מחקר זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדע, הקרן מק &#39;נייט קרן Neuroscience, כריסטופר ודנה ריב קרן קרן Amerisure הצדקה.

<ol>
	<li>Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+regeneration+requires+a+conserved+MAP+kinase+pathway.">Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway.</a> Science. 323, 802-806 (2009).</li><li>Steinmeyer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+femtosecond+laser+microsurgery+system.">Construction of a femtosecond laser microsurgery system.</a> Nature protocols. 5, 395-407 (2010).</li><li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+neuronal+regeneration+is+influenced+by+life+stage,+ephrin+signaling,+and+synaptic+branching.">Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching.</a> Proc Natl Acad. 104, 15132-15137 (2007).</li><li>Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+immobilization+of+physiologically+active+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans.</a> Nature protocols. 5, 1888-1902 (2010).</li><li>Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+nanosurgery+and+cell+enucleation+using+a+picosecond+laser.">Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser.</a> J. Microsc. 234, 1-8 (2009).</li><li>Hutson, M. S., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+and+cavitation+dynamics+during+pulsed+laser+microsurgery+in+vivo.">Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo.</a> Physical review letters. 99, 158104-158104 (2007).</li><li>Venugopalan, V., Guerra, A., Nahen, K., Vogel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+laser-induced+plasma+formation+in+pulsed+cellular+microsurgery+and+micromanipulation.">Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation.</a> Physical review letters. 88, 078103-078103 (2002).</li><li>Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+nanoaxotomy+properties+and+their+effect+on+axonal+recovery+in+C.+elegans.">Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans.</a> Opt Express. 16, 5963-5963 (2008).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), e1129-e1129 (2009).</li><li>Tsai, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-mediated+ablation:+an+optical+tool+for+submicrometer+surgery+on+neuronal+and+vascular+systems.">Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 20, 90-99 (2009).</li><li>Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+AFD+neuron+in+C.+elegans+thermotaxis+analyzed+using+femtosecond+laser+ablation.">The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation.</a> BMC Neurosci. 7, 30-30 (2006).</li><li>Shen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+cytoskeletal+filaments+and+mitochondria+in+live+cells+using+a+femtosecond+laser+nanoscissor.">Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor.</a> Mech. Chem. Biosyst. 2, 17-25 (2005).</li><li>Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nanosecond+laser+axotomy:+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport.">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Opt. Express. 16, 9884-9894 (2008).</li><li>Rohde, C. B., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+in+vivo+time-lapse+imaging+and+optical+manipulation+of+Caenorhabditis+elegans+in+standard+multiwell+plates.">Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates.</a> Nat. Commun. 2, 271-271 (2011).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

