מחקרים היו בחסות AdvanDx.

1. הדגימה איסוף הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף דם ורידי מחולים החשודים אלח דם ולשים לשתי BACTEC (BD, ניצוצות, MD) בתרבות בקבוקי דם, אחד ואחד אנאירובי אירובי, יחד תרבות אחת הכוללת מערכת הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום בקבוקים לתוך המכשיר 9240 BACTEC ב 35 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור עד מכשיר האזעקה מופעלת לתוך בשל הצמיחה של אורגניזמים בבקבוק תרבות דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בקבוק מהמכשיר תרבות דם. </li></ol> 2. הכנה של ריאגנטים לפני מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון לרחוץ על ידי הוספת 4 מ&quot;ל של פתרון לשטוף 60x ואחריו 240 מ&quot;ל מים מזוקקים או deionized טריים ישירות המנה מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את צלחת מכתים את האמבטיה C ° 55 מים חמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות להתרכז הנותרים בבית 2-8 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרכבה בינונית מהמקרר ולחמם לטמפרטורת החדר. </li></ol> 3. גראם מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת בעדינות את הבקבוק תרבות דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט מזרק או מנגנון subculturing, להסיר דם (כ 5 מ&quot;ל) מהבקבוק ומכניסים צינורית בורג סטרילי כתרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה סטרילית, במקום טיפה אחת גדולה של דם לשקופית מיקרוסקופ זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האוויר יבש השקופית ולתקן ב מתנול למשך 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר להחליק לייבוש באוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע גראם כתם על הסרט דם כדי לקבוע את המורפולוגיה של האורגניזם גדל בבקבוק תרבות דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש העדשה טבילה שמן, להציג שקופיות. Cocci גראם חיובי בזוגות ורשתות קצר נצפה על הכתם גראם עולה בקנה אחד עם רוב המינים אנטרוקוקוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זו תוצאה כתם גראם אז כוננים הבחירה של ערכת בדיקה נאותה PNA FISH להשתמש לצורך זיהוי חיידקים. תרבות זו תהיה מוכתמת בדם באמצעות E. faecalis / OE FISH PNA הכתם. </li></ol> 4. FISH PNA כתמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את שפופרת המכילה את הדם בעדינות על ידי מתערבל לפני הכנה למרוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים טיפה אחת של פתרון קיבעון היטב של שקופיות מיקרוסקופ FISH PNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 10 μL או טיפה אחת קטנה מהצינור עם התרבות דם חיובית הפתרון קיבוע ומערבבים בעדינות emulsify. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הכתמים על ידי חימום אותם 20 דקות. בשעה 55 ° C על צלחת החימום. </li></ol> 5. בקרת איכות חומר אחת חיובית ואחת שלילית שקופיות בקרת איכות חייבים להיבדק עם כל אצווה של שקופיות עבור מכתים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש E. faecalis / OE בקרה שקופיות שנרכשו AdvanDx למטרה זו או להכין מריחות מתרבויות נוזלי של זנים התייחסות של E. faecalis וא פאציום כמו בקרה חיובית או בשקופיות נפרדות או מעורבות בשקופית אחת Staphylococcus spp או סטרפטוקוקוס spp כחומר בקרה שלילית. </li></ol> תוצאות QC צריכים להיות מסוגלים לפקח על התנאים הבדיקות המתאימות, במיוחד אלו המשפיעים על חומרא הכלאה קיר חדירה לתא, מאז מתודולוגיה הרשות הפלסטינית נועד לייעל את הקיר חדירה לתא 6. הכלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה אחת של E. faecalis / OE PNA לבאר בשקופית מיקרוסקופ עם הכתם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף coverslip. הימנע בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 30 ± 5 דקות. ב 55 ± 1 ° C בצלחת חימום </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות מקום דגירה השקופיות במנשא שקופית </li></ol> 7. מחמירים שטפי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הספק שקופיות לטבול הפתרון לשטוף שחומם מראש ב 55 ° C ו בזהירות להסיר את coverslip. לעתים קרובות, coverslip השקופיות את ידי בעדינות להסעיר את השקופית בפתרון לשטוף. מדי פעם, coverslip יש דחף בעדינות את עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בפתרון לשטוף במשך 30 ± 5 