עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי להזדקנות (AG04418), המכון הלאומי לשימוש בסמים, המכון הלאומי לבריאות, קרולינסקה תוכנית Institutet שותפויות בוגר, קרולינסקה Institutet, שוודית מועצת המחקר, כוח המוח שוודית, קרן המוח שוודית. תודות רבות Mattias קרלן, ד&quot;ר ג&#39;וזפה Coppotelli לתמיכה יצירתי עם איור 1 ו - 2, בהתאמה; קארין Pernold לקבלת סיוע טכני; ואת בני הזוג. בארי ג&#39;יי הופר, לארס אולסון, נילס, גוראן לארסון עבור עצות מועילות דיון רב.

1. רקמות כהכנה cryosectioning <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקורבן בעלי חיים על ידי פריקה או עריפת ראש או צוואר הרחם, על פי היתר מוסרי זמין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות לאסוף רקמות עניין (למשל. במוח), במהירות הקפאת קרח יבש (רקמות עשויה לדרוש הקפאת isopentane או פרופאן מקורר עם חנקן נוזלי כדי להשיג מורפולוגיה אופטימלית). רקמות חנות בנייר אלומיניום ב -80 ° C עד מוכן סעיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטמע הרקמה הקפואה לקראת cryosectioning. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף של 14 מיקרומטר סעיפים cryostat ב -21 ° C (ייתכן שיהיה עליך להתאים הטמפרטורה ± 1-2 ° C). להפשיר חלקים על שקופיות באמצעות בלוק חימום, בלי שקופיות חנות coverslipping ב -20 ° C עד מוכן לשימוש. </li></ol> 2. COX histochemistry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר שקופיות לייבוש בטמפרטורת החדר במשך שעה 1. שים שקופיות בתא שקופיות הכתמה עם נייר סינון רטוב, חתוך לרצועות. כדי להשיג consistenתוצאות לא בכל ניסוי, מומלץ לעבד עד עשר שקופיות הניסוי כדי למזער את העיכובים זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תחת ברדס כימיים 1X DAB, 100 מיקרומטר ציטוכרום C ב 0.1 M PBS pH = 7.0. וורטקס במהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיקרוגרם שור Catalase (2 מיקרוגרם מ&quot;ל -1 או כ 4 IU מ&quot;ל -1). מערבבים היטב על ידי vortexing לשבור את כל גרגרי Catalase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת 150-200 μL של המדיום הדגירה להחליק כל, להשתמש קצה פיפטה כדי להתפשט באופן שווה על כל חלקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות במשך 40 דקות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון עודף השקופיות. לשטוף שקופיות 4 פעמים, 10 דקות בכל פעם, ב 0.1 M PBS pH = 7.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור שקופיות קאמרית השקופית מכתים עם רצועות נייר רטוב. </li></ol> 3. SDH histochemistry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מתחת למכסה המנוע כימי 1.5 מ&quot;מ NBT, נתרן 130 mM succinate, PMS 0.2 מ&quot;מ, 1.0 mM אזיד הנתרן ב 0.1 M PBS pH = 7.0. קח זהירות כדי להגן עלתסמונת קדם וסתית מן האור. וורטקס במהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 150-200 μL של המדיום הדגירה להחליק כל, להשתמש קצה פיפטה כדי להתפשט באופן שווה על כל חלקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות במשך 40 דקות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון עודף השקופיות. לשטוף שקופיות 4 פעמים, 10 דקות בכל פעם, ב 0.1 M PBS pH = 7.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים את השקופיות 2 דקות בריכוזים הבא של אתנול: 70%, 70%, 95%, 95%, 99.5%. לאחר מכן לאפשר 10 דקות בשלב 99.5% נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום שקופיות קסילן במשך 10 דקות. הר עם Entellan ו coverslip. אפשר השקופיות להתייבש שעות הלילה, או לפחות 1-2 במקום מאוורר. </li></ol> 4. קביעת תפקוד המיטוכונדריה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסכום של תפקוד המיטוכונדריה הוא הצביע על ידי כמות מכתים כחול הסלולר. כדי למחצה לכמת את הסכומים הללו, מגלשות צריך להיות מקודדים דמיינו תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. חצי כימות צריכה להתבצע על עיוור<html> בסיס באמצעות סולם, למשל 0-4 (0, ללא כתמים כחולים, 4, רק כתמים כחולים). עדיף לבצע סוג זה של כימות למחצה על כמה סעיפים מנושא מסוים / חיה כדי לחשב ערך ממוצע לכל נושא / בעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סטטיסטיקה צריכה להתבצע באמצעות בדיקת אי - פרמטריים, כגון מאן ויטני, או Kruskal-Wallis. </li></ol> 5. סגוליות בקרות מתאימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור פקדים סגוליות פעילות COX, חזור &quot;COX histochemistry&quot; צעדים, ולהוסיף 2.5 mM אזיד הנתרן, בדרכי הנשימה מסוף מעכב שרשרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור פקדים סגוליות לפעילות SDH, חזור &quot;SDH histochemistry&quot; צעדים עם הסרת succinate נתרן תוספת של malonate 50 מ&quot;מ, מעכב תחרותי של SDH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ו מייבשים חלקים בסדרה אתנול, ולאחר מכן לטעון