Biofilm הקשורות לעבודה במעבדה ממומנת על ידי מענק ממוספרים R21DE017294 ו R21AI080930 מהמכון הלאומי למחקר דנטלי &amp; Craniofacial לבין המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (JLL ל-R.). התוכן הוא באחריות הבלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצגים את הדעות הרשמיות של NIDCR, את NIAID או NIH.

1. הכנת ג אלביקנס ג אלביקנס היא קבוצת סיכון מיקרואורגניזם 1/BSL1. זכרו תמיד להשתמש בטכניקות aseptic / סטרילי טוב לעבוד עם בקטריה זו ופעל נהלים מוסדיים לסילוק נאות של חומרים Biohazard. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תרבות הלילה של C. אלביקנס בינוני (שמרים Peptone דקסטרוז) YPD נוזלי על ידי inoculating מושבה אחת של ג אלביקנס לתוך 25 מ&quot;ל של YPD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תרבות שייקר מסלולית (בערך 180 סל&quot;ד) בשעה 30 ° C במשך הלילה. רוב ג אלביקנס זנים יגדלו כמו תאים שמרים בתנאים אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התרבויות בין לילה (כ -3,000 סל&quot;ד, 5-10 דקות), לשטוף את התאים פעמיים עם PBS סטרילי, resuspend את הכדור האחרון על 20-25 מ&quot;ל של מדיום 1640 RPMI שנאגרו עם חומצה 165 mM morpholinepropanesulfonic עד 7.0 pH מראש חימם בשעה 37 ° C (מעתה והלאה המדיום הזה נקרא בפשטות &quot;RPMI 1640&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemacytometer. לאחר הספירה, להכין ההשעיה של תאים בצפיפות הסופי של 1.0 x 10 6 תאים / מ&quot;ל RPMI 1640. הערה: מאחר תאים יש נטייה צבירה, חשוב מערבולת במרץ בין כביסות ולפני pipetting. </li></ol> 2. הקמת 96-היטב פלייט microtiter להיווצרות של biofilm <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה רב להוסיף 100 μL של C. אלביקנס ההשעיה לתוך בארות נבחר הצלחת-96 גם microtiter (-s). אל תוסיף התאים בארות בעמודה 12, כמו אלה ישמש שולטת שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הצלחת microtiter שלם עם מכסה המקורי, חותם עם parafilm, מקום בתוך החממה דגירה של 24 שעות ב 37 ° C. אורכו של הדגירה ניתן להתאים תכנון הניסוי הספציפי. לדוגמה, אפשר לבחון את קינטיקה של היווצרות biofilm על פני תקופה של 24-48 שעות על ידי זריעת הצלחות מרובות ועיבוד כל צלחת בנקודות זמן שונות (כלומר 2, 4, 8, 12, 24 ו - 48 ח) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר היווצרות biofilm, בעזרת פיפטה רב לשאוב את המדיום בזהירות לא לגעת ולשבש את biofilms כי נוצרו בכל אחת הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה רב צלחות לשטוף שלוש פעמים PBS סטרילית (200 μL לכל היטב). לחלופין, להשתמש מכונת כביסה אוטומטיות צלחת microtiter. בין שוטף, ובעיקר לאחר לשטוף האחרון, לנקז את צלחות בעמדה הפוכה על ידי סופג עם מגבות נייר כדי להסיר כל PBS שיורית. בנקודה זו נוצר biofilms בתחתית בארות צריך להיות לעין גם בעין בלתי מזוינת, ויכול גם להיות דמיינו באמצעות מיקרוסקופ הפוך (איור 1). Biofilms מוכנים כעת להיות מעובד עבור מבחני רגישות בדיקות נגד פטריות. (אם המטרה העיקרית של הניסוי היא להעריך את מידת היווצרות biofilm, צלחות מוכנים להיות מעובד בשיטת colorimetric. לשם כך, מגיב XTT / menadione (ראה שלב 3 להלן), ניתן להוסיף את הצבע וכתוצאה מכך לקרוא באמצעות קורא צלחת microtiter). </li></ol> 3. בדיקה של רגישות נגד פטריות Biofilms <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מ פתרונות מניות או אבקה, להכין פתרון עובד בינוני 1640 RPMI של פטריות כל להיבדק. ריכוזים גבוהים אופייניים 1,024 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​עבור fluconazole, ו -16 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​הן amphotericin B ו caspofungin. ריכוזים אחרים עשויים לשמש סוכנים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת טפטפת רב, להוסיף 200 μL של ריכוז גבוה של עובדים נגד פטריות על בארות המקביל בעמודה 1 של כל צלחת microtiter המכיל biofilms פטרייתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של RPMI 1640 היטב כל בעמודות 2-10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של RPMI 1640 לבארות בעמודה 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 100 μL של סוכן פטריות מבארות הטור 1 ולהוסיף את בארות הסמוך בעמודה 2 (כבר המכיל 100 μL של מדיום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב את תוכנו על ידי pipetting מעלה ומטה כדי לבצע דילול הכפלת סדרתי, ולהסיר את עצות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור זז ימינה עד בארות הטור 10, שלאחריו נפח סופי 100 μL מבארות הטור 10 לאחר ערבוב נמחקת. בדרך זו, סדרה של דילולים הכפלה של הסוכן שלך (-ים) של עניין נוצרו; מן מרוכז רוב הבארות של טור 1 עד לפחות מרוכזת בארות של טור 10. Biofilms הבלתי מעורער בעמודה 