המימון סופק על ידי NIH מענקים 5T32CA09216-26 (עבור JSB), ו K01 AR055619-01A1 ו 3 K01 AR055619-03S1 (עבור DML), כמו גם על ידי אלכס לימונדה סטנד Foundation, גזע הרווארד Cell מכון האמריקנית לסרטן האגודה.

1. DNA עוברי דג הזברה microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Linearize rag2: cMyc ו rag2: 11-GFP בונה DNA על ידי לעכל 10μg של כל פלסמיד עם NotI ב 37 ° C במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנול: לחלץ כלורופורם המשקע פלסמידים, ו resuspend כל 20μL H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הריכוז של ה-DNA על ידי הפעלת דילול 01:01, 01:05 ו - 01:10 של כל פלסמיד מעוכל על 1% agarose ג&#39;ל עם 20μL, 10μL ו 5μL סולם גבוה מגוון DNA. זה סוג של כימות הוא בדרך כלל יותר מדויק לקרוא ספקטרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את ריכוז ה-DNA כדי הסופי של 60ng/μL ב 1M KCl 0.5 X TE עבור הזרקה לתוך זן CG1 (או זן syngeneic אחרים) עוברי דג הזברה באמצעות 30ng/μL rag2: cMyc + 30ng/μL rag2: ה-GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זריקות יש לבצע כמו 12 הפגינו בעבר, 13. בקצרה, דג הזברה הזכר והנקבה מוגדרים בתאי ההזדווגות בלילה לפני הזריקה. ביום של הזריקה, ה-DNA הוא נטען לתוך מחט הזריקה, הלחץ הוא מותאם כך בועה בקוטר 50μm מסולק (30pg DNA), אשר נמדד על ידי מיקרומטר הבמה. לאחר מכן, עוברים מוזרקים בשלב אחד בתא, עם ה-DNA להיות מוזרק ישירות לתוך התא, ולא בחלמון. הישרדות של CG1 עוברים מוזרק וזחלים ירודה בדרך כלל, ורק 5% דגים יהיה בהצלחה לשלב את transgene, ולכן&gt; 600 עוברים צריך להיות מוזרק על מנת להבטיח כי דגים מסוימים יפתחו לוקמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות עוברים מוזרק על 28.5 ° C, ולהסיר את העוברים המתים לאחר 24 שעות. בעלי חיים מועברים לאחר מכן טנקים גדול 5 ימי חייך והעלה כפי שתואר לעיל 14. </li></ol> 2. הקרנת עבור T-ALL העיקרי הזחלים דג הזברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 28 ימים לאחר ההזרקה, להרדים דג הזברה הזחל ידי הוספת 200μL של 4ng / m Tricane-S כדי 25mL מים מערכת דגים בצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הזחלים לפיתוח fluorescently שכותרתו T-ALL באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence בהגדלה 20X, באמצעות גל עירור ופליטה 485/20 530/25 מסנן הקרינה לזהות GFP (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד הזחלים חיובי הגידול מאלה שלילית. הזחלים שלילי ניתן לבדוק בנקודת זמן מה לאחר מכן, פעם גידולים עשויים גדלה עוד יותר, כדי לוודא ששום T-ALL דגים חיובי הוחמצו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג T-ALL דגים חיובי לפחות פעם בשבוע באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence כדי לעקוב אחר הגידול. </li></ol> 3. בידוד וטיהור של fluorescently שכותרתו תאים לוקמיה העיקרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ה-GFP חיובי תאים לוקמיה יש עקפה&gt; 50% של החיה, להקריב את הדג על ידי הוספת 1mL של 4ng/mL Tricane-S בצלחת פטרי המכילות 9mL מערכת מים ודגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הדג בצלחת פטרי חדשה המכילה 1mL 0.9X PBS עם סרום 5% שור עוברית למאגר תאים. מרוכך את הדג עם pipet להב, תער תערובת לנתק