coverslip את השקופיות כפי שמתואר צעדים 3.4-3.6. </li></ol> 6. נציג תוצאות: אוהל &quot;&gt; התוכנית הכוללת של COX / SDH פעמיים תיוג assay histochemical מתוארת באיור 2. דוגמאות מייצגות של histochemistry COX / SDH פעמיים תיוג מתאים בסעיפים המוח של wild-type ו הזדקנות בטרם עת עכברים mtDNA המוטטורי מוצגים באיור 3. מכתים חום כהה wild-type עכברים (איור 3, פאנל משמאל) הראו פעילות נורמלית COX. תאים עם ליקויים שרשרת הנשימה, שמסומן על ידי צביעת הכחול, נחשפו 12 בן שבוע עכברים mtDNA המוטטורי, ועל ליקויים אלה הפכו נפוץ יותר כמו עכברים mtDNA המוטטורי בגילאי עד 46 שבועות (איור 3, מרכז הפאנל מימין). דוגמאות של תיוג כפול הולם COX / SDH בסעיפים המוח מפני wild-type עכברים בשל תיוג COX מספיק מוצגים באיור 4. זמן הדגירה לקוי להפגנה של פעילות COX, או לצמצם את הזמינות של חמצן מולקולרי על ידי coverslipping השקופית במהלך הדגירה, הביא בתצהיר מופחת של מגיבים DABמוצר יון, ובכך אפשרה היווצרות של המוצר formazan כחול במהלך סוף הדגירה SDH. פעילות COX ו SDH יכול להיות גם נחקר בנפרד (איור 5, שמאל ומרכז), אולם תיוג סדרתית מסייעת לזיהוי תאים עם ליקויים COX, עקב היווצרות של המשקע הכחול במהלך הדגירה SDH (איור 3, מרכז מימין). בקרות ספציפיות לפעילויות קוקס SDH יכול להעשות גם (איור 5, מימין). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3266/3266fig1.jpg" /> באיור 1. מיטוכונדריאלי מכלולים הנשימה IV. שרשרת הנשימה במיטוכונדריה ממוקם בתוך הממברנה הפנימית כולל חמישה מתחמי. מטרת שרשרת הנשימה הוא להעביר אלקטרונים מורכבים אני אל IV ותוך כדי כך הוא יוצר מפל פרוטונים דרך הממברנה הפנימית בשימוש על ידי V מורכבות (ATPase) כדי לייצר ATP. Represe משושים האדוםיחידות משנה nt המקודדים על ידי mtDNA. משושים לבנים מייצגים יחידות משנה המקודדים על ידי הדנ&quot;א הגרעיני (שים לב קומפלקס II מקודד לחלוטין הגנום הגרעיני). לפיכך, מוטציות בגנום המיטוכונדריאלי יכול לגרום לבעיות של שרשרת הנשימה עקב מוטציות יחידות משנה של מתחמי שרשרת הנשימה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3266/3266fig2.jpg" /> באיור 2. תרשים זרימה של assay COX / SDH פעמיים תיוג histochemical. מנתחים את האיברים של עניין, במהירות להקפיא את רקמות על קרח יבש, ולאחסן אותם ב - 80 ° C. איסוף חלקים cryostat ולשמור על - 20 ° C עד השימוש. אפשר סעיפים לאוויר יבש בטמפרטורת החדר במשך שעה 1. הכן את המדיום הדגירה של histochemistry COX, ולהחיל אותו על שקופיות דגירה במשך 40 דקות ב 37 ° C. לשטוף את הסעיפים PBS 4 פעמים למשך 10 דקות כל אחד לשטוף. הכן את המדיום הדגירה של histochemistry SDH, ולהחיל אותו על SLIדה, ועל דגירה שוב 37 מעלות במשך 40 דקות שטפו את החלקים שוב PBS, מייבשים בסדרה אתנול, ולאחר מכן לטעון coverslip השקופיות. COX / SDH פעמיים שכותרתו קטעים מוכנים להציג תחת מיקרוסקופ שדה בהיר בתוך 1-2 שעות. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3266/3266fig3.jpg" /> באיור 3. דוגמאות מייצגות של COX / SDH פעמיים תיוג. חלקים מן המוח wild-type ו הזדקנות בטרם עת עכברים mtDNA המוטטורי תויגו ברצף לפעילויות COX ו - SDH. (סרגל קנה מידה:. 200 מיקרומטר) Normal פעילות COX (מסומנת בצבע חום כהה) הוצגה בהיפוקמפוס של wild-type עכברים (משמאל). ליקויים COX (מסומנת בצבע כחול) נחשפו בהיפוקמפוס מעכברים mtDNA המוטטורי (מרכז וימין). חלה ירידה נוספת בפעילות COX על ידי 46 שבועות של גיל בעכברים mtDNA המוטטורי, דבר המצביע על החרפה נרחב של בעיות בתפקוד שרשרת הנשימה. צפו מיטותפקוד לקוי chondrial ב mtDNA המוטטורי עכברים 12 נגרמת על ידי רמות גבוהות של mtDNA מוטציות נקודה, כמו גם רמות גבוהות של מחיקות ליניארי 5. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3266/3266fig4.jpg" /> איור 4. דוגמאות לא הולם COX / SDH פעמיים תיוג. חלקים מן המוח wild-type עכברים תויגו ברצף לפעילויות COX ו - SDH. (סרגל קנה מידה:. 200 מיקרומטר) פעמים הדגירה לקוי (10 ו - 25 דקות) להפגנה של פעילות COX הביא בתצהיר מופחת של המוצר התגובה חום DAB, לעומת זמן של 40 דקות הדגירה (שמאל מרכז). פעמים הדגירה מתקצר אפשרה היווצרות של המוצר formazan כחול במהלך סוף הדגירה SDH, מטעה המצביע על נוכחות של תאים עם ליקויים COX. Coverslipping את השקופיות במהלך הדגירה COX גם הביאה להיווצרות בתצהיר מדויק של מגיבים DABיון מוצר (מימין). <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3266/3266fig5.jpg" /> איור 5. Ndividual COX אני וסימון SDH ושליטה סגוליות. חלקים מן המוח wild-type עכברים תויגו בנפרד עבור פעילויות COX ו - SDH, שמסומן על ידי צבע חום כהה בצבע כחול, בהתאמה (שמאל מרכז). למרות פעילות COX ו SDH יכול להיות מתויג בנפרד, תיוג רציפים הוכיח את יתרון באיתור תאים עם תפקוד המיטוכונדריה. דוגמה של פקד סגוליות לפעילויות קוקס SDH במוח של עכבר wild-type הראו היעדר תיוג (מימין). (סרגל קנה מידה:. 200 מיקרומטר)