11 ישמש שולטת חיובית, בארות ריק בעמודה 12 ישמש שולטת שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הצלחות עם העפעפיים שלהם, חותם עם parafilm ו דגירה של 24 -48 שעות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת דגירה לשטוף את הצלחות כמו לפני שלב 2.4 (3 x PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה רב להוסיף 100 μL של פתרון XTT / menadione זה היטב המכיל biofilm מראש שטף כמו גם בארות שליטה שלילי למדידת רקע XTT-colorimetric רמות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> XTT מוכן כפתרון רווי ב 0.5 g / L ב לקטט רינגר של סטרילית, PBS או תמיסת מלח, אשר צריך להיות פילטר עיקור באמצעות 0.22 מיקרומטר, מסנן גודל הנקבוביות. הפתרון XTT אור רגיש, כך זה צריך להיות מכוסה בנייר אלומיניום במהלך ההכנה. מוכן ברגע ולסנן-מעוקרים, aliquot תוך 10 כרכים עובד מ&quot;ל, ולאחסן ב -70 ° C. הגנה על צינורות מן האור באמצעות רדיד אלומיניום. הפשירי רק צינורות רבים ככל הדרוש לניסוי מסוים רק לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Menadione מוכן כפתרון 10 mM המניות אצטון 100%, aliquoted לתוך נפח קטן יותר (כ - 50 μL) ומאוחסנים ב -70 ° C. הכן את הפתרון XTT / menadione רק לפני השימוש, על ידי הוספת 1 μL של פתרון המניות של menadione אל צינור המכיל 10 מ&quot;ל של התמיסה XTT מופשר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הצלחות בנייר אלומיניום דגירה בחושך במשך שעות 2 ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הצלחות. בעזרת פיפטה רב להסיר 80 ​​μL של supernatant בצבע הנובע גם כל העברת לתוך בארות המקביל צלחת microtiter חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרא את צלחת (-ים) קורא microtiter צלחת ב 490 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את ריכוזי נייחים מעכבות מינימום SMIC50 ו SMIC80, המהווים את ריכוזי פטריות בו ירידה של 50% או 80% בקריאה colorimetric מזוהים בהשוואה לשלוט biofilms שנוצר בהעדר תרופה נגד פטריות (במקרה זה הערכים עבור העמודה 11 , זכור גם לחסר ערכים שליליים שולטת מבארות בעמודה המכילה 12 XTT בלבד). תוצאות SMIC יכול להיות מוצג כטבלה (כלומר מבודד מרובים נגד antifungals מרובים) או לחילופין, התוצאות עבור כל פטרייתי הפרט לבודד נגד פטריות כל אחד יכול להיות מוצג בגרף על ידי התוויית עיכוב אחוז לעומת ריכוז פטריות. </li></ol> דוגמה: לאחר הפחתת ערכי בבקרה שלילית, OD הממוצע של biofilms לשלוט נוצר בטור 11 הוא 1.32. SMIC50 הוא הריכוז הנמוך ביותר נגד פטריות מוביל להפחתה&gt; 50% בקריאה colorimetric, במקרה הזה פחות מ 1.32 x 50 / 100 = 0.66. כמו כן, SMIC80 הוא הריכוז הנמוך ביותר נגד פטריות מוביל להפחתה&gt; 80% בקריאה colorimetric, במקרה הזה פחות מ 1.32 x 20/100 = 0.264. 4. נציג תוצאות איור 1 מציג microphotograph של C. אלביקנס biofilm נוצר בתחתית באר בצלחת 96 microtiter גם נלקח באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. איור 2 מראה XTT-colorimetric קריאות (OD 490 ערכים) עבור כל אחד 11 biofilms של C. זן אלביקנס סוג בר נוצרו בכל אחת 8 שורות שונות של צלחת 96 microtiter אותו היטב. איור 3 מראה את הפעילות של amphotericin B בריכוזים שונים נגד ג אלביקנס biofilms; החצים מצביעים SMIC50 ו SMIC80 ערכים. <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. (א) לוח מראה microphotograph נלקח באמצעות מצלמה מחוברת מיקרוסקופ הפוכה של C. אלביקנס biofilm נוצר בתחתית הבאר לאחר השאיפה של המדיום RPMI ו כביסות הבאים עם PBS. (ב) מיקרוסקופ של ג אופייני אלביקנס biofilm דמיינו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. ברים הם 100 מיקרומטר ו 10 מיקרומטר עבור לוחות A ו-B בהתאמה. <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. כינונה של C. המקבילה מרובים אלביקנס biofilms ב 96-היטב צלחות microtiter. קריאות Colorimetric (OD 490 ערכים) מן XTT הפחתת מבחני של biofilms שהוקמה על ידי ג אלביקנס סוג בר בארות של צלחות microtiter. ערכים הם עבור 11 biofilms עצמאי שנוצר בכל אחת 8 שורות שונות של צלחת 96 microtiter אותו היטב. תוצאות עבור השורות שונה הושוו על ידי ניתוח חד סטרי השונות באמצעות בדיקה של ברטלט על ההומוגניות של שונויות והשוואה מרובים של Bonferroni שלאחר הבדיקה. ההבדלים לא היו משמעותיים מבחינה סטטיסטית ציין כאשר משווים את כל זוגות של שורות זה לזה (P&gt; 0.05). <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. תוצאות אופייניות של בדיקות רגישות נגד פטריות ג אלביקנס biofilms. גרף המתאר תוצאות אופייני היעילות של ריכוזים שונים amphotericin B נגד biofilms של C. אלביקנס זן פראי סוג. ערכים הם כפי שבאה לידי ביטוי בקריאה אחוזים בממוצע colorimetric עבור XTT הפחתת מבחני לעומת שליטה בארות. SMIC50 ו SMIC80 ערכים מסומנים על ידי חצים.

