הממומן על ידי סיגמא אולדריץ

1. Mycoplasma איתור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות supernatants סלולרי ניתן לבדוק באופן ישיר או המדגם יכול מוכן לשימוש במועד מאוחר יותר. כדי להכין לשימוש מאוחר יותר במקום 100 μl של supernatant בתוך שפופרת הגברה דגירה סטרילית על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. ברגע זה הוא להשלים את המדגם ניתן לאחסן ב 2-8 מעלות צלזיוס עד שבוע. רק לפני הפעלת צנטריפוגות מדגם בקצרה (5 שניות) על גלולה כל פסולת הסלולר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את דגימות ה-PCR, לקבוע את הנפח הכולל של המאגר Jumpstart תקי DNA פולימראז / התייבשות הדרושים התגובות. אנחנו נהיה הכנת 5 תגובות מוחלטת. חמש תגובות ידרוש 2.5μl של תקי ו 114.5μl של חיץ להחזרת נוזלים. זה יכיל לפחות יחידה אחת של תקי לכל התגובה 22.5μl של חיץ התייבשות לכל תגובה מדגם שליטה שלילי בתוספת 24.5μl של חיץ התייבשות לשליטה חיובית. 1 יחידה של פולימראז ה-DNA לכל תגובה יש להוסיף נפח מתאים של חיץ להחזרת נוזלים. זה ישתנה עם תקי בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את נפח מחושב של פולימראז הדנ&quot;א תקי לתוך צינור microcentrifuge נקי ופעל עם נפח המחושב של חיץ להחזרת נוזלים. המאגר פולימראז / התייבשות DNA צריכה להיות מעורבת על ידי מצליף בעדינות את הצינורית. תערובת זו לא צריכה להיות vortexed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את הביקורת השלילית דגימות להשתמש צינורות התגובה שקוף המסופק בערכה. צינורות התגובה המסופק בערכה כבר מכילים את nuclueotides, primers ו-DNA הבקרה הפנימית. 23 μl של Jumpstart לערבב תקי פולימראז / Rehydration למאגר הדנ&quot;א, מוכן כמו בשלבים הקודמים, צריך להיות ממוקם בכל אחד לשלוט שלילי דוגמיות. הוסף 2 μl מים DNA חופשיים לשלוט שלילי ולהוסיף 2 μl של המדגם לכל אחד הצינורות מדגם התווית. מערבבים את תכולת מצליף על ידי צינורות. תוכן לא צריכה להיות vortexed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את השליטה חיובי להשתמש צינורות התגובה ורוד המסופק בערכה. צינורות התגובה המסופק בערכה כבר מכילים את nuclueotides, primers ו-DNA הבקרה הפנימית. הוסף 25 μl של Jumpstart לערבב תקי פולימראז / Rehydration DNA חיץ, מוכן כמו בשלבים הקודמים, את צינורות התגובה התווית. מערבבים את תכולת מצליף על ידי צינורות. תוכן לא צריכה להיות vortexed. דגירה שליטה שלילית, שליטה חיובית דוגמיות בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור PCR כדי לקחת את המקום דגימות את הצורך להציב Cycler תרמית. בעת שימוש JumpStart תקי צעד הפעלה אינה נדרשת. מניחים את צינורות התגובה Cycler התרמית. מחזורי צריך להיות מוגדר כדלקמן: 94 ° C למשך 30 שניות, 55 ° C למשך 30 שניות ו 72 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות. מחזורים אלה ינוהלו 40 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מחזורי PCR השלימו דוגמאות צריך להיות מקורר 4-8 מעלות צלזיוס על ידי הוצאתם Cycler תרמי הכנסתם קרח. כאשר הדגימות התקררו הם צריכים להיות הועמסו על הג&#39;ל agarose עבור אלקטרופורזה. ג&#39;ל טוען וצבע אינם נחוצים כפי שהם כבר נוכח צינורות התגובה. ישירות לטעון 8 μl לכל PCR למסלול נפרד. עצור את אלקטרופורזה לאחר ההגירה של 2.5-3.0 ס&quot;מ. </li></ol> 2. נציג תוצאות השליטה שלילי צריך להראות להקה של כ 481 נ&quot;ב. ניתן לראות זאת בעמודה בקרה שלילית על ג&#39;ל אלקטרופורזה, אשר מוצג בתחילת הסרטון. היעדרם של הלהקה בקרה שלילית על 481 נ&quot;ב הוא אינדיקטור טוב כי פעילות של פולימראז לא היה בשימוש sufficienttaq לא היה רגיש מספיק. דגימות חיוביות Mycoplasma יציג להקות בטווח של 270 ± 8 נ&quot;ב. הלהקה יהיה כבד על דגימות מזוהמות מאוד חלש עבור דגימות מזוהמות קלות. וריאציות בעוצמת ניתן לראות את העמודות מדגם חיובית על ג&#39;ל אלקטרופורזה, אשר מוצג בתחילת הסרטון. כל הדגימות מכילות פקד שלילי פנימי על מנת להוכיח כי PCR התרחש כצפוי. זה נורמלי לראות את היעדר הבקרה הפנימית על דגימות מזוהמות מאוד. אם אין להקה בטווח חיובי או להקה בטווח שלילית על מדגם שלך זה הוא אינדיקטור טוב כי דגימות שלך עכבות. אם המדגם הוא עכבות מעכבי PCR ניתן להסיר על ידי ביצוע מיצוי DNA. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3057/3057fig1.jpg" /> . איור 1 להקות Amplicon רלוונטיים: תוצאות של גילוי mycoplasma על ידי PCR מוצגים. ליין 2 הוא שליטה שלילי, שאמורה להראות להקה של כ 481 נ&quot;ב. היעדרם של הלהקה בקרה שלילית על 481 נ&quot;ב הוא אינדיקטור טוב כי השתמשו תקי לא היה רגיש מספיק. Mycoplasma חיובי דגימות יציג להקות בטווח של 270 + 8 נ&quot;ב כפי שמוצג נתיבים 3-6. הלהקה יהיה heaVY עבור דגימות מזוהמות ביותר (נתיב 6), קלוש עבור דגימות מזוהמות קלות (מסלול 4). כל הדגימות מכילות פקד שלילי פנימי (481 נ&quot;ב) על מנת להוכיח כי PCR התרחש כצפוי. זה נורמלי לראות את היעדר הבקרה הפנימית על דגימות מזוהמות מאוד.