גושי תאים גדולים, ולאחר מכן להעביר את התאים דרך מסננת רשת 40μm לשפופרת 50 מ&quot;ל. אין צורך לנתק את כל גושי רקמה לתוך תאים בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 500μL התאים לצינור קלקר 4mL. הוסף יודיד 1μL 1mg/mL propidium (PI), אשר תווית תאים מתים. וורטקס, אז לשמור על התאים על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקורבן wild-type CG1 דגים, מרוכך ומתח באותה צורה כמו לעיל כדי לאסוף תאים נורמליים, המשמשים כנשא של תאים סרטניים במהלך transplant.Add 4mL 5% FBS ב 0.9X PBS על צינור 50 מ&quot;ל על סך נפח של 5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים נורמליים, כדי לדלל 3x10 5 תאים / מ&quot;ל ב -5% ב FBS 0.9X PBS, אז 100μL/well pipet צלחת 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סדרן פלואורסצנטי תא פעיל (FACS), GFP סוג חיובי, שלילי לצרכן גידול התאים (איור 2 א &#39;, ב&#39;) לתוך צלחת 96-היטב המכילה כדוריות דם במינון הבא: 10 תאים / גם לתוך 48 בארות, 100 תאים / טוב תוך 24 בארות, 1000 תאים / גם לתוך 12 בארות, ו -10,000 תאים / 6 גם לתוך בארות. בנוסף, 10,000 תאים יש למיין לתוך באר ללא כדוריות דם נורמלי, reanalyzed באמצעות FACS להעריך את טוהר הכדאיות של תאים ממוינים (איור 2C). </li></ol> 4. הגבלת השתלת דילול לתוך דג הזברה מבוגר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים על ידי centrifuging את הצלחת 96-2000xg היטב במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 95μL של supernatant ו resuspend התאים 5μL הנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק מבוגר (&gt; 60 ימים) syngeneic בצד הגחון דג הזברה למעלה, להזריק את ההשעיה התא לתוך חלל הצפק, באמצעות 26G / 2 &quot;מיקרו מזרק. דג הזברה לא צריך להיות מורדם לפני ההשתלה. בדרך כלל, 45 דגים מושתלים עם 10 תאים לוקמיה, 20 מושתלים עם 100 תאים, 7 מושתלים עם 1,000 תאים 5 דגים מושתלים עם 10,000 T-ALL תאים. </li></ol> 5. ניתוח על מנת לקבוע לוקמיה, ייזום תדירות תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 28 ימים לאחר ההשתלה, המושתל לבחון את הדג עם מיקרוסקופ epifluoresence באמצעות גל עירור ופליטה 485/20 530/25 לסנן לזהות GFP פלואורסצנטי. רשום את מספר הדגים חיובי לכל המספר הכולל של דגים מוזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון מחדש את הדג כל 14 ימים עד 90 יום ולהקליט את מספר הדגים חיובית. כאשר דג גידול חיובי להיות גוסס, הקרבת בעלי חיים על ידי Tricane-S ממנת יתר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלט את התוצאות לתוך טבלה, כפי שמוצג באיור 3D. העלה את הנתונים לתוך מבוססי אינטרנט Elda (דילול אקסטרים הגבלת ניתוח) תוכנה סטטיסטית ב <a href="http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html">http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html</a> 15, אשר עושה שימוש בתדר של בעלי חיים חיוביים ושליליים הגידול ב כל מנה השתלת כדי לקבוע את תדירות עצמית חידוש תאים לוקמיה בתוך הראשוני T-ALL. </li></ol> 6. נציג תוצאות: Microinjection DNA לעוברי דגים syngeneic לעתים קרובות תוצאות שיעור הישרדות נמוך של העוברים מוזרק, עם &lt;60% עוברים ששרדו למשך 24 שעות. בנוסף, ההישרדות של הדג syngeneic מוזרק בדרך כלל עניים במהלך התפתחות הזחל, לעתים