease-Like Model.</a> J. Neurogenet. 24, 194-206 (2010).</li><li>Ramon y Cajal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histology of the nervous system of man and vertebrates, 1995 translation. , (1911).</li><li>London, M., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+computation.">Dendritic computation.</a> Annu. Rev. Neurosci. 28, 503-532 (2005).</li><li>Jinushi-Nakao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knot/Collier+and+cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape.">Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56, 963-978 (2007).</li><li>Li, W., Gao, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+filament-stabilizing+protein+tropomyosin+regulates+the+size+of+dendritic+fields.">Actin filament-stabilizing protein tropomyosin regulates the size of dendritic fields.</a> J. Neurosci. 23, 6171-6175 (2003).</li><li>Ye, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+dendritic+and+axonal+development+by+the+novel+Kruppel-like+factor+Dar1.">Differential regulation of dendritic and axonal development by the novel Kruppel-like factor Dar1.</a> J. Neurosci. 31, 3309-3319 (2011).</li><li>Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+bantam+functions+in+epithelial+cells+to+regulate+scaling+growth+of+dendrite+arbors+in+drosophila+sensory+neurons.">The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 63, 788-802 (2009).</li><li>Sugimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+developmental+modes+and+lesion-induced+reactions+of+dendrites+of+two+classes+of+Drosophila+sensory+neurons.">Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons.</a> J. Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).</li><li>Budnik, V., Gorczyca, M., Prokop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+methods+for+the+anatomical+study+of+Drosophila+embryonic+and+larval+neuromuscular+junctions.">Selected methods for the anatomical study of Drosophila embryonic and larval neuromuscular junctions.</a> Int. Rev. Neurobiol. 75, 323-365 (2006).</li><li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Protocols. , (2000).</li><li>Shimono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidendritic+sensory+neurons+in+the+adult+Drosophila+abdomen:+origins,+dendritic+morphology,+and+segment-+and+age-dependent+programmed+cell+death.">Multidendritic sensory neurons in the adult Drosophila abdomen: origins, dendritic morphology, and segment- and age-dependent programmed cell death.</a> Neural. Dev. 4, 37-37 (2009).</li><li>Colomb, S., Joly, W., Bonneaud, N., Maschat, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+concerted+action+of+Engrailed+and+Gooseberry-Neuro+in+neuroblast+6-4+is+triggering+the+formation+of+embryonic+posterior+commissure+bundles.">A concerted action of Engrailed and Gooseberry-Neuro in neuroblast 6-4 is triggering the formation of embryonic posterior commissure bundles.</a> PLoS One. 3, 2197-2197 (2008).</li><li>Dubois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collier+transcription+in+a+single+Drosophila+muscle+lineage:+the+combinatorial+control+of+muscle+identity.">Collier transcription in a single Drosophila muscle lineage: the combinatorial control of muscle identity.</a> Development. 134, 4347-4355 (2007).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18, 377-402 (2004).</li><li>Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Futsch/22C10+is+a+MAP1B-like+protein+required+for+dendritic+and+axonal+development.">Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development.</a> Neuron. 26, 357-370 (2000).</li><li>Zipursky, S. L., Venkatesh, T. R., Teplow, D. B., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+development+in+the+Drosophila+retina:+monoclonal+antibodies+as+molecular+probes.">Neuronal development in the Drosophila retina: monoclonal antibodies as molecular probes.</a> Cell. 36, 15-26 (1984).</li><li>Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Larval+NMJ+Immunohistochemistry.">Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry.</a> J. Vis. Exp. (25), e1108-e1108 (2009).</li><li>Karim, M. R., Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+Analysis+of+Drosophila+Larval+Peripheral+Sensory+Neuron+Dendrites+and+Axons+Using+Genetic+Mosaics.">Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics.</a> J. Vis. Exp. (57), e3111-e3111 (2011).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Larval+NMJ+Dissection.">Drosophila Larval NMJ Dissection.</a> J. Vis. Exp. (24), e1107-e1107 (2009).</li><li>Tao, J., Rolls, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrites+have+a+rapid+program+of+injury-induced+degeneration+that+is+molecularly+distinct+from+developmental+pruning.">Dendrites have a rapid program of injury-induced degeneration that is molecularly distinct from developmental pruning.</a> J. Neurosci. 31, 5398-5405 (2011).</li><li>Yamamoto, M., Ueda, R., Takahashi, K., Saigo, K., Uemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+axonal+sprouting+and+dendrite+branching+by+the+Nrg-Ank+complex+at+the+neuron-glia+interface.">Control of axonal sprouting and dendrite branching by the Nrg-Ank complex at the neuron-glia interface.</a> Curr. Biol. 16, 1678-1683 (2006).</li><li>Mattie, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+microtubule+growth,++TIPs,+and+kinesin-2+are+required+for+uniform+microtubule+polarity+in+dendrites.">Directed microtubule growth, +TIPs, and kinesin-2 are required for uniform microtubule polarity in dendrites.</a> Curr. Biol. 20, 2169-2177 (2010).</li><li>Pawson, C., Eaton, B. A., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formin-dependent+synaptic+growth:+evidence+that+Dlar+signals+via+Diaphanous+to+modulate+synaptic+actin+and+dynamic+pioneer+microtubules.">Formin-dependent synaptic growth: evidence that Dlar signals via Diaphanous to modulate synaptic actin and dynamic pioneer microtubules.</a> J. Neurosci. 28, 11111-11123 (2008).</li><li>Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+and+tau+reporters+disrupt+central+projections+of+sensory+neurons+in+Drosophila.">Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila.</a> J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).</li></ol>