<ol>
	<li>Bachmann, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+activity+of+caspofungin+against+Candida+albicans+biofilms.">In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).</li><li>Hawser, S. P., Norris, H., Jessup, C. J., Ghannoum, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-t+etrazolium+hydroxide+(XTT)+colorimetric+method+with+the+standardized+National+Committee+for+Clinical+Laboratory+Standards+method+of+testing+clinical+yeast+isolates+for+susceptibility+to+antifungal+agents.">Comparison of a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-t etrazolium hydroxide (XTT) colorimetric method with the standardized National Committee for Clinical Laboratory Standards method of testing clinical yeast isolates for susceptibility to antifungal agents.</a> J Clin Microbiol. 36, 1450-1452 (1998).</li><li>Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uses+and+limitations+of+the+XTT+assay+in+studies+of+Candida+growth+and+metabolism.">Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism.</a> J Clin Microbiol. 41, 506-508 (2003).</li><li>Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+susceptibility+of+Candida+biofilms:+Unique+efficacy+of+amphotericin+B+lipid+formulations+and+echinocandins.">Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1773-1780 (2002).</li><li>Nobile, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+albicans+transcription+factor+Bcr1p:+a+regulator+of+cell-surface+genes+and+biofilm+formation.">C. albicans transcription factor Bcr1p: a regulator of cell-surface genes and biofilm formation.</a> Current Biol. 15, 1150-1155 (2005).</li><li>Ramage, G., Saville, S. P., Thomas, D. P., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+biofilms:+an+update.">Candida biofilms: an update.</a> Eukaryot Cell. 4, 633-638 (2005).</li><li>Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., p, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+method+for+in+vitro+antifungal+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+biofilms.">Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).</li><li>Bachmann, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+combinations+against+Candida+albicans+biofilms+in+vitro.">Antifungal combinations against Candida albicans biofilms in vitro.</a> Antimicrob Agents Chemother. 47, 3657-3659 (2003).</li><li>Ramage, G., VandeWalle, K., Bachmann, S. P., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+pharmacodynamic+properties+of+three+antifungal+agents+against+preformed+Candida+albicans+biofilms+determined+by+time-kill+studies.">In vitro pharmacodynamic properties of three antifungal agents against preformed Candida albicans biofilms determined by time-kill studies.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 3634-3636 (2002).</li><li>Ramage, G., VandeWalle, K., Wickes, B. L., L&#243;pez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans.">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).</li><li>Tellier, R., Krajden, M., Grigoriew, G. A., Campbell, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+endpoint+determination+system+for+antifungal+susceptibility+testing+of+yeasts.">Innovative endpoint determination system for antifungal susceptibility testing of yeasts.</a> Antimicrob Agents Chemother. 36, 1619-1625 (1992).</li><li>Nett, J., Andes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilm+development,+modeling+a+host-pathogen+interaction.">Candida albicans biofilm development, modeling a host-pathogen interaction.</a> Curr Opin Microbiol. 9, 340-345 (2006).</li></ol>