דקות. ב 55 ± 1 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השקופיות מפתרון לשטוף </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר להחליק לייבוש באוויר </li></ol> 8. הרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה אחת של הרכבה בינונית עד שקופית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף coverslip. הימנע בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את השקופית מיקרוסקופ פלואורסצנטי תוך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תחשוף את השקפים לכוון אור השמש או אחר מקורות אור חזק כמו זה עלול להוביל מרווה פלואורסצנציה. </li></ol> 9. פרשנות של תוצאות מיקרוסקופ פלואורסצנטי משמש לבדיקה שקופיות חייב להיות מצויד במסנן בנד AdvanDx כפולה מטרה או שמן 60x 100x. השקופיות QC יש לבחון תחילה לאשר הכלאה כי עלה. E. faecalis אמור להופיע כפי בהיר cocci פלואורסצנטי ירוק בתחומים מרובים של נוף ואת פאציום E. יופיעו אדום בוהק cocci. Non-enterococci שקופית מלאה אמור להופיע nonfluorescent. לאחר אישור המערכת שולטת, מגלשות החולה יכול להיבדק. בתחילה דם filמ &#39;יופיעו אדמדם אבל אדום בהיר וירוק cocci יהיה ברור למדי. <img src="/files/ftp_upload/2616/2616fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. נציג דוגמאות של ירוק חיובי E. faecalis (משמאל), אדום חיובי E. פאציום (באמצע), ושלילי (מימין) תוצאות הבדיקה. 10. נציג תוצאות שלושה מוסדות נכללו במחקר רב מרכזי קליני להערכת זה דג PNA כתם ומשווה פרוטוקול 2.5 שעה לפרוטוקול 1.5 מקוצר שעה שזה עתה הנסקרת. סך של 152 cocci שגרתי גראם חיובי בזוגות ורשתות (GPC) חיובי תרבות בקבוקי דם נכללו במחקרים. היה 100% (152/152) הסכם בין התוצאות של שינוי ושל הליך assay המקורי E. faecalis / OE FISH הרשות הפלסטינית: א &#39;41/41 faecalis; enterococci אחרים 33/33 ו 78/78 GPC אחרים (טבלה 1). שיטה זו מכתים את רגישות וספציפיות מעולה במהלך המשפט הזה קליני (טבלה 2). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> שיטות שגרתיות </td><td> א faecalis / OE רגיל PNA FISH נוהל </td><td> א faecalis / OE PNA נוהל FISH קצר </td></tr><tr><td> א faecalis </td><td> 41 </td><td> 41 (גרין חיובי) </td><td> 41 (גרין חיובי) </td></tr><tr><td> א פאציום </td><td> 27 </td><td> 27 (האדום חיובית) </td><td> 27 (האדום חיובית) </td></tr><tr><td> א casseliflavus </td><td> 2 </td><td> 2 (האדום חיובית) </td><td> 2 (האדום חיובית) </td></tr><tr><td> א gallinarum </td><td> 2 </td><td> 2 (האדום חיובית) </td><td> 2 (האדום חיובית) </td></tr><tr><td> אחרים אנטרוקוקוס spp. </td><td> 2 </td><td> 2 (האדום חיובית) </td><td> 2 (האדום חיובית) </td></tr><tr><td> S. pneumoniae </td><td> 17 </td><td> 17 (שלילי) </td><td> 17 (שלילי) </td></tr><tr><td> ס viridans </td><td> 33 </td><td> 33 (שלילי) </td><td> 33 (שלילי) </td></tr><tr><td> ס mitis </td><td> 1 </td><td> 1 (שלילי) </td><td> 1 (שלילי) </td></tr><tr><td> S. pyogenes </td><td> 3 </td><td> 3 (שלילי) </td><td> 3 (שלילי) </td></tr><tr><td> ס בוביס </td><td> 2 </td><td> 2 (שלילי) </td><td> 2 (שלילי) </td></tr><tr><td> ס salivarius </td><td> 1 </td><td> 1 (שלילי) </td><td> 1 (שלילי) </td></tr><tr><td> ס sanguinis </td><td> 2 </td><td> 2 (שלילי) </td><td> 2 (שלילי) </td></tr><tr><td> ס agalagtae </td><td> 7 </td><td> 7 (שלילי) </td><td> 7 (שלילי) </td></tr><tr><td> אחרים סטרפטוקוקוס spp. </td><td> 7 </td><td> 7 (שלילי) </td><td> 7 (שלילי) </td></tr><tr><td> Abiotrophia spp. </td><td> 3 </td><td> 3 (שלילי) </td><td> 3 (שלילי) </td></tr><tr><td> Peptostrepococcus spp. </td><td> 2 </td><td> 2 (שלילי) </td><td> 2 (שלילי) </td></tr><tr><td> סך הכל </td><td> 152 </td><td> 152/152 100% הסכם </td><td> 152/152 100% הסכם </td></tr></tbody></table> טבלה 1. Listing של חיידקים נבדק הן באמצעות תקן (2.5hr) ומהיר (1.5 שעות) פרוטוקול. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רגישות E.faecalis </td><td> אחרים רגישות אנטרוקוקוס spp. </td><td> סגוליות </td></tr><tr><td> 100% (41/41) 95% CI (93.0-100) </td><td> 100% (33/33) 33/33 95% CI (91.3-100) </td><td> 100% (78/78) 95% CI (96.2-100) </td></tr></tbody></table> טבלה 2. רגישות וספציפיות של פרוטוקול PNA 1.5 שעה FISH.