<ol>
	<li>Wirth, M., Hauser, H., Drexler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+Sensitivity+of+Polymerase+Chain+Reaction+(PCR)+in+Comparison+with+Other+Methods+for+the+Detection+of+Mycoplasma+Contamination+in+Cell+Lines.">Specificity and Sensitivity of Polymerase Chain Reaction (PCR) in Comparison with Other Methods for the Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Lines.</a> Journal of Immunological Methods. 164, 91-100 (1993).</li><li>Kong, H., Volokhov, D. V., George, J., Ikonomi, P., Chandler, D., Anderson, C., Chizhikov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+Cell+Culture+Enrichment+for+Improving+the+Sensitivity+of+Mycoplasma+Detection+Methods+Based+on+Nucleic+Acid+Amplification+Technology+(NAT).">Amplification of Cell Culture Enrichment for Improving the Sensitivity of Mycoplasma Detection Methods Based on Nucleic Acid Amplification Technology (NAT).</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 223-232 (2007).</li><li>Volokhov, D. V., Graham, L. J., Borson, K. A., Chizhikov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+Testing+of+Cell+Substrates+and+Biologics:+Review+of+Alternative+Non-Microbiological+Techniques.">Mycoplasma Testing of Cell Substrates and Biologics: Review of Alternative Non-Microbiological Techniques.</a> Molecular and Cellular Probes. , (2011).</li></ol>

הכותבים הם עובדי סיגמא אולדריץ שיצרה ריאגנטים וכלים המשמשים במאמר זה.