קרובות עם &lt;20% לשרוד במשך 28 ימים. לכן חשוב להזריק מספר גדול של עוברים כדי ליצור דג מהונדס כי יפתחו T-ALL. כדוגמה, CG1 עוברים זן הוזרקו rag2: cMyc + rag2: ה-GFP. Transgenes שיתוף לבודד בעובר המתפתח, כך שכל תא מבטא GFP גם להביע cMyc. הזחלים הוקרנו על יסודי T-ALL לאחר 28 ימים (איור 1). עבודות קודמות הראו כי כ 5% דגים מוזרק יהיה חיובי GFP-T-תאים בתוך התימוס שלהם (איור 1), ו - 100% של דגים אלה יפתחו לוקמיה כמו ה-T לתאים להפוך 11 טרנספורמציה. בעוד חלק קטן של דג הזברה עשויה להיות לוקמיה מתקדמת יותר, כי קל מאוד לזהות בכל יום 28, רוב רק יש GFP חיובי התימוס (איור 1), ולכן הזחלים יש לבחון בנפרד בהגדלה גבוהה על מנת להבטיח כי כל חיובי דגים נבחרים. GFP-T-חיובי כל התאים יהיה לעקוף&gt; 50% של החיה בין 45-70 ימים. בדוגמה בתנאי, דג הזברה הוקרבו על 65 ימים של חיים, ותאי לוקמיה היו מבודדים FACS מיון להגבלת השתלת דילול. תאים בודדים היו יודיד propidium שלילי GFP חיוביים (איור 2) מוינו לתוך צלחת 96-היטב. Reanalysis נעשה על 10,000 תאים ממוינים על מנת להעריך את הכדאיות (רצוי&gt; 95%) טוהר (רצוי&gt; 92%, איור 2). המושתלים T-במחזה &#39;כטוב בעיניכם בדרך כלל להתעורר לפני 28 ימים, אבל גידולים מסוימים עלול לקחת יותר מ -60 ימים כדי להתפתח. בדוגמה זו, ביום 28, גידולים בשלב מוקדם נראו בשטח של ה-GFP חיובי תאים ליד הזריקה (איור 3B), בעוד כמה T-במחזה &#39;כטוב בעיניכם היו התקדם יותר, לאחר התרחבה כדי למלא את חלל הצפק (איור 3 ג) . מנתוני הגבלת תא דילול משלושה מבחני השתלת העיקרי שונה T-במחזה &#39;כטוב בעיניכם מוצגים באיור 3D. בניסויים אלה, מעל 220 בעלי חיים הושתלו, אשר ניתן להשיג בקלות על ידי אדם אחד תוך כמה שעות. ניתוח נתונים באמצעות תוכנה Elda הראו כי, בממוצע, 1 ב 135 T-ALL התאים היו עצמית חידוש לוקמיה, הפצת התאים (איור 3E). <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig1.jpg" alt="איור 1"/> איור 1 הזחלים דג הזברה מוזרק בשלב אחד לתא עם סמרטוט:.:-CMyc + סמרטוט::-eGFP הוקרנו לצמיחה לוקמיה העיקרית 28 ימים לאחר ההזרקה. דגים (*) היה ה-GFP-T-חיובי תאים בתוך התימוס; הדג הזה יפתחו T-ALL כמו ה-T לתאים להפוך הפך במשך הזמן. בשלב זה נפוץ מאוד בכל יום 28. אחת דגים (**) היה מתקדם T-ALL אשר התפשט לרקמות הרכות. הדגים הנותרים השניים שלילי הגידול. התמונה צולמה בהגדלה של 16X. <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. Fluorescently שכותרתו T-ALL תאים מוינו מבעלי חיים חולים בשימוש assay הגבלת תא דילול השתלה. ראשית, שער נמשך לבחור תאים בודדים (פאנל השמאלית העליונה), ואז התאים יודיד propidium שלילי נבחרים (הפאנל השמאלי באמצע). לבסוף, שער נמשך לבחור רק את ה-GFP חיובי תאים לוקמיה למיון (הפאנל השמאלי התחתון). תאים מסודר צריך להיות reanalyzed להעריך כדאיות וטוהר לפני ההשתלה (לוחות מימין). <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. דג הזברה נבדקו לצמיחה לוקמיה 28 ימים לאחר ההשתלה. דגים הם נג הגידול אוAtive (א), יש גידולים קטנים גדל במקום ההזרקה (ב), או יש לוקמיה התקדמה (C). התמונות צולמו בהגדלה 7x. המספר הכולל של דגים לוקמיה חיובי לכל המספר הכולל של דגים המושתלים בדילול כל נרשם, כמו (D). הנתונים הם קלט לתוכנית Elda מבוססי אינטרנט כדי לחשב את מספר עצמית חידוש התאים לוקמיה העליונה והתחתונה 95% מרווחי (E).