<ol>
	<li>Oliveira, K., Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Haase, G., Weber-Heynemann, J., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Stender, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+and+differentiation+of+Enterococcus+faecalis+and+other+Enterococcus+species+directly+from+positive+blood+cultures+by+dual+color+fluorescence+in+situ+hybridization+using+PNA+probes.">Rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures by dual color fluorescence in situ hybridization using PNA probes.</a> , (2002).</li><li>Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Oliveira, K., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Johansen, J. T., Procop, G. W., Wilson, D., Padilla, E., Gonzalez, V., Stender, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicenter+evaluation+of+E.+faecalis+PNA+FISH+for+rapid+identification+and+differentiation+of+Enterococcus+faecalis+and+other+Enterococcus+species+directly+from+positive+blood+cultures.">Multicenter evaluation of E. faecalis PNA FISH for rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures.</a> , (2003).</li><li>Rausei, V., Youssef, E., Morgan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+identification+of+Staphylococcus+aureus,+Enterococcus+faecalis,+and+Candida+albicans+from+blood+cultures+using+fluorescence+in+situ+hybridization+with+nucleic+acid+probes.">Direct identification of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, and Candida albicans from blood cultures using fluorescence in situ hybridization with nucleic acid probes.</a> , (2005).</li><li>Novak-Weekley, S. M., LaForga, M., Carey, L., Frazier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+S.+aureus+PNA+FISH,+E.+faecalis+PNA+FISH+&#38;+C.+albicans+PNA+FISH+for+Rapid+Identification+of+Positive+Blood+Culture+Bottles.">Validation of S. aureus PNA FISH, E. faecalis PNA FISH &#38; C. albicans PNA FISH for Rapid Identification of Positive Blood Culture Bottles.</a> , (2006).</li><li>Johnson, J. K., Roberts, A. A., Forrest, G. N., Lincalis, D. P., Venezia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Identification+of+Enterococcus+Species+in+Positive+Blood+Cultures+with+Therapeutic+Implications.">Rapid Identification of Enterococcus Species in Positive Blood Cultures with Therapeutic Implications.</a> , (2006).</li></ol>

ההפקה של המאמר וידאו זה היה בחסות AdvanDx. בנימין גביש הינו עובד AdvanDx, שעושה את הכלים ריאגנטים שימוש במאמר זה.