ישנם מספר דיונים טובה של לייזר microsurgery עם מערכות לייזר שונות 3,5-11. Femtosecond לייזרים IR הם &quot;תקן הזהב&quot; עבור אבלציה לייזר subcellular 12 ונוחה אם הקשורים במתקן הדמיה, אבל הם לעיתים קרובות יקר מדי עבור משתמשים פרטיים. אם אתם זקוקים לייזר femtosecond IR עבור הדמיה מדגם שלך בגלל עומק הדמיה אז אתה כנראה צריך אחד עבור לייזר axotomy. רקמות שקוף עם אקסונים היעד בתוך 30-50 אממ של פני השטח הם כנראה אפשרי עם לייזרים הדופק כחול וירוק בטווח Uj / דופק 20 ממוקדות מבעד לעדשה na גבוה טבילה. לא יהיה נזק סביבתי יותר עם ​​ננו ולייזרים פיקו second לעומת הלייזר femtosecond, במיוחד כאשר העומק של עליות האקסון היעד. ג elegans שקוף אקסונים כולם בתוך 20-30 אממ של פני השטח. אנו שגרתי לחתוך אקסונים מנוע, כי הם בתוך 5 אממ של פני השטח. יש לנו גם לחתוך בקלות גרזןתוספות בתוך טבעת העצב כי הם בערך 20 אממ מפני השטח לציפורן. מצאנו את מגבלת לחיתוך אקסונים להיות כ 30-50 אממ דרך בקוטר של תולעת מבוגר. סביר להניח כי אבלציה לייזר במערכת המתואר כאן יעבוד היטב עם תכשירים שונים שמתאימים לקריטריונים של שקיפות ועומק של אקסונים היעד. ובכל זאת, זה קצת מפתיע, בהתחשב ביתרונות התיאורטיים של לייזרים femtosecond IR, כי ננו picosecond 355 nm ו 532 nm לייזרים לבצע כל כך טוב עבור לייזר axotomy ב C. elegans 6,13. אנו רואים הבדלים התחדשות האקסון בתגובה לייזר axotomy שבריר שנייה עם 440 ננומטר, 532 ננומטר שבריר שנייה, לייזרים femtosecond IR. מצב מוצק 355 ננומטר לייזרים UV הן על העלות זהה דיודה 532 ננומטר שאוב פסיבי Q-Switched לייזר מצב מוצק, אך דורשים סמכויות או גבוה או אופטיקה ביעילות לעבור אלה אורכי גל קצרים יותר. רוב אופטיקה נועדו לבצע היטב עם 400 גלוי -700 ננומטר אור. 355 ננומטר לייזרים תציע כמה יתרונות כגון 6 סף פלזמה מופחת, גודל נקודה קטן יותר, dichroic לעבור זמן רב היה יעיל ישיר 100% של הלייזר אבלציה ליעד ולאפשר דימות סימולטני של ה-GFP ללא אובדן האות המדגם. כחול 440 ננומטר לייזרים היה לשמר את היתרונות של עבודה עם לייזר האור הנראה (ביצועים טובים עם אופטיקה תקן בטיחות). למרבה הצער, את העלות של DPP Q-switched מוצק המדינה 440 ננומטר לייזר 3 פעמים את העלות של לייזר 355nm או 532 ננומטר עוצמה דומה בתקופה זו. אם היינו בתכנון מערכת חדשה עבור C. elegans, שם בעומק המטרה היא מינימלית, היינו לבחור עדשה שקופה UV (עלות כ - 3000 $ עבור עדשה שמן 40X 1.3na עם העברה 50-70% ב 355nm) ו לייזר 355 ננומטר לייצור Uj 5-10 / דופק על 1 -20 קילוהרץ. אבלציה אקסון נחשבת עקב היווצרות פלזמה. פולסים קצרים יפיק ספי פלזמה ב חשמל נמוכה הכרכים פלזמה w<html> חולה להיות קטן 6. המטרה היא לייצר את הפלזמה הקטן משך החיים הקצר ביותר על ידי התאמת אנרגיה הדופק העוצמה הנמוכה ביותר. מוגדלת חיים ארוכים פלזמות תיצור בועות cavitation כי נזק לתאים הסמוכים. גילינו בדרך כלל כי אבלציה באמצעות כ 50-100 פעימות בתדירות הגבוהה ביותר (כלומר 2.5kHz) נותן את התוצאות הטובות ביותר. הדבר מצביע על כך הנזק ניתן לשלב בהדרגה במשך סדרה של פולסים לשלוט טוב יותר את מידת הנזק. אבלציה לייזר המערכת המתוארת כאן היא סלחנית מאוד אם קרן מיושר והרחיב במדויק. אנחנו מתחילים חיתוך האקסונים של תולעים בוגרות לייזר בהספק 10% (ממוצע של 0.3 mW נמדד ב הרץ 2500 והעריך 1 Uj / דופק) והוא יכול לחתוך עם נזק מקומי מוגבל באמצעות כוח 14%. אתה יכול לראות אזורים גדולים של נזק מהשלטון לייזר 15-39%, אבל רק מעל כוח 40% (כ 