<ol>
	<li>Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mitochondrial+DNA+mutations+in+mammalian+aging.">Somatic mitochondrial DNA mutations in mammalian aging.</a> Annu. Rev. Biochem. 79, 683-706 (2010).</li><li>Cottrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mitochondrial+DNA+mutations+in+disease+and+aging.">Role of mitochondrial DNA mutations in disease and aging.</a> Ann. NY Acad. Sci. 908, 199-207 (2000).</li><li>Harman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biologic+clock:+the+mitochondria.">The biologic clock: the mitochondria.</a> J. Am. Geriatr. Soc. 20, 145-147 (1972).</li><li>Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+genetics+-+a+paradigm+for+aging+and+degenerative+diseases.">Mitochondrial genetics - a paradigm for aging and degenerative diseases.</a> Science. 256, 628-632 (1992).</li><li>Trifunovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+ageing+in+mice+expressing+defective+mitochondrial+DNA+polymerase.">Premature ageing in mice expressing defective mitochondrial DNA polymerase.</a> Nature. 429, 417-423 (2004).</li><li>Ameur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-deep+sequencing+of+mouse+mitochondrial+DNA:+mutational+patterns+and+their+origins.">Ultra-deep sequencing of mouse mitochondrial DNA: mutational patterns and their origins.</a> PLoS Genet. 7, e1002028-e1002028 (2011).</li><li>Safdar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endurance+exercise+rescues+progeroid+aging+and+induces+systemic+mitochondrial+rejuvenation+in+mtDNA+mutator+mice.">Endurance exercise rescues progeroid aging and induces systemic mitochondrial rejuvenation in mtDNA mutator mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4135-4140 (2011).</li><li>DiMauro, S., Bonilla, E., Zeviani, M., Nakagawa, M., DeVivo, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+myopathies.">Mitochondrial myopathies.</a> Ann. Neurol. 17, 521-538 (1985).</li><li>Old, S. L., Johnson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+microphotometric+assay+of+succinate+dehydrogenase+and+cytochrome+c+oxidase+activities+for+use+on+human+skeletal+muscle.">Methods of microphotometric assay of succinate dehydrogenase and cytochrome c oxidase activities for use on human skeletal muscle.</a> Histochem. J. 21, 545-555 (1989).</li><li>Chaturvedi, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+PGC-1alpha+function+in+muscle+in+Huntington's+disease.">Impaired PGC-1alpha function in muscle in Huntington's disease.</a> Hum. Mol. Genet. 18, 3048-3065 (2009).</li><li>Edgar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+point+mutations+with+major+effects+on+protein-coding+genes+are+the+driving+force+behind+premature+aging+in+mtDNA+mutator+mice.">Random point mutations with major effects on protein-coding genes are the driving force behind premature aging in mtDNA mutator mice.</a> Cell. Metab. 10, 131-138 (2009).</li><li>Ross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+brain+lactate+is+a+hallmark+of+aging+and+caused+by+a+shift+in+the+lactate+dehydrogenase+A/B+ratio.">High brain lactate is a hallmark of aging and caused by a shift in the lactate dehydrogenase A/B ratio.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20087-20092 (2010).</li><li>Crugnola, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+chain+dysfunction+in+muscle+from+patients+with+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Mitochondrial respiratory chain dysfunction in muscle from patients with amyotrophic lateral sclerosis.</a> Arch. Neurol. 67, 849-854 (2010).</li><li>Nonaka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+pathology+in+cytochrome+c+oxidase+deficiency.">Muscle pathology in cytochrome c oxidase deficiency.</a> Acta. Neuropathol. 77, 152-160 (1988).</li><li>DiMauro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+encephalomyopathies.">Mitochondrial encephalomyopathies.</a> Neurol. Clin. 8, 483-506 (1990).</li><li>Bonilla, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+morphological+approaches+to+the+study+of+mitochondrial+encephalomyopathies.">New morphological approaches to the study of mitochondrial encephalomyopathies.</a> Brain. Pathol. 2, 113-119 (1992).</li><li>Brierley, E. J., Johnson, M. A., Lightowlers, R. N., James, O. F., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mitochondrial+DNA+mutations+in+human+aging:+implications+for+the+central+nervous+system+and+muscle.">Role of mitochondrial DNA mutations in human aging: implications for the central nervous system and muscle.</a> Ann. Neurol. 43, 217-223 (1998).