E. faecalis / OE assay PNA דגים אנטרוקוקוס יכול לספק זיהוי 2-3 ימים מוקדם יותר מאשר בשיטות תרבות סטנדרטי. הליך מקוצר עבור assay (1.5 כזאת?) מספק זיהוי מהיר שיכול לשמש עבור גישה טובה יותר לטיפול מיקרוביאלית והתוצאה המטופל. מחקר אחד כדי לתמוך זה בוצע על ידי פורסט, et al. (6). במשך שנתיים רצופות החל משנת 2005 את המעבדה למיקרוביולוגיה מזוהה cocci גראם חיובי בזוגות ורשתות צומח בבקבוקי תרבות דם בשיטות מיקרוביולוגיות קונבנציונאלי בשנת 2006 הוספת E. faecalis / OE PNA FISH. בנוסף אלגוריתם טיפול שפותחה על ידי צוות המוסדות מיקרוביאלית (AMT) להשתמש ביעילות את הנתונים שנוצר על ידי הרשות הפלסטינית FISH במעבדה באופן ובמועד. התוצאה העיקרית הייתה להעריך את הזמן מתרבות דם לצייר ליישום טיפול יעיל מיקרוביאלית לפני ואחרי FISH הרשות הפלסטינית הונהגה לתוך העבודה במעבדות. חומרת מיקום המחלה, החולה טיפול אמפירי מיקרוביאלית נמדדו. סך של 224 חולים עם בית החולים רכשה enterococcal בקטרמיה הוערכו עם 129 בתקופה טרום ההתערבות 95 בתקופה FISH PNA. FISH PNA מזוהה E. faecalis 3 ימים מוקדם יותר מאשר תרבויות קונבנציונאלי (1.1 לעומת 4.1 ימים, p &lt;0.001). FISH PNA מזוהה E. פאציום חציון 2.3 ימים קודם לכן (1.1 לעומת 3.4 ימים, p &lt;0.001) הייתה קשורה עם ירידה משמעותית מבחינה סטטיסטית הזמן ליזום טיפול יעיל (1.3 לעומת 3.1 ימים, p &lt;0.001) וירידה 30 יום התמותה (26% לעומת 45%, p = 0.04). קבוצה זו הגיע למסקנה כי א faecalis / OE assay PNA דגים בשילוב עם אלגוריתם טיפול AMT הביא חניכה קודמות של טיפול אמפירי המתאים מיקרוביאלית עבור חולים עם בית החולים רכשה א &#39;בקטרמיה פאציום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאגנטים אסור להשתמש אחרי תאריכי התפוגה מודפס על גבי התוויות ריאגנטים לא צריך להיות שונה בכל דרך שהיא. הם צריכים להישאר במקרר כאשר אינו בשימוש או שהם יכולים לאבד עוצמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות בקבוקי דם צריך להיות מעורב לפני הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב לא לאפשר את קצה בקבוק טפטפת לגעת כתם דם כי זה עלול לגרום זיהום לחצות של חומר בין שקופיות, או לגרום לזיהום של מגיב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא אמבט מים לחסום חימום מתוחזקים על 55 ° C. קבוע </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אין להשתמש במסננים אחר מאשר מסנן או צבעים Dual Band לא יהיה להבחין בבירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אין להשתמש שקופיות מיקרוסקופ אחר מאשר שקופיות מיקרוסקופ או הכלאה לא תתרחש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב המיקרוסקופ פועל כהלכה. ודא את הנורה מיקרוסקופ בתוך מספר שעות של אושר לשימוש. </li></ol><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נדירים המתרחשים מינים אחדים אנטרוקוקוס לא מזוהים על ידי בדיקה PNA והכלאה אנטרוקוקוס למינים אחרים, כגון E. asinii, E.dispar, א haemoperoxidus, א cecorum, א columbae, saccharolyticus א, א solitarius ו-E . גופריתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Moraviensis E. מזוהה E. בשל הדמיון רצף faecalis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמה זנים של Streptococcus anginosus לייצר פלואורסצנטי ירוק חיובי כוזב בשל הדמיון ברצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות VersaTREK בקבוקי דם לא הוערכו במהלך המחקרים הקליניים. המופע כדי לזהות E. faecalis ו אנטרוקוקוס אחרים spp. עם תרבות בקבוקי VersaTREK דם אינה ידועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> False autofluorescence ירוק חיובית עשויה להתרחש אם תקן FITC לסנן משמש במקום מסנן Dual Band. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוצאות שליליות שקר עשוי לעתים רחוקות להתרחש עקב צמיחה מעורבת או בשל טעות בטכניקה assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוג ומצבו של מכשור המשמש תשפיע על המראה החזותי של התמונה המתקבל. הקרינה עשויה varydue לסוג של מיקרוסקופ מועסקים, את מקור האור ואת רמת rRNA בתאים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד על התקשורת מוצק יש צורך להבדיל צמיחה מעורבת עם אורגניזמים אחרים כדי לזהות תרביות דם חיוביות מניב תוצאה שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוצר לא קיבל תוקף עם דגימות אחר מאשר תרבויות דם. </li></ul>