1 ממוצע mW נמדד הרץ 2500) לעשות התולעים להתפוצץ עקב בועות cavitation גדול ונזק לציפורן של התולעת. e_content &quot;&gt; et al. 2010 2 הנייר הוא משאב מצוין עבור בניית מערכת אבלציה לייזר. Steinmeyer ליאון אייברי יש גם תיאור מעשי נחמד של מערכת לייזר אבלציה מבוסס על לייזר זול גז N2 337 ננומטר והוא מספק כמה מעשית רבה עצה (elegans.swmed.edu / Worm_labs / אייברי /). בעת תכנון המערכת שלך אתה צריך קודם לדבר עם נציג מיקרוסקופ כדי לקבוע כיצד לכוון את הלייזר אבלציה למטרה מיקרוסקופ. מיקרוסקופ שלך צריך להיות מותקן על שולחן בידוד רעידות (ניופורט, TMI, Thor). גבי קרש החיתוך הוא אופטימלי, אבל בראש פלדה מוצק עדיין ניתן להשתמש עם positioners מגנטי. מודול ייעודי ביניים על היקף זקופה נחמד כי כל אלמנטים אופטיים ניתן להשאיר במקום. עם זאת, יכול להיות זול יותר ונוח יותר להשתמש ביציאת המצלמה (הפוכה) או &quot;combiner&quot; שמחוברים ליציאת עלית פלורסנט. אתה צריך לדעת את גודל הצמצם האחורי לבין העברה (ב<html> blation לייזר באורך גל) של העדשה אובייקטיבי אתה מתכוון להשתמש. ברגע שאתה מחליט על לייזר (למשל, Crylas, לשרוץ, קריסטל, או CRC) אתה צריך ליצור קשר תור או ניופורט לעזרה עם בחירת אלמנטים אופטיים נכונה, ציוד חומרה ובטיחות. החלטנו על ההרחבה הקורה הכפולה גלילי כדי לחסוך מקום, אלא פשוט קפלרי ההרחבה היא אופציה (f2/f1 = גורם הרחבה). ההרחבה קרן אישית יהיה הכי זול, אבל בניופורט, Thor, וכמה יצרני לייזר להציע איכות מעולה מסחרי הקורה expanders. חלק מהיצרנים מציעים גם לייזר attenuators ידני מבוקר אלקטרונית שעשויים להיות העלות האפקטיבית לחסוך מקום, אבל לא תכליתי כמו מקטב Glan-תומפסון ואת גל צלחת וחצי. אתה גם צריך להחליט כיצד לשלוט על לייזר. באפשרותך לעצב בקר LabVIEW מבוסס, להשתמש במחולל מסחרי TTL, או תוכנה המסופקים על ידי החברה לייזר. דונו באפשרויות עם היצרן לייזר ספציפי. אוהל &quot;&gt; סיפקנו רשימה של החומרה השתמשנו רק כהנחיה כללית. המערכת המתוארת כאן עולה על 15,000 $ כאשר הוסיף מערכת ההדמיה הקיימים שלנו. המחלקה לפיסיקה המקומי שלך לעתים קרובות יהיה מישהו מוכן לתת הקדמה מעשית בבטחה לעבוד עם אלומת לייזרים חינם. שיטות חלופיות immobilization זמן לשגות הדמיה של C. elegans תוארו לאחרונה. 14 פתרון בעיות השלב הקשה ביותר והקריטי הוא יישור של הקורה מורחבת במרכז לציר האופטי של המיקרוסקופ. ברגע שיש לך את אלומת האור ממוקדת והרחיב דרך עדשות הגלילי אתה צריך לעבוד קשה כדי לקבל את זה מיושר בתוך 5 אממ של ציר אופטי של מיקרוסקופ לפני תחילת השימוש במראות ההיגוי יישור הסופי למרכז. שימוש מוגזם המראות היגוי כדי ליישר את הקורה המיקרוסקופ יעברו דרך אותו ציר הקורהההרחבה. שימוש בזהירות רבה אתה יכול להחליש את קרן הלייזר עם מסנן ND המתאים להציג ישירות את פרופיל קרן לייזר על מטרה רפלקטיבית (ראי פני השטח הקדמי). אתה יכול לנדנד בעדינות את המיקרוסקופ למרכז בדיוק את הקורה בתחום 60x המטרה של התצוגה (אם זה לא יכול להיות מרוכז בטווח למעלה למטה / אתה צריך להתאים את גובה המעקה). פרופיל קרן יכול לשמש בדיוק ליישר את ציר מיקרוסקופ אופטי לתת קרן ממוקדת כי הוא עגול &quot;התפרצויות&quot; סימטרי. התלקחות אסימטרית הוא אינדיקציה לכך את ציר מיקרוסקופ אינו מיושר לחלוטין (או המעקה לא ברמה). לבסוף, אתה צריך להתאים L3 ולראות הרחבה אפילו סימטרי והתכווצות של הקורה. פוקוס מיקרוסקופ דווקא על משטח היעד ולאחר מכן להתאים L3 למקד את קרן הלייזר למקום הקטן. כעת אתה אמור למצוא את