</li><li>Borthwick, G. M., Johnson, M. A., Ince, P. G., Shaw, P. J., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+enzyme+activity+in+amyotrophic+lateral+sclerosis:+implications+for+the+role+of+mitochondria+in+neuronal+cell+death.">Mitochondrial enzyme activity in amyotrophic lateral sclerosis: implications for the role of mitochondria in neuronal cell death.</a> Ann. Neurol. 46, 787-790 (1999).</li><li>Gellerich, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+rates+and+activities+of+respiratory+chain+complexes+correlate+linearly+with+heteroplasmy+of+deleted+mtDNA+without+threshold+and+independently+of+deletion+size.">Mitochondrial respiratory rates and activities of respiratory chain complexes correlate linearly with heteroplasmy of deleted mtDNA without threshold and independently of deletion size.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1556, 41-52 (2002).</li><li>Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transcription+factor+A+is+necessary+for+mtDNA+maintenance+and+embryogenesis+in+mice.">Mitochondrial transcription factor A is necessary for mtDNA maintenance and embryogenesis in mice.</a> Nat. Genet. 18, 231-236 (1998).</li><li>Ekstrand, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+parkinsonism+in+mice+with+respiratory-chain-deficient+dopamine+neurons.">Progressive parkinsonism in mice with respiratory-chain-deficient dopamine neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1325-1330 (2007).</li><li>Seligman, A. M., Karnovsky, M. J., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondroplet+ultrastructural+demonstration+of+cytochrome+oxidase+activity+with+a+polymerizing+osmiophilic+reagent,+diaminobenzidine+(DAB).">Nondroplet ultrastructural demonstration of cytochrome oxidase activity with a polymerizing osmiophilic reagent, diaminobenzidine (DAB).</a> J. Cell. Biol. 38, 1-14 (1968).</li><li>Dubowitz, V., Brooke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Biopsy:+A+Modern+Approach.">Muscle Biopsy: A Modern Approach.</a> , (1973).</li><li>Cottrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+c+oxidase+deficient+cells+accumulate+in+the+hippocampus+and+choroid+plexus+with+age.">Cytochrome c oxidase deficient cells accumulate in the hippocampus and choroid plexus with age.</a> Neurobiol. Aging. 22, 265-272 (2001).</li><li>Blanco, C. E., Sieck, G. C., Edgerton, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+histochemical+determination+of+succinic+dehydrogenase+activity+in+skeletal+muscle+fibres.">Quantitative histochemical determination of succinic dehydrogenase activity in skeletal muscle fibres.</a> Histochem. J. 20, 230-243 (1988).</li><li>Moraes, C. T., Ricci, E., Bonilla, E., DiMauro, S., Schon, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+tRNA(Leu(UUR))+mutation+in+mitochondrial+encephalomyopathy,+lactic+acidosis,+and+strokelike+episodes+(MELAS):+genetic,+biochemical,+and+morphological+correlations+in+skeletal+muscle.">The mitochondrial tRNA(Leu(UUR)) mutation in mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes (MELAS): genetic, biochemical, and morphological correlations in skeletal muscle.</a> Am. J. Hum. Genet. 50, 934-949 (1992).</li><li>Petruzzella, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+high+levels+of+mutant+mtDNAs+co-localize+with+cytochrome+c+oxidase-negative+ragged-red+fibers+in+patients+harboring+a+point+mutation+at+nt+3243.">Extremely high levels of mutant mtDNAs co-localize with cytochrome c oxidase-negative ragged-red fibers in patients harboring a point mutation at nt 3243.</a> Hum. Mol. Genet. 3, 449-454 (1994).</li><li>Tulinius, M. H., Holme, E., Kristiansson, B., Larsson, N. G., Oldfors, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+encephalomyopathies+in+childhood.+I.+Biochemical+and+morphologic+investigations.">Mitochondrial encephalomyopathies in childhood. I. Biochemical and morphologic investigations.</a> J. Pediatr. 119, 242-250 (1991).</li><li>Haas, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in-depth+evaluation+of+suspected+mitochondrial+disease.">The in-depth evaluation of suspected mitochondrial disease.</a> Mol. Genet. Metab. 