<ol>
	<li>Zhou, B. -. B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-initiating+cells:+challenges+and+opportunities+for+anticancer+drug+discovery.">Tumour-initiating cells: challenges and opportunities for anticancer drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 8, 806-823 (2009).</li><li>Dick, J. E., Bhatia, M., Gan, O., Kapp, U., Wang, J. C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+human+stem+cells+by+repopulation+of+NOD/SCID+mice.">Assay of human stem cells by repopulation of NOD/SCID mice.</a> Stem Cells. 15, 199-207 (1997).</li><li>Bonnefoixa, T., Bonnefoixa, P., Verdiela, P., Sotto, J. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitting+limiting+dilution+experiments+with+generalized+linear+models+results+in+a+test+of+the+single-hit+Poisson+assumption.">Fitting limiting dilution experiments with generalized linear models results in a test of the single-hit Poisson assumption.</a> J Immunol Methods. 194, 113-119 (1996).</li><li>Stoletov, K., Klemke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch+of+the+day:+zebrafish+as+a+human+cancer+model.">Catch of the day: zebrafish as a human cancer model.</a> Oncogene. 27, 4509-4520 (2008).</li><li>Taylor, A. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Tumor+Assays:+The+State+of+Transplantation.">Zebrafish Tumor Assays: The State of Transplantation.</a> Zebrafish. 6, 339-346 (2009).</li><li>Mizgirev, I., Revskoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+clonal+zebrafish+lines+and+transplantable+hepatic+tumors.">Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors.</a> Nat Protocols. 5, 383-394 (2010).</li><li>Mizgirev, I. V., Revskoy, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantable+Tumor+Lines+Generated+in+Clonal+Zebrafish.">Transplantable Tumor Lines Generated in Clonal Zebrafish.</a> Cancer Research. 66, 3120-3125 (2006).</li><li>Smith, A. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cell+transplantation+establishes+that+tumor-initiating+cells+are+abundant+in+zebrafish+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 115, 3296-3303 (2010).</li><li>Kelly, P. N., Dakic, A., Adams, J. M., Nutt, S. L., Strasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Growth+Need+Not+Be+Driven+by+Rare+Cancer+Stem+Cells.">Tumor Growth Need Not Be Driven by Rare Cancer Stem Cells.</a> Science. 317, 337-337 (2007).</li><li>Rosen, J. M., Jordan, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Increasing+Complexity+of+the+Cancer+Stem+Cell+Paradigm.">The Increasing Complexity of the Cancer Stem Cell Paradigm.</a> Science. 324, 1670-1673 (2009).</li><li>Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tracking+of+T+cell+development,+ablation,+and+engraftment+in+transgenic+zebrafish.">In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 7369-7374 (2004).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function.">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos.">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Hu, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELDA:+Extreme+limiting+dilution+analysis+for+comparing+depleted+and+enriched+populations+in+stem+cell+and+other+assays.">ELDA: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays.</a> Journal of Immunological Methods. 347, 70-78 (2009).</li><li>Ignatius, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+identifies+that+myf5++embryonal+rhabdomyosarcoma-propagating+cells+are+dynamically+reorganized+during+tumor+growth.">In vivo imaging identifies that myf5+ embryonal rhabdomyosarcoma-propagating cells are dynamically reorganized during tumor growth.