קרן הלייזר נמצא במרחק 5 אממ המרכז כאשר צילמו באמצעות LSCM או CCD מערכת הנקודה נמצאת בתוך אבלציה1um של המוקד Z. אם אתה מוצא שאתה &quot;לפוצץ&quot; תולעים או באופן עקבי לייצר בועות cavitation גדול לחתוך אקסונים הבעיה שלך היא ככל הנראה את יישור קנס של הלייזר אבלציה. ודא המינימום (&lt;500nm) במקום אבלציה הוא מקומי למקד את Z (להתאים את ההתכנסות עם עדשה L3) וכן למקום XY נאמנות (להתאים עם מראה רכוב kinematically אחרון). מיקוד אקסונים קרוב לפני השטח ידרוש פחות כוח לייזר. באופן דומה, בעלי חיים קטנים (L1 ו-L2) ידרוש פחות כוח לייזר axotomy לעומת מיקוד אקסונים זהה אצל מבוגרים. אם אקסונים בר שלך סוג לא להתחדש או אקונומיקה אקסונים אתה צריך לנסות לצמצם כוח הדמיה לייזר או להקטין את קצב הדגימה. אם תולעים שלך למות או להיות חולני לנסות לצמצם את אחוז agarose בשלבים 1%. ודא שאתה לא העברת coverslip אחרי תולעים הרכבה כמו זה יהיה לעיתים קרובות לגרום להם למות בעת שימוש גבוה לכלcentage agarose ו microspheres. אם תולעים שלך להתפוצץ או למות במהלך הפגישה זמן לשגות זה בגלל: 1. אחוז agarose הוא גבוה מדי. 2. נזק לציפורן על ידי לייזר אבלציה. 3. תנועת coverslip לאחר הרכבה. אם נזק לציפורן הוא אשם זה ישפיע רק על תולעים רכוב כי כבר ממוקד עם לייזר אבלציה. אם התולעת שלך נעה יותר מדי במהלך הפגישה זמן לשגות נסה להגדיל את אחוז agarose בצעדים 0.5%. אקסונים בריאה תולעים בריא הם תמיד &quot;פעיל&quot; ולהציג רמה עקבית של הקרינה. אם אתה רואה ירידה פתאומית פלואורסצנטי או פעילות התולעת גוסס או מת. אקסונים חרוזים או מקוטעת מרובות הן סימן בטוח של תולעת גוסס או מת. אם אתה מתקשה לשמור על אקסונים שלך בפוקוס במהלך הפגישה כל הזמן לשגות ייתכנו בעיות שונות. ראשית לבדוק להיסחף הבמה שלך על ידי הדמיה מדגם אינרטי בשקופית זכוכית מעל 10 שעותrs. להיסחף מיקרון כמה יכול להיות בגלל חוסר יציבות תרמית, אבל יותר מ -5 אממ כנראה בשל בעיות מכניות עם מיקרוסקופ שלך. בעיות עם הרכבה שכיחים יותר. בואו תולעים רכוב שלך לאזן עם מיקרוסקופ הבמה שלך במשך 30 דקות לפני תחילת זמן לשגות שלך. בדוק חותם וזלין שלך לא לפתח דליפות במהלך ההפעלה זמן לשגות.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> 535 ננומטר לייזר </td><td> Crylas </td><td> FDSS532Q3 </td><td> (לשרוץ, קריסטל, ו CRC מציעים גם לייזרים מקביל) </td></tr><tr><td> כל אופטיקה וחומרה </td><td></td><td></td><td> (Thor מציעה אופטיקה דומה וחומרה) </td></tr><tr><td> SUPREMA אופטי הר, 1.0-בקוטר </td><td> ניופורט </td><td> SS100-F2KN </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 1 &quot;פוסט בקוטר 1&quot; גובה </td><td> ניופורט </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;פוסט קוטר המזלג </td><td> ניופורט </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> אכרומטי Zero-Order פלייט Wavel, ½ גל פיגור, 400-700nm </td><td> ניופורט </td><td> 10RP52-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> שלב סיבוב, 1 &quot;Aperature </td><td> ניופורט </td><td> RSP-1T </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;פוסט בקוטר 1&quot; גובה </td><td> ניופורט </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;פוסט קוטר המזלג </td><td> ניופורט </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Glan-לייזר מקטב קלציט, 430-700nm </td><td> ניופורט </td><td> 