94, 16-37 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה המשולבת COX / SDH histochemical מאפשרת ויזואליזציה של תאים בעלי תפקוד המיטוכונדריה. טכניקה זו, עם מחקרים מוקדמים שראשיתה 1968, נותר פופולרי, עם הרבה בהתחשב בכך את &quot;תקן הזהב&quot; לזיהוי מחלות מיטוכונדריאליות בחולים 14,19,26,27. עכשיו זה משמש לעתים קרובות כדי לחקור mtDNA מוטציה מונע הזדקנות הזדקנות בהפרעות הקשורות 12,13,18,20,21,24. COX / SDH פעמיים שיטת תיוג משמש לעתים קרובות במקביל עם טכניקות אחרות כדי לזהות מוטציות mtDNA ספציפיים להמשיך לחקור את האנזימים הנשימה במיטוכונדריה, כגון מדידות oximetric וניתוח אנזים spectrophotometric 28,29. למרות השימוש שלה ארוכת שנים, פרטים חשובים, שולטת סגוליות פשוטה, ומקדם כדי לשפר את השיטה טרם הוצגו. בכל הנוגע לטיפול של הרקמה, חשוב להשתמש טרי קפוא עם רקמה זו technique, כי למרות COX ישרדו את קיבוע בפורמלין, SDH לא. למרות זאת הוא הגבלה של הטכניקה, אין עיכוב שלאחר המוות נמצאה להפריע שיטה זו 24, אבל הוא הציע להסיר במהירות את האיברים של עניין לשמר את המורפולוגיה. עם זאת, רציפה להקפיא להפשיר מחזורים של הרקמות וחתכים יש להימנע. דגימות רקמה יכול להיות קפוא על קרח יבש, אולם הרקמות מסוימים עשויים לדרוש הקפאת isopentane פרופאן או מקורר עם חנקן נוזלי כדי להשיג מורפולוגיה אופטימלית, כדי למנוע artifacts ההקפאה. עובי מתאים של קטעים cryostat, בהתאם לסוג רקמות, צריך גם להיות נחושה. מומלץ לגבות בין 8-14 מיקרומטר, סעיפים, רזה מספיק בשביל חדירה של פתרונות אבל עבה מספיק כדי לשמר את תכונות אנטומיות לאחר התייבשות. הטמפרטורה cryostat הציע של -21 ° C עשוי צריך להיות מותאם ± 1-2 ° C. אם הדגימה הוא קר מדי, בחלק עשוי תלתל, אםהוא חם מדי, בחלק עשוי לדבוק הסכין. לגבי הטיפול של השקופיות, השימוש בעט שומן, אשר לעיתים קרובות מועיל בשמירה על המדיום הדגירה בשקופית, יש להימנע. במקום זאת, השתמש 150-200 μl של המדיום הדגירה לכל שקופית, תלוי במספר סעיפים. השימוש coverslip במהלך דגירה יש להימנע גם עד לשקופית מוכן להיות מותקן, כי חמצן מולקולרי חייבים להיות נוכחים במהלך השלב תיוג COX (איור 4). לבסוף, הוא הציע להשתמש פתרון זמין מסחרית DAB (למשל סיגמא), חלופה בטוחה יותר להכנת פתרון DAB מ מוצק גבישי. פתרון DAB יכול להיות גם מן הלוחות זמין, אבל לא עקבי תוצאות COX תיוג נמצאו כאשר פתרון זה לוח מבוסס DAB היה בשימוש. כדי להשיג תוצאות עקביות ואמינות מבית assay זה ביוכימיים, הנקודות הבאות מומלצות. השתמש טרי PBS מוכן אתנול experimen כלt. הכינו פתרונות המניות של ציטוכרום C, NBT, תסמונת קדם וסתית (מגן מפני אור), succinate נתרן, אזיד הנתרן, ואת malonate ב 0.1 M PBS pH = 7.0, להתאים את pH עד 7.0 עם 0.1 או 0.1 M HCl M NaOH. Aliquot ולאחסן את פתרונות המניה ב -20 ° C, במהירות להפשיר את הפתרונות רק לפני השימוש. כדי לקבל תוצאות עקביות בניסוי אחד, מומלץ לעבד עד עשר שקופיות הניסוי כדי למזער את העיכובים זמן. יש כמה ההשתנות בין הניסויים, ולכן קטעים מתוך כל נושא / בעלי חיים יש לחזור לפחות שלוש עד ארבע פעמים, בקרות מתאימות יש להשתמש בכל ניסוי. לבסוף, כמו פעמים הדגירה לעשות להשפיע על כמות COX-תיוג (איור 4, לוחות שמאל באמצע) ו-SDH תיוג, לא מומלץ לשנות את הזמנים הדגירה על ידי למעלה מ -5% (2 דקות). בשילוב COX / SDH פרוטוקול המוצג כאן מתבססת על עקרונות בעבר תיאר 9,22,23,25. כמוtechnqiues רבים, וריאציות של פרוטוקול זה, כגון למעט תוספת של PMS ו אזיד הנתרן, באמצעות mountant מימית, ו משתנה הדגירה ולשטוף פעמים, קיימים ועשויים לעבוד באותה מידה גם.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> קרח יבש </td><td> AGA גז AB </td><td> לחסום טופס </td><td></td></tr><tr><td> Isopentane (2-methylbutane) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 277258 CAS: 78-78-4 </td><td></td></tr><tr><td> Cyrostat פתרון הטבעה </td><td> סאקורה Finetek </td><td> רקמות Tek 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Cryostat </td><td> Microm </td><td> Microm דגם HM -500 </td><td></td></tr><tr><td> שקופיות </td><td> Thermo Scientific </td><td> פרוסט סופר פלוס Menzel גלזר J1800AMWZ </td><td></td></tr><tr><td> כיסוי משקפיים בורוסיליקט זכוכית </td><td> VWR הבינלאומי </td><td> 16004-098 </td><td> 24 x 50 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> מסנן נייר </td><td> Munktell סינון AB </td><td> איכות: 1350 מאמרמספר: 242 001 </td><td> 430 x 430 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> סיגמא מערכת התשתית נוזלי, D7304 </td><td></td></tr><tr><td> ציטוכרום C (סוג III, מהלב סוסים) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C2506 CAS: 9007-43-6 </td><td></td></tr><tr><td> שור Catalase (מהכבד) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C9322 CAS: 9001-05-2 </td><td></td></tr><tr><td> Nitroblue tetrazolium (NBT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N6876 CAS: 298-83-9 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן succinate </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S2378 CAS: 6106-21-4 </td><td></td></tr><tr><td> Phenazine methosulfate (PMS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9625 CAS: 299-11-6 </td><td> PMS הוא רגיש לאור. מגן מפני אור. </td></tr><tr><td> אזיד הנתרן </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S8032 CAS: 26628-22-8 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> קסילן </td><td> VWR הבינלאומי </td><td> EM-XX0060-4 </td><td></td></tr><tr><td> Entellan </td><td> VWR הבינלאומי </td><td> 100503-870 </td><td></td></tr><tr><td> Malonate (חומצה Malonic) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1296 CAS: 141-82-2 </td><td></td></tr></table>