בגלל הרגישות הקיצונית של הערכה, כאשר היא מבוצעת כהלכה הערכה צריכה להניב תוצאות מדויקות המציין אם המדגם שלך יש זיהום mycoplasma. הערכה כבר מותאם לשימוש עם ה-DNA פולימראז תקי JumpStart. Taqs אחרים ניתן להשתמש בעת הכנת הדגימות אבל הלהקה הבקרה הפנימית על 481 נ&quot;ב צריכים להיות נוכחים כדי לציין רגישות ראויה של תקי חלופיים. זה אפשרי עבור הלהקות חיובי להציג צפיפויות שונות בהתאם לרמת הזיהום. אפשר לראות את העדרו של הלהקה הבקרה הפנימית על דגימות מזוהמות בכבדות. באמצעות טכניקה נכונה זהירות בעת הכנת הדגימות על מנת למנוע זיהום הם קריטיים עבור הנכונה. זיהוי בעת שימוש Mycoplasma Lookout ערכת ה-PCR לזיהוי.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> מצפור Mycoplasma PCR ערכת זיהוי </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> MP0035 </td><td> </td></tr><tr><td> JumpStart תקי פולימראז ה-DNA </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> D9307 </td><td> </td></tr><tr><td> דם GenElute הגנום דנ&quot;א ערכת </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> MP0030 </td><td> </td></tr><tr><td> הגברה צינורות Nunc </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> T0447 </td><td> </td></tr></tbody></table>

optimized pcr-based detection of mycoplasma

תחזוקה של זיהום ללא שורות תאים חיוני מחקר מבוססי תאים. בין החששות הגדולים ביותר הם זיהום זיהום mycoplasma. למרות mycoplasma בדרך כלל לא להרוג תאים נגועים, הם קשים לאיתור יכול לגרום למגוון של השפעות על תאים בתרבית, כולל חילוף החומרים משתנה, האט התפשטות סטיות כרומוזומליות. בקיצור, זיהום mycoplasma פשרות את הערך של שורות תאים אלה במתן נתונים מדויקים על המחקר במדעי החיים. מקורות זיהום mycoplasma במעבדה הם מאוד מאתגר לשלוט לחלוטין. כמו מינים מסוימים mycoplasma נמצאים על העור האנושי, הם יכולים להיות הציג באמצעות טכניקה aseptic עניים. בנוסף, הם יכולים לבוא תוספי מזון מזוהם כמו בסרום שור עוברית, והכי חשוב משאר תרביות תאים נגועים. לאחר mycoplasma מזהם תרבות, היא יכולה להתפשט במהירות לזהם באזורים אחרים במעבדה. ההקפדה על נהלי מעבדה טובים כמו טכניקה aseptic טובים מפתח, בדיקה שגרתית עבור mycoplasma מומלץ מאוד לשליטה מוצלחת של זיהום mycoplasma. PCR מבוססי זיהוי של mycoplasma הפכה שיטה פופולרית מאוד לצורך תחזוקה שגרתית בתא קו. PCR מבוססות שיטות הזיהוי רגישים מאוד והוא יכול לספק תוצאות מהירות, המאפשר לחוקרים כדי להגיב במהירות כדי לבודד ולמנוע זיהום לאחר שהוא זוהה לעומת הזמן הנדרש באמצעות טכניקות מיקרוביולוגיות. Mycoplasma Lookout ערכת ה-PCR לזיהוי רגיש ביותר, עם הגבלה זיהוי של רק 2 הגנום לכל μl. ניצול של פולימראז מאוד ספציפיות תקי DNA JumpStart ועיצוב פריימר קניינית, חיוביות שגויות מופחתים מאוד. הפורמט נוח 8-צינור, רצועות מראש מצופה dNTPs, הקשורים primers עוזר להגדיל את התפוקה כדי לענות על הצרכים של הלקוחות עם אוספים גדולים של שורות תאים. לאור רגישות קיצונית של הערכה, בזהירות רבה יש לנקוט על מנת למנוע זיהום מכוונת של דגימות ריאגנטים. פרוטוקול צעד אחר צעד אנחנו מדגימים מדגיש את אמצעי הזהירות והנהלים הנדרשים לאיתור mycoplasma אמין. אנחנו גם מראים ולדון בתוצאות טיפוסי הפרשנות שלהם. המטרה שלנו היא להבטיח את הצלחת החוקרים באמצעות Mycoplasma Lookout ערכת ה-PCR לזיהוי.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma at JoVE.com

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

Mycoplasma Lookout ערכת ה-PCR לזיהוי מנצל את שרשרת התגובה פולימראז (PCR), אשר הוקמה כשיטת הבחירה של רגישות גבוהה לגילוי של זיהום Mycoplasma, Acholeplasma ו Ureaplasma בתרביות תאים והתרבות תאים אחרים הנגזרים ביולוגיות.