אין לנו שום דבר לגלות.

כדי להבין כיצד צורות מורכבות התא מושגות חשוב להיות מסוגל הארגון במדויק microtubule assay. כאן אנו מתארים את שיטת תיוג חזקים immunohistological לארגון assay microtubule הדנדריטים של נוירון דנדריטים arborization חושית. בנוסף עצב סנסורי מכתים, שיטה זו משיגה מכתים immunohistological החזקה של קנה הנשימה, השרירים ושאר רקמות הגוף הקיר. אנו משתמשים בפרוטוקול זה כדי לבחון ארגון microtubule של דנדריטים של נוירונים חושיים פיתוח התובע. דנדריטים אלה רגישים מאוד לפציעה או מתח 25, ו - לשבור במהירות לאחר תחילת הניתוח 23. Dissection אמור להתבצע תוך חמש דקות או פחות. Microtubules של קנה הנשימה ועוד קיר רקמות הגוף יציבים יותר. פרוטוקול זה מותאם מאלו המשמשים להכנת פילה הזחל לניתוח של צומת neuromuscular 14,15, והוא מותאם במיוחד ו מהירהixation לאחר דיסקציה מהיר. כאשר מנתחים את דנדריטים של נוירונים התובע, מכתים חזקים אנטי טובולין בשריר שמעל, ותאי אפיתל בבסיס 26 יכול להוביל דפוס מכתים מסובך (איור 1, Movie1). לפיכך מעקב זהיר של מכתים הדנדריטים באמצעות קטעים מספר סידורי (Movie1) עשויים להידרש לצורך ניתוח מלא של ארגון microtubule של נוירון התובע דנדריט ארבור. נוגדנים חד שבטיים כדי homologue תסיסנית ספציפיים של MAP1B, Futsch 20,21, יכול לשמש גם לתייג את cytoskeleton microtubule במערכת העצבים ההיקפית תסיסנית 5,9,20. Futsch מתבטאת רק בנוירונים ולכן הוא מייצר דפוס מכתים מסובך פחות מ-α טובולין (איור 2). GFP-tagged-אנדוגני, טאו גם שימש כסמן של הדנדריטים התובע נוירון microtubules 27. שימוש סמנים אלה הוא יעיל, אך יש לציין כי ב-Termini האקסון של הדואר neuromuscular צומת Futsch במיוחד תוויות microtubules ארוזות 28. יחסים מרחביים המדויק בין Futsch, טאו, ו microtubules ב דנדריטים התובע הם עדיין לא מאופיין במלואו. בפרוטוקול זה יש לנו מענה ארגון microtubule אנדוגני. זה גם אפשרי microtubules התווית באמצעות overexpression של טאו GFP מתויג או טובולין. יש להקפיד על גרימת פנוטיפים צפויים כאשר גישות overexpression משמשים 29. בידיים שלנו, מכתים immunohistochemical של microtubules בנוירונים התובע ושאר הקיר רקמות הגוף מושגת בצורה הטובה ביותר כאשר נוגדנים משני לשמש כדי לזהות את הנוגדן אנטי טובולין העיקרית היא מצמידים את fluorophore בקלות, דמיינו כגון Alexa פלואוריד 488. לכן, כאשר השימוש בכלים מהונדס לתייג נוירונים התובע בתיאום עם אנטי טובולין למשל תיוג באמצעות מערכת Gal4/UAS, מערכת לכסה, או MARCM 23 ו MARCM נגזרים, אנו מעדיפים חלבונים עם סמןאת החפיפה ספקטרלי עם זה משנית, כגון mCD8: KO: שרי mCD8:.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> קטלוג מספר </th><th> תגובות (לא חובה) </th></tr><tr><td> מצבטים </td><td> דומון </td><td> 11251-20 </td><td></td></tr><tr><td> Microscissors </td><td> FST </td><td> 15000-08 </td><td></td></tr><tr><td> עכבר אנטי-α טובולין (Clone: ​​DM1A) </td><td> סיגמא </td><td> T9026 </td><td> דילול 1 / 1000 </td></tr><tr><td> עכבר אנטי Futsch (Clone: ​​22C10), supernatant </td><td> התפתחותי מחקרים Hybridoma בנק </td><td> 22C10 </td><td> דילול 1 / 1000 </td></tr><tr><td> עכברוש אנטי CD8 (Clone: ​​5H10) </td><td> Caltag </td><td> MCD0800 </td><td> דילול 1 / 1000 </td></tr><tr><td> אלקסה פלואוריד 488 אנטי עכבר IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-11001 </td><td> דילול 1 / 500 </td></tr><tr><td> Cy3 אנטי עכברוש IgG </td><td> ג&#39;קסון Immunoresearch </td><td> 712-166-150 </td><td> דילול 1 / 200 </td></tr></tbody></table>