visualization of mitochondrial respiratory function using cytochrome c oxidase / succinate dehydrogenase (cox/sdh) double-labeling histochemistry

דנ&quot;א מיטוכונדריאלי (mtDNA) ליקויים הם גורם חשוב של המחלה וייתכן ביסוד הזדקנות מהזדקנות 1,2 שינויים. התיאוריה המיטוכונדריה של הזדקנות מציע תפקיד מוטציות mtDNA, אשר יכול לשנות הומאוסטזיס bioenergetics ותפקוד התא, בתהליך ההזדקנות 3. שפע של עדויות כבר מלוקט תמיכה 1,4 זה בתיאוריה, להיות דוגמה המוטטורי mtDNA עכבר 5, אך את התפקיד המדויק של הנזק mtDNA בהזדקנות הוא לא הבין לגמרי 6,7. התבוננות את הפעילות של אנזימים הנשימה היא גישה פשוטה לחקירת תפקוד המיטוכונדריה. קומפלקס IV, או ציטוכרום אוקסידאז ג (COX), חיוניים לתפקוד המיטוכונדריה. יחידות משנה קטליטי של COX מקודדים על ידי mtDNA חיוניים להרכבה של המתחם (איור 1). לפיכך, סינתזה לתפקוד תקין והם מבוססים במידה רבה על mtDNA שלמות 2.למרות מתחמי נשימתיות אחרות יכול להיחקר, מתחמי IV ו-II הם נוחים ביותר לבחינה histochemical 8,9. קומפלקס II, או דהידרוגנז succinate (SDH), מקודד כולו על ידי ה-DNA גרעיני (איור 1), ואת הפעילות שלה הוא בדרך כלל לא מושפעים לקויי mtDNA, למרות עלייה עשויים להצביע biogenesis המיטוכונדריה 10-12. MtDNA לקויי שנצפתה מחלות מיטוכונדריאליות, ההזדקנות, מחלות הקשורות לגיל מוביל לעתים קרובות נוכחות של תאים עם פעילות COX נמוך או נעדר 2,12-14. למרות פעילות COX ו SDH יכול להיחקר בנפרד, שיטת רציפים פעמיים תיוג 15,16 הוכיח את יתרון באיתור תאים עם תפקוד המיטוכונדריה 12,17-21. רבים מן החוקות אופטימלי של assay נקבעו, כגון ריכוז המצע, acceptors האלקטרון / תורמים, נושאות אלקטרון ביניים, ההשפעה של ה-pH, ו-t התגובהIME 9,22,23. 3,3 &#39;-diaminobenzidine (DAB) הוא תורם אלקטרון יעיל ואמין 22. בתאים עם תפקוד COX, המוצר פולימר חום indamine יהיה להתמקם cristae המיטוכונדריה ו להרוות תאים 22. תאים אלה עם COX מתפקדת ולכן לא יהיה רווי ידי DAB המוצר, המאפשר הדמיה של פעילות SDH על ידי הפחתה של nitroblue tetrazolium (NBT), acceptor האלקטרון, למוצר formazan כחול סוף 9,24. ציטוכרום C ו succinate מצעים נתרן מתווספים לנרמל את רמות אנדוגני מלאה בין חולה / מוטציה רקמות 9. Catalase נוסף כאמצעי זהירות, כדי למנוע זיהום אפשרי התגובות מפעילות peroxidase 9,22. Methosulfate Phenazine (PMS), נושאת אלקטרון ביניים, הוא משמש יחד עם אזיד הנתרן, מעכב שרשרת הנשימה, כדי להגביר את היווצרותם של תוצרי התגובה הסופית 9,25. למרות זאת להודיעation, כמה פרטים קריטיים המשפיעים על התוצאה של assay זה פשוט נאה, בנוסף שולטת הספציפיות התקדמות הטכניקה, טרם הציג.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry at JoVE.com

