פרוטוקול זה פותח במעבדות של ג&#39;יין דוד, תומאס Jessell ואנדרו לומסדן. אנשים רבים, כולל קונרד Basler, אן Calof, תומאס Edlund, פיל המילטון, Domna Karagogeos, אריאל רואיז אני Altaba ו Toshiya יאמאדה נקבע כיצד explants תרבות של חוט השדרה של קולגן. מרישה Placzek ומארק טסייה-לאבין חלוץ בטכניקה של צמיחה באמצעות האקסון מ ב explants במבחנה כאמצעי זיהוי מולקולות הנחיה האקסון. עבודה במעבדה באטלר נתמך על ידי תרומות של מצעד הפרוטות ו R01 NS063999 מ-NIH / NINDS.

חלק 1: הכנת מצרפי של תאים transfected COS באמצעות טיפות תליה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים COS-7 (COS) תאים בצלחות תרבות 35mm. כאשר הם מגיעים 80% confluency, 1μg transfect הביטוי הפלסמיד לתוך התאים באמצעות Lipofectamine2000 לפי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין תלוי טיפות, לשאוב את המדיום transfection ולשטוף את התאים COS transfected עם פוספט 1ml של 1x פתרון שנאגרו (PBS). התייחס תאים עם 0.5ml של המדיום האנזים ללא תא דיסוציאציה במשך 15 דקות. הוסף 1ml של תמיסה של Opti-ממ סרום + 1x פניצילין / סטרפטומיצין / גלוטמין (P / S / G) 10% + שור עוברית (FBS) כדי לעצור את התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Triturate התאים כדי להסיר אותם מפני השטח של צלחת התרבות להעביר לתוך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. ספין 2 דקות ב 2000k ל גלולה התאים. הסר supernatant ו resuspend גלולה ב 100μl של Opti-1x ממ + P / S / G + 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוט טיפות 20μl מרובים על החלק הפנימי של מכסה תרבות 35mm צלחת, להפוך המכסה ומניחים על גבי החלק התחתון של צלחת ולהשאיר בתוך 37 ° C בחממה במשך כמה שעות עד התאים מצטברים. </li></ol> חלק 2: הכנת Explants עמוד השדרה הגבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח עוברים E11 חולדה מן הרחם של האם לשמור על הקרח במדיום L15 עד הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מחט טונגסטן חידד, להסיר סעיף 4-6 קטע מתא המטען של העובר כל מהאזור מיד מתחת forelimb ניצן. בעזרת פיפטה פלסטיק, לאסוף את פיסות רקמה אחת גם מנה 4-באר Nunc ולשמור על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כל חלקי העובר כבר גזור, השתמש פיפטה פלסטיק להעביר את חתיכות לתוך תמיסה של 1ml L15 + 1mg dispase שנייה גם של המנה Nunc. דגירה בטמפרטורת החדר למשך לא יותר מ 5 דקות. אל על דגירה חלקי רקמה עם dispase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה, הוסף 0.5ml של חום עז מומת בסרום נורמלי (וההיגז) עד 10 מ&quot;ל של כ L15 לתוך צלחת פטרי מערבולת לערבב. העברת 1ml של פתרון זה לתוך 1 / 3 גם של המנה Nunc ולהעביר את חתיכות רקמה לתוך פתרון זה כאשר הדגירה נגמר. שמור על הקרח. הערה: לנתיחה שלאחר מכן יהיה קל יותר אם חתיכות רקמה מותר &quot;לנוח&quot; על קרח למשך שעה. </li></ol> חלק 3: קולגן תחול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני 40μl 10x Essential מינימלית קולגן 360μl, לערבב במהירות וביסודיות על ידי מצליף או בקצרה vortexing את הצינורית. ספין למטה במהירות picofuge. הפתרון יהיה צהוב. שמור על הקרח כמה שיותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מספיק סודיום ביקרבונט 0.8M (NaHCO 3) להפוך את פתרון קולגן כתום מעט (ראה הערה להלן). שוב, לערבב במהירות וביסודיות על ידי מצליף, ואת ספין למטה בקצרה picofuge. אם הפתרון נשאר ורוד לאחר ערבוב, שהוספת NaHCO 3 יותר מדי ויהיה צריך להתחיל שוב עם צינור חדש של קולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה הפתרון קולגן הוא דרוך. זה יישאר נוזלי על הקרח, אבל יהיה לגבש בתוך כ -5 דקות (גוון ורוד) כאשר הביאו לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוט 20μl של קולגן היטב כל מנה 4-באר Nunc. באמצעות קצה פיפטה שלך, להפיץ את הקולגן להקים &quot;כרית&quot; קטנה. תן קולגן להגדיר בטמפרטורת החדר. </li></ol> הערה: הכמות המדויקת של NaHCO 3 יהיה צורך טיטרציה עבור כל אצווה של קולגן. התחל נמוכה (11μl) ולאחר מכן להוסיף 0.5-1μl בשלבים עד הפתרון הוא גוון קל של כתום. הסכום &quot;הנכון&quot; הוא בדרך כלל 1ul פחות מהסכום הקטן ביותר של NaHCO 3 שיהפוך הוורוד קולגן. כמות NaHCO 3 לא בקנה מידה ליניארי למעלה או למטה. חלק 4: Dissection של הגב Explants חוט השדרה מיצוב מהם עם מצרפי COS תא קולגן מטריקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט טונגסטן חידד טרי וזוג מלקחיים קנס (# 5 או # 55), להסיר את והמזודרם שסביב לחוט השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיתוך במקביל צלחת על הרצפה עם המחט טונגסטן, להסיר בזהירות החמישי הגחון של חוט השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החוצים את השדרה הגבי explant, ולוודא כי הקצוות נחתכים כמו נקי ככל האפשר. Re-לקצץ את הקצוות, במידת הצורך. העברת כל explant השדרה הגבי על כריות קולגן נפרדים באמצעות פיפטה בפה מצויד עם שפופרת זכוכית נימי משך כ. 0.5mm קוטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את המצרפי של תאים COS transfected לריבועים של רוחב כ זהה לקצה הלטרלי של explant השדרה הגבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת באחד הריבועים האלה על כרית עם קולגן explant השדרה הגבי, בעזרת פיפטה בפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה בפה, לשאוב את כל הנוזל העודף באמצעות פיפטה בפה. אל על לשאוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 4μl של קולגן דרוך על כרית, וכן, באמצעות מחט הטונגסטן, הזז את הקולגן על explants מבלי לגעת ישירות רקמות. על ידי הזזת המחט טונגסטן ב קולגן סביב explants, המזרח explants כך מצטברים בתאי COS צמוד לקצה הלטרלי של explant השדרה הגבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקולגן קבע, לחזור את היישום של 4μl של קולגן על מנת להבטיח כי explants נארזים לחלוטין קולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף בתרבית רקמה, להוסיף 0.5ml של 1xP/S/G + Opti-ממ ותרבות שעות 30-40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן explants במשך 45 דקות עם 4% paraformaldehyde 0.5ml ב 1xPBS, שמירה על צלחת על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו פעמיים עם 0.5ml של פתרון חסימת 1xPBS + 0.1% Triton-X100 וההיגז 1% (PBTN). בלוק על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שעות לפחות, דגירה לילה עדיפה ואז התהליך אימונוהיסטוכימיה. </li></ol> חלק 5: ויזואליזציה של אקסונים Commissural ידי אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חסימת PBTN, לחתוך את explants מתוך צלחת 4 היטב עם מלקחיים ומניחים בצלחת 48-באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200μl של נוגדנים ראשוני זה טוב להשאיר לילה בשעה 4 ° C. כדי להמחיש אקסונים commissural, להשתמש בפתרון 01:06 של נוגדנים נגד Tag1 העכבר. כדי לקבוע אם transfection בוצעה בהצלחה, כוללים גם נוגדן כנגד העיקרי או מולקולת האיתות למבחן, או epitope רלוונטי אם מולקולת האיתות כבר epitope מתויג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף כל מדגם לשעה 5 1 x ב PBTN ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200μl של נוגדנים משני זה טוב להשאיר לילה בשעה 4 ° C. אם אנטי Tag1 נוגדנים שימשו הנוגדן העיקרי, להשתמש בעכבר נגד עז IgM נוגדנים משני מצמידים או FITC או Cy3. אם באמצעות אור רגישים משני הנוגדנים מצמידים את FITC או Cy3, לשמור את המנה 48-מכוסה היטב בנייר כסף מנקודה זו ואילך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף כל מדגם 5 x 1 שעה כל PBTN ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת explant להחליק 3-באר דיכאון, להסיר את נוזל עודף, הר ב Vectashield בינוני coverslip. חנות בתיבת בטוח אור או 4 ° C או -20 ° C. </li></ol> חלק 6: תמונות נציג Explants בניסוי מוצלח, explant ו המצרפי COS יישאר הסמוכים זה לזה ולא מתרחקים זה מזה כמו קולגן קובע. יהיו יתר מינימלית של אקסונים; יתר axonal משמעותי מצביע על כך explant השדרה הגבי היה מתורבת יותר מדי זמן. לא יהיה blebs הגוברת מצד explant; blebbing מתרחשת כאשר הרקמה בא במגע ישיר עם המדיום לתרבות. היכולת של מולקולת איתות לארגון מחדש של אקסונים הוא הוערכה באמצעות מיקרוסקופיה confocal. היקף של ארגון מחדש האקסון ניתן לכמת על ידי מדידת זווית ממוצעת של ארגון מחדש של אקסונים הקרובים במצטבר תא COS 3. כפי שניתן לראות בתרשים 1, תאים COS להביע myc-tagged BMP7 (כחול) לארגון מחדש של אקסונים commissural Tag1 + (ירוק) הרחק ממקור BMP7 (איור 1B) בדומה לאופן שבו explant צלחת גג דוחה אקסונים commissural (איור 1A). תאים COS להביע וקטור השליטה אין השפעה על הכיוון של אקסונים commissural 3,4. Explants אלה כונו גם עם נוגדנים נגד גורם שעתוק Isl1 / 2 (אדום), אשר מעטר הנוירונים המוטוריים interneurons הגבי. תוצאה זו היתה הסימן הראשון כי חבר של המשפחה BMP מתווכת את הפעילות של 3 הגג צלחת chemorepellent. <img src="/files/ftp_upload/1853/1853fig1tmb.jpg" border="0" /> איור 1: אנא <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/1853/1853fig1.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1.