אופטימליים PCR מבוססי זיהוי של Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

optimized-pcr-based-detection-of-mycoplasma

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

53.6K Views.  Sigma-Aldrich. Mycoplasma Lookout ערכת ה-PCR לזיהוי מנצל את שרשרת התגובה פולימראז (PCR), אשר הוקמה כשיטת הבחירה של רגישות גבוהה לגילוי של זיהום Mycoplasma, Acholeplasma ו Ureaplasma בתרביות תאים והתרבות תאים אחרים הנגזרים ביולוגיות.

Video: Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

אופטימליים הפיברין ג&#39;ל ביד Assay לחקר אנגיוגנזה

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

זיהוי של חלבון Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been identified and are separated into six groups based on their structure and substrate specificity (collagenases, gelatinases, membrane type [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, and others). MMPs play a critical role in cell invasion, cartilage degradation, tissue remodeling, wound healing, and embryogenesis. They therefore participate in both normal processes and in the pathogenesis of many diseases, such as rheumatoid arthritis, cancer, or chronic obstructive pulmonary disease1-6. Here, we will focus on MMP-2 (gelatinase A, type IV collagenase), a widely expressed MMP. We will demonstrate how to detect MMP-2 in cell culture supernatants by zymography, a commonly used, simple, and yet very sensitive technique first described in 1980 by C. Heussen and E.B. Dowdle7-10. This technique is semi-quantitative, it can therefore be used to determine MMP levels in test samples when known concentrations of recombinant MMP are loaded on the same gel11.
Solutions containing MMPs (e.g. cell culture supernatants, urine, or serum) are loaded onto a polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulfate (SDS; to linearize the proteins) and gelatin (substrate for MMP-2). The sample buffer is designed to increase sample viscosity (to facilitate gel loading), provide a tracking dye (bromophenol blue; to monitor sample migration), provide denaturing molecules (to linearize proteins), and control the pH of the sample. Proteins are then allowed to migrate under an electric current in a running buffer designed to provide a constant migration rate. The distance of migration is inversely correlated with the molecular weight of the protein (small proteins move faster through the gel than large proteins do and therefore migrate further down the gel). After migration, the gel is placed in a renaturing buffer to allow proteins to regain their tertiary structure, necessary for enzymatic activity. The gel is then placed in a developing buffer designed to allow the protease to digest its substrate. The developing buffer also contains p-aminophenylmercuric acetate (APMA) to activate the non-proteolytic pro-MMPs into active MMPs. The next step consists of staining the substrate (gelatin in our example). After washing the excess dye off the gel, areas of protease digestion appear as clear bands. The clearer the band, the more concentrated the protease it contains. Band staining intensity can then be determined by densitometry, using a software such as ImageJ, allowing for sample comparison.

This protocol describes an activity-based assay for detecting matrix metalloproteinases in culture supernatants or body fluids.

גילוי Metalloproteinases מטריקס פונקציונלית על ידי Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine parasitoids known to infect the host during the egg stage1. Second, it has a wide range of potential fruit fly hosts. Perhaps due to its life history, F. arisanus has been a successfully used for biological control of fruit flies in multiple tropical regions2-4. One impediment to the wide use of F. arisanus for fruit fly control is that it is difficult to establish a stable laboratory colony5-9. Despite this difficulty, in the 1990s USDA researchers developed a reliable method to maintain laboratory populations of F. arisanus10-12. There is significant interest in F. arisanus biology13,14, especially regarding its ability to colonize a wide variety of Tephritid hosts14-17; interest is especially driven by the alarming spread of Bactrocera fruit fly pests to new continents in the last decade18. Further research on F. arisanus and additional deployments of this species as a biological control agent will benefit from optimizations and improvements of rearing methods. In this protocol and associated video article we describe an optimized method for rearing F. arisanus based on a previously described approach12. The method we describe here allows rearing of F. arisanus in a small scale without the use of fruit, using materials available in tropical regions around the world and with relatively low manual labor requirements.

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

Fopius arisanus is an egg-larval parasitoid of Tephritid fruit flies that is successfully used in biological control of these important tropical pests. We describe here an optimized protocol for rearing F. arisanus on a small scale using readily available materials.