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

ציטוכרום c אוקסידאז / נתרן דהידרוגנז (COX / SDH) פעמיים תיוג השיטה מאפשרת להדמיה ישירה של המיטוכונדריה אנזים ליקויים בדרכי הנשימה טרי קפוא סעיפים רקמות. זוהי טכניקה פשוטה histochemical שימושי חוקרת מחלות מיטוכונדריאליות, הזדקנות, הזדקנות בהפרעות הקשורות.

ויזואליזציה של תפקודי נשימה מיטוכונדריאלי באמצעות ציטוכרום C מונואמין / succinate dehydrogenase (COX / SDH) תיוג פעמיים Histochemistry

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

visualization-mitochondrial-respiratory-function-using-cytochrome-c

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

36.6K Views.  Karolinska Institutet. ציטוכרום c אוקסידאז / נתרן דהידרוגנז (COX / SDH) פעמיים תיוג השיטה מאפשרת להדמיה ישירה של המיטוכונדריה אנזים ליקויים בדרכי הנשימה טרי קפוא סעיפים רקמות. זוהי טכניקה פשוטה histochemical שימושי חוקרת מחלות מיטוכונדריאליות, הזדקנות, הזדקנות בהפרעות הקשורות.

Video: Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

הפעלה של אפופטוזיס על ידי Microinjection cytoplasmic של ציטוכרום ג</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

לשעבר vivo הכנה מבודדת Microvessel השלד לחקירות תגובתיות כלי דם

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC regulates mitochondrial function and cellular energy status. Numerous reports demonstrated that the activation of PKC-a and PKC-&epsilon; improves mitochondrial function in the ischemic heart and mediates cardioprotection. In contrast, we have demonstrated that PKC-&alpha; and PKC-&epsilon; are involved in nephrotoxicant-induced mitochondrial dysfunction and cell death in kidney cells. Therefore, the goal of this study was to develop an in vitro model of renal cells maintaining active mitochondrial functions in which PKC isozymes could be selectively activated or inhibited to determine their role in regulation of oxidative phosphorylation and cell survival. Primary cultures of renal proximal tubular cells (RPTC) were cultured in improved conditions resulting in mitochondrial respiration and activity of mitochondrial enzymes similar to those in RPTC in vivo. Because traditional transfection techniques (Lipofectamine, electroporation) are inefficient in primary cultures and have adverse effects on mitochondrial function, PKC-&epsilon; mutant cDNAs were delivered to RPTC through adenoviral vectors. This approach results in transfection of over 90% cultured RPTC.
Here, we present methods for assessing the role of PKC-&epsilon; in: 1. regulation of mitochondrial morphology and functions associated with ATP synthesis, and 2. survival of RPTC in primary culture. PKC-&epsilon; is activated by overexpressing the constitutively active PKC-&epsilon; mutant. PKC-&epsilon; is inhibited by overexpressing the inactive mutant of PKC-&epsilon;. Mitochondrial function is assessed by examining respiration, integrity of the respiratory chain, activities of respiratory complexes and F0F1-ATPase, ATP production rate, and ATP content. Respiration is assessed in digitonin-permeabilized RPTC as state 3 (maximum respiration in the presence of excess substrates and ADP) and uncoupled respirations. Integrity of the respiratory chain is assessed by measuring activities of all four complexes of the respiratory chain in isolated mitochondria. Capacity of oxidative phosphorylation is evaluated by measuring the mitochondrial membrane potential, ATP production rate, and activity of F0F1-ATPase. Energy status of RPTC is assessed by determining the intracellular ATP content. Mitochondrial morphology in live cells is visualized using MitoTracker Red 580, a fluorescent dye that specifically accumulates in mitochondria, and live monolayers are examined under a fluorescent microscope. RPTC viability is assessed using annexin V/propidium iodide staining followed by flow cytometry to determine apoptosis and oncosis.
These methods allow for a selective activation/inhibition of individual PKC isozymes to assess their role in cellular functions in a variety of physiological and pathological conditions that can be reproduced in in vitro.