immunohistological labeling of microtubules in sensory neuron dendrites, tracheae, and muscles in the drosophila larva body wall

כדי להבין כיצד ההבדלים בצורות התא מורכב מושגות, חשוב לעקוב במדויק ארגון microtubule. הקיר הזחל תסיסנית הגוף מכיל סוגי תאים מספר דגמים ללמוד התא המורפוגנזה רקמות. לדוגמה tracheae משמשים לבחון המורפוגנזה צינור 1, ואת arborization הדנדריטים (DA) עצב סנסורי של הזחל תסיסנית הפכו המערכת העיקרית של הבהרה כללית נוירון ברמה ספציפי מנגנוני 2-5 בידול הדנדריטים וניוון 6 . צורת הענפים דנדריט יכול להשתנות באופן משמעותי בין מעמדות נוירון, ואפילו בין סניפים שונים של תא עצב בודד 7,8. מחקרים גנטיים מראים כי הנוירונים התובע ארגון cytoskeletal ההפרש יכול ביסוד הבדלים מורפולוגיים בצורת ענף הדנדריטים 4,9-11. אנו מספקים שיטה חזקים תיוג החיסוני לssay בארגון microtubule vivo ב DA דנדריט נוירון חושי סוכת (איורים 1, 2, סרט 1). פרוטוקול זה ממחיש את לנתיחה ו immunostaining של הזחל instar הראשון, השלב שבו פעיל דנדריט נוירון חושי תולדה וארגון הסתעפות מתרחש 12,13. בנוסף מכתים עצב סנסורי, שיטה זו משיגה תיוג החזקה של ארגון microtubule בשרירים (סרטים 2, 3), קנה הנשימה (איור 3, סרט 3), ועוד קיר רקמות הגוף. זהו ערך עבור חוקרים המבקשים לנתח ארגון microtubule באתרו בקיר הגוף כאשר חוקרים מנגנונים רקמות מלאה צורת התא.

Watch this Scientific Journal Video about Immunohistological Labeling of Microtubules in Sensory Neuron Dendrites, Tracheae, and Muscles in the Drosophila Larva Body Wall at JoVE.com

Immunohistological Labeling of Microtubules in Sensory Neuron Dendrites, Tracheae, and Muscles in the Drosophila Larva Body Wall

כדי להבין כיצד צורות תאים מורכבים, כגון דנדריטים עצביים, מושגות במהלך הפיתוח, חשוב להיות מסוגל הארגון במדויק microtubule assay. כאן אנו מתארים את שיטת תיוג חזקים immunohistological לבחון ארגון microtubule הדנדריטים של נוירון דנדריטים arborization חושית, קנה הנשימה, שריר, ועוד<em&gt; תסיסנית</em&gt; גוף הזחל רקמות קיר.