ריאגנטים א faecalis / דגים OE PNA מורכב מרכיבי הערכה הבאה: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון פתרון קיבוע קיבוע 3 מ&quot;ל בופר פוספט עם חומר ניקוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> א faecalis / OE PNA E. faecalis / OE PNA 1.5 מ&quot;ל בדיקות הרשות הפלסטינית ב הכלאה. הפתרון. מכיל לפוראמיד 30%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון 60x לשטוף לשטוף 60x פתרון 50 מ&quot;ל טריס שנאגרו מלוחים עם חומר ניקוי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני הרכבה הרכבה בינונית 3 מ&quot;ל מעכב photobleaching ב גליצרול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקרת איכות שקופיות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> <a href="http://www.advandx.com">AdvanDX</a> </li></ul>

a 1.5 hour procedure for identification of enterococcus species directly from blood cultures

Enterococci הם גורם שכיח של בקטרמיה עם E. faecalis להיות המין השולט ואחריו E. פאציום. בגלל התנגדות אמפיצילין ו vancomycin ב E. faecalis עדיין בהשוואה נדיר ההתנגדות E. פאציום, פיתוח של בדיקות מהיר המאפשר הבחנה בין מינים enterococcal חשוב עבור טיפול מתאים ומעקב התנגדות. E. faecalis OE assay PNA דגים (AdvanDx, Woburn, MA) משתמשת מינים ספציפיים גרעין פפטיד חומצה (PNA) בדיקות הקרינה ב בפורמט הכלאה באתרו ומציע זמן התוצאות של 1.5 שעות פוטנציאל לספק מידע חשוב עבור מינים ספציפיים הטיפול. מחקרים Multicenter בוצעו כדי להעריך את הביצועים של ה 1.5 שעות faecalis / OE הליך PNA FISH לעומת הליך assay המקורי 2.5 שעה לשיטות בקטריולוגיה תקן לזיהוי enterococci ישירות מתוך בקבוק דם חיובית לתרבות.

Watch this Scientific Journal Video about A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures at JoVE.com

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

פרוטוקול מהירה לצורך זיהוי ישיר של אנטרוקוקוס faecalis ומינים אחרים אנטרוקוקוס מתרבות דם חיובית באמצעות חומצות גרעין פפטיד ניאון assay הכלאה באתרו (FISH PNA).

נוהל 1.5 שעה עבור זיהוי אנטרוקוקוס מינים ישירות מתרבויות דם

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

a-15-hour-procedure-for-identification-enterococcus-species-directly

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

20.8K Views.  Cedars-Sinai Medical Cente. פרוטוקול מהירה לצורך זיהוי ישיר של אנטרוקוקוס faecalis ומינים אחרים אנטרוקוקוס מתרבות דם חיובית באמצעות חומצות גרעין פפטיד ניאון assay הכלאה באתרו (FISH PNA).