JLL-R מחזיקה בהון MicrobeHTS Technologies, Inc, המפתחת חומרים נגד פטריות. MicrobeHTS Technologies, Inc לא סיפקו תמיכה כספית עבור מחקרים אלו.

כאן אנו מתארים פשוט, מהיר, חסכוני מאוד לשחזור 96 microtiter גם צלחת מודל להקמת biofilms קנדידה בשילוב עם שיטת colorimetric אשר מודד את הפעילות המטבולית של תאים בתוך biofilm באמצעות XTT. 96 זה microtiter גם צלחת מודל להקמת biofilm פותחה במקור עבור ג אלביקנס אך יכול לשמש אחרים קנדידה spp. ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sabouraud-dextrose agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>211584</td>
<td>To prepare plates for fresh subcultures of fungal isolates</td>
</tr>
<tr>
<td>YPD: Yeast peptone dextrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>US Biological </td>
<td>Y2076</td>
<td>Medium for propagation of overnight liquid cultures</td>
</tr>
<tr>
<td>RPMI-1640 without sodium bicarbonate supplemented with L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>50-020-PB</td>
<td>Liquid medium for biofilm formation</td>
</tr>
<tr>
<td>Morpholinepropanesulfonic acid (MOPS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP308</td>
<td>To buffer RPMI 1640</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline, PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4417</td>
<td>Buffer for washes</td>
</tr>
<tr>
<td>XTT sodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>X4251</td>
<td>See above for preparation instructions</td>
</tr>
<tr>
<td>Ringer's lactate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hospira</td>
<td>NDC0409-7953-09</td>
<td>For preparation of XTT solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Menadione</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M5625</td>
<td>Caution: hazardous by skin contact, inhalation or ingestion</td>
</tr>
<tr>
<td>Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>08-757-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 ml conical centrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430790</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 ml conical centrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430828</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>96 well microtiter plates: Polystyrene, flat-bottomed, tissue culture treated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3595</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Multichannel pipette and tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microtiter plate reader</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a 96 well microtiter plate-based method for monitoring formation and antifungal susceptibility testing of candida albicans biofilms