<ol>
	<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The development of the rat spinal cord. , (1984).</li><li>Placzek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+recombinations+in+collagen+gels.">Tissue recombinations in collagen gels.</a> Methods in molecular biology. , 325-335 (2008).</li><li>Augsburger, A., Schuchardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPs+as+mediators+of+roof+plate+repulsion+of+commissural+neurons.">BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons.</a> Neuron. 24, 127-141 (1999).</li><li>Butler, S. J., Dodd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+BMP+heterodimers+in+roof+plate-mediated+repulsion+of+commissural+axons.">A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons.</a> Neuron. 38, 389-401 (2003).</li><li>Kennedy, T. E., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord.">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78, 425-435 (1994).</li><li>Charron, F., Stein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogen+sonic+hedgehog+is+an+axonal+chemoattractant+that+collaborates+with+netrin-1+in+midline+axon+guidance.">The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance.</a> Cell. 113, 11-23 (2003).</li><li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system.">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li><li>Dodd, J., Morton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+axonal+glycoprotein+expression+on+subsets+of+embryonic+spinal+neurons.">Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons.</a> Neuron. 1, 105-116 (1988).</li><li>Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+type+I+receptor+complexes+have+distinct+activities+mediating+cell+fate+and+axon+guidance+decisions.">BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions.</a> Development. 135, 1119-1128 (2008).</li></ol>