</a> , (2010).</li><li>Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-injection+strategies+to+modify+radiation+sensitivity+and+tumor+initiation+in+transgenic+Zebrafish.">Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish.</a> Oncogene. 27, 4242-4248 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הכוח העיקרי של השימוש דג הזברה בחקר הסרטן היא כי מספר רב של בעלי חיים יכול לשמש בעלות נמוכה יחסית. זה חשוב במיוחד בהגבלת תא דילול השתלת מבחני, שם את הפרופורציות של חיות המושתלים כי לפתח גידולים למספר הכולל המושתלים משמשות כדי לקבוע תדירות הגידול ייזום התא. בשיטה המוצגת כאן, מעל 70 מקבל חיות השתלת משמשים לכל assay, מתן אומדן מדויק של מספר גידולים הפצת התא. גם את מספר בעלי החיים המשמשים ואת מנות של התאים הסרטניים המושתלים צריך להיות מותאם מודל סרטן נתון, למשל, אם הניסויים הראשוניים להראות גידולים ייזום תאים הם נדירים, במינונים ההשתלה עשוי להיות שימושי 100,000, 50,000, 10,000 ו -1,000 תאים לכל ההשתלה. Syngeneic זני דג הזברה שימושיים הגבלת ניתוח דילול. עם זאת, זנים אלה עדיין אינם בשימוש נפוץ במעבדות הכל, כמה דגמים סרטן דג הזברה קיימים רק דגים allogenic. הגבלת תא השתלות דילול ניתן לבצע wild-type זנים שעברו אבלציה החיסון, למרות התדירות העצמית חידוש התא עשוי להיות מחושב 1-10 לקפל גבוה יותר מאשר אם syngeneic דג הזברה שימשו 8. חשוב לציין כי מינון גבוה של תאים אמור לשמש להשתלה לתוך הלא החיסונית, מקבלי מתאימים מוקרן, כמו כמה תאים סרטניים לא ישרדו את ההשתלה microenvironment זרה. בנוסף, גידולים רבים יתחילו לסגת לאחר 21 ימים כאשר מערכת החיסון החי של הנמען מתאוששת, כך חיות יש לבחון את הגידול כל 7 ימים לאחר ההשתלה. השיטות שהוצגו כאן מתאימים לשימוש עם כל מודל סרטן דג הזברה, ויש להם עד כה נעשה שימוש כדי לקבוע גידולים ייזום תדירות תא T-cell לוקמיה לימפובלסטית חריפה הן 8, ומודל גידולים מוצקים, רבדומיוסרקומה 16. גידולים אלה היו שכותרתו fluorescently ידי הזרקה משותף של עוברים עם oncogene והן סמן פלואורסצנטי, כי ה-DNA שיתוף שמפריד בין, כל תא לבטא את oncogene גם לבטא את חלבון פלואורסצנטי 17. בעוד פלואורסצנציה מומלץ משום שהוא מאפשר מעקב אחר הגידול ללא צורך להקריב את החיה מספק דרך ישר קדימה לבודד תאים סרטניים על ידי FACS, אפשר לתייג תאים סרטניים עם נוגדנים גידולים ספציפיים כדי להקל על מקבלי טיהור שלהם אף מכתים הנוגדן דג הזברה עשויים לדרוש אופטימיזציה. לבסוף, פעם אחת את השכיחות של גידולים להפצת תאים נקבע לסוג גידול נתון, אפשר להשתמש אלה מבחני לזהות את המנגנונים ששולטים תדירות הנייד שלהם. לדוגמה, תאים סרטניים העיקרי יכולים להיות מטופלים עם מעכבי מסלול ספציפי לפני השתלת הגבלת דילול, או דגים המושתלים עצמם עשויים להיות במינון עם סמים. בנוסף, גנטיקה של גידולים עצמם ניתן לטפל על ידי הזרקת הדגים חד תא הבמה עם בגן של עניין, כך גידולים ראשוניים וכתוצאה מכך יהיה מעל לבטא את הגן. בניסויים אלו, כל השפעה על תדירות עצמית חידוש התא יהיה שנצפתה מבחני דילול מגבילים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> NotI אנזים הגבלה </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> R0189 </td></tr><tr><td> פנול: כלורופורם </td><td> EMD ביוכימיקלים </td><td> 6805-OP </td></tr><tr><td> 5M KCl </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P9541 </td></tr><tr><td> 100x טריס-EDTA </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> T9285 </td></tr><tr><td> טווח גבוה בסולם ה-DNA </td><td> Fermentas </td><td> R0621 </td></tr><tr><td> Syngeneic דג הזברה </td><td></td><td> הפניות 6-8 </td></tr><tr><td> סרום שור עוברית </td><td> Gibco </td><td> 16000-036 </td></tr><tr><td> Propidium יודיד </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P4864 </td></tr><tr><td> 26G / 2 &quot;Microsyringe </td><td> המילטון </td><td> 80366 </td></tr><tr><td> תא 40μm רשת מסננת </td><td> BD פלקון </td><td> 352340 </td></tr></tbody></table>

quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish

עצמית חידוש תאים סרטניים הם תאים מסוגים רק בתוך הגידול, כי יש יכולת בלתי מוגבלת כדי לקדם את צמיחת הגידול, ידועים כמו כן הגידול מתפשט תאים או תאים סרטניים, ליזום. הוא חשב כי המיקוד הללו עצמית חידוש תאים להרס תחסום התקדמות הגידול לעצור נסיגה, שיפור משמעותי פרוגנוזה החולה 1. הדרך הנפוצה ביותר כדי לקבוע את תדירות עצמית חידוש תאים בתוך הגידול הוא תא הגבלת דילול השתלת assay, שבו תאים סרטניים הם הושתלו בחיות הנמען במינונים הגדלת; חלקם של בעלי החיים לפתח גידולים משמש לחשב את מספר עצמית חידוש תאים בתוך מדגם הגידול המקורי 2, 3. באופן אידיאלי, מספר רב של בעלי חיים ישמשו בכל ניסוי דילול הגבלת לקבוע במדויק את השכיחות של גידולים להפצת תאים. עם זאת, ניסויים בקנה מידה גדול הכוללים עכברים הם יקרים, ורוב מבחני דילול להגביל את השימוש רק 10-15 עכברים בכל ניסוי. דג הזברה זכו לגדולה כמודל סרטן, במידה רבה בשל הקלות שלהם מניפולציה גנטית והכלכלה שבה ניסויים בקנה מידה גדול יכול להתבצע. בנוסף, סוגי סרטן הדגם של דג הזברה נמצאו מקרוב לחקות את מקבילו האנושי שלהם 4 המחלה. אמנם זה אפשרי להשתיל תאים סרטניים מדגים אחד למשנהו על ידי הקרנה משנה קטלני של חיות הנמען, התחדשות של מערכת החיסון לאחר 21 ימים בדרך כלל גורם רגרסיה הגידול 5. היצירה האחרונה של דג הזברה syngeneic יש להקל מאוד מחקרים השתלת הגידול 6-8. בגלל החיות האלה זהים מבחינה גנטית, נקלטים התאים המושתלים לתוך הגידול וחסונה דגים הנמען הגידול יכול להיות פיקוח על פני תקופות זמן ארוכות. Syngeneic דג הזברה הם אידיאליים עבור הגבלת מבחני השתלת דילול ב כי תאים סרטניים לא צריך להתאים את הגידול microenvironment זרה, אשר עשוי לזלזל עצמית חידוש תדירות תא 9, 10. בנוסף, אחד של השתלות הושלמו בהצלחה באמצעות דג הזברה syngeneic 8 וכמה מאות בעלי חיים ניתן להשתיל בקלות ו כלכלית בעת ובעונה אחת, אשר שניהם משמשים כדי לספק הערכה מדויקת יותר של תדירות עצמית חידוש התאים. הנה, שיטת מוצג ליצירת העיקרי, fluorescently שכותרתו תא T לוקמיה לימפובלסטית חריפה (T-ALL) ב דג הזברה syngeneic, ואת השתלת גידולים אלה על הגבלת דילול לתוך דגים בוגרים כדי לקבוע תדירות עצמית חידוש התאים. בעוד לוקמיה מסופק כדוגמה, פרוטוקול זה מתאים כדי לקבוע את התדירות של גידולים להפצת תאים סרטניים באמצעות כל מודל של דג הזברה.

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish at JoVE.com

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

הגבלת תא דילול מבחני השתלת משמשות כדי לקבוע את התדירות של גידולים להפצת תאים. פרוטוקול זה מתאר שיטה להפקת דג הזברה syngeneic כי לפתח לוקמיה fluorescently שכותרתו ופרטים כיצד לבודד השתלת תאים אלה לוקמיה על הגבלת דילול לתוך חלל הצפק של דג הזברה מבוגר.

כימות תדירות הגידול מתפשט תאים באמצעות הגבלת השתלת דילול ב Syngeneic דג הזברה

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

quantifying-frequency-tumor-propagating-cells-using-limiting-dilution

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

19.1K Views.  Harvard Medical School. הגבלת תא דילול מבחני השתלת משמשות כדי לקבוע את התדירות של גידולים להפצת תאים. פרוטוקול זה מתאר שיטה להפקת דג הזברה syngeneic כי לפתח לוקמיה fluorescently שכותרתו ופרטים כיצד לבודד השתלת תאים אלה לוקמיה על הגבלת דילול לתוך חלל הצפק של דג הזברה מבוגר.