קנדידה אלביקנס נשאר הגורם השכיח ביותר של זיהומים פטרייתיים האוכלוסייה המתרחבת של חולים נפרץ קנדידה עכשיו את הזיהום השלישי בשכיחותו בבתי חולים בארה&quot;ב. ביטויים שונים של קנדידה המשויכים היווצרות biofilm, הן רקמות המארח ו / או מכשירים רפואיים (כלומר צנתרים). היווצרות biofilm נושאת השלכות קליניות שליליות, כמו תאים בתוך biofilms מוגנים מפני תגובות מארח החיסונית מפעולה של antifungals. פיתחנו מודל במבחנה פשוטה, מהירה וחזקה ליצירת ג biofilms אלביקנס באמצעות 96 היטב microtiter צלחות, אשר יכול לשמש גם עבור בדיקות רגישות biofilm נגד פטריות. Readout של assay זה colorimetric, המבוססת על הפחתת XTT (מלח tetrazolium) על ידי תאים פעילים מבחינה מטבולית biofilm פטרייתי. ניסוי טיפוסי לוקח כ 24 שעות ליצירת biofilm, עם 24 שעות נוספות לצורך בדיקות רגישות נגד פטריות. בגלל הפשטות שלה, את השימוש בחומרים במעבדה זמין בדרך כלל ציוד, טכניקה זו democratizes מחקר biofilm מייצג צעד חשוב לקראת סטנדרטיזציה של בדיקות רגישות של פטריות biofilms פטרייתי.

Watch this Scientific Journal Video about A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms at JoVE.com

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

אנו מתארים שיטה פשוטה, מהירה וחזקה ליצירת<em&gt; קנדידה אלביקנס</em&gt; Biofilms באמצעות 96 צלחות microtiter היטב השירות שלה בבדיקת רגישות פטריות של תאים בתוך biofilms.

96 microtiter ובכן פלייט מבוססי שיטה ליצירת ניטור ובדיקה של רגישות נגד פטריות קנדידה אלביקנס Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

a-96-well-microtiter-plate-based-method-for-monitoring-formation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

44.7K Views.  University of Texas San Antonio - UTSA. אנו מתארים שיטה פשוטה, מהירה וחזקה ליצירת קנדידה אלביקנס Biofilms באמצעות 96 צלחות microtiter היטב השירות שלה בבדיקת רגישות פטריות של תאים בתוך biofilms.

Video: A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Biofilm microtiter תבשיל גיבוש Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

ב גיבוש biofilm חוץ גופית ב 8-Slide גם לשכת

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). Antimicrobial susceptibility testing (AST) of Mtb has traditionally been performed by the agar method of proportion or by 
macrobroth testing on an instrument such as the BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Diagnostics, Cleveland, OH) or BacT/ALERT (bioM&eacute;rieux, Hazelwood, MO). The agar proportion method, while considered the &#x201C;gold&#x201D; standard of AST, is labor intensive and requires calculation of resistance by performing colony counts on drug-containing agar as compared to drug-free agar. If there is &ge;1% growth on the drug-containing medium as compared to drug-free medium, the organism is considered resistant to that drug. The macrobroth methods require instrumentation and test break point ("critical") drug concentrations for the first line drugs (isoniazid, ethambutol, rifampin, and pyrazinamide). The method described here is commercially available in a 96 well microtiter plate format [MYCOTB (TREK Diagnostics)] and contains increasing concentrations of 12 antimicrobials used for treatment of tuberculosis including both first (isoniazid, rifampin, ethambutol) and second line drugs (amikacin, cycloserine, ethionamide, kanamycin, moxifloxacin, ofloxacin, para-aminosalicylic acid, rifabutin, and streptomycin). Pyrazinamide, a first line drug, is not included in the microtiter plate due to its need for acidic test conditions. Advantages of the microtiter system include both ease of set up and faster turn around time (14 days) compared with traditional agar proportion (21 days). In addition, the plate can be set up from inoculum prepared using either broth or solid medium. Since the microtiter plate format is new and since Mtb presents unique safety challenges in the laboratory, this protocol will describe how to safely setup, incubate and read the microtiter plate.