פרוטוקול אופטימליים לגידול Fopius arisanus, טפיל של פירות Tephritid זבובים

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent modifications on the amino-terminal tails of histones H3 and H4 play essential roles1-2. H3 and H4 histone modifications include methylation of lysine and arginine, acetylation of lysine, and phosphorylation of serine residues1-2. These modifications are associated either with gene activation, repression, or a primed state of gene that supports more rapid and robust activation of expression after perception of appropriate signals (microbe-associated molecular patterns, light, hormones, etc.)3-7. 
Here, we present a method for the reliable and sensitive detection of specific chromatin modifications on selected plant genes. The technique is based on the crosslinking of (modified) histones and DNA with formaldehyde8,9, extraction and sonication of chromatin, chromatin immunoprecipitation (ChIP) with modification-specific antibodies9,10, de-crosslinking of histone-DNA complexes, and gene-specific real-time quantitative PCR. The approach has proven useful for detecting specific histone modifications associated with C4 photosynthesis in maize5,11 and systemic immunity in Arabidopsis3.

A reliable and useful approach to detect histone modifications on specific plant genes is described. The approach combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) and real-time quantitative PCR. It allows detection of histone modifications on specific genes with a role in diverse physiological processes.

זיהוי של שינויים היסטון בעלים הצמח

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

PCR מבוסס genotyping שיטה להבחין בין זנים wild-type ו נוי של Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

פרוטוקול אופטימלי עבור רשתית Wholemount הכנה להדמיה ואימונוהיסטוכימיה

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

איתור של טפסים השתנו ציטוזין שימוש אימונוהיסטוכימיה רגיש

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

Implantation of Electrospun Vascular Grafts with Optimized Structure in a Rat Model

Here, we present a protocol to fabricate macroporous PCL vascular graft and describe an evaluation protocol by using a rat model of abdominal aorta replacement. The electrospun vascular grafts often possess relatively small pores, which limit cell infiltration into the grafts and hinder the regeneration and remodeling of the neo-arteries. In this study, PCL vascular grafts with thicker fibers (5 - 6 &#181;m) and larger pores (~30 &#181;m) were fabricated by using a modified processing technique. The long-term performance of the graft was evaluated by implantation in a rat abdominal aorta model. Ultrasound analysis showed that the grafts remained patent without aneurysm or stenosis occurring even after 12 months of implantation. Macroporous structure improved the cell ingrowth and thus promoted tissue regenerated at 3 months. More importantly, there was no sign of adverse remodeling, such as calcification within the graft wall after 12 months. Therefore, electrospun PCL vascular grafts with modified macroporous processing hold potential to be an artery substitute for long-term implantation.

Here, we present a modified electrospinning method to fabricate PCL vascular grafts with thick fibers and large pores, and describe a protocol to evaluate the in vivo performance in a rat model of abdominal aorta replacement.

השרשה שתלי כלי הדם Electrospun עם אופטימיזציה מבנה במודל חולדה

Here, we present a protocol to fabricate macroporous PCL vascular graft and describe an evaluation protocol by using a rat model of abdominal aorta ...

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for developing methods to study the migration. The scratch assay has long been the most common in vitro method to test compounds with anti- and pro-migration properties because of its low cost and simple procedure. However, an often-reported problem of the assay is the accumulation of cells across the edge of the scratch. Furthermore, to obtain data from the assay, images of different exposures must be taken over a period of time at the exact same spot to compare the movements of the migration. Different analysis programs can be used to describe the scratch closure, but they are labor intensive, inaccurate, and forces cycles of temperature changes. In this study, we demonstrate an optimized method for testing the migration effect, e.g. with the naturally occurring proteins Human- and Bovine-Lactoferrin and their N-terminal peptide Lactoferricin on the epithelial cell line HaCaT. A crucial optimization is to wash and scratch in PBS, which eliminates the aforementioned accumulation of cells along the edge. This could be explained by the removal of cations, which have been shown to have an effect on keratinocyte cell-cell connection. To ensure true detection of migration, pre-treating with mitomycin C, a DNA synthesis inhibitor, was added to the protocol. Finally, we demonstrate the automated optical camera, which eliminates excessive temperature cycles, manual labor with scratch closure analysis, while improving on reproducibility and ensuring analysis of identical sections of the scratch over time.

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Here we describe a procedure to test the cell migration in vitro with an automated optical camera microscope. The scratch assay has been widely used where the closure of the scratch is followed for a set period. The optical microscope enables dependable and cheap detection of cell migration.