10GL08AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> סיבוב מקטב הר </td><td> ניופורט </td><td> RM25A </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ¼ &quot;spacer עבור 1&quot; פוסט בקוטר </td><td> ניופורט </td><td> PS-0.25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ½ &quot;גובה, 1&quot; פוסט בקוטר </td><td> ניופורט </td><td> PS-0.5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> פורק, 1 &quot;פוסט בקוטר </td><td> ניופורט </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> קרן Dump </td><td> ניופורט </td><td> PL15 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> המטרה עדשה מיקרוסקופ הר </td><td> ניופורט </td><td> LH-OBJ1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;פוסט בקוטר 1&quot; גובה </td><td> ניופורט </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;פוסט קוטר המזלג </td><td> ניופורט </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> High-Energy Nd: YAG לייזר מראה, קוטר 25.4 מ&quot;מ, 45 °, 532 ננומטר </td><td> ניופורט </td><td> 10Q20HE.2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SUPREMA אופטי הר, בקוטר 1.0 אינץ&#39;, חור אישור הרכבה </td><td> ניופורט </td><td> SN100C-F </td><td> 2 </td></tr><tr><td> דיוק גבוהה Knob בורג כוונון, נסיעות 12.7mm, 100TPI </td><td> ניופורט </td><td> AJS100-0.5K </td><td> 4 </td></tr><tr><td> מתאם נושא, ¼ זכר -20, 8-32 נקבה </td><td> ניופורט </td><td> SS-1-B </td><td> 2 </td></tr><tr><td> רוד קלאמפ עבור מוט בקוטר 1.5 אינטש </td><td> ניופורט </td><td> 340-RC </td><td> 2 </td></tr><tr><td> רוד, 14 אינץ&#39; (35.5 ס&quot;מ) גבוה </td><td> ניופורט </td><td> 40 </td&gt; <td> 1 </td></tr><tr><td> Rail המוביל לכל אורך x26 רבועים, 40mm </td><td> ניופורט </td><td> CN26-40 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Steel Rail, 384mm (15 &quot;) אורך </td><td> ניופורט </td><td> X26-384 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> רוד פלטפורמה עבור מוט בקוטר 1.5 אינטש </td><td> ניופורט </td><td> 300-P </td><td> 2 </td></tr><tr><td> רוד, 14 אינץ&#39; (35.5 ס&quot;מ) גבוה </td><td> ניופורט </td><td> 40 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plano-עדשה קעורה, בקוטר 12.7mm, 25mm-EFL, 430-700nm </td><td> ניופורט </td><td> KPC025AR.14 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plano-עדשה קמורה, בקוטר 25.4mm, 50.2mm EFL, 430-700nm </td><td> ניופורט </td><td> KPX082AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Plano-עדשה קמורה, בקוטר 25.4mm, 62.9mm EFL, 430-700nm </td><td> ניופורט </td><td> KPX085AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> עדשה קבועה בהר, 0.5 &quot;, בקוטר 1.0&quot; גובה הציר </td><td> ניופורט </td><td> LH-0.5 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> עדשה קבועה בהר, 1.0 &quot;קוטר, 1.0&quot; גובה הציר </td><td> ניופורט </td><td> LH-1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Microspheres 0.1um </td><td> Polysciences </td><td> 00876 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> RPI </td><td> A20090 </td><td> EEO בעניינים </td></tr><tr><td> Muscimol </td><td> סיגמא </td><td> M1523 </td><td></td></tr></tbody></table>

constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in c. elegans

לייזר axotomy ואחריו מיקרוסקופיה זמן לשגות הוא assay רגיש פנוטיפים האקסון התחדשות ב C. elegans 1. הקושי העיקרי של assay זה היא העלות נתפס ($ 25-100K) ואת המומחיות הטכנית הנדרשת ליישום אבלציה לייזר מערכת 2,3. עם זאת, המדינה לייזר מוצק הדופק של עלויות צנוע (&lt;$ 10K) יכול לספק ביצועים חזקים עבור אבלציה לייזר בהכנות שקוף שבו האקסונים היעד &quot;לסגור&quot; על פני השטח רקמות. בנייה ויישור של המערכת יכול להתבצע ביום אחד. הנתיב האופטי המסופק על ידי אור הקבל ממוקד לייזר אבלציה מספק מדריך יישור נוח. מודול ביניים עם כל אופטיקה הסיר ניתן המוקדש לייזר אבלציה ומבטיחה שאין אלמנטים אופטיים צריך להתרגש במהלך הפגישה אבלציה לייזר. Dichroic במודול ביניים מאפשר הדמיה סימולטני אבלציה לייזר. מרכוז קרן הלייזר לאo קרן היוצאת מן עדשה מיקרוסקופ ממוקד הקבל מנחה את היישור ההתחלתי של המערכת. מגוון של עדשות משמשים תנאי ולהרחיב את קרן הלייזר כדי למלא את הפתח האחורי של העדשה המטרה שנבחרה. יישור בדיקות הסופי מתבצע עם יעד משטח מול מראות זכוכית שקופית. כוח לייזר מותאם לתת הגודל המינימלי אבלציה נקודה (&lt;1um). נקודה אבלציה מרוכז עם התאמות בסדר המראה רכוב kinematically האחרון לחצות שערות קבוע בחלון ההדמיה. לייזר כוח axotomy יהיה 10X כ גבוה יותר מאשר צורך במקום אבלציה המינימום בשקופית היעד (זה עשוי להשתנות עם יעד אתה משתמש). תולעים יכולים להיות משותקת עבור לייזר ו axotomy זמן לשגות הדמיה על ידי הרכבה על כריות agarose (או microfluidic לתאי 4). רפידות agarose נעשים בקלות מלוחים מאוזנת נמס במיקרוגל עם agarose 10%. ירידה של agarose מותכת מושם על שקופית זכוכית שטוחה עם אחרשקופיות הזכוכית לתוך כרית כ 200 אממ עבה (שכבה יחידה של קלטת זמן בשקופיות הסמוך משמש כשומר רווח). &quot;ממולח&quot; כובע משמש לגזור משטח עגול בקוטר במדים של 13mm. הרדמה (1ul Muscimol 20mm) ו microspheres (כריס פאנג-ין תקשורת אישית) (1ul 2.65% פוליסטירן 0.1 אממ במים) מתווספים במרכז כרית ואחריו 3-5 תולעים אוריינטציה כך שהם שוכבים על הצד השמאלי שלהם. Coverslip כוס מוחל ואז וזלין משמש לאטום את coverslip ולמנוע התאדות של המדגם.

Watch this Scientific Journal Video about Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans at JoVE.com

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

לייזר axotomy ואחריו הדמיה זמן לשגות היא דרך רגיש assay את ההשפעות של מוטציות<em&gt; ג elegans</em&gt; על התחדשות האקסון. איכות גבוהה, אבל זול, מערכת לייזר אבלציה ניתן להוסיף בקלות לרוב מיקרוסקופים. זמן לשגות הדמיה מעל 15 שעות מחייבת immobilization זהיר של התולעת.

בניית מערכת בתקציב נמוך לייזר Axotomy לחקר התחדשות אקסון ב ג elegans</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

constructing-low-budget-laser-axotomy-system-to-study-axon

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

15.4K Views.  University of Utah. לייזר axotomy ואחריו הדמיה זמן לשגות היא דרך רגיש assay את ההשפעות של מוטציות ג elegans על התחדשות האקסון. איכות גבוהה, אבל זול, מערכת לייזר אבלציה ניתן להוסיף בקלות לרוב מיקרוסקופים. זמן לשגות הדמיה מעל 15 שעות מחייבת immobilization זהיר של התולעת.

Video: Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

עיצוב של bioreactor לחץ על מחזורי Ex Vivo מחקר של מסתמי הלב אבי העורקים

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key component of lung development is the differentiation of alveolar type II epithelial cells, the major source of pulmonary surfactant. These cells also participate in fluid homeostasis in the alveolar lumen, host defense, and injury repair. In addition, distal lung parenchyma cells can be directly exposed to exaggerated stretch during mechanical ventilation after birth. However, the precise molecular and cellular mechanisms by which lung cells sense mechanical stimuli to influence lung development and to promote lung injury are not completely understood. Here, we provide a simple and high purity method to isolate type II cells and fibroblasts from rodent fetal lungs. Then, we describe an in vitro system, The Flexcell Strain Unit, to provide mechanical stimulation to fetal cells, simulating mechanical forces in fetal lung development or lung injury. This experimental system provides an excellent tool to investigate molecular and cellular mechanisms in fetal lung cells exposed to stretch. Using this approach, our laboratory has identified several receptors and signaling proteins that participate in mechanotransduction in fetal lung development and lung injury.