Video: Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

I am Christina Ceso. I am a postdoc in David's Den lab and I work on the hematopoietic stem cells. Today we are going to purify long-term recuperating hematopoietic stem cells and we'll transplant them into a mouse.We start by spraying the mice with alcohol so that first of all, the mind starts sterilized and also the hair doesn't interfere with the dissection. We use PBS with 2%serum for the dissection. I cut the back skin and I pull the skin apart in order to expose the tissue.In order to isolate the tibia, I hold the tibia with tweezers. I cut the tendon on top of the knee and I cut the muscles below the knee and after that I cut through the knee so that the TBI is not connected to the rest of the limb anymore and I pull in order to isolate it. I then hold the TB upside down and with the scissors I separate the foot from the tibia In order to obtain the femur.I cut the muscles around the femur and then I dislocate the femur from the hip. In order to isolate the hip, I cut the muscle around the hip bone on the side of the tail of the mouse and then I pull the hip away from the body of the mouth In order to isolate the spine. I cut through the tail as close as I can to the beginning of the back and then I cut on the two sides of the spine and below the spine, trying to stay as close as possible to the spine so that the peritoneum is not cut and the intestine is left untouched.A first round of cleaning of the bones is done with a scalpel, which is used to scrape the bone, the muscles away from the bone. The scalpel is good to clean the femurs, the hip and the spine. In order to clean the tibia, I hold them with forceps and I use the forceps to remove as much tissue as possible.A second round of cleaning is done using clean wipe to completely clean the bones outta the muscle, and I use the F wipe to clean the tibia, the femurs and the hips. So this is how bones look. After cleaning, I prefer 50 amount tubes with filters on top and I transfer the bones into the mortar.I add the section media and I crush the bones ask of the first round of crashing of the bones. I piped the mixture in order to release as many styles as possible into solution and reduce clumps. I transferred the mixture on the tubes through the filters and this is what the bone fragments look like after the first round of crushing.So I add more dissection medium to the bone fragments and I flash them again. I transferred the seline mixture to the tubes through the filters and at this point the remaining bone fragments are white and there is no bone marrow left. The tubes are filled with PBS 2%serum and in order to have them all with the same weight so that they're balanced in the centrifuge, but also in order to wash the filters so that we obtain as many cells as possible, I then centrifuge the cell mixture and after centrifugation, the palt includes the bone marrow cells.I aspirate the medium and I move back and forward the tube on the rack so that the pelle is becomes loose and fewer clamps are formed. When I add medium, at this point I add one ml of medium per tube and I ics since I'm sorting hematopoietic stem cells. Later on, I'm going to store an ALI output of total bone marrow sizes at this point, which I will use later for the fact single color control.I add lineage antibody cocktail. I ordered the samples to mix them well and I invaded four degrees for 15 minutes. In the meantime, I start preparing the columns for the lineage division.I put the columns on the magnet and I prepare Ian tubes under the columns. I also prepared the gas PBS using aster flip filter and attaching it to the vacuum so that all the bubbles of air move in the top part of the filter. I then add three ml of the gas DBS to each column in order for the column to become wet.After the incubation with the antibodies, I add medium to the cell samples and I centrifuge them in order to remove the excess of antibodies. After the centrifugation, the stain cells are in the pallet. I aspirate the medium and I suspend the pallet in one mile of the gas PBSI Add the strip tab beans, I mix the cells and I incubate for 15 minutes at four degrees.After the incubation, I put new elucian tubes under the columns. I add two ml of PBS to each tube with the cells and I transferred the cell mixture to the column through a 40 micron filter. I wash the tubes with more medium in order to collect all the cells remaining and I apply the remaining medium through the filters to the columns.The progenitor cells lineage low are alluded into the collection views. I pulled the luted samples and I sent tofu them. So after the centrifugation, the depleted cells are in a white pate.I aspirate the medium and re suspend the cells. I store an adequate of the depleted cells and I add the antibodies to the cell mixture for the sorting and also to all the single color controls. The antibodies are incubated in that with the size for 15 minutes in the fridge.After the ation, I add medium to the cells and and centrifuge them to remove the ex excess of antibodies. After the centrifugation, the cells are in the pt, I aspirate the media that I suspend the cells and I transfer the cells into fox tubes with a blue filter. At this point, the cells are ready to be sorted.I place, I place the mouse under a heating lamp for a few minutes so that the veins dilate and they are more easily seen. When preparing the syringe, you have to be careful to eliminate all the bubbles from the, the mixture that is in the syringe and then you bend the needle at 90 degrees. I put the mouse under a glass cup with a weight on top so that it can run away.I sterilize the tail with the alcohol pad so that the site of injection is sterile, but also it's easier to identify the vein. If you look at the tail of the mouse from the top in the middle and top of the tail, there is an artery while on the two sides there are the two veins and we inject the cells in one of the two veins. I insert the needle into the vein and I inject following injection.It is to wait for a couple of seconds before removing the needle, the needle, and after that I clean the side of injection. This is a representation of the syringe with the ben needle bent at 90 degrees with the knee, the at this ankle compared to the tail, which makes the injection the easiest. When you injecting the tail of the mouse, you have to keep in mind that the tail vein is extremely superficial, so really this is the orientation of the needle compared to the tail.And it looks like you will just keep sliding on top of the tail, but actually you will get into the tail then. I am Christina Ceso. I am a post in David Kaden lab, and I work on the hematopoietic stem cells.I usually use for animals to start with, and I had more variability at the beginning, but once you become consistent with your methods, I consistently get about 50, 000 to 60, 000 stem cells out for mice. I did my PhD in London with Dr.Fiona Wat working on derma stem cells. After that, I just wanted to have a wider knowledge of adult stem cells in various tissues, and so I decided to move to David Kaden lab to work on hematopoietic stem cells, mainly because the things that are known about hematopoietic stem cells are the things that are not known for the epidermic stem cells and a number of assays that can be done with epi.Epidermal stem cells are not really done yet with the hematopoietic stem cells, and so at this point I'm trying to put together the, the knowledge from the two different fields and ultimately I'm interested in the study of the mechanism to regulate adult tissue sensors in general, so not just the epidermis or the stem cells, but also different tissues because there are, there are similar mechanism that is, it's always the same genes that are involved in the regulation that just interact with each other in different ways, and it's just interesting to understand what makes each stem cell be a stem, but then ultimately a stem cell in a different tissue. So giving rise to a different protein.