גורמים קריטיים הקובעים הצלחה בביצוע הזה assay הם הראשון, רקמות לא צריכים להיות מטופלים עם dispase לתקופה ממושכת מדי, טיפול כזה יביא הרקמה להיות דביק מאוד לאחר ירידה הכדאיות. שני, קולגן חייב להיות דרוך לחלוטין ושמר על הקרח כמה שיותר. זה יהיה קשה יותר ויותר להתמודד אם זה מתחיל לשקוע, כלומר להפוך ורוד. שלישית, המחט טונגסטן חייב תמיד להיות כל הזמן מאוד חדה.

assaying the ability of diffusible signaling molecules to reorient embryonic spinal commissural axons

אקסונים commissural הגבי בעמוד השדרה חוליות 1 כבר מערכת מודל יסולא בפז שבו כדי לזהות אותות הדרכה האקסון. כאן אנו מתארים ב assay חוץ גופית, &quot;assay ארגון מחדש&quot;, כי כבר נעשה שימוש נרחב כדי לחקור את ההשפעה של אותות החיצונית והרמה הפנימית על האוריינטציה של אקסונים commissural 2. Assay זו פותחה על ידי אנשים רבים במעבדות של ג&#39;יין דוד, תומאס Jessell ואנדרו לומסדן (ראה התודות לפרטים נוספים) וגירסאות של assay זה שימשו כדי להדגים את פעולות ארגון מחדש של מולקולות הנחיה מפתח האקסון, כולל BMP chemorepellent ב הגג צלחת 3,4 ופעילות chemoattractive של Netrin1 5 ו סוניק הקיפוד (ששש) 6 בצלחת הרצפה בחוט השדרה. Explants הכולל 2-3 שכבות הגבי שני שלישים של עמוד השדרה הם גזור מיום עובריים (E) 11 חולדות תרבותי בשלוש ג&#39;ל קולגן ממדי 7. Explants E11 השדרה הגבי מכילים נוירונים commissural שזה עתה נולד, אשר ניתן לזהות על ידי ביטוי axonal שלהם גליקופרוטאין, Tag1 8. במהלך 30-40 שעות בתרבות, מסלול האקסון commissural הוא סיכם אלה explants הגב עם כמובן זמן דומה לזה ראיתי in vivo. מסלול זה axonal ניתן לערער על ידי הצבת או רקמות מבחן או במצטבר תא COS להביע מולקולה מועמד איתות במגע עם אחד הקצוות לרוחב של explant הגבי. אקסונים Commissural הארכת באזור של רקמת צירף יגדל תחת השפעת הצלחת שני גג אנדוגני אותות מן הרקמה לרוחב חוץ רחמי. המידה שבה הם אקסונים commissural ההתמצאות בנסיבות אלו ניתן לכמת. שימוש assay זה, אפשר גם לבחון את ההסתפקות של אות מסוים לארגון מחדש של אקסונים commissural 3,4 כמו גם הצורך לאות זה לכוון את מסלול commissural 9.

Watch this Scientific Journal Video about Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons at JoVE.com

Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

Assay זה מעריך את היכולת של מולקולות איתות, עצם פה חלבון המוךפו&quot;גנטי שהולך 7 (BMP7), לארגון מחדש של אקסונים commissural. Explant של חוט השדרה הגבי העובריים בתרבית הסמוכים המצרפי של הפרשת התאים COS הצמיחה גורמים מועמד. אקסונים commissural ההתמצאות גדל בתוך explant הם דמיינו ידי אימונוהיסטוכימיה.