Mechanical forces play a key role in lung development and lung injury. Here, we describe a method to isolate rodent fetal lung type II epithelial cells and fibroblasts and to expose them to mechanical stimulation using an in vitro system.

מערכת ניסיונית ללמוד Mechanotransduction ב לתאי ריאה עוברית

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

התקני microfluidic פשוטים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של<em&gt; ג elegans</em&gt;,<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ודג זברה

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in contrast, have been conducted using microscope-based approaches, which limit the movement and behavior to a narrow, nearly two-dimensional focal field.1 We present a novel analytical approach that provides real-time analysis of freely swimming C. elegans in a cuvette without dependence on microscope-based equipment. This approach consists of tracking the temporal periodicity of diffraction patterns generated by directing laser light through the cuvette. We measure oscillation frequencies for freely swimming nematodes.
Analysis of the far-field diffraction patterns reveals clues about the waveforms of the nematodes. Diffraction is the process of light bending around an object. In this case light is diffracted by the organisms. The light waves interfere and can form a diffraction pattern. A far-field, or Fraunhofer, diffraction pattern is formed if the screen-to-object distance is much larger than the diffracting object. In this case, the diffraction pattern can be calculated (modeled) using a Fourier transform.2
C. elegans are free-living soil-dwelling nematodes that navigate in three dimensions. They move both on a solid matrix like soil or agar in a sinusoidal locomotory pattern called crawling and in liquid in a different pattern called swimming.3 The roles played by sensory information provided by mechanosensory, chemosensory, and thermosensory cells that govern plastic changes in locomotory patterns and switches in patterns are only beginning to be elucidated.4 We describe an optical approach to measuring nematode locomotion in three dimensions that does not require a microscope and will enable us to begin to explore the complexities of nematode locomotion under different conditions.

Microscopic organisms like the free-swimming nematode C. elegans, live and behave in a complex three-dimensional environment. We report on a novel approach that provides analysis of C. elegans using diffraction patterns. This approach consists of tracking the temporal periodicity of diffraction patterns generated by directing laser light through a cuvette.

מחקר נידות כמותית של חי מייקרו אורגניזמים בחופשיות באמצעות ליזר עקיף

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is subject to chemical and mechanical signals, and the mechanisms by which it senses and responds to mechanical signals are poorly understood. Elucidating the role of forces in cell maturation will enable the design of scaffolds that can promote cell adhesion and cytoskeletal coupling to the substrate, and therefore improve the capacity of different neuronal types to regenerate after injury.
Here, we describe a method to apply simultaneous force spectroscopy measurements during laser induced cell lesion. We measure tension release in the partially lesioned axon by simultaneous interferometric tracking of an optically trapped probe adhered to the membrane of the axon. Our experimental protocol detects the tension release with piconewton sensitivity, and the dynamic of the tension release at millisecond time resolution. Therefore, it offers a high-resolution method to study how the mechanical coupling between cells and substrates can be modulated by pharmacological treatment and/or by distinct mechanical properties of the substrate.

We measured the tension release in an axon that was partially lesioned with a laser dissector by simultaneous force spectroscopy measurement performed on an optically-trapped probe adhered to the membrane of the axon. The developed experimental protocol evaluates the axon adhesion to the culture substrate.

מדידה לשחרר מתח בנגע לייזר מושרה אקסון להעריך הידבקות axonal למצע בpiconewton והאלפית השני רזולוציה

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

הנדסת ג&#39;ל קולגן Cellularized 3D לשחזור רקמות וכלי דם

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

מישורי צבע מערכת דיפוזיה לחקירת Chemotaxis בקולגן מטריקס 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues. 
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRP&#945; and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

בניית רקמות לב Engineered האנושית תחם לחקור מנגנונים של טיפול בתאי לב

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

ייצור של חלקיקי מתכת על ידי פעימה לייזר ablation בנוזלים: כלי לחקר מאפיינים אנטיבקטריאליים של חלקיקים

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

תלת מימדי רקמות מהונדסים מיושר אסטרוציט רשתות כדי לסכם מנגנונים התפתחותית וכדי להקל על מערכת העצבים התחדשות

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...