Video: A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

דלדול של אוכלוסיות תאים ספציפיים על ידי דלדול משלים

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. Therefore, rapid administration of adequate antibiotic therapy is of foremost importance in the treatment of bloodstream infections. The critical element in this process is timing, heavily dependent on the results of bacterial identification and antibiotic susceptibility testing. Both of these parameters are routinely obtained by culture-based testing, which is time-consuming and takes on average 24-48 hours2, 4. The aim of the study was to develop DNA-based assays for rapid identification of bloodstream infections, as well as rapid antimicrobial susceptibility testing. The first assay is a eubacterial 16S rDNA-based real-time PCR assay complemented with species- or genus-specific probes5. Using these probes, Gram-negative bacteria including Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli as well as Gram-positive bacteria including Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., and Streptococcus pneumoniae could be distinguished. Using this multiprobe assay, a first identification of the causative micro-organism was given after 2 h.
Secondly, we developed a semi-molecular assay for antibiotic susceptibility testing of S. aureus, Enterococcus spp. and (facultative) aerobe Gram-negative rods6. This assay was based on a study in which PCR was used to measure the growth of bacteria7. Bacteria harvested directly from blood cultures are incubated for 6 h with a selection of antibiotics, and following a Sybr Green-based real-time PCR assay determines inhibition of growth. The combination of these two methods could direct the choice of a suitable antibiotic therapy on the same day (Figure 1). In conclusion, molecular analysis of both identification and antibiotic susceptibility offers a faster alternative for pathogen detection and could improve the diagnosis of bloodstream infections.

The design of a straightforward one-day workflow scheme for bacterial pathogen diagnostics enables the rapid recognition of bloodstream infections. The inclusion of eight clinically relevant bacterial targets and their antibiotic resistance profiles offers the clinician an initial insight on the same day, which can lead to more adequate therapy.

יום אחד זרימת עבודה עבור תוכנית זיהוי פתוגן חיידקי ובדיקות ההתנגדות Antimicrobial מתרבויות דם

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates epithelial differentiation. There are many uses for this system. For instance, the ability to grow three-dimensional organotypic raft cultures of keratinocytes has been an important milestone in the study of human papillomavirus (HPV)1. The life cycle of HPV is tightly linked to the differentiation of squamous epithelium2. Organotypic epithelial raft cultures as demonstrated here reproduce the entire papillomavirus life cycle, including virus production3,4,5. In addition, these raft cultures exhibit dysplastic lesions similar to those observed upon in vivo infection with HPV. Hence this system can also be used to study epithelial cell cancers, as well as the effect of drugs on epithelial cell differentiation in general. Originally developed by Asselineau and Prunieras6 and modified by Kopan et al.7, the organotypic epithelial raft culture system has matured into a general, relatively easy culture model, which involves the growth of cells on collagen plugs maintained at an air-liquid interface (Figure 1A). Over the course of 10-14 days, the cells stratify and differentiate, forming a full thickness epithelium that produces differentiation-specific cytokeratins. Harvested rafts can be examined histologically, as well as by standard molecular and biochemical techniques. In this article, we describe a method for the generation of raft cultures from primary human keratinocytes. The same technique can be used with established epithelial cell lines, and can easily be adapted for use with epithelial tissue from normal or diseased biopsies8. Many viruses target either the cutaneous or mucosal epithelium as part of their replicative life cycle. Over the past several years, the feasibility of using organotypic raft cultures as a method of studying virus-host cell interactions has been shown for several herpesviruses, as well as adenoviruses, parvoviruses, and poxviruses9. Organotypic raft cultures can thus be adapted to examine viral pathogenesis, and are the only means to test novel antiviral agents for those viruses that are not cultivable in permanent cell lines.

An in vitro method to mimic in vivo epithelial differentiation is described. Many viruses target epithelial cells as part of their viral life cycle, and this method provides a means of examining virus:host interactions that more closely resembles that which occurs in vivo. This technique can be used with primary keratinocytes, established cell lines, as well as normal or diseased biopsy tissue.