Antimicrobial susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis is challenging but critical for patient care. This microtiter plate format offers testing of 12 antimycobacterial drugs and provides minimum inhibitory concentration (MIC) values, which will aid in appropriate treatment.

רגישות בדיקת Antimicrobial של קומפלקס שחפת Mycobacterium עבור תרופות הקו הראשון והשני על ידי דילול מרק בפורמט פלייט microtiter

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a rapid identification of the infectious agent to guide optimal antibiotic treatment. The analysis of Gram stains from positive blood culture can be rapidly conducted and already significantly impact the antibiotic regimen. However, the accurate identification of the infectious agent is still required to establish the optimal targeted treatment. We present here a simple and fast bacterial pellet preparation from a positive blood culture that can be used as a sample for several essential downstream applications such as identification by MALDI-TOF MS, antibiotic susceptibility testing (AST) by disc diffusion assay or automated AST systems and by automated PCR-based diagnostic testing. The performance of these different identification and AST systems applied directly on the blood culture bacterial pellets is very similar to the performance normally obtained from isolated colonies grown on agar plates. Compared to conventional approaches, the rapid acquisition of a bacterial pellet significantly reduces the time to report both identification and AST. Thus, following blood culture positivity, identification by MALDI-TOF can be reported within less than 1 hr whereas results of AST by automated AST systems or disc diffusion assays within 8 to 18 hr, respectively. Similarly, the results of a rapid PCR-based assay can be communicated to the clinicians less than 2 hr following the report of a bacteremia. Together, these results demonstrate that the rapid preparation of a blood culture bacterial pellet has a significant impact on the identification and AST turnaround time and thus on the successful outcome of patients suffering from bloodstream infections.

A rapid bacterial pellet preparation from a positive blood culture can be used as a sample for applications such as identification by MALDI-TOF, Gram staining, antibiotic susceptibility testing and PCR-based test. The results can be rapidly communicated to clinicians to improve the outcome of patients suffering from bloodstream infections.

הכנה של תרבות דם כדוריים לראפיד בקטריאלי זיהוי ואנטיביוטיקת רגישות בדיקה

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, which are expressed as minimum inhibitory concentrations (MICs) are used in research for antimicrobial development and monitoring of resistance development and in the clinical setting for antimicrobial therapy guidance. Dalbavancin is a semi-synthetic lipoglycopeptide antimicrobial agent that was approved in May 2014 by the Food and Drug Administration (FDA) for the treatment of acute bacterial skin and skin structure infections caused by Gram-positive organisms. The advantage of dalbavancin over current anti-staphylococcal therapies is its long half-life, which allows for once-weekly dosing. Dalbavancin has activity against Staphylococcus aureus (including both methicillin-susceptible S. aureus [MSSA] and methicillin-resistant S. aureus [MRSA]), coagulase-negative staphylococci, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus anginosus group, &#946;-hemolytic streptococci and vancomycin susceptible enterococci. Similar to other recent lipoglycopeptide agents, optimization of CLSI and ISO broth susceptibility test methods includes the use of dimethyl sulfoxide (DMSO) as a solvent when preparing stock solutions and polysorbate 80 (P80) to alleviate adherence of the agent to plastic. Prior to the clinical studies and during the initial development of dalbavancin, susceptibility studies were not performed with the use of P-80 and MIC results tended to be 2-4 fold higher and similarly higher MIC results were obtained with the agar dilution susceptibility method. Dalbavancin was first included in CLSI broth microdilution methodology tables in 2005 and amended in 2006 to clarify use of DMSO and P-80. The broth microdilution (BMD) procedure shown here is specific to dalbavancin and is in accordance with the CLSI and ISO methods, with step-by-step detail and focus on the critical steps added for clarity.