תיוג Immunohistological של microtubules ב דנדריטים Neuron חושי, Tracheae, והשרירים של תסיסנית גוף Larva הכותל

To understand how differences in complex cell shapes are achieved, it is important to accurately follow microtubule organization. The Drosophila larval ...

immunohistological-labeling-microtubules-sensory-neuron-dendrites

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Immunohistological Labeling of Microtubules in Sensory Neuron Dendrites, Tracheae, and Muscles in the Drosophila Larva Body Wall

12.3K Views.  RIKEN Brain Science Institute. כדי להבין כיצד צורות תאים מורכבים, כגון דנדריטים עצביים, מושגות במהלך הפיתוח, חשוב להיות מסוגל הארגון במדויק microtubule assay. כאן אנו מתארים את שיטת תיוג חזקים immunohistological לבחון ארגון microtubule הדנדריטים של נוירון דנדריטים arborization חושית, קנה הנשימה, שריר, ועוד תסיסנית

Video: Immunohistological Labeling of Microtubules in Sensory Neuron Dendrites, Tracheae, and Muscles in the Drosophila Larva Body Wall

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

ניתוח מורפולוגי של תסיסנית הזחל היקפיים Neuron דנדריטים חושי האקסונים באמצעות פסיפסים גנטי

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

ויזואליזציה של Proprioceptors ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים וגלמים

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

תיוג של פלורסנט מדרדר מאפשר להקלטה ממוקדת חד תאית מיחידת נוירונים שזוהו<em&gt; בvivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

תיוג של תאים בודדים במערכת העצבים המרכזית של<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אנטנה

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

התנהגויות חוש הריח assayed ידי מעקב ממוחשב של<em&gt; תסיסנית</em&gt; בתוך אולפקטומטר ארבעה-רביע

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). Therefore, detection of the presence of A&#946; in AD brain tissue is a valuable tool for developing new treatments to prevent the progression of AD. Several classical amyloid binding dyes, fluorochrome, imaging probes, and A&#946;-specific antibodies have been used to detect A&#946; histochemically in AD brain tissue. Use of these compounds for A&#946; detection is costly and time consuming. However, because of its intense fluorescent activity, high-affinity, and specificity for A&#946;, as well as structural similarities with traditional amyloid binding dyes, curcumin (Cur) is a promising candidate for labeling and imaging of A&#946; plaques in postmortem brain tissue. It is a natural polyphenol from the herb Curcuma longa. In the present study, Cur was used to histochemically label A&#946; plaques from both a genetic mouse model of 5x familial Alzheimer&#39;s disease (5xFAD) and from human AD tissue within a minute. The labeling capability of Cur was compared to conventional amyloid binding dyes, such as thioflavin-S (Thio-S), Congo red (CR), and Fluoro-jade C (FJC), as well as A&#946;-specific antibodies (6E10 and A11). We observed that Cur is the most inexpensive and quickest way to label and image A&#946; plaques when compared to these conventional dyes and is comparable to A&#946;-specific antibodies. In addition, Cur binds with most A&#946; species, such as oligomers and fibrils. Therefore, Cur could be used as the most cost-effective, simple, and quick fluorochrome detection agent for A&#946; plaques.

Curcumin is an ideal fluorophore for labeling and imaging of amyloid beta protein plaques in brain tissue due to its preferential binding to amyloid beta protein as well as its structural similarities with other traditional amyloid binding dyes. It can be used to label and image amyloid beta protein plaques more efficiently and inexpensively than traditional methods.

תיוג והדמיה של שלטי עמילואיד ברקמת המוח באמצעות פוליפנול טבעי כורכומין

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

בליסטי לתיוג של הנוירונים בתוך המוח בפרוסות ובתרבות התא הראשוני

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

תיוג Immunohistological של microtubules ב דנדריטים Neuron חושי, Tracheae, והשרירים של תסיסנית גוף Larva הכותל

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

ניתוח מורפולוגי של תסיסנית הזחל היקפיים Neuron דנדריטים חושי האקסונים באמצעות פסיפסים גנטי

ויזואליזציה של Proprioceptors ב

תיוג של פלורסנט מדרדר מאפשר להקלטה ממוקדת חד תאית מיחידת נוירונים שזוהו

תיוג של תאים בודדים במערכת העצבים המרכזית של

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים

התנהגויות חוש הריח assayed ידי מעקב ממוחשב של

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים

תיוג והדמיה של שלטי עמילואיד ברקמת המוח באמצעות פוליפנול טבעי כורכומין

בליסטי לתיוג של הנוירונים בתוך המוח בפרוסות ובתרבות התא הראשוני