הדור של תרבויות רפסודות Organotypic של קרטינוציטים אדם מן המעלה הראשונה

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

בידוד של קבוצות משנה מבשר B-cell מדם טבורים

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

The investigation of the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to understanding the pathogenic mechanisms of diseases caused by these organisms. Here we describe a procedure for protein extraction from Burkholderia species based on mechanical lysis using glass beads in the presence of ethylenediamine tetraacetic acid and phenylmethylsulfonyl fluoride in phosphate buffered saline. This method can be used for different Burkholderia species, for different growth conditions, and it is likely suitable for the use in proteomic studies of other bacteria. Following protein extraction, a two-dimensional (2-D) gel electrophoresis proteomic technique is described to study global changes in the proteomes of these organisms. This method consists of the separation of proteins according to their isoelectric point by isoelectric focusing in the first dimension, followed by separation on the basis of molecular weight by acrylamide gel electrophoresis in the second dimension. Visualization of separated proteins is carried out by silver staining.

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Members of the Burkholderia genus are pathogens of clinical importance. We describe a method for total bacterial protein extraction, using mechanical disruption, and 2-D gel electrophoresis for subsequent proteomic analysis.

הפקת חלבון סה&quot;כ ו2-D שיטות ג&#39;ל אלקטרופורזה עבור<em&gt; Burkholderia</em&gt; מינים

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission of TSE diseases, such as chronic wasting disease (CWD), is presumed to be from animal to animal2,3 as well as from environmental sources4-6. Scavengers and carnivores have potential to translocate PrPRes material through consumption and excretion of CWD-contaminated carrion. Recent work has documented passage of PrPRes material through the digestive system of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common North American scavenger7.
We describe procedures used to document passage of PrPRes material through American crows. Crows were gavaged with RML-strain mouse-adapted scrapie and their feces were collected 4 hr post gavage. Crow feces were then pooled and injected intraperitoneally into C57BL/6 mice. Mice were monitored daily until they expressed clinical signs of mouse scrapie and were thereafter euthanized. Asymptomatic mice were monitored until 365 days post inoculation. Western blot analysis was conducted to confirm disease status. Results revealed that prions remain infectious after traveling through the digestive system of crows and are present in the feces, causing disease in test mice.

Scavengers have potential to translocate infectious transmissible spongiform encephalopathy prions in their feces to disease-free areas. We detail methods used to determine if mouse-adapted scrapie prions remain infectious after passage though the digestive tract of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common consumer of dead animals.

נהלים לזיהוי פריוני זיהומיות לאחר המעבר דרך מערכת העיכול של מינים עופות

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

זיהוי מהיר של חיידקים גראם שליליים מהדם תרבות מרק שימוש MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a rapid identification of the infectious agent to guide optimal antibiotic treatment. The analysis of Gram stains from positive blood culture can be rapidly conducted and already significantly impact the antibiotic regimen. However, the accurate identification of the infectious agent is still required to establish the optimal targeted treatment. We present here a simple and fast bacterial pellet preparation from a positive blood culture that can be used as a sample for several essential downstream applications such as identification by MALDI-TOF MS, antibiotic susceptibility testing (AST) by disc diffusion assay or automated AST systems and by automated PCR-based diagnostic testing. The performance of these different identification and AST systems applied directly on the blood culture bacterial pellets is very similar to the performance normally obtained from isolated colonies grown on agar plates. Compared to conventional approaches, the rapid acquisition of a bacterial pellet significantly reduces the time to report both identification and AST. Thus, following blood culture positivity, identification by MALDI-TOF can be reported within less than 1 hr whereas results of AST by automated AST systems or disc diffusion assays within 8 to 18 hr, respectively. Similarly, the results of a rapid PCR-based assay can be communicated to the clinicians less than 2 hr following the report of a bacteremia. Together, these results demonstrate that the rapid preparation of a blood culture bacterial pellet has a significant impact on the identification and AST turnaround time and thus on the successful outcome of patients suffering from bloodstream infections.

A rapid bacterial pellet preparation from a positive blood culture can be used as a sample for applications such as identification by MALDI-TOF, Gram staining, antibiotic susceptibility testing and PCR-based test. The results can be rapidly communicated to clinicians to improve the outcome of patients suffering from bloodstream infections.

הכנה של תרבות דם כדוריים לראפיד בקטריאלי זיהוי ואנטיביוטיקת רגישות בדיקה

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...