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

Microdilution שיטת ההפניה מרק לDalbavancin<em&gt; במבחנה</em&gt; בדיקה של רגישות חיידקים שגדלות אירובי

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

ויזואליזציה של ביופילמים ב קנדידה אלביקנס שימוש בהתקן Microfluidic אוטומטי

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily lead to infections in the dermis which can, in turn, result in the dissemination of pathogens into the bloodstream. Understanding how the immune system fights infections at the very early stage and how the host can eliminate the pathogens is an important step to set the base for future therapeutic interventions. Here we describe a model of Candida albicans infection that can visualize the processes that occur early during an infection, including when the pathogen has passed the epithelial barrier, as well as the immune response elicited by the C. albicans invasion. We used this infection model to perform histological analyses that show the immune cells that infiltrate the skin as well as the presence and localization of the pathogen. Samples collected after the infection can be processed for RNA extraction.

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Here we describe a protocol that allows histological and molecular analysis of skin samples after Candida albicans intradermal injection. This protocol maintains the structural integrity of the skin and allows for the localization of tissue-resident or newly recruited immune cells as well as the pathogen distribution.

עמוק עורי הזרקת כמו מודל של קנדידה אלביקנס דלקת עור עבור ניתוחים היסטולוגית

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic growth of C. albicans SN425, the inoculums grew on Yeast Nitrogen Base media. For biofilm formation, RPMI 1640 media, which have high concentrations of amino acids, were applied to help biofilm growth. Biofilms of 48 h were treated twice a day for a period of 1 min with a non-coherent light device (red light; wavelength = 635 nm; energy density = 87.6 J&#183;cm-2). As a positive control (PC), 0.12% chlorhexidine (CHX) was applied, and as a negative control (NC), 0.89% NaCl was applied to the biofilms. Colony forming units (CFU), dry-weight, soluble and insoluble exopolysaccharides were quantified after treatments. Briefly, the protocol presented here is simple, reproducible and provides answers regarding viability, dry-weight and extracellular polysaccharide amounts after red light treatment.

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Here, we present a protocol to assess the outcome of red light application on the growth of Candida albicans biofilm. A non-coherent red light device with the wavelength of 635 nm and energy density of 87.6 J&#183;cm-2 was applied throughout the growth of Candida albicans biofilms for 48 h.

פוטותרפיה יומי עם אור אדום כדי לווסת קנדידה אלביקנס Biofilm צמיחה

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

ויזואליזציה של קנדידה אלביקנס במערכת העיכול מוריין באמצעות פלורסנט היברידיזציה באתרו

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch from yeast-form growth to hyphal growth. Cells initiating this process become adherent to surfaces as well as to each other, with the resulting development of a biofilm colony. This commonly occurs not only on mucosal tissue surfaces in yeast infections, but also on medical implants such as catheters. It is well known that biofilm cells are resistant to antifungal drugs, and that cells that shed from the biofilm can lead to dangerous systemic infections. Biofilms range from heavily translucent to opaque due to refractive heterogeneity. Therefore, fungal biofilms are difficult to study by optical microscopy. To visualize internal structural, cellular, and subcellular features, we clarify fixed intact biofilms by stepwise solvent exchange to a point of optimal refractive index matching. For C. albicans biofilms, sufficient clarification is attained with methyl salicylate (n = 1.537) to enable confocal microscopy from apex to base in 600 &#181;m biofilms with little attenuation. In this visualization protocol we outline phase contrast refractometry, the growth of laboratory biofilms, fixation, staining, solvent exchange, the setup for confocal fluorescence microscopy, and representative results.

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

To view and quantify the internal features of Candida albicans biofilms, we prepare fixed intact specimens that are clarified by refractive index matching. Then, optical sectioning microscopy can be used to obtain three-dimensional image data though the full thickness of the biofilm.

הבהרת והדמיה של קנדידה ביוביאמים

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...