בידוד והשתלות של בתאי גזע hematopoietic (HSCs)

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

השתלה של מח כליות שלמים דג הזברה למבוגרים

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Tracheotomy: A Method for Transplantation of Stem Cells to the Lung

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell therapy may alleviate many of the symptoms associated with lung disease and induce alveolar repair in adults. Concurrent with the ongoing search for stem cells applicable for human treatment, precise delivery and homing (to the site of disease) must be reassured for successful therapy. Here, I report that stem cells can safely be instilled via the trachea opening a non-stop route to the lung. This method involves a skin incision, caudal insertion of a cannula into and along the tracheal lumen, and injection of a stem cell vehicle mixture into airways of the lung. A broad range of media solutions and stabilizers can be instilled via tracheotomy, resulting in the ability to deliver a wider range of cell types. With alveolar epithelium confining these cells to the lumen, lung expansion and negative pressure during inhalation may also assist in stem cell integration. Tracheal delivery of stem cells, with a quick uptake and the ability to handle a large range of treatments, could accelerate the development of cell-based therapies, opening new avenues for treatment of lung disease.

Significant breakthroughs in stem cell identification are continuously being made. To translate these discoveries, however, novel methods for cellular delivery must be devised. Here I report that the airways provide a safe route for stem cell transplantation to the lungs.

הקנה: שיטה להשתלת בתאי גזע כדי ריאות

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell ...

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development can be addressed. The zebrafish is useful for genetic studies due to several advantageous characteristics, including small size, high fecundity, short lifecycle, and ease of care. Lens development occurs rapidly in zebrafish. By 72 hpf, the zebrafish lens is functionally mature [3]. Abundant genetic and molecular resources are available to support research in zebrafish. In addition, the similarity of the zebrafish eye to those of other vertebrates provides basis for its use as an excellent animal model of human defects[4-7]. Several zebrafish mutants exhibit lens abnormalities, including high levels of cell death, which in some cases leads to a complete degeneration of lens tissues [8]. To determine whether lens abnormalities are due to intrinsic causes or to defective interactions with the surrounding tissues, transplantation of a mutant lens into a wild-type eye is performed. Using fire-polished metal needles, mutant or wild-type lenses are carefully dissected from the donor animal, and transferred into the host. To distinguish wild-type and mutant tissues, a transgenic line is used as the donor. This line expresses membrane-bound GFP in all tissues, including the lens. This transplantation technique is an essential tool in the studies of zebrafish lens mutants.

Lens development involves interactions with other tissues. Several zebrafish eye mutants are characterized by an abnormally small lens size. Here we demonstrate a lens transplantation experiment to determine whether this phenotype is due to intrinsic causes or defective interactions with tissues that surround the lens.

השתלת עדשה של דג הזברה Application שלה ניתוח של מוטאנטים העין

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

הדור של האדם CD40 בתאי B המופעל

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

ממוקד רקמות מפלצות עובריים: דג הזברה Gastrula השתלת תאים

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

השתלה של תאים ישירות לתוך הכליה של דג הזברה למבוגרים

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

לומד Proteolysis של cyclin B ברמת התא הבודד באוכלוסיות תאים שלמות

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

ניתוח Craniofacial המורפוגנזה בדג הזברה שימוש 4D מיקרוסקופיה confocal

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...