Assaying את היכולת של מולקולות איתות Diffusible כדי כיוון מחדש עובריים האקסונים Commissural השדרה

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals.  Here, we ...

assaying-ability-diffusible-signaling-molecules-to-reorient-embryonic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.8K Views.  University of Southern California. Assay זה מעריך את היכולת של מולקולות איתות, עצם פה חלבון המוךפו"גנטי שהולך 7 (BMP7), לארגון מחדש של אקסונים commissural. Explant של חוט השדרה הגבי העובריים בתרבית הסמוכים המצרפי של הפרשת התאים COS הצמיחה גורמים מועמד. אקסונים commissural ההתמצאות גדל בתוך explant הם דמיינו ידי אימונוהי...

Video: Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for culturing neurons. Previously, a silicon wafer was patterned with the design for the neuron microfluidic device using SU-8 and photolithography to create a master mold, or what we simply refer to as a "master". Next, we pour the silicon polymer PDMS on top of the master which is then cured by heating the PDMS to 80&deg;C for 1 hour. The PDMS forms a negative mold of the device. The PDMS is then carefully cut and lifted away from the master. Holes are punched where the reservoirs will be and the excess PDMS trimmed away from the device. Nitrogen is used to blow away any excess debris from the device. At this point the devices are now ready for use and can either bonded to corning No. 1 cover glass with a plasma sterilizer/cleaner or can be reversibly bound to the cover glass by simply placing the device on top of the cover glass. The reversible bonding of the device to glass is covered in a separate video and requires first that the device be sterilized either with 70% ethanol or by autoclaving. Plasma treating sterilizes the devices so no further treatment is necessary. It is, however, important, when plasma-treating the devices, to add liquid to the devices within 10 minutes of the plasma treatment while the surfaces are still hydrophilic. Waiting longer than 10 minutes to add liquid to the device makes it difficult for the liquid to enter the device. The neuron devices are typically plasma-bound to cover glass and 0.5 mg/ml poly-L-lysine (PLL) in pH 8.5 borate buffer is immediately added to the device. After a minimum of 3 hours incubating with PLL, the devices are washed with dH2O water a minimum of 3 times with at least 15 minutes between each wash. Next, the water is removed and fresh media is added to the device. At this point the device is ready for use. It is important to remember at this point to never remove all the media from the device. Always leave media in the main channel.

In this video we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to farbricate a microfluidic device for culturing neurons.

המצאה של המכשיר microfluidic עבור מידור של Neuron סומה האקסונים

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

חוט השדרה Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction analysis. One particular method to achieve this conditional deletion is via the use of the Cre-loxP system. This method involves flanking the gene of interest with loxP sites, which are specific recognition sequences for the Cre recombinase protein. Exposure of the so-called floxed (flanked by loxP site) DNA to this enzyme results in a Cre-mediated recombination event at the loxP sites, and subsequent excision of the intervening gene3. Several different methods exist to administer Cre recombinase to the site of interest. In this video, we demonstrate the use of an adenovirus containing the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) obtained from embryos containing a floxed Rac1 allele1. Our rationale for selecting Rac1 MEFs for our experiments is that clear morphological changes can be seen upon deletion of Rac1, due to alterations in the actin cytoskeleton2,5. 72 hours following viral transduction and Cre expression, cells were stained using the actin dye phalloidin and imaged using confocal laser scanning microscopy. It was observed that MEFs which had been exposed to the adeno-Cre virus appeared contracted and elongated in morphology compared to uninfected cells, consistent with previous reports2,5. The adenovirus method of Cre recombinase delivery is advantageous as the adeno-Cre virus is easily available, and gene deletion via Cre in nearly 100% of the cells can be achieved with optimized adenoviral infection.

In this video we use an adenovirus carrying the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts carrying a floxed Rac1 allele.