The effects of activation of protein kinase C (PKC) isozymes on mitochondrial functions associated with respiration and oxidative phosphorylation and on cell viability are described. The approach adapts adenoviral technique to selectively overexpress PKC isozymes in primary cell culture and a variety of assays to determine mitochondrial functions and energy status of the cell.

הערכה של פונקציות מיטוכונדריאלי וכדאיויות תא בתאי כלית overexpressing חלבון קינאז C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

ויזואליזציה של Craniofacial פיתוח בsox10: קאאד מהונדס דג הזברה הקו באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופיה confocal

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well when a small number of genes are targeted for knockdown, large scale feeding screens show variable knockdown efficiencies, which limits their utility. We have deconstructed previously published RNAi knockdown protocols and found that the primary source of the reduced knockdown can be attributed to the loss of dsRNA-encoding plasmids from the bacteria fed to the animals. Based on these observations, we have developed a dsRNA feeding protocol that greatly reduces or eliminates plasmid loss to achieve efficient, high throughput knockdown. We demonstrate that this protocol will produce robust, reproducible knock down of C. elegans genes in multiple tissue types, including neurons, and will permit efficient knockdown in large scale screens. This protocol uses a commercially available dsRNA feeding library and describes all steps needed to duplicate the library and perform dsRNA screens. The protocol does not require the use of any sophisticated equipment, and can therefore be performed by any C. elegans lab.

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

While dsRNA feeding in C. elegans is a powerful tool to assess gene function, current protocols for large scale feeding screens result in variable knockdown efficiencies. We describe an improved protocol for performing large scale RNAi feeding screens that results in highly efficacious and reproducible knockdown of gene expression.

מציאה גן בקנה מידה גדולה ב<em&gt; ג elegans</em&gt; שימוש בספריות האכלת dsRNA ליצור פנוטיפים הפסד של הפונקציה חזקות

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

Measuring Respiratory Function in Mice Using Unrestrained Whole-body Plethysmography

Respiratory dysfunction is one of the leading causes of morbidity and mortality in the world and the rates of mortality continue to rise. Quantitative assessment of lung function in rodent models is an important tool in the development of future therapies. Commonly used techniques for assessing respiratory function including invasive plethysmography and forced oscillation. While these techniques provide valuable information, data collection can be fraught with artefacts and experimental variability due to the need for anesthesia and/or invasive instrumentation of the animal. In contrast, unrestrained whole-body plethysmography (UWBP) offers a precise, non-invasive, quantitative way by which to analyze respiratory parameters. This technique avoids the use of anesthesia and restraints, which is common to traditional plethysmography techniques. This video will demonstrate the UWBP procedure including the equipment set up, calibration and lung function recording. It will explain how to analyze the collected data, as well as identify experimental outliers and artefacts that results from animal movement. The respiratory parameters obtained using this technique include tidal volume, minute volume, inspiratory duty cycle, inspiratory flow rate and the ratio of inspiration time to expiration time. UWBP does not rely on specialized skills and is inexpensive to perform. A key feature of UWBP, and most appealing to potential users, is the ability to perform repeated measures of lung function on the same animal.

The assessment of respiratory physiology has traditionally relied upon techniques, which require restraint or sedation of the animal. Unrestrained whole-body plethysmography, however, provides precise, non-invasive, quantitative analysis of respiratory physiology in animal models. In addition, the technique allows repeated respiratory assessment of mice allowing for longitudinal studies.

מדידת תפקודי נשימה בעכברים באמצעות Plethysmography של כל הגוף ללא ריסון

Respiratory dysfunction is one of the leading causes of morbidity and mortality in the world and the rates of mortality continue to rise. Quantitative ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.

Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.

גישות ניסוייות לחקר מיטוכונדריאלי לוקליזציה ותפקוד של מחזור התא הגרעיני קינאז, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

ברזולוציה גבוהה Respirometry להעריך תפקוד מיטוכונדריאלי permeabilized ו תאים שלמים

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

לימוד מבנה ותפקוד מיטוכונדריאלי<em&gt; תסיסנית</em&gt; שחלות

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...