Adenovirus בתיווך הסרת גנטית של מולקולות איתות ב Cultured Fibroblasts עכבר ראשיים עובריים

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

מבחני photobleaching (FRAP &amp; FLIP) כדי למדוד Dynamics חלבון הכרומטין בתוך החיים בתאי גזע עובריים

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

Assaying פעילות קינאז של LRRK2 במבחנה</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

מערכת ל<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; Culturing של לבלב עוברי

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Explants Blastomere לבדיקת מחויבות גורל תא במהלך התפתחות עוברית

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the brain, liver, retina, cochlea and vasculature. In experimental settings, intercellular Ca2+-waves can be elicited by applying a mechanical stimulus to a single cell. This leads to the release of the intracellular signaling molecules IP3 and Ca2+ that initiate the propagation of the Ca2+-wave concentrically from the mechanically stimulated cell to the neighboring cells. The main molecular pathways that control intercellular Ca2+-wave propagation are provided by gap junction channels through the direct transfer of IP3 and by hemichannels through the release of ATP. Identification and characterization of the properties and regulation of different connexin and pannexin isoforms as gap junction channels and hemichannels are allowed by the quantification of the spread of the intercellular Ca2+-wave, siRNA, and the use of inhibitors of gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-wave in monolayers of primary corneal endothelial cells loaded with Fluo4-AM in response to a controlled and localized mechanical stimulus provoked by an acute, short-lasting deformation of the cell as a result of touching the cell membrane with a micromanipulator-controlled glass micropipette with a tip diameter of less than 1 &mu;m. We also describe the isolation of primary bovine corneal endothelial cells and its use as model system to assess Cx43-hemichannel activity as the driven force for intercellular Ca2+-waves through the release of ATP. Finally, we discuss the use, advantages, limitations and alternatives of this method in the context of gap junction channel and hemichannel research.

Intercellular Ca2+-waves are driven by gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-waves in cell monolayers in response to a local single-cell mechanical stimulus and its application to investigate the properties and regulation of gap junction channels and hemichannels.

הרבייה מכאנית מושרה גירוי סיד גל בmonolayers הסלולרי: דוגמה לתאי אנדותל קרני שור

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro and in vivo. Fluorescent probes are particularly useful in determining the bio-distribution of administered large molecules, where the addition of a small-molecule fluorescent label is unlikely to affect the kinetics or bio-distribution of the compound. A variety of methods exist to examine bio-distribution that vary significantly in the amount of effort required and whether the resulting measurements are fully quantitative, but using multiple methods in conjunction can provide a rapid and effective system for analyzing bio-distributions.
Ex vivo whole-organ imaging is a method that can be used to quickly compare the relative concentrations of fluorescent molecules within tissues and between multiple types of tissues or treatment groups. Using an imaging platform designed for live-animal or whole-organ imaging, fluorescence within intact tissues can be determined without further processing, saving time and labor while providing an accurate picture of the overall bio-distribution. This process is ideal in experiments attempting to determine the tissue specificity of a compound or for the comparison of multiple different compounds. Quantitative tissue histology on the other hand requires extensive further processing of tissues in order to create a quantitative measure of the labeled compounds. To accurately assess bio-distribution, all tissues of interest must be sliced, scanned, and analyzed relative to standard curves in order to make comparisons between tissues or groups. Quantitative tissue histology is the gold standard for determining absolute compound concentrations within tissues.
Here, we describe how both methods can be used together effectively to assess the ability of different administration methods and compound modifications to target and deliver fluorescently labeled molecules to the central nervous system1.

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo whole-organ imaging is a rapid method for determining the relative concentrations of fluorescently labeled compounds within and between tissues or treatment groups. Conversely, quantitative fluorescence histology, while more labor intensive, allows for the quantification of the absolute tissue levels of labeled molecules.

השימוש של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; הדמיה Whole-איברים היסטולוגיה רקמות כמותי כדי לקבוע את ביו-הפצה של מולקולות